Αφηρημένο

Ιστορικό

Η κυστεΐνη βιολογία είναι σημαντική για την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων. Η έρευνά μας έχει επικεντρωθεί στην επιγενετική αποσιώπηση της κυστεΐνης διοξυγενάσης τύπου 1 (CDO1) σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε περιγράψει την ανίχνευση του

CDO1

μεθυλίωσης στο πλάσμα των ασθενών με CRC χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης ειδική PCR (Q-MSP) και εκτεταμένη ανάλυση της αντίδρασης PCR.

Μέθοδοι

DNA εκχυλίζεται από το πλάσμα, και αναλύθηκαν για μεθυλίωση του

CDO1

γονίδιο χρησιμοποιώντας Q-MSP. Το ποσοστό ανίχνευσης

CDO1

γονίδιο μεθυλίωσης υπολογίσθηκε και συγκρίθηκε με εκείνη του αραιωμένου DNA από «θετικό μάρτυρα« κύτταρα DLD1.

CDO1

γονίδιο μεθυλίωσης στο πλάσμα 40 ασθενών CRC που clinicopathologically αναλύονται στη συνέχεια προσδιορίστηκε.

Αποτελέσματα

(1) Η κλωνοποιημένη ανάλυση της αλληλουχίας ανιχνεύεται 93,3% μεθυλίωση του υποστηρικτής CpG νησιά του

CDO1

γονίδιο των θετικών κυττάρων DLD1 ελέγχου και 4,7% μεθυλίωση του αρνητικού ελέγχου HepG2

CDO1

γονίδιο. (2) DLD1

CDO1

DNA δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε αυτή τη δοκιμασία εάν το εκχυλισμένο DNA αραιώθηκε περίπου 1000 φορές. Όσο περισσότερο DNA που χρησιμοποιήθηκε για την αντίδραση PCR, τόσο περισσότερο αποτελεσματικά ενισχύθηκε σε Q-MSP. (3) Με την αύξηση της ποσότητας του DNA που χρησιμοποιείται, μεθυλιωμένο

CDO1

μπορούσε να ανιχνευθεί σαφώς στο πλάσμα του 8 (20%) των ασθενών CRC. Ωστόσο, το ποσοστό των ασθενών CRC ανιχνεύεται από μεθυλιωμένα

CDO1

στο πλάσμα ήταν χαμηλότερη από εκείνη που ανιχνεύεται από το CEA (35,9%) ή CA19-9 (23,1%) σε προεγχειρητική ορό. Συνδυασμός ΟΕΑ /CA19-9 συν πλάσμα μεθυλιωμένα

CDO1

θα μπορούσε να αυξήσει το ποσοστό ανίχνευσης CRC ασθενών ιάσιμη (39,3%) σε σύγκριση με το CEA /CA19-9 (25%).

συμπέρασμα

Έχουμε περιγράψει την ανίχνευση του

CDO1

μεθυλίωσης στο πλάσμα των ασθενών CRC. Παρά το γεγονός ότι

CDO1

μεθυλίωση δεν ανιχνεύθηκε τόσο συχνά όσο τα συμβατικά καρκινικών δεικτών, ανάλυση του πλάσματος

CDO1

μεθυλίωση σε συνδυασμό με τα επίπεδα του CEA /CA19-9 αυξάνει το ποσοστό ανίχνευσης του CRC ασθενείς ιάσιμη.

Παράθεση: Yamashita Κ, Waraya Μ, Kim MS, Sidransky D, Katada Ν, Sato Τ, et al. (2014) Ανίχνευση Methylated

CDO1

στο πλάσμα του καρκίνου του παχέος εντέρου? Ένα PCR Μελέτη. PLoS ONE 9 (12): e113546. doi: 10.1371 /journal.pone.0113546

Επιμέλεια: Ντιέγκο Calvisi, Πανεπιστήμιο Ιατρικής, Greifswald, Γερμανία

Ελήφθη: 7 του Ιούνη του 2014? Αποδεκτές: 25 του Οκτωβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3, Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Yamashita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

κυτοσίνη μεθυλίωσης του DNA της περιοχής του υποκινητή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ένα κοινό φαινόμενο του καρκίνου [1], [2], και θα μπορούσε να προσφέρει καλό υποψήφιο βιοδείκτες για την ανίχνευση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης ειδική PCR ενίσχυση [3], [4]. μεθυλίωσης DNA αλλοιώσεις διαφέρουν από γονιδιωματική αλλοιώσεις όπως μεταλλάξεις στο ότι οι ανωμαλίες μεθυλίωση συμβαίνουν αρκετά συχνά για εφαρμογή στην κλινική διάγνωση [5]. Για παράδειγμα, έχουμε εντοπίσει

N-μεθυλ-D-ασπαρτικού υποδοχέα τύπου 2Α

(

NMDAR2A

) [6],

κώφωση, αυτοσωματικό κυρίαρχο 5

(

DFNA5

) [7],

Ογκοστατίνη Μ υποδοχέα

β (

OSMR

) [8], και

κυστεΐνη διοξυγενασο 1

(

CDO1

) [9], όπως επιρρεπή σε καρκίνο συχνά μεθυλιωμένη γονιδίων σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) με τη χρήση φαρμακολογικών μικροσυστοιχίες αποκάλυψη [1], [2]. Αυτών των γονιδίων, τα καρκινικά επιρρεπείς γονίδια που ήταν πιο συχνά μεθυλιώνονται στην πρωτοβάθμια CRC ήταν

CDO1

[9].

Η κυστεΐνη βιολογία έχει κερδίσει πρόσφατα την προσοχή από την άποψη της βιολογίας όγκου διότι συνεπάγεται αντιδραστική οξυγόνου (ROS) παραγωγή και επηρεάζει την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων μέσω της (δείκτης-κυστεΐνη μεταφορέα του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων) CD44-XCT άξονα [10], [11]. CDO1 επηρεάζει το μεταβολισμό κυτοσίνη, με αποτέλεσμα την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) και τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και της ανάπτυξης [12], [13]. Ως εκ τούτου,

CDO1

πιστεύεται ότι είναι ένα γονίδιο καταστολής κρίσιμη όγκων, και θα μπορούσε να είναι ένας δείκτης της χημειο-αντίσταση των καρκινικών κυττάρων.

Από μεθυλίωσης του DNA ανιχνεύθηκε πρώτα στο πλάσμα του οισοφάγου ασθενείς με καρκίνο [14], μεθυλιωμένο DNA έχει επανειλημμένα βρεθεί στο πλάσμα διαφόρων καρκίνων συμπεριλαμβανομένων CRC [15].

SEPT9

υποκινητή θεωρήθηκε ότι είναι η πιο πολλά υποσχόμενη δείκτης όγκου, επειδή το 69% των πρωτογενών ιστών CRC ήταν θετικά για αυτό το μεθυλίωση, ενώ δεν ανιχνεύθηκε στο 86% των ελέγχων. Περαιτέρω μελέτες επικύρωσης αποδείχθηκε ότι ένα πλάσμα

SEPT9

δοκιμασία μεθυλίωσης θα μπορούσε να ανιχνεύσει CRC με υψηλή ευαισθησία [16], [17].

Στην παρούσα μελέτη, απηύθυνε την εξαιρετική

CDO1

υπερμεθυλίωση που παρατηρήθηκε σε πρωτεύοντες ιστούς CRC: το 91% των καρκινικών ιστών ήταν θετικά για

CDO1

μεθυλίωση, ενώ δεν ανιχνεύθηκε στο 93% των ελέγχων [9]. Έχουμε περιγράψει την ανίχνευση του CDO1 μεθυλίωσης στο πλάσμα των ασθενών CRC και εκτεταμένη ανάλυση της αντίδρασης PCR.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα δείγματα πλάσματος

Η κυτταρική σειρά CRC DLD1 ήταν ευγενική παραχώρηση από το κινητό Κέντρο Πληροφόρησης για Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ινστιτούτο Ανάπτυξης, γήρανση και ο καρκίνος, το Πανεπιστήμιο Tohoku (Σεντάι, Ιαπωνία). Το κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2 αγοράστηκε από την Bioresource Κέντρου RIKEN (Ibaraki, Japan). κύτταρα DLD1 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). κύτταρα HepG2 αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (GIBCO), συμπληρωμένου με 10% FBS.

πλάσματος από 20 (για την προκαταρκτική μελέτη) και 40 (για τη μελέτη επικύρωσης) ασθενείς με πρωτοπαθή CRC συλλέχθηκε πριν υποβλήθηκαν οι ασθενείς χειρουργική εκτομή του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Kitasato από την 1η Σεπτεμβρίου 2009 μέχρι 30 Ιουνίου 2011. Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kitasato. Οι συμμετέχοντες παρέχεται γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση τους για τη συμμετοχή σε αυτή τη μελέτη πριν από τη χειρουργική επέμβαση.

στάδιο CRC κατηγοριοποιήθηκε σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ, 7

η έκδοση της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC) και του 7

η έκδοση του ιαπωνικού Ταξινόμηση σύστημα σταδιοποίησης καρκίνου του παχέος εντέρου (ΜΕΤΣ). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

DNA

εξόρυξη

Δωρεάν πλωτή κυκλοφορούν DNA εκχυλίζεται από το πλάσμα χρησιμοποιώντας τη Magna Αγνό κιτ Απομόνωση Compact νουκλεϊκών οξέων Ι (Roche Applied Science, Mannhein, Γερμανία) και μια καθαρή συσκευή Roche magna. Πλάσμα (400 μL: μικρές ποσότητες, και 1 έως 2,5 ml: μεγάλα ποσά) διανεμήθηκαν σε Magna Καθαρό πηγάδια και ήταν εκχυλίζεται ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κιτ. Γονιδιωματικό DNA εκλούστηκε σε δείγματα 100 μλ. Και γενωμικό DNA από κυτταρικές γραμμές εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Sciences, Hilden).

κατεργασία όξινου θειώδους του DNA και Sequencing Analysis

Προς DNA μετουσίωσης, το DNA εκχυλίζεται από το πλάσμα του ασθενείς CRC (τελικός όγκος 100 μΙ) ή 2 μα γενωμικού DNA που λαμβάνεται από κυτταρικές γραμμές, επωάστηκαν με 5 μg DNA σπέρματος σολωμού σε 0,3 mol /l NaOH για 20 λεπτά στους 50 ° C. Το δείγμα DNA αραιώθηκε στη συνέχεια με 500 μΙ μεταδιθειώδους 2,5 mol /l νάτριο (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, ΜΟ) /125 mmol /l υδροκινόνη (Sigma) /0.4 διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου mol /l, και τοποθετείται στο 70 ° C για 1,5 ώρες. Το δείγμα εφαρμόστηκε στη συνέχεια σε μία στήλη (Wizard DNA Clean-UP System, Promega Inc., Madison, WI), επωάστηκαν με 0,3 mol /l NaOH για 10 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3 mol /l οξικού αμμωνίου για 5 λεπτά. Το δείγμα καταβυθίστηκε σε 100% αιθανόλη, και το DNA επαναιωρήθηκε σε 25 ή 50 μΙ Lote που αποτελείται από 10 μΜ Tris-HCl, ρΗ 8 και 2,5 μΜ αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), ρΗ 8. Το DNA από κυτταρικές γραμμές ήταν μεταγενέστερα ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Bisulfite αποτελέσματα της θεραπείας στη χημική τροποποίηση του μη μεθυλιωμένα, αλλά όχι μεθυλιωμένη, κυτοσίνες σε ουρακίλες, επιτρέποντας τη διάκριση μεταξύ μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων γονιδιωματικό DNA. Primer αλληλουχίες για τα γονίδια ενδιαφέροντος είχαν σχεδιαστεί για να αναγνωρίζουν αυτά τα αλλοιώσεις DNA (Πίνακας S1). Τα προϊόντα εκκινητή αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συσκευασία Big Dye Terminator Cycle Sequencing v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Για την ανάλυση των κλωνοποιημένων αλληλουχιών, τα PCR προϊόντα εισήχθησαν εντός του φορέα pCR4-ΤΟΡΟ χρησιμοποιώντας ένα κιτ κλωνοποίησης ΤΟΡΟ ΤΑ για αλληλούχιση (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Δέκα κλώνοι επιλέχθηκαν για κάθε δείγμα, τα οποία στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ημι-ένθετη εκκινητές (Πίνακας S1).

Ποσοτική-μεθυλίωση-ειδική PCR (Q-MSP)

TaqMan μεθυλίωσης ειδική PCR ( Q-MSP) διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το iQ Supermix (Bio-Rad), και το σύστημα PCR Ανίχνευση iCycler iQ Real-Time (Bio-Rad). Οι συνθήκες PCR και οι αλληλουχίες εκκινητή που παρέχονται στον Πίνακα S1. Διαδοχικές αραιώσεις διθειώδους τροποποιημένου DNA από DLD1 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος μεθυλίωση για να κατασκευαστεί μια καμπύλη βαθμονόμησης σε κάθε πλάκα, και τροποποιημένου DNA από κύτταρα HepG2 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Στατιστική Ανάλυση

κατηγορικές μεταβλητές αξιολογήθηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher. Η επιβίωση υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η μονοπαραγοντική ανάλυση των προγνωστικών παραγόντων για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου log-rank. PFS ορίστηκε ως χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση στην εξέλιξη (υποτροπή ή /2 λειτουργία R1) ή θανάτους από οποιαδήποτε αίτια, καθώς και στοιχεία σχετικά με τους επιζώντες ασθενείς είχαν λογοκριθεί κατά την τελευταία παρακολούθηση. Η διάμεση παρακολούθηση ήταν 46 μήνες. (Εύρος: 0-55 μήνες)

Αποτελέσματα

Ανάδοχος DNA υπερμεθυλίωση του

CDO1

γονιδίου με ανάλυση της κλωνοποιημένης ακολουθίας από την ανθρώπινη καρκινικές κυτταρικές σειρές για τη δημιουργία θετικών και αρνητικών μαρτύρων για την ποσοτική μεθυλίωση ανάλυση

Αν και

CDO1

σαφώς υπερμεθυλίωση σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές [9], ο βαθμός

CDO1

υποστηρικτής υπερμεθυλίωση κλωνοποιημένων

CDO1

αλληλουχίες υποκινητή δεν έχει προσδιοριστεί. Χρησιμοποιώντας την κατεργασία όξινου θειώδους του DNA που ακολουθείται από ανάλυση αλληλουχίας, αναλύσαμε το επίπεδο μεθυλίωσης της

CDO1

αλληλουχία προαγωγού κλωνοποιήθηκε από ενισχυμένο με PCR γενωμικό DNA του DLD1 (μεθυλίωση θετικό) και HepG2 (μεθυλίωση αρνητικό) κύτταρα. Αυτή η δοκιμασία έδειξε μεθυλίωση του 93% και το 4,7% των θέσεων CpG του

CDO1

περιοχή του υποκινητή σε DLD1 και HepG2 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικ. 1α). Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι οι κυτταρικές σειρές DLD1 και HepG2 ήταν κατάλληλη για χρήση ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα, για το

CDO1

ανάλυση μεθυλίωσης.

(α) Η ανάλυση της αλληλουχίας του κλωνοποιημένου

CDO1

υποκινητή. Η συχνότητα των μεθυλιωμένων CpG νησίδες στο κλωνοποιημένο

CDO1

υποκινητή από τον θετικό έλεγχο, κύτταρα DLD1, και του αρνητικού ελέγχου, κύτταρα HepG2. (Β) την αποτελεσματικότητα Q-MSP για ενίσχυση PCR του

CDO1

και β-ακτίνη ήταν εξαιρετική. (Γ) Ευαισθησία του

CDO1

ανίχνευση μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας Q-MSP αναλύθηκε με χρήση 2-φορές αραιώσεις (από 100 να 3,125 ng /PCR) κλωνοποιημένων

CDO1

υποκινητές από κύτταρα DLD1 και HepG2. (Δ) Q-MSP του

CDO1

μεθυλίωση σε σε κύτταρα DLD1 χρησιμοποιώντας 10-πλάσιες αραιώσεις (100, 10, 1, 0.1, και 0.01 ng /PCR) του κλωνοποιημένου

CDO1

υποκινητή . Μια συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 1 ng /αντίδραση PCR του θετικού μάρτυρα DNA κυττάρου DLD1 μπορεί να ανιχνευθεί με σαφήνεια. Ωστόσο, DNA σε 1000 αραίωση αναδίπλωσης (0,1 ng /PCR) μπορεί να μόλις και μετά βίας να ανιχνευθεί. Σημειώστε ότι η ανίχνευση είναι λιγότερο ευαίσθητη όταν εφαρμόζονται μικρότερες ποσότητες DNA.

Η

Q-MSP των μεθυλιωμένων CpG θέσεων του

CDO1

γονίδιο ενισχύθηκε σαφώς ένα συγκεκριμένο σήμα στον θετικό έλεγχο, DLD1, αλλά όχι στον αρνητικό μάρτυρα, HepG2

επόμενο ποσοτικά μετουσιωμένο

CDO1

μετά την κατεργασία όξινου θειώδους DNA χρησιμοποιώντας Q-MSP με το ίδιο σετ εκκινητών και του ανιχνευτή που είχε αναφερθεί στο παρελθόν [9] . Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, θα μπορούσε να προσδιορίζεται σαφώς ενισχυμένα σήματα. Η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR του μεθυλιωμένου

CDO1

ήταν εξαιρετική και βρέθηκε να είναι συγκρίσιμη με την αποτελεσματικότητα ενίσχυση β-ακτίνης (Εικ. 1b). Q-MSP του

CDO1

methyaltion έδειξαν ότι η μεθυλίωση θα μπορούσε να ανιχνευθεί σαφώς όταν το πρότυπο DNA από κύτταρα DLD1 χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 και ng /αντίδραση PCR, ενώ δεν μεθυλίωση καθόλου μπορούσε να ανιχνευθεί σε αρνητικό έλεγχο templates HepG2 DNA (Σχ. 1γ). Χρησιμοποιήσαμε φθορισμού του 0,35 ως τη γραμμή ορίου σε αυτή τη δοκιμασία, επειδή ο αρνητικός μάρτυρας είναι πάντα κάτω από αυτό το όριο. Όταν η μήτρα DNA αραιώθηκε περαιτέρω συγκεντρώσεις 100, 10, 1, 0.1, και 0.01 ng /αντίδραση PCR αναλύθηκαν, Q-MSP του

CDO1

DNA από DLD1 ανιχνεύθηκε μεθυλίωση σε αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας 100, 10, ή 1 ng /αντίδραση, ενώ θα μπορούσε μετά βίας να ανιχνεύσει μεθυλίωση σε αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας 0,1 ή 0,01 ng /αντίδραση. Δεν μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε συγκέντρωση του DNA σε αντιδράσεις με τη χρήση του HepG2 DNA αρνητικού ελέγχου (Σχ. 1 d). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ακόμη και πυκνό

CDO1

μεθυλίωσης όπως αυτό που βρέθηκε στα κύτταρα DLD1 δύσκολα μπορεί να ανιχνευθεί με τη χρήση Q-MSP, όταν το DNA αραιώνεται περίπου 1000 φορές, και ότι η ανίχνευση είναι λιγότερο ευαίσθητο όταν λιγότερο εφαρμόζεται DNA. Ως εκ τούτου, προκειμένου να ανιχνευθούν ελάχιστα υπολειμματικής νόσου του καρκίνου σε σωματικά υγρά, θα ήταν καλύτερα να είναι σε θέση να χρησιμοποιήσει ένα μεγαλύτερο όγκο του DNA από αυτό που συνήθως χρησιμοποιείται για την ποσοτική ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA.

Ανίχνευση μεθυλίωσης η αλληλουχία CpG νησίδα του

CDO1

γονίδιο στο πλάσμα ασθενών CRC από την Q-MSP χρησιμοποιώντας μία μικρή ποσότητα του προτύπου DNA

στη συνέχεια εξετάστηκε η ευαισθησία της ανίχνευσης του

CDO1

μεθυλιωμένο DNA στο πλάσμα των ασθενών 20 CRC. Σε αυτό το προκαταρκτικό πείραμα, εξάγαμε DNA από 400 μl του CRC ασθενείς πλάσμα. Το ήμισυ του εκχυλίζεται DNA εφαρμόστηκε σε τριπλές δοκιμασίες τόσο

CDO1

και β-ακτίνης. Έτσι ο όγκος του πλάσματος για κάθε μεμονωμένη δοκιμασία ήταν 33.3 μl, η οποία ορίζεται ως 1 όγκο πρότυπο.

CDO1

μεθυλίωση ανιχνεύθηκε μόνο σε 2 (10%) από τους 20 ασθενείς CRC, ενώ β-ακτίνη μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα (Σχ. 2). Σύκο. 2α δείχνει ένα

CDO1

θετικές περιπτώσεις? μεθυλίωση του

CDO1

-3 σαφώς εντοπιστεί, αλλά ότι του

CDO1

-1 και

CDO1

-2 ήταν οριακή, επειδή τα σήματα που ήταν κάτω από το όριο. Ωστόσο, αυτό το επίπεδο μεθυλίωσης μπορεί να ισχύει, όπως PCR 1/1000 αραίωση του θετικού ελέγχου εμφάνισαν ένα παρόμοιο σήμα (Σχ. 1 d). Σε αντίθεση,

CDO1

αρνητικές περιπτώσεις δεν παρουσίασαν κανένα σήμα σε όλα ενισχυμένου

CDO1

μεθυλίωσης (Σχ. 2β). Για αυτά τα πειράματα, οι ποσότητες του DNA που εξάγεται από τις αρχικές 400 μΐ πλάσματος μέσο όρο 435 ng, που κυμαίνονται από 160 ng έως 2000 ng. Ως εκ τούτου, η ποσότητα του DNA εφαρμόζεται σε 1 PCR αντίδραση αντιστοιχούσε σε τουλάχιστον 16,7 (1/6) ng /αντίδραση. Αυτή η ποσότητα του DNA πιστεύεται ότι είναι επαρκής για την Q-MSP, αν οι μεθυλιωμένα αλλήλια περιλαμβάνονται (βλέπε Σχ. 1γ). Ωστόσο, η τιμή Ct για β-ακτίνη κυμαίνονταν από 34 έως 38, η οποία ήταν εντελώς διαφορετική με εκείνη που λαμβάνεται κατά την εκτέλεση Q-PCR των κυτταρικών γραμμών, κατά την οποία η συνήθης τιμή Ct β-ακτίνης είναι περίπου 28. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η ανίχνευση πλάσματος DNA ήταν λιγότερο ευαίσθητη από εκείνη του DNA από κυτταρικές γραμμές, πιθανόν λόγω αποικοδόμησης DNA ή άλλους άγνωστους λόγους. Επαρκής DNA για την PCR αντίδραση ήταν παρούσα μόνο σε 1 από 2

6 (64 φορές) για 2

10 (1024 φορές). Αυτό σήμαινε ότι ο αρχικός όγκος του πλάσματος που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA θα πρέπει ιδανικά να αυξηθεί 100 έως 1000 φορές (δηλαδή για να 4-40 ml πλάσματος) για προσδιορισμό του DNA πλάσματος χρησιμοποιώντας Q-MSP. Ως εκ τούτου, για να ληφθούν αρκετά DNA στο πλάσμα για την ανίχνευση ελάχιστης υπολειμματικής νόσου, περισσότερο DNA από ότι θα απαιτείται αυτή που χρησιμοποιείται σε αυτήν την προκαταρκτική μελέτη. Έτσι αρχική προκαταρκτική μελέτη μας δεν είχε χρησιμοποιήσει τις βέλτιστες συνθήκες για την ανίχνευση του

CDO1

μεθυλίωσης στο πλάσμα.

(α) Ένας εκπρόσωπος θετική περίπτωση φάνηκε. Το γονίδιο β-ακτίνης αναλύθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για όξινο θειώδες DNA αντιμετωπίζεται. Ακόμη και για τη θετική αυτή την περίπτωση, η ανίχνευση του μεθυλιωμένου

CDO1

δεν είναι σταθερή, επειδή όλα τα πρότυπα δεν ξεπεράσει το όριο. (Β) Ένας εκπρόσωπος αρνητική περίπτωση εμφανίζεται. Σημειώστε ότι το επίπεδο β-ακτίνης είναι χαμηλότερη από την αναμενόμενη.

Η

Ανίχνευση του μεθυλιωμένου αλληλουχία CpG νησίδα του

CDO1

γονιδίου με Q-MSP χρησιμοποιώντας αυξημένες ποσότητες του DNA από το πλάσμα του CRC ασθενών

στη συνέχεια εξετάστηκε το DNA εκχυλίζεται από το ισοδύναμο των 3 όγκων πρότυπο για την ανίχνευση του

CDO1

μεθυλίωση στο πλάσμα από τους 20 ασθενείς CRC. Αυτή η δοκιμασία ανιχνεύεται 4 περιπτώσεις (20%) που ήταν θετικοί για μεθυλίωση του

CDO1

στο πλάσμα. Επιπλέον σαφέστερη σήματα ελήφθησαν από όταν χρησιμοποιήθηκε ένας όγκος προτύπου, υποδεικνύοντας ότι η ευαισθησία της δοκιμασίας μπορεί να αυξηθεί σε μεγάλο βαθμό με αύξηση της ποσότητας του DNA που προέρχεται από πλάσμα (Σχ. 3).

(α) Ε -1 έως 69 (β) Ε-2-10 (γ) E-2-31 (δ) Ε-2-32 που ήταν θετικά για μεθυλίωση του

CDO1

στο πλάσμα, όταν το πρότυπο DNA εκχυλίστηκε από ένα μεγαλύτερο όγκο του πλάσματος.

η

στη συνέχεια εξετάστηκαν 40 ανεξάρτητες περιπτώσεις CRC από την Q-MSP, χρησιμοποιώντας DNA από ένα μεγαλύτερο όγκο του πλάσματος (1,0 έως 2,5 ml πλάσματος που αντιστοιχεί σε 5 έως 12,5 όγκους πρότυπο βασίζεται στο ορισμό του όγκου αρχικό πρότυπο μας). Το μέσο ποσό του DNA που εξάγεται DNA ήταν 1491 ng, (που κυμαίνονται από 580 ng έως 2590 ng). Η δοκιμασία αυτή ανιχνεύεται σαφές

CDO1

μεθυλίωσης σε 8 από τα 40 περιπτώσεις CRC (20%). Clear μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε 1 από 6 (16,7%), 2 10 (20,0%), 1 13 (7,7%), και 4 από 11 (36,4%) του Ι, II, III, και IV CRC περιπτώσεις στάδιο, αντίστοιχα (Εικ. 4α). Όσο υψηλότερη είναι η φάση, τόσο υψηλότερο το επίπεδο μεθυλίωσης που εντοπίστηκε (Εικ. 4β). Τα υπόβαθρα των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Αν και

CDO1

μεθυλίωση βρίσκεται πιο συχνά σε ασθενείς CRC με μακρινή μετάσταση, η πρόγνωση των ασθενών με μετουσιωμένο

CDO1

στο πλάσμα δεν ήταν σημαντικά χειρότερη από ό, τι οι ασθενείς στην οποία κανένα μεθυλιωμένα

CDO1

ανιχνεύθηκε στο πλάσμα (Σχ. 4c). Παρακάτω σήμα κατωφλίου αντιστοιχεί στην αραίωση 1/1000 του θετικού μάρτυρα (Σχ. 4d). Αν μια τέτοια οριακή κάτω από το σήμα όριο των

CDO1

μεθυλίωση συμπεριλήφθηκε ως θετικό σήμα, τότε η μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε όλα τα 40 των ασθενών CRC.

(α) ανάλυση Q-MSP μεθυλιωμένου

CDO1

χρησιμοποιώντας μια μεγάλη ποσότητα προέρχεται από το πλάσμα DNA των ασθενών με CRC σε διαφορική στάδια. (Β) Αντιπροσωπευτικά θετικά κρούσματα εμφανίζονται ανάλογα με το στάδιο. Μια εικόνα της ίνