Αφηρημένο

Καρκίνοι έχουν αποκαλυφθεί ότι είναι εξαιρετικά ετερογενής όσον αφορά τη συχνότητα και το είδος των μεταλλάξεων στα κύτταρα από διάφορες κακοήθεις όγκους. Έτσι, είναι πιθανό ότι η ομοιόμορφη κλινική θεραπεία δεν είναι η βέλτιστη για όλους τους ασθενείς, και ότι η ανάπτυξη της εξατομικευμένης θεραπευτικές αγωγές μπορεί να είναι ευεργετική. Περιγράφουμε την παραγωγή πολλαπλών, μοναδικά μικρά πεπτίδια εννέα έως τριάντα-τέσσερα αμινοξέα σε μήκος τα οποία, όταν επισημαίνεται με το ραδιοϊσότοπο

32Ρ, δεσμεύονται με πολύ διαφορετικές αποδόσεις για κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διαφορετικές αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου. Επιπλέον, ο πιο αποτελεσματικός αυτών των πεπτιδίων μεταφέρει μόνιμα το

32Ρ ραδιοϊσότοπο να κυτταρικών πρωτεϊνών ορθοκολικού καρκίνου εντός δύο ωρών σε ένα ποσοστό που είναι περισσότερο από 150 φορές υψηλότερη από ό, τι σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από άλλους καρκίνους ή από φυσιολογικούς ιστούς που ελέγχθηκαν. Επί του παρόντος, οι μόνες δύο FDA-εγκριθεί ραδιοανοσοθεραπευτικές παράγοντες σε χρήση απασχολούν τόσο τα αντισώματα που κατευθύνονται έναντι του CD20 δείκτη Β κυττάρων για τη θεραπεία του λεμφώματος μη-Hodgkin. Με τη χρήση της μεθόδου που περιγράφεται στο παρόν, μεγάλοι αριθμοί διαφορετικών

32Ρ-επισημασμένων πεπτιδίων μπορούν να παραχθούν εύκολα και προσδιορίστηκαν ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα τύπων καρκίνου. Αυτή η έκθεση προτείνει την ανάπτυξη και χρήση των

32Ρ-σημασμένα πεπτίδια ως πιθανούς εξατομικευμένες θεραπείες πεπτίδιο-δεσμευτική για τη θεραπεία των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Αβραάμ JM, Cheng Υ, Hamilton JP, Paun Β, Jin Ζ, Agarwal R, et al. (2008) Δημιουργία Μικρών

32Ρ-επισημασμένα πεπτίδια ως πιθανή προσέγγιση για καρκίνο του παχέος εντέρου θεραπεία. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10.1371 /journal.pone.0002508

Επιμέλεια: Edathara Αβραάμ, του Πανεπιστημίου του Αρκάνσας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24, Απρ 2008? Αποδεκτές: 6η Μαΐου 2008? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2008

Copyright: © 2008 Abraham et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 και 7R21 /R33CA106763 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Πρόσφατες ανακαλύψεις έχουν πειστικά τεκμηριώσει την εκτεταμένη γενετική ετερογένεια μεταξύ των ανθρώπινων καρκίνων, κυρίως του παχέος όγκους, από την ίδρυση της ύπαρξης ενός μικρού αριθμού συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο «βουνά» και πολύ μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων «λόφους» μεταλλαγμένη σε πολύ χαμηλότερες συχνότητες [1], [2]. Αυτός ο υψηλός βαθμός ποικιλομορφίας μεταξύ των ανθρώπινων καρκίνων του παχέος υποδηλώνει ότι εξατομικευμένες στρατηγικές θεραπείας υπόσχονται πολλά για την επιτυχή κλινική παρέμβαση. Αρκετοί αντικαρκινικοί ανοσοθεραπείες είναι σήμερα σε χρήση, συμπεριλαμβανομένων Herceptin, Rituxin, και Avastin, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι VEGF (αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας) που έχει εγκριθεί για τον ορθοκολικό καρκίνο θεραπεία [3] – [9].

Ραδιοανοσοθεραπεία (RIT) είναι μια αναδυόμενη τεχνολογία με την μέχρι τώρα μόνο δύο FDA-εγκεκριμένα πρωτόκολλα, τόσο στρέφεται κατά του λεμφώματος μη-Hodgkin λέμφωμα (NHL). Κάθε πρωτόκολλο χρησιμοποιεί ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι του δείκτη των Β-κυττάρων CD20 και μπορεί να παραδώσει

90Y (Zevalin) ή

131I (Bexxar), καθένα από τα οποία παράγει ηλεκτρόνια (σωματίδια βήτα) ότι το DNA βλάβη, οδηγώντας σε κυτταρικό θάνατο [10], [11]. Επί του παρόντος, δεν RIT έχει ακόμη εγκριθεί για τη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου [12].

Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα μια σειρά εννέα διαφορετικών δεκαπεπτιδίων, το καθένα διαφορετικό από τα άλλα με μόνη τρία αμινοξέα, τα οποία όταν επισημασμένο με το βήτα-εκπομπό

32Ρ, συνδέεται προς και μόνιμα παραδοθεί, σε διάφορους βαθμούς, αυτό το ραδιοϊσότοπο να κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ένα πάνελ διαφορετικών παχέος αδενοκαρκινώματα [13]. Ο πιο αποτελεσματικός

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτιδίου οδήγησε σε μόνιμη ενσωμάτωση του ραδιοϊσοτόπου σε κυτταρικές πρωτεΐνες αδενοκαρκινώματος κόλου σε ποσοστό πάνω από 100 φορές μεγαλύτερη σε σχέση με κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μια ποικιλία άλλων καρκίνων ή από φυσιολογικό κόλον, του νεφρού ή του οισοφάγου.

Εδώ, αναφέρουμε μια κατηγορία ελαφρώς μεγαλύτερα πεπτίδια (έως 34 αμινοξέα μακρύ) που περιέχουν ευρέως ανόμοιες πεπτιδικές αλληλουχίες, καταλήγοντας σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικής σύνδεσης και ραδιοϊσότοπο ιδιότητες πρόσληψης. Κάθε πεπτίδιο 34 αμινοξέων περιέχει ένα πυρήνα εννέα αμινοξέων στο αμινο άκρο του να δώσει

επισήμανσης 32Ρ από την κινάση πρωτεΐνης Α, ένας πυρήνας οκτώ αμινοξέος στο άκρο καρβοξύ του, και μέχρι 17 επιπλέον αμινοξέα τα οποία μεταβάλλουν δραματικά τόσο δεσμευτική του σε κύτταρα και μόνιμη ενσωμάτωση του ραδιοϊσοτόπου σε κυτταρικές πρωτεΐνες του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω διερεύνηση αυτής της στρατηγικής για την ανάπτυξη πιθανών νέων εξατομικευμένες θεραπευτικές αγωγές εναντίον των καρκίνων του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Παραγωγή

32Ρ-σημασμένα πεπτίδια και δεσμευτική για την άνω και κάτω τελεία αδενοκαρκινώματος κύτταρα

Προηγουμένως, αναφέραμε την ανακάλυψη εννέα διαφορετικές

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτίδια, το καθένα διαφορετικό από το ένα το άλλο με μία μόνο προς τρία αμινοξέα, που έδειξαν ευρέως ανόμοιες ικανότητες να προσδένονται και να ραδιοϊσότοπο μεταφορά μόνιμα με τις πρωτεΐνες σε κυτταρικές γραμμές εγκατεστημένος από ένα πάνελ αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου. Ο πιο αποτελεσματικός από αυτά τα

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτίδια μόνιμα παραδοθεί ραδιοϊσότοπο με τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα περισσότερο από 100 φορές πιο αποτελεσματικά από ό, τι σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από άλλους καρκίνους ή φυσιολογικούς ιστούς που ελέγχθηκαν. Εδώ, αναφέρουμε την παραγωγή και την ταυτοποίηση μιας νέας σειράς πεπτιδίων, μέχρι 34 αμινοξέα σε μήκος, του οποίου η αλληλουχίες αμινοξέων να αλλάξει δραματικά την ικανότητά τους να συνδέονται με και μόνιμα τη διευκόλυνση

ενσωμάτωση 32Ρ μέσα σε κύτταρα. Το Σχήμα 1 είναι μια σχηματική αναπαράσταση του πειραματικού σχεδιασμού, που απεικονίζει την κλωνοποίηση ενός θραύσματος DNA που περιέχει 17 που δημιουργείται τυχαία κωδικόνια στην θέση περιοριστικού ενζύμου BamHI του ρΟΕΧ-2ΤΚ. Μετά από βακτηριακή μεταμόρφωση, επιλέχθηκαν και επεκτάθηκαν για να παράγουν ένα διαφορετικό σύνολο των

32Ρ-σημασμένα πεπτίδια μεμονωμένων κλώνων. Εάν δεν κωδικόνια τερματισμού ήταν παρόντες στην τυχαία αλληλουχία DNA, στη συνέχεια, ένα πεπτίδιο 34-υπολειμμάτων δημιουργήθηκε, που πλαισιώνεται στο αμινο άκρο του από την πρωτεΐνη 9-υπολειμμάτων κινάσης Α μοτίβο επισήμανση και στο καρβοξυ-άκρο της από μία αλληλουχία 8-καταλοίπων. Όπως ήταν αναμενόμενο, σε διάφορους κλώνους, ένα κωδικόνιο στοπ εισήχθη, με αποτέλεσμα κολοβωμένο πεπτίδια? Ωστόσο, όλες αυτές οι κολοβωμένες πεπτίδια περιείχαν την πρωτεΐνη κινάσης Α χαρακτηριστική ομάδα υπόστρωμα. Αυτές οι ποικίλες πεπτίδια επωάστηκαν με αρκετές διαφορετικές κυτταρικές σειρές για δύο ώρες, προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές, και η ραδιενέργεια που παραμένει δεσμευμένη στα κύτταρα προσδιορίστηκε είτε αμέσως, είτε μετά από ολονύκτια επώαση σε πλήρες μέσο.

Ένα PCR προϊόν που περιέχει 17 τυχαία κωδικόνια εισήχθη στη θέση BamHI του ρΟΕΧ-2ΤΚ παραγωγή διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης που συνδέεται προς γλουταθειόνη-σεφαρόζη, και σημάνθηκαν με

32Ρ χρησιμοποιώντας κινάση πρωτεΐνης Α Μετά από πλύσιμο και θρομβίνη πέψη, το επισημασμένο πεπτίδια επωάστηκαν με διάφορες διαφορετικές κυτταρικές γραμμές και εξετάσθηκαν.

η

το σχήμα 2 δείχνει τη δραματική διακύμανση των επιπέδων των μόνιμων

32Ρ ενσωμάτωση στην γραμμή αδενοκαρκινώματος κόλον Caco2 μετά το πλύσιμο και τη διάρκεια της νύχτας μέσο επώασης. Έχουμε προηγουμένως έδειξε ότι τα κύτταρα πρόσδεσης με επιτυχία δεκαπεπτίδια μετά από δύο ώρες επώασης απελευθερώνεται μέχρι το 88% των αρχικά τους δεσμεύονται

32Ρ σε μέσο μετά από ολονύκτια επώαση, αλλά εξακολουθεί να ενσωματώνεται μόνιμα υψηλά επίπεδα ραδιοϊσοτόπων σε πρωτεΐνες τους. Οι δεκαεννέα διαφορετικών πεπτιδίων στο Σχήμα 2 ορίζεται MA (τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό) 10 έως 28. Έντεκα από αυτά τα 19 περιέχουν πλήρη ένθετα 17-υπολειμμάτων, με ΜΑ18 μόνιμη μεταφορά

32P στα κύτταρα Caco2 πάνω από 37 φορές πιο αποτελεσματικά από ό, τι MA26. Ο πιο αποτελεσματικός ενσωμάτωση μόνιμων ραδιοϊσότοπο σε κύτταρα Caco2 εμφανίστηκαν μετά από επώαση με MA27, το οποίο περιέχει μόνο μία τυχαία παρεμβάλλονται αμινοξέος ανοδικά ενός κωδικονίου στοπ. Πεπτίδια MA16 και ΜΑ 17 κωδικοποιούνται από το αρχικό ανασυνδυασμένο φορέα έκφρασης, οδηγώντας σε χαμηλά επίπεδα ενσωμάτωσης ραδιοϊσοτόπου.

Διαφορετικές

32Ρ-επισημασμένων πεπτιδίων επωάστηκαν για δύο ώρες με 10000 κύτταρα Caco2, πλύθηκαν τρεις φορές, και επωάζονται σε πλήρες μέσο για 24 ώρες. Η ποσότητα του

32Ρ ραδιοϊσότοπο που παρέμεινε μόνιμα ενσωματωθεί κυτταρικές πρωτεΐνες παρουσιάζεται ως ποσοστό της πρόσληψης της ποσότητας του πεπτιδίου προστέθηκε σε κάθε κυτταρική καλλιέργεια καλά (μέση τιμή συν μία τυπική απόκλιση). Ο αριθμός των αμινοξέων που υπάρχουν σε κάθε ένθετο φαίνεται και κυμαίνεται από 0 έως 17 αμινοξέα. Η αλληλουχία αμινοξέων της κάθε ένθετο εμφανίζεται κάτω από το επίπεδο του

32Ρ ενσωμάτωση αποδίδεται σε κάθε ένθετο.

Η

Οπτικοποίηση της

32Ρ ενσωμάτωση με αυτοραδιογραφία γέλης

Τέσσερα πεπτίδια που δείχνει τα μέσα επίπεδα ενσωμάτωσης ραδιοϊσοτόπου επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη? Οι προσδιορισμοί εις τριπλούν φρεατίων αυτών των πεπτιδίων που εμφανίζονται στην Εικόνα 3. ένθετο Peptide MA11 περιείχε τρία κατάλοιπα ανοδικά ένα κωδικόνιο στοπ, έχοντας σαν αποτέλεσμα ένα πεπτίδιο μόνο 12 αμινοξέα σε μήκος. Παρά το σχετικά μικρό μήκος του, αυτό το κολοβωμένο πεπτίδιο μεταφέρθηκε

32Ρ σε κύτταρα Caco2 215 φορές πιο αποτελεσματικά από ό, τι στο αυχενικό προέρχεται όγκου κυτταρική γραμμή HeLa σε δύο ώρες. Μετά από πλύση και ολονύκτια επώαση σε μέσο, ​​ραδιενέργεια που κατακρατήθηκε από τα κύτταρα Caco2 ήταν περισσότερο από 150 φορές μεγαλύτερη από εκείνη που διατηρούνται από τα κύτταρα HeLa. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, τα περισσότερα

32Ρ δεσμεύεται με κύτταρα Caco2 ήταν παρόντα σε ένα χαμηλού μοριακού βάρους συστατικό (LMW) (

έντονο βέλος

) στις 2 ώρες, αλλά σε 24 ώρες το μεγαλύτερο μέρος αυτής της ραδιενέργειας είχε ενσωματωθεί σε αρκετές διαφορετικές κυτταρικές πρωτεΐνες.

Τέσσερα από τα ΜΑ (τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό)

32Ρ-πεπτίδια φαίνεται στο Σχήμα 2 επωάστηκαν με τριπλές εκβαθύνσεις Caco2 κύτταρα HeLa ή για δύο ώρες. Μετά την πλύση, 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πηκτώματος προστέθηκαν και τα περιεχόμενα έτρεξαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές (που ορίζεται ως «2 ώρες»). Ταυτόσημα φρεάτια είχαν πλήρες μέσο προστίθεται αμέσως μετά το στάδιο πλύσης και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες, και τα περιεχόμενα στη συνέχεια καλά τρέχουν σε πήγματα (που ορίζεται ως «24 ώρες»). Film αναπτύχθηκε μετά ολονύκτια έκθεση που δείχνει την προφανή μόνιμη ενσωμάτωση του

32Ρ σε κυτταρικές πρωτεΐνες στις 24 ώρες (που σημειώνεται με * στον πίνακα MA11). Peptide MA11 δεσμεύεται 215 φορές μεγαλύτερη ευκολία σε κύτταρα Caco2 από τα κύτταρα HeLa σε δύο ώρες, και 150 φορές μεγαλύτερη ευκολία στις 24 ώρες. Peptide MA20 δεσμεύεται καλά και στα δύο κύτταρα Caco2 και HeLa σε δύο ώρες, αλλά μόνο τα κύτταρα Caco2 φάνηκε να κατέχουν τον κυτταρικό μηχανισμό που απαιτείται για την ενσωμάτωση

32Ρ σε κυτταρικές πρωτεΐνες. Το λεπτό βέλος δείχνει τη θέση του

32Ρ-σημασμένο πεπτίδιο, ενώ το έντονο βέλος δείχνει τη θέση ενός σχετικά χαμηλού μοριακού βάρους σημασμένο ενδιάμεσο που δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα HeLa.

Η

Παρόμοιες αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για τα πεπτίδια MA15 και MA22, δύο από τα οποία περιείχαν ένθετα 17-υπολειμμάτων για συνολικό μήκος 34 αμινοξέα, και δύο από τα οποία ενσωματώνονται 23 φορές περισσότερα

32Ρ μέσα σε κύτταρα Caco2 από σε κύτταρα HeLa μετά από ολονύκτια επώαση (Σχήμα 3). Για άλλη μια φορά, τόσο MA15 και MA22 παρουσίασαν έντονα ραδιενεργών μπάντα LMW (

έντονο βέλος

) στις 2 ώρες που είχαν σχεδόν εξαφανιστεί εντελώς σε 24 ώρες, με ενσωμάτωση του υπόλοιπου

32Ρ σε κυτταρικές πρωτεΐνες. Αρχικά, υποθέτουμε ότι αυτή η μπάντα LMW δει σε 2 ώρες (

έντονα βέλος

) εκπροσωπείται άθικτο δεσμεύεται

32Ρ-σημασμένο πεπτίδιο. Ωστόσο, τα πεπτίδια 34 αμινοξέων MA15 και MA22 προσδιορίζονται αυτά ανέπαφη πρόδρομοι πεπτίδιο 34-aa, όπως διακρίνεται από την έντονη μικρότερες μπάντα MW (

έντονα βέλη

). Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η μικρότερη ζώνη ήταν μια ταχέως επεξεργασία μικρή ενδιάμεσο μόριο, το οποίο μειώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια των εξασφαλίζοντας 24 ώρες κατά τη διάρκεια της οποίας είχε ενσωματωθεί στις κυτταρικές πρωτεΐνες η

32Ρ.

Το πεπτίδιο MA20 περιείχε επίσης ένα ένθετο 17-υπολείμματος. Αυτό το πεπτίδιο ήταν ιδιαίτερα αξιοσημείωτη, δεδομένου ότι ήταν η μόνη δοκιμή που ήταν σε θέση να συνδέεται με μία γραμμή κυττάρων που δεν προέρχονται από αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και υπό την προϋπόθεση κλειδί στοιχεία που δείχνουν ένα πιθανό μηχανισμό κυτταρικής επεξεργασίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, MA20 δεσμεύεται σε υψηλά επίπεδα τόσο Caco2 και σε κύτταρα HeLa σε δύο ώρες. Ωστόσο, η ζώνη LMW (

έντονο βέλος

) παρατηρήθηκε με τα άλλα τρία πεπτίδια στο Σχήμα 3 ήταν ορατή μόνο με κύτταρα Caco2, αλλά όχι με κύτταρα HeLa. Μετά το πλύσιμο και ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα Caco2 φαίνεται να έχουν επεξεργαστεί την ενδιάμεση ζώνη LMW (

έντονα βέλος

) σε κυτταρικές πρωτεΐνες, ενώ τα κύτταρα HeLa προφανώς δεν είχαν τη δυνατότητα να ολοκληρώσει αυτό το επόμενο βήμα (

δηλαδή

, δεν ραδιενεργά κυτταρικών πρωτεϊνών σε αυτά τα MWs οπτικοποιήθηκαν, και όλα HeLa δεσμευμένη ραδιενέργεια ήταν ακόμα στο ίδιο μοριακό βάρος όπως το αρχικά δεσμεύεται

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου (

λεπτό βέλος

)). Οι δύο ζώνες (

λεπτό βέλη

, πρώτη λωρίδα της MA20 και τζελ MA22) ήταν το αποτέλεσμα της επώασης

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου σε μέσο που περιέχει ορό για δύο ώρες στους 37 ° C, και όπως αποδείχθηκε εμφανής μερική πρωτεόλυση του πεπτιδίου κατά τη διάρκεια αυτού του χρόνου.

Μόνο κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου επεξεργάζονται δεσμευμένη ραδιενέργεια σε κυτταρικές πρωτεΐνες

Σχήμα 4 παρουσιάζει τα αποτελέσματα της επώασης πεπτιδίων MA11, MA20 και MA22 με επτά διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκινώματος σε 2 ώρες και μετά από ολονύκτια επώαση. Πεπτίδια MA11 και MA22 παρουσίασαν ισχυρή δεσμευτική και μεταφορά

32Ρ μόνο στις τρεις γραμμές αδενοκαρκινώματος κόλου (Caco2, HCT116, και HCT15) και να μην του τραχήλου της μήτρας (HeLa), ινοσάρκωμα (1080), του παγκρέατος ή των πνευμόνων κύτταρα αδενοκαρκινώματος. MA20, αντίθετα, δεσμευμένη με μεγάλη προσοχή σε όλες τις επτά κυτταρικές σειρές, αλλά η ραδιενέργεια του υπέστη επεξεργασία στο συγκρότημα LMW (

έντονο βέλος

) και αργότερα σε κυτταρικές πρωτεΐνες μόνο από τις γραμμές αδενοκαρκινώματος τρία κόλου (Caco2, HCT116, και HCT15). κύτταρα HCT116 δεσμεύεται με συνέπεια, καθώς και μεταποιούνται σε μεγαλύτερες-MW ζώνες, ραδιενέργεια και από τις τρεις

32Ρ-σημασμένα πεπτίδια (MA11, MA20, και MA22) σε πολύ χαμηλότερο ρυθμό από ό, τι Caco2 και HCT15 κύτταρα, αλλά ενσωμάτωση σε HCT116 κυτταρική πρωτεΐνες ήταν τελικά ορατό στο πλέον ανοίγματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι

32Ρ-επισημασμένων πεπτιδίων MA11, MA20 και MA22 επωάστηκαν με επτά διαφορετικές κυτταρικές γραμμές, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3. MA11 και MA22 συνδεδεμένο με και είχε

32Ρ ραδιοϊσότοπο ενσωματώνεται μόνιμα από τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται τρεις αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. MA20 συνδέονται σε σημαντικό βαθμό όλες τις επτά κυτταρικές γραμμές, των οποίων το ένα προέρχεται από παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και ένα που προέρχεται από ένα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, αλλά είχε σημαντικά επίπεδα

32Ρ ενσωματώνεται μόνιμα στο κυτταρικών πρωτεϊνών μόνο από τις τρεις αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου. Η

λεπτό βέλος

δείχνει τη θέση του

32Ρ-σημασμένο πεπτίδιο, ενώ το

έντονο βέλος

υποδεικνύει τη θέση του ενός σχετικά χαμηλού μοριακού βάρους σημασμένο ενδιάμεσο που παρατηρήθηκε μόνο σε αδενοκαρκίνωμα κόλου κύτταρα.

Η

μη-φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο συναγωνίζεται με

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου για δέσμευση σε κύτταρα Caco2

Το πεπτίδιο 12-aa MA11 συντέθηκε χημικά, επισημαίνεται με

32Ρ, και χρησιμοποιούνται σε μία δοκιμασία ανταγωνιστικής πρόσδεσης με κύτταρα Caco2 κατά ποικίλες ποσότητες κρύο, μη φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο MA11. Το Σχήμα 5 απεικονίζει ότι η φωσφορυλίωση του πεπτιδίου αυτού δεν όφειλε να ανταγωνίζεται επιτυχώς για την πρόσδεση στα κύτταρα Caco2, και ότι αυξανόμενες ποσότητες κρύου ανταγωνιστή ανέστειλε ταχέως την ποσότητα του

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου που συνδέεται προς τα κύτταρα.

σε κάθε φρεάτιο που περιέχει κύτταρα Caco2 προστέθηκε 0.005 μg

32Ρ-σημασμένο πεπτίδιο MA11 και την ένδειξη της ποσότητας, του κρύου, μη φωσφορυλιωμένη MA11. Μετά από μία ώρα επώασης, τα προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν και προσδιορίστηκε τα δεσμευμένα ραδιενεργά μετράει.

Η

Συζήτηση

Δεκαεννέα διαφορετικά μικρά πεπτίδια έως και 34 αμινοξέα σε μήκος έχουν παραχθεί με ανασυνδυασμό, το καθένα που περιέχει ένα ένθετο έως 17 υπολείμματα μακρά, η οποία μπορεί να επισημανθεί σε μια διατηρημένη υπόστρωμα εννέα αμινοξέων χρησιμοποιώντας

32Ρ και της πρωτεϊνικής κινάσης Α Αυτές

32Ρ-επισημασμένο πεπτίδια συνδέονται με μοναδικές συγγένειες σε κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν από διαφορετικές αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και μόνιμα μεταφέρει ραδιοϊσότοπο να κυτταρικών πρωτεϊνών μετά από δύο ώρες επώασης. Τα πιο αποτελεσματικά δέσμευσης πεπτιδίων ως αποτέλεσμα τη μόνιμη πρόσληψη

32Ρ από καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου πάνω από 150 φορές υψηλότερη από ό, τι από κυτταρικές σειρές που προέρχονται από άλλους καρκίνους ή φυσιολογικούς ιστούς. Επιπλέον, ένας

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου δεσμεύεται σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, αλλά

32Ρ υποβλήθηκε σε επεξεργασία και να ενσωματωθεί οριστικά μόνο από κυτταρικές σειρές που προέρχονται από αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου, πράγμα που σημαίνει ότι μόνο αυτό το είδος των καρκινικών κυττάρων, διαθέτει το αναγκαίο για μηχανήματα αυτό το στάδιο της επεξεργασίας. Τα δεκαεννέα διαφορετικά πεπτίδια φαίνεται στο Σχήμα 2 επελέγησαν από μία αρχική διαλογή πίνακα που περιέχει μόνο 25 πεπτίδια. Αυτή η απροσδόκητα υψηλό ποσοστό απόκτηση επιτυχή πεπτιδίων αυξάνει την πιθανότητα ότι αυτή η στρατηγική για την ανάπτυξη εξατομικευμένων θεραπειών θα είναι εφικτή. Τέλος, μια ανάλυση ανταγωνιστικής σύνδεσης χρησιμοποιώντας κρύο και

32Ρ-σημασμένο συνθετικό πεπτίδιο MA11 απέδειξαν ότι το μη φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο ανταγωνίζεται πολύ αποτελεσματικά ως προς τη δέσμευση σε κύτταρα Caco2.

Πιο σήμερα εγκεκριμένο καρκίνος ανοσοθεραπευτικό σχήματα χρησιμοποιούν ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι μια γνωστή κυτταρική μόριο και μπορεί επίσης να συνδέεται με ένα μέσο όγκο εκτομής, όπως ένα ραδιοϊσότοπο ή μια τοξίνη [14] – [18]. Μόνο δύο ραδιοανοσοθεραπευτικές (RIT) θεραπείες είναι σήμερα εγκεκριμένη από την FDA? και οι δύο στρέφονται κατά του λεμφώματος μη-Hodgkin αξιοποιώντας

131I (Bexxar) ή

90Y (Zevalin) μέσω της δραστηριότητας των κυττάρων-θανάτωσης των εκπεμπόμενων ηλεκτρονίων.

32Ρ ραδιοϊσότοπο είναι ένας καθαρός βήτα πομπός, και όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, έχει πολλές ιδιότητες που συγκρίνονται ευνοϊκά με

131I και

90Y, εκτός του ότι είναι άμεσα διαθέσιμη και σχετικά φθηνή. Ένα πλεονέκτημα της χρήσης σωματιδίων βήτα για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα είναι ότι η σειρά πορεία τους αποτελεσμάτων έως 5 mm σε ένα μεγάλο αριθμό κυττάρων που διαπερνάται από κάθε ηλεκτρόνιο, οδηγώντας σε ένα σωρευτικό «φαινόμενο γειτνιάσεως» λόγω διασταυρούμενα πυρά από γειτονικά επισημασμένα κύτταρα.

Μια πολύ ενεργή περιοχή της βιοϊατρικής έρευνας εστιάζεται στην σύζευξη των ραδιοϊσοτόπων με πεπτίδια, όπως επίσης και η χρήση της σε διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές [19] – [22]. προτεινόμενη εφαρμογή μας

32Ρ-επισημασμένο μικρά πεπτίδια στην θεραπεία σύνδεσης πεπτιδίου προτείνει μια σειρά από πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών RIT βασίζεται σε μονοκλωνικά αντισώματα. Για παράδειγμα, τα μικρότερα θεραπευτικά μόρια αναμένεται να παρέχει την καλύτερη διείσδυση του όγκου, και το μέσο μικρό πεπτίδιο μοριακό βάρος μικρότερο από 4.000 Da είναι λιγότερο από 3% του μεγέθους ενός μορίου αντισώματος. [23] Ραδιενεργά αλογόνα όπως

131I μπορεί να επεξεργαστεί και να απελευθερώνονται πρόωρα από τα κύτταρα, ενώ το

32Ρ που παραδίδονται από αυτά τα μικρά πεπτίδια ενσωματώνεται μόνιμα στο καρκινικό κύτταρο πρωτεΐνες [24]. Ένα μικρό πεπτίδιο είναι λιγότερο πιθανό να υποκινήσει τον τύπο της απόκρισης αντι-πρωτεΐνη ξενιστή που μπορεί να αναπτυχθεί κατά τη χρήση των πολύ μεγαλύτερο αντισώματα, και η απουσία ενός θραύσματος Fc ανοσοσφαιρίνης θα πρέπει να οδηγήσει σε λιγότερο μη ειδικής σύνδεσης από το ήπαρ. Το ραδιοϊσότοπο

32P έχει μια μακρά ιστορία της κλινικής χρήσης που χρονολογείται από τις αρχές του 1930, ενώ σήμερα εξακολουθεί να χρησιμοποιείται για τη θεραπεία πολυκυτταραιμία και βασική θρομβοκυτταραιμία [25]. Υπάρχει σαφής ανάγκη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών νέων θεραπειών για καρκίνο του παχέος εντέρου [26]. Η εργασία μας δείχνει ότι μια εξαιρετικά μεγάλη βιβλιοθήκη διαφορετικών μικρών πεπτιδίων, το καθένα με μοναδική δεσμευτική και

ικανότητες μεταφοράς 32Ρ, μπορούν εύκολα να παραχθούν είτε χημικά ή βιολογικά, αυξάνοντας έτσι τη σκοπιμότητα της ανάπτυξης εξατομικευμένων θεραπευτικών σχημάτων για διαφορετικούς ασθενείς. Καρκίνος έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα εξαιρετικά ετερογενής νόσος, έτσι η ανάπτυξη αυτών των μοναδικών πεπτιδίου που δεσμεύεται με θεραπείες θα μπορούσαν να διευκολύνουν σε μεγάλο βαθμό εξατομικευμένη θεραπείες ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

Η παραγωγή της ανασυνδυασμένης

32Ρ -επισημασμένο πεπτίδια

Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1, η PCR παράγονται προϊόντα που αποτελούνται από 17 τυχαίων κωδικονίων περιστοιχίζεται από θέσεις BamHI κλωνοποιήθηκαν εντός της θέσεως BamHI του ρΟΕΧ-2ΤΚ (GE Healthcare). Μετά από μετασχηματισμό σε ϋΗ5α βακτήρια, απομονώνονται κλώνοι αυξήθηκαν για μία νύχτα σε ζωμό LB-amp, αραιωμένο 1/10 σε ίδιο, που καλλιεργούνται για δύο ώρες, IPTG προστέθηκε σε 1 mM, και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C για πέντε ώρες. Δέκα ml καλλιέργειας υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε 1 ml 1 χ TBS που περιέχει 100 μg /ml λυσοζύμη. Μετά από δύο κύκλους ψύξης-απόψυξης, το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε και αναμίχθηκαν με 100 μΙ Sepharose-Γλουταθειόνης για μία ώρα, πλύθηκαν τρεις φορές με 1 χ TBS, και τα συνδεδεμένα ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης σημαίνονται με τη χρήση

32Ρ-γ-ΑΤΡ και κινάση πρωτεΐνης Α σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma, St. Louis, Μο). Το σφαιρίδιο πλύθηκε τρεις φορές με 1 χ PBS και το επισημασμένο πεπτίδιο αποκόπηκε και απελευθερώθηκε στο υπερκείμενο χρησιμοποιώντας θρομβίνης (GE Healthcare). Για κάθε ανασυνδυασμένο πεπτίδιο που παράγεται και προσδιορίστηκαν, η αλληλουχία DNA του ενθέτου στο πλασμίδιο έκφρασης προσδιορίστηκε.

Δοκιμασία πρόσδεσης του

32Ρ-επισημασμένων πεπτιδίων σε κυτταρικές σειρές

Κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει 10% θερμοαπενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό. Σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων, 10.000 κύτταρα από διάφορες κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Δέκα μΐ του

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου σε 1 × PBS και 90 μλ πλήρους μέσου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για δύο ώρες. Το πεπτίδιο-μέσο απομακρύνθηκε και ένας μΐ προστέθηκαν σε ρυθμιστικό φόρτωσης γέλης 100 μΙ για μέτρηση σπινθηρισμού για την ποσοτικοποίηση ανιχνευτή ή να τρέξει σε ένα 10% -20% πολυακρυλαμιδίου-SDS γέλη (Biorad). Τα προσκολλημένα κύτταρα ήταν εν συντομία και απαλά πλένεται με πλήρες μέσο τρεις φορές και μερικές πηγάδια προσδιορίστηκαν αμέσως με την προσθήκη 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πηκτώματος σε κάθε φρεάτιο και να τρέξει σε μια γέλη ή μετρήθηκαν σε μετρητή σπινθηρισμού. Άλλες κατεργαστεί ταυτόσημα φρεάτια είχαν 200 μΐ πλήρους μέσου προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 24 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκαν 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πηκτώματος και τα δείγματα σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ή υπολογίζονται όπως περιγράφεται παραπάνω.

Η παραγωγή των συνθετικών

32Ρ-επισημασμένου πεπτιδίου

Το 12 αμινοξέων πεπτίδιο MA11 συνετέθη χημικώς και 0.2 μg σημάνθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας 300 μθί

32Ρ-γ-ΑΤΡ και 30 μονάδες κινάσης πρωτεΐνης Α μετά από αντίδραση επισήμανσης πέντε ωρών, το μίγμα μικροφυγοκεντρείται αν και μια μονάδα Microcon-10 για την απομάκρυνση του ενζύμου από μεταγενέστερες δοκιμασίες σύνδεσης. Για την ανταγωνιστική δοκιμασία πρόσδεσης, 0,005 μα

32Ρ-σημασμένο πεπτίδιο MA11 προστέθηκε σε ένα φρεάτιο που περιείχε 10,000 κύτταρα Caco2 και ένα καθορισμένο ποσότητα ψυχρού, μη φωσφορυλιωμένο MA11. Μετά από επώαση για μία ώρα, τα προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν απαλά και τα περιεχόμενα καλά μετρήθηκαν.