Αφηρημένο

βαϊκαλεΐνη, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη κινέζικα βότανα ιατρικής, έχει πολλαπλές φαρμακολογικές δράσεις. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί των αντι-πολλαπλασιασμό και αντι-μεταστατική επιπτώσεις της βαϊκαλεΐνη για τον καρκίνο της χοληδόχου κύστης (GBC) παραμένουν ελάχιστα κατανοητή. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εκτιμηθούν οι αντι-πολλαπλασιασμού και αντι-μεταστατική επιδράσεις της βαϊκαλεΐνη και το σχετικό μηχανισμό (ες) στην GBC. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με βαϊκαλεΐνη προκάλεσε μια σημαντική ανασταλτική δράση επί του πολλαπλασιασμού και απόπτωσης σε προωθούνται GBC-SD και SGC996 κύτταρα, δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες κυτταρικές σειρές καρκίνου της χοληδόχου κύστης. Επιπλέον, η θεραπεία με βαϊκαλεΐνη ανέστειλε την μετάσταση των κυττάρων GBC. Επιπλέον, δείξαμε για πρώτη φορά ότι βαϊκαλεΐνη ανάπτυξη ανέστειλε GBC κυττάρων και τη μετάσταση μέσω προς τα κάτω ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη Χ-συνδεδεμένο (ZFX). Εν κατακλείδι, οι μελέτες μας δείχνουν ότι βαϊκαλεΐνη μπορεί να είναι μια πιθανή φυτοχημικές φλαβονοειδών για θεραπευτική της GBC και ZFX μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα μοριακό δείκτη ή προγνωστική στόχος για GBC

Παράθεση:. Liu TY, Γκονγκ W, Ταν ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) βαϊκαλεΐνη Αναστέλλει εξέλιξη του καρκίνου της χοληδόχου κύστης κύτταρα από ρύθμιση προς τα κάτω ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10.1371 /journal.pone.0114851

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 16 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιανουαρίου 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81172026, 81272402, 81301816 και 81172029), Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας έρευνας και του Προγράμματος Ανάπτυξης (863 Program) (Αρ 2012AA022606), Ίδρυμα για διεπιστημονική έρευνα της Σαγκάης Jiao Tong University (Αρ YG2011ZD07) , η επιστήμη της Σαγκάης και της Επιτροπής τεχνολογία διακυβερνητική έργο διεθνούς συνεργασίας (Νο 12410705900), Σαγκάη επιστήμη και την τεχνολογία προμήθεια ιατρικών-καθοδήγησης του έργου (αρ 12.401.905.800), Πρόγραμμα για Changjiang Scholars, Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα Ερευνών της Σαγκάης Jiao Tong University School of Medicine (Αρ 13XJ10037), με αποτέλεσμα το πρόγραμμα ταλέντο της Σαγκάης, το πρόγραμμα Ιστιοπλοΐα της Σαγκάης επιστήμης και της τεχνολογίας της Επιτροπής (14YF1403000) και του Ιδρύματος εξειδικευμένη έρευνα για Ph.D πρόγραμμα της Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης-Προτεραιότητα Ανάπτυξης πεδίο (Νο 20130073130014). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της χοληδόχου κύστης (GBC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου του χοληφόρου οδού, η οποία χαρακτηρίζεται από τις αρχές εισβολή των λεμφαδένων και απομακρυσμένων μεταστάσεων [1-3]. Τείνει να είναι μια επιθετική όγκου που εξαπλώνεται νωρίς και το 90% των ασθενών GBC παρουσιάζονται σε προχωρημένο, ανεγχείρητο στάδιο [4, 5]. καρκίνωμα νωρίς χοληδόχος κύστη είναι ασυμπτωματική ή να εκδηλώνεται μόνο ως κοιλιακή δυσφορία. Μερικοί ασθενείς μπορεί να αναπτύξει το σύμπτωμα της οξείας ή χρόνιας χολοκυστίτιδας, η οποία είναι εύκολο να αγνοήσει ή να χάσετε. Σε μεταγενέστερη περίοδο, οι ασθενείς μπορούν να αναπτύξουν κοιλιακό άλγος, ίκτερος, και γωνιακά, αλλά οι περισσότεροι από τους ασθενείς δεν έχουν χειρουργική ευκαιρίες. Η πρόγνωση του προχωρημένου καρκινώματος της χοληδόχου κύστης είναι πολύ φτωχή [6-10], και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόνο περίπου 5%. Μέχρι στιγμής, η χειρουργική εκτομή είναι η μόνη αγωγή που προσφέρει μια ελπίδα για θεραπεία [11]. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό για τον εντοπισμό αξιόπιστων βιοδεικτών και τα φάρμακα για την παρακολούθηση τόσο την εξέλιξη και τη θεραπεία της νόσου.

βαϊκαλεΐνη είναι ένα από τα αποτελεσματικά συστατικά που προέρχονται από το

Labiatae

φυτά

Scutellaria baicalensis Γκεόργκι ξηρά ρίζα

‘s, η οποία έχει πολλά φαρμακολογικά αποτελέσματα όπως αντιφλεγμονώδη, αντι-βακτηριακή, αντι-ιικές, αντι-αλλεργία, αντι-οξείδωση και ούτω καθεξής [12-14]. Πρόσφατα, η αντικαρκινική δράση της βαϊκαλεΐνη έχει προκαλέσει όλο και περισσότερη προσοχή των ανθρώπων. Κυτταρικά και ζωικά πειράματα έχουν δείξει ότι βαϊκαλεΐνη είχε ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου. Για παράδειγμα, βαϊκαλεΐνη ενεργοποιημένα AhR και διευκολύνονται την αποικοδόμηση της κυκλίνης D1, η οποία προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1, και επάγει την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [15]. Βαϊκαλεΐνη αναστέλλει ϋΜΒΑ /ΤΡΑ-προκαλούμενη δέρμα tumorigenesisin ποντικούς με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και η φλεγμονή [16]. Βαϊκαλεΐνη καταργεί αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μεσολάβηση μιτοχονδριακή δυσλειτουργία κατά τη διάρκεια της πειραματικής πνευμονικής καρκινογένεση

in vivo

[17]. Βαϊκαλεΐνη μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανασταλτική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [18]. Λόγω του ευρέως φάσματος κατά του όγκου του, επαρκή πηγή ιατρική, μικρή τοξικότητα και παρενέργειες, βαϊκαλεΐνη φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη μοριακό δείκτη ή θεραπευτικό στόχο του καρκίνου της χοληδόχου κύστης.

δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη, φυλοσύνδετη (ZFX) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που κωδικοποιείται από το γονίδιο της σχετικά με το χρωμόσωμα Χ των θηλαστικών. Η ZFX διαδραματίζει βασικό ρόλο στον έλεγχο της αυτο-ανανέωση και τη συντήρηση των δύο εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα [19-23]. Το επίπεδο έκφρασης του ZFX συσχετίζεται με επιθετικότητα και τη σοβαρότητα σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, του καρκίνου του μαστού, ανθρώπινο κακόηθες γλοίωμα και λευχαιμία. Προηγούμενη έρευνα έδειξε ότι ZFX μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, και την απόπτωση σε πολλά καρκινικά κύτταρα [24-29]. Μας στο παρελθόν αποτελέσματα Διαπιστώθηκε επίσης ότι ZFX μπορεί να περιλαμβάνει στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης στον καρκίνο της χοληδόχου κύστης [30]. Έτσι, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τις επιπτώσεις και τους μηχανισμούς της βαϊκαλεΐνη κατά της διάδοσης του καρκίνου της χοληδόχου κύστης κυττάρων, την εισβολή και τη μετάσταση

in vitro

και σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο της χοληδόχου κύστης όγκου

in vivo

. Επιπλέον, η ZFX είχε αποδειχθεί ως κατάντη στόχου της βαϊκαλεΐνη, η οποία μπορεί να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη νέα προσέγγιση στην αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου της χοληδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Γυμνά ποντίκια (με αρχικό σωματικό βάρος 20-22 g) ελήφθησαν από τη Σαγκάη SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι θεραπείες των ζώων έγιναν αυστηρά σύμφωνα με τις διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας και τα Εθνικά Ινστιτούτα Οδηγός Υγείας σχετικά με τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Σαγκάης Jiao Tong University.

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

GBC-SD και SGC996 κύτταρα αγοράστηκαν από την Σαγκάη κυττάρων Ινστιτούτο Χώρα Τράπεζα Κυττάρων . Τα κύτταρα GBC-SD καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης (Gibco, USA) και τα κύτταρα SGC996 καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Gibco, USA). Όλα τα δύο κύτταρα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (Gibco, USA), 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 100 U /mL πενικιλλίνη (Hyclone, USA), στους 37 ° C, υπό ατμόσφαιρα 5,0% CO2.

ναρκωτικά και αντισώματα

Η βαϊκαλεΐνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), διαλυμένο σε DMSO ως μία συγκέντρωση αποθέματος από 100 mmol /L, και αποθηκεύονται στο σκοτάδι στους -20 ΝΤΟ. Σύκο. 1 δείχνει τη χημική δομική του βαϊκαλεΐνη. Οι τελικές συγκεντρώσεις βαϊκαλεΐνη που χρησιμοποιούνται για τα διάφορα πειράματα παρασκευάστηκαν με αραίωση του διαλύματος αποθέματος με ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης ή RPMI1640. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για κηλίδωση Western ήταν ως εξής: αντι-κασπάση-3, αντι-ΒοΙ-2, αντι-Βαχ, αντι-PARP, αντι-ρ53, αντι-κυκλίνη, αντι-cyclinB1, αντι-cyclinD1, αντι-ΜΜΡ2 κουνελιού , αντι-ΜΜΡ9, αντι-ZFX και αντι-β-ακτίνης ποντικού. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology.

Ο μοριακός τύπος του βαϊκαλεΐνη είναι C15H10O5and μοριακό του βάρος είναι 270.24.

Η

3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2, 5 διφαινυλ τετραζολίου (ΜΤΤ)

ευαισθησία φαρμάκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Corning, USA) σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για όλη τη νύχτα και στη συνέχεια επανατροφοδοτήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις (0, 15, 30, 60, 120, και 240 μmol /L) του βαϊκαλεΐνη για 24, 48, και 72 ώρες. Στη συνέχεια, 20 μΐ του ΜΤΤ (Sigma-Aldrich) διαλελυμένη σε PBS στα 5 mg /ml προστέθηκε απευθείας σε όλα τα φρεάτια και οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίστηκαν διαλύθηκαν σε 100 μΙ DMSO μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου. Η οπτική πυκνότητα καταγράφηκε στα 490 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Tek, USA). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων γίνεται σε πολλαπλές ημέρες. Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας υπολογίστηκε ως εξής:

σχηματισμού αποικίας

δοκιμασία

Κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης υπέστησαν πέψη σε ένα ενιαίο-κυτταρικό εναιώρημα με ένα διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Gibco, USA) και στη συνέχεια 2 ml του κυτταρικού εναιωρήματος εμβολιάστηκε πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων (Corning, USA) σε πυκνότητα 200 κύτταρα /ml. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βαϊκαλεΐνη (0,6,12, και 24μmol /L) για 48 ώρες και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 15 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και χρωματίζονται με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma-Aldrich). Μετά την πλύση, οι πλάκες ξηραίνονται στον αέρα και ψηφιακές εικόνες λήφθηκαν από χρωματίστηκαν απλών κλώνων που παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο (Leica, Germany). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν επί πολλές ημέρες.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βαϊκαλεΐνη (0,30,60 και 120μmol /L) για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 70% αιθανόλη και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά με 10 mg /ml RNase και 1 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich). DNA ανάλυση περιεχομένου έγινε με κυτταρομετρία ροής (BD, San Diego, USA). Το ποσοστό των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με τη χρήση του λογισμικού Cell Quest απόκτηση (BD Biosciences).

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κυτταρικής απόπτωσης

Η δοκιμασία ιωδιούχο αννεξίνης V /προπίδιο διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Invitrogen, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Corning, USA) και επωάστηκαν για 48 ώρες με βαϊκαλεΐνη (0,30,60, και 120μmol /l). Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια πλύθηκαν με ψυχρό PBS, φυγοκεντρήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης που περιέχει 2.5 μΐ FITCconjugatedannexin-V και 1 μΐ 100 μg /ml ΡΙ και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Συνολικά, τουλάχιστον 10 000 εκδηλώσεις συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD, San Diego, USA).

Ανίχνευση των μορφολογικών απόπτωσης με Hoechst 33342 χρώση

Μετά τη θεραπεία με βαϊκαλεΐνη (0 , 30,60, και 120μmol /L) για 48 ώρες, τα κύτταρα GBC-SD πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη: οξικό οξύ (3: 1) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με 5 μg /ml του Hoechst 33342 λεκέ για 10 λεπτά. Αλλαγές στους πυρήνες των κυττάρων μετά από χρώση με Hoechst 33342 παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Γερμανία).

Η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

GBC-SD3 × 10

4 κύτταρα και SGC996 1 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σχετικά με τη μη επικαλυμμένη μεμβράνη στην κορυφή του θαλάμου (Corning, ΗΠΑ). Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Μέσο που περιέχει 10% FBS τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο για να ενεργεί ως χημειοελκτικό. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις βαϊκαλεΐνη (0, 7,5, 15, 30, 60 μmol /L) σε απαλλαγμένο από ορό μέσο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες? κύτταρα που δεν εισβάλλουν μέσα από τους πόρους απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω 8,0 μm μεμβρανών πολυανθρακικού στην κατώτερη επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν με 10% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Μεταναστεύοντα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας χρωματισμένα κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο (χ 200) σε πέντε τυχαία πεδία για κάθε φρεάτιο. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. δοκιμασίες Εισβολή διεξήχθησαν με παρόμοιο τρόπο με τις δοκιμασίες μετανάστευσης, εκτός από το ότι τα ένθετα προεπικαλύφθηκαν με Matrigel (BD, ΗΠΑ).

In vitro επούλωσης πληγής δοκιμασία

κύτταρα GBC-SD αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 /mL και αναπτύχθηκαν σε συρροή. Πληγή δημιουργήθηκε με απόξεση συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων με ένα ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν εκτεταμένα με μέσο για να απομακρυνθεί το κυτταρικό απόρριμμα πριν την επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 7,5, 15, και 30 μπιοί /L) του βαϊκαλεΐνη σε FBS στερούνται κατάσταση. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες και εικόνες των μετανάστευσαν κύτταρα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Leica, Germany).

αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR)

Ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA στις πειραματικές ομάδες. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία GBC με βαϊκαλεΐνη (15, 30, 60 και 120 μmol /L) για 48 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNA εύκολο κιτ (Invitrogen, USA). Ο πρώτος κλάδος cDNA συντέθηκε από 500 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα PrimeScript ανάστροφης μεταγραφάσης (TaKaRa, Ιαπωνία). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 20 μΙ συμπεριλαμβανομένων 2 cDNA μλ. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής: ΜΜΡ9 (εμπρός-5′-TGT ACC GCT ATG ΟΤΤ ACA CTC G-3 ‘, αντίστροφη-5′-GGC ΑΓΓ GAC AGT TGC TTC Τ-3′), ΜΜΡ2 (εμπρός-5′ AAC TAC GAT GAT GAC ΚΕΔ Α.Ε.Ε. »? αντίστροφη-5’-GAC AGA CGG ΑΑΟ TTC TTG ΟΤΟ 3 ‘), ZFX (εμπρός-5′-TGT GGA ΟΤΟ ΤΟΟ ΤΑΑ GGG ΤΤΤ Τ’? αντίστροφη-5′-ACT GGT ΟΤΟ ΤΤΤ TGC ΤΤΤ CTT G-3 ‘), και GAPDH (εμπρός-5′-AAG CTC ΑΤΤ TCC TGG ΤΑΤ GACA-3′, αντίστροφη-5’-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3 ‘). Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 95 ° C για 30sec που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 34 δευτ. Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό γονίδιο αναφοράς για την εξομάλυνση της έκφρασης των αποπτωτικών γονιδίων. Σχετική ποσοτικοποίηση των γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση αναλύθηκε με τη μέθοδο συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct). Για κάθε δείγμα, η τιμή Ct των αποπτωτικών γονιδίων ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: ΔCt = Ct (αποπτωτικών γονιδίων) – Ct (GAPDH). Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης, ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε: ΔΔCt = ΔCt (θεραπεία) – ΔΟΙ (ελέγχου). Η αξία χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιαστεί η έκφραση των αποπτωτικών γονιδίων χρησιμοποιώντας τον τύπο 2-ΔΔCt.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις βαϊκαλεΐνη (0, 15, 30, 60 και 120 μmol /l) για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα ρυθμιστικό δείγματος, που ακολουθείται από μετουσίωση. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας δικιγχονινικού οξέος (Beyotime, Κίνα) με BSA σαν πρότυπο. Ίσες ποσότητες (80 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα) του συνόλου των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (8%, 12% πηκτώματα) υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες μετά μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και επωάστηκαν withanti-κασπάσης-3, αντι-ΒοΙ-2, αντι-Βαχ, αντι-PARP, αντι-ρ53, αντι-κυκλίνη, αντι-cyclinB1, αντι-cyclinD1, αντι- ΜΜΡ2, αντι-ΜΜΡ9, αντι-ZFX αντισωμάτων, αντίστοιχα (1: 1000? Cell Signaling Technology) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Αυτό ακολουθήθηκε από μια επώαση με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού /αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (1: 5000? Abcam). Ένας ίσος φόρτωση του κάθε λωρίδα εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση τις ίδιες μεμβράνες με αντισώματα β-ακτίνης μετά την απόσπαση των προηγούμενων πρωτογενή αντισώματα. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν και οι οπτικές πυκνότητες των ζωνών σαρώθηκαν και ποσοτικά με το Doc Gel 2000 (BioRad, USA).

In vivo όγκου μελέτη ξενομόσχευμα

Έξι εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντίκια (με αρχικό σωματικό βάρος 20-22 g) ελήφθησαν από τη Σαγκάη SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα) και στεγάστηκαν κάτω από συνθήκες ελεύθερες παθογόνων με ελεγχόμενη θερμοκρασία (22 ° C), υγρασία, και ένα 12 ώρες φωτός /σκότους. Τροφή και νερό είχαν ad libitum τη διάρκεια του πειράματος. SGC996 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ξενομοσχεύματα όγκων και αναπτύσσονται σε καλλιέργεια και έπειτα αποσπάται με αγωγή με θρυψίνη, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε RPMI1640 ελεύθερο ορού. Κάθε ένα από τα αθυμικών γυμνών ποντίκι υποδόρια ένεση του 1 × 10

6 κυττάρων ina όγκο 100 ul στη σωστή περιοχή πλευρό να ξεκινήσει την ανάπτυξη του όγκου. Μετά SGC996 εμβολιασμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (5 ποντικοί /ομάδα). Μία ομάδα υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα (10% DMSO και 90% προπυλενογλυκόλη) ενδοπεριτοναϊκώς, και η άλλη ομάδα received0.4mg /ποντικό ενδοπεριτοναϊκώς βαϊκαλεΐνη για 9 φορές. Κατά την 21η ημέρα, τα ζώα θυσιάστηκαν, και ο ιστός του όγκου αφαιρέθηκε και ζυγίστηκε.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD και αναλύθηκαν με του φοιτητή

t-test

τη χρήση του SPSS έκδοση 13.0 του λογισμικού. Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Επίδραση του βαϊκαλεΐνη στη βιωσιμότητα και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων της χοληδόχου κύστης in vitro και in vivo

Τα αποτελέσματα της βαϊκαλεΐνη στην ανάπτυξη των ανθρώπινων GBC-SD και SGC996, δύο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη κυτταρικές σειρές του καρκίνου της χοληδόχου κύστης,

in vitro

ελέγχθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2 (Α), μετά από θεραπεία για 24, 48, και 72 ώρες, βαϊκαλεΐνη προκάλεσε τη δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στην βιωσιμότητα τόσο της GBC-SD και SGC996 κυττάρων, όπως αναλύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2 (Β) & amp? (Γ), η ικανότητα της GBC-SD και SGC996 κύτταρα να σχηματίσουν αποικίες με την παρουσία βαϊκαλεΐνη ανιχνεύθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας επίπεδη πλάκα. Η καταμέτρηση των αποικιών έδειξε ότι βαϊκαλεΐνη είχε προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην ικανότητα σχηματισμού αποικίας. Τα ευρήματα υποστηρίζουν το γεγονός ότι βαϊκαλεΐνη μπορεί να ασκήσει σημαντική επιρροή στην GBC-SD και τα κύτταρα SGC996 πολλαπλασιασμό. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση της βαϊκαλεΐνη

in vivo

, ελέγξαμε την ογκογονικότητα των κυττάρων καρκινώματος της χοληδόχου κύστης με τη χρήση γυμνών ποντικών μελέτη ξενομόσχευμα όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2 (D), το μέγεθος του όγκου στην ομάδα αγωγής βαϊκαλεΐνη ήταν μικρότερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου.

(Α) GBC-SD και SGC996 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις βαϊκαλεΐνη, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ τις ημέρες 1, 2 και 3. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση ± SD (η = 3). (Β και Γ) βαϊκαλεΐνη κατέστειλε το σχηματισμό αποικιών του GBC-SD και SGC996 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βαϊκαλεΐνη (6, 12, και 24 mmol /L) και αφέθηκαν να σχηματίσουν αποικίες σε φρέσκο ​​μέσο για 14 ημέρες. Η επίδραση των αποικιών (μέση ± SD, η = 3) σε σχηματισμό αποικίας παρουσιάζονται. (D) βαϊκαλεΐνη αγωγή ξενομοσχεύματος όγκοι ήταν πολύ μικρότερες από όγκους ελέγχου. (Ε) Το βάρος των όγκων αποκάλυψε ότι η ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου σε γυμνούς ποντικούς ήταν σημαντικά βραδύτερη σε γυμνούς όγκους βαϊκαλεΐνη αγωγή από όγκους ελέγχου. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001.

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον βαϊκαλεΐνη επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων στην φάση πολλαπλασιασμού G0 /G1 και μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στην φάση S, μετά από 48 ώρες αγωγής με βαϊκαλεΐνη (Εικ. 3 (Α)). Κυκλίνη, ένας G1 /S πρωτεΐνη προώθησης μετάβαση, ήταν εξαρτώμενο από τη δόση αυξήθηκε κατά βαϊκαλεΐνη θεραπεία. Μπορεί να είναι ο λόγος της σύλληψης φάσης S που προκαλείται από βαϊκαλεΐνη. CyclinB1 και cyclinD1 που αντιπροσωπεύουν διαδικασία μετάβασης M /G1 S /G2 και αντίστοιχα, δοσοεξαρτώμενο μειώθηκε κατά βαϊκαλεΐνη θεραπεία (Εικ. 3 (Β) και S5 Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι συλλήψεις βαϊκαλεΐνη ο κυτταρικός κύκλος στη φάση S.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 30, 60, ή 120 μmol /L βαϊκαλεΐνη για 48 ώρες και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, S, G2 και /οι M φάσεις του κυτταρικού κύκλου φαίνεται. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν από την 1η αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3 ανεξάρτητες δοκιμές. (Β) έκφραση της κυκλίνης Β και κυκλίνη D σε κύτταρα GBC-SD και κυκλίνη Α και κυκλίνη D σε SGC996 κύτταρα μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά από θεραπεία με βαϊκαλεΐνη σύγκριση με τον έλεγχο. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001.

Η

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, θα αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της βαϊκαλεΐνη στην απόπτωση σε GBC-SD και SGC996 κύτταρα χρησιμοποιώντας V-FITC και χρώση ιωδιούχου προπιδίου αννεξίνης. Όπως εκτιμάται με κυτταρομετρία ροής και φαίνεται στο Σχ. 4 (Β), μια αξιοσημείωτη δοσοεξαρτώμενη αύξηση τόσο στα πρώιμα και όψιμα στάδια της απόπτωσης ήταν προφανής σε GBC-SD και SGC996 κυττάρων μετά βαϊκαλεΐνη θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

(Α) Τα αποπτωτικά μορφολογικές αλλαγές όπως ως ανώμαλη πυρηνική μορφολογία, μείωση του αριθμού των κυττάρων με σχηματισμό αποπτωτικών σώμα, και συρρίκνωση κυττάρου, που προκαλείται από βαϊκαλεΐνη (30,60 και /L 120 μmol) θεραπεία για 48 ώρες, παρατηρήθηκαν με χρώση Hoechst 33342 σε GBC-SD και κυτταρικές σειρές SGC996 . (Β) Τα κύτταρα επωάστηκαν με βαϊκαλεΐνη (30,60 και 120 μmol /L) για 48 ώρες, ακολουθούμενη από χρώση με αννεξίνη-ν /ΡΙ. Κυτταρική απόπτωση εκτιμήθηκε με την κυτταρομετρία ροής. (Γ) βαϊκαλεΐνη επάγει την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών απόπτωσης που σχετίζονται με GBC-SD και SGC996 κύτταρα. Μετά τη θεραπεία με βαϊκαλεΐνη (0, 15, 30, 60, και 120μmol /L) για 48 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε έναντι Bcl-2, Βαχ, προ-κασπάση-3, Ρ53 και PARP. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001.

Η

Μορφολογικές αλλαγές στα αποπτωτικά κύτταρα αποκάλυψε η χρώση Hoechst 33342, όπως φαίνεται στο Σχ. 4 (Α). Στην χωρίς θεραπεία GBC-SD και SGC996 κύτταρα, οι πυρήνες βάφτηκαν ασθενές ομογενή μπλε, ενώ στην ομάδα που αντιμετωπίστηκε με βαϊκαλεΐνη, φωτεινό συμπύκνωση χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση παρατηρήθηκαν.

Επίδραση της βαϊκαλεΐνη σχετικά με τους παράγοντες που σχετίζονται με την απόπτωση

Για να προσδιορίσετε ποιες πρωτεΐνες ήταν ασχολείται κυρίως με την αποπτωτική διαδικασία βαϊκαλεΐνη που προκαλείται, αναλύσαμε έναν αριθμό που σχετίζονται με την απόπτωση παράγοντες με κηλίδα western. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 4 (C), προ-κασπάσης-3 και Ρ53 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω από βαϊκαλεΐνη θεραπεία. Διασπασμένη PARP ήταν σημαντικά αυξημένη. επίπεδο πρωτεΐνης Bax αυξορρυθμίστηκε, ενώ Το επίπεδο πρωτείνης Bcl-2 ήταν σημαντικά μειωμένη.

Επίδραση του βαϊκαλεΐνη για την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων της χοληδόχου κύστης

Από κύτταρο καρκινώματος της χοληδόχου κύστης μετανάστευση και εισβολή οι συνδέεται με τη μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε διάφορες κυτταρικές δοκιμασίες για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της βαϊκαλεΐνη στο μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων της χοληδόχου κύστης. Για να εξεταστεί η επίδραση της βαϊκαλεΐνη στην κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, εκτελέσαμε δοκιμασία μετανάστευσης χρησιμοποιώντας GBC-SD και SGC996 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5 (Α), κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται από βαϊκαλεΐνη θεραπεία. Επίσης πραγματοποιήσαμε πληγή δοκιμασία επούλωσης να επιβεβαιώσει περαιτέρω την επίδραση αναστολής της βαϊκαλεΐνη για τη μετανάστευση των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5 (C), βαϊκαλεΐνη εμφανώς ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση GBC-SD σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν η επεμβατική δραστηριότητα επηρεάστηκε σε απάντηση βαϊκαλεΐνη, εξετάσαμε την επεμβατική δραστηριότητα μέσω μιας matrigel με επικάλυψη μεμβράνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι βαϊκαλεΐνη μειωθεί δραματικά ο αριθμός των κυττάρων και εισβολή αυτή η αναστολή συνέβη σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 5 (Β)). Επιπλέον, οι ικανότητες πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση περαιτέρω ενισχύεται σε κύτταρα κατεργασμένα με αμφότερα siRNA κατά ZFX και βαϊκαλεΐνη (S4 Εικ.).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 7,5, 15, 30 και 60μmol /L βαϊκαλεΐνη για 12 ώρες πριν στη μετανάστευση (Α) ή δοκιμασία εισβολής (Β). (Γ) μονοστιβάδες κυττάρων τραυματίστηκαν με ξύσιμο με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Η περιοχή κατοχή στην κυτταρική μονοστιβάδα GBC-SD αγωγή με βαϊκαλεΐνη ήταν δοσοεξαρτώμενη μείωση 24 ώρες μετά από το μηδέν. Βαϊκαλεΐνη επηρεάζει την έκφραση του μεταλλοπεπτιδασών μήτρας (MMPs). (D) Η έκφραση του mRNA του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ανιχνεύθηκε με qPCR μετά επεξεργάστηκε με βαϊκαλεΐνη για 48 ώρες. (Ε) Η πρωτεΐνη έκφραση του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ανιχνεύθηκε με κηλίδα western μετά επεξεργάστηκε με βαϊκαλεΐνη για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001.

Η

MMPs είναι γνωστό ότι είναι ζωτικής σημασίας για την αποδόμηση εξωκυττάριας μήτρας συστατικά και για την προώθηση του όγκου κυτταρική εισβολή

in vitro

και

in vivo

. Μετά τη θεραπεία με διαφορετική συγκέντρωση του βαϊκαλεΐνη για 48 ώρες σε GBC-SD και SGC996 κύτταρα, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5 (D & amp?. Ε)).

βαϊκαλεΐνη κάτω ρυθμισμένα Χ-χρωμοσωμικές πρωτεΐνες (ZFX) δακτύλου ψευδαργύρου και έκφραση mRNA σε GBC-SD και SGC996 κύτταρα

προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι knock-down του ZFX θα μπορούσε να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό GBC-SD κυττάρων και τη μετανάστευση. Έτσι είμαστε περίεργοι σχετικά με το αν η επίδραση της βαϊκαλεΐνη σε κύτταρα καρκινώματος της χοληδόχου κύστης είναι συνδεδεμένο με την έκφραση ZFX. κηλίδα Western και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση αποκάλυψε ότι η έκφραση πρωτεΐνης και mRNA του ZFX ήταν δοσο-εξαρτώμενο (Σχήμα 6 (Α & amp?. Β)) μειώθηκε κατά βαϊκαλεΐνη θεραπεία σε GBC-SD και SGC996 κυττάρων και τη μετατόπιση του ZFX εντός πυρήνων καταστάλθηκε από βαϊκαλεΐνη κατεργασία (S2 Εικ.). Η επίδραση της βαϊκαλεΐνη επί της έκφρασης ZFX ήταν ειδική επειδή το επίπεδο έκφρασης της NF-κΒ και STAT3 δεν επηρεάστηκαν από αυτό το μόριο (S1 Εικ.).

(Α και Β) έκφραση ZFX σε GBC-SD και SGC996 κυττάρων που επάγεται από βαϊκαλεΐνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 15, 30, 60 και 120 μmol /L βαϊκαλεΐνη για 48 ώρες, τότε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης και του mRNA του ZFX προσδιορίστηκε με κηλίδα Western (Α) και qPCR (Β). (Γ και Δ) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με ZFX-GFP πλασμίδιο και το πλασμίδιο GFP, αντίστοιχα. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 7,5, 15, 30 και 60 mmol /L βαϊκαλεΐνη για 72 ώρες. ZFX-GFP μπλοκάρει σημαντικά την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων GBC-SD με βαϊκαλεΐνη χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ (C). ZFX-GFP μπλοκάρει σημαντικά την επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων GBC-SD με βαϊκαλεΐνη εκτιμάται από την κυτταρομετρία ροής (D). (Ε και F) 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 60 μmol /L βαϊκαλεΐνη για 24 ώρες. ZFX-GFP μπλοκάρει σημαντικά την αντι-μεταναστευτική και η εισβολή επίδραση των κυττάρων GBC-SD από βαϊκαλεΐνη. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία επούλωσης πληγών (Ε) και η εισβολή των κυττάρων εκτιμήθηκε με transwell δοκιμασίας (F). (G) ZFX-GFP εμπόδισε την έκφραση της PARP, της αναστολής της ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και επάνω ρυθμισμένη την αναλογία του Bcl2 /Bax σε απόκριση βαϊκαλεΐνη. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 60 μmol /L βαϊκαλεΐνη για τα επίπεδα 48h.The πρωτεΐνης PARP, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, Bcl2, Βαχ και ZFX προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001.

Η

Η υπερέκφραση του ZFX απαλλαγεί τη βιωσιμότητα, την απόπτωση και την μετάσταση επίδραση της βαϊκαλεΐνη στα κύτταρα GBC-SD

Επιπλέον, η υπερέκφραση του ZFX (S3 Εικ.) Οδήγησε σε μερική απόφραξη των βαϊκαλεΐνη επαγόμενο πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε κύτταρα GBC-SD (Σχήμα 6 (Γ) & amp?. (Δ)). Κατά συνέπεια, η αναστολή της μετανάστευσης (Εικ. 6Ε) και εισβολή (Σχ. 6F) ικανότητες των κυττάρων με βαϊκαλεΐνη είχαν αξιοσημείωτα αναστραφεί με την υπερέκφραση του ZFX. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του ZFX ανέστειλε σημαντικά βαϊκαλεΐνη επαγόμενη ενεργοποίηση της PARP και αύξησε την αναλογία Bcl2 /Βαχ. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ZFX είχε επίσης ως αποτέλεσμα τον αποκλεισμό του βαϊκαλεΐνη επαγόμενη αναστολή της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 (Σχ. 6 (G)). Έτσι, τα δεδομένα υπέδειξαν ότι η πρωτεΐνη ZFX θα μπορούσαν να συμμετάσχουν σε βαϊκαλεΐνη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων και αντι-μετάσταση σε κύτταρα καρκινώματος της χοληδόχου κύστης.

Συζήτηση

Η μελέτη μας παρέχει ορισμένες νέες πληροφορίες σχετικά με βαϊκαλεΐνη χρησιμοποιούνται στην αντικαρκινική θεραπεία. Η αντικαρκινική δράση του βαϊκαλεΐνη έχει επιβεβαιωθεί σε πολλές άλλες μορφές καρκίνου, αλλά το αντι-πολλαπλασιασμό και μεταστατικές αποτέλεσμα και τον σχετικό μηχανισμό (ες) σε GBC κύτταρα δεν είναι σαφής. Εδώ, δείξαμε τις βιοχημικές και μοριακών μηχανισμών της απόπτωσης και αντι-μεταστατικός επαγωγή με βαϊκαλεΐνη.

Πρώτον, βρήκαμε ότι βαϊκαλεΐνη μπορεί να παίξει ένα σημαντικό ρόλο στην GBC πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

σε vitro

και

in vivo

. Η θεραπεία με βαϊκαλεΐνη οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση στην βιωσιμότητα των καλλιεργημένων GBC-SD και SGC996 κυττάρων και του αριθμού των αποικιών που σχηματίστηκαν αυτά τα κύτταρα. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για την αξιολόγηση του δυνητικού ρόλου των βαϊκαλεΐνη στο

in vivo

ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο. Σημαντική μείωση του μάζας του όγκου παρατηρήθηκε μετά από μία θεραπεία 3 εβδομάδων. Η

in vivo

επίδραση της βαϊκαλεΐνη για GBC όγκους υποστηρίξει σθεναρά βαϊκαλεΐνη ως πιθανό νέο φάρμακο για τη θεραπεία αντι-GBC.

Η επίδραση της βαϊκαλεΐνη κατά τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή της απόπτωσης σε GBC κύτταρα αξιολογήθηκε επίσης. πιστεύεται Τα αποτελέσματα κατά του όγκου των βαϊκαλεΐνη να χρησιμοποιηθούν από επηρεάζοντας σύλληψη στον κυτταρικό κύκλο ή με αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων [31]. Στη μελέτη μας, βαϊκαλεΐνη επάγεται επίσης φάση S διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αναστολή της κυκλίνης Β1, κυκλίνη D1, η προώθηση της κυκλίνης Α σε GBC-SD και SGC996 κύτταρα. Δεδομένου ότι η απόπτωση θεωρείται ως ένας σημαντικός μηχανισμός στην αναστολή του καρκίνου, εκτελέσαμε hoechst33342 δοκιμασία χρώσης, αννεξίνης V /δοκιμασίας ΡΙ, και ανίχνευση της έκφρασης πρωτεΐνης που σχετίζονται με την απόπτωση για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού της βαϊκαλεΐνη απόπτωση. Βαϊκαλεΐνη αξιοσημείωτα προκάλεσε την απόπτωση τόσο GBC-SD και SGC996 κυττάρων, όπως καταδεικνύεται από τις αλλαγές στην πυρηνική μορφολογία, η αύξηση του ποσοστού των αννεξίνης κυττάρων V-χρώση, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αυξημένη έκφραση της διάσπασης του προ-κασπάσης-3, διάσπαση της PARP, Βαχ και μειωμένη έκφραση του Bcl-2 και Ρ53. Πολλά από αυτά τα γονίδια σχετίζονται με το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι. Διάσπαση του προ-κασπάσης-3, η διάσπαση της PARP και τελικά αποικοδόμηση του DNA. πρωτεΐνες Βαχ και Bcl-2, τα οποία ρυθμίζουν την ουσιαστική αλλαγή στην διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης για απόπτωση [32]. Από τα δεδομένα αυτά, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι βαϊκαλεΐνη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων GBC με την ενεργοποίηση της εγγενούς μιτοχονδριακό μονοπάτι.

Εκτός κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων είναι επίσης δύο από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά της κακοήθους συμπεριφοράς των κυττάρων. Για να αποσαφηνιστεί η επίδραση της βαϊκαλεΐνη στην κυτταρική κινητικότητα, μετανάστευση κυττάρου και διεισδυτικότητα προσδιορίστηκαν με μια δοκιμασία μετανάστευσης επούλωσης τραυμάτων και Transwell προσδιορισμού, αντίστοιχα. Από τα δεδομένα αυτά, βρήκαμε ότι βαϊκαλεΐνη θα μπορούσε να καταστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή ικανότητα του GBC-SD και SGC996 κύτταρα. MMPs είναι μια εξαιρετικά ρυθμιζόμενη υπεροικογένεια ψευδαργύρου εξαρτώμενων ενδοπεπτιδασών που αιτιολογικά σχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων [33].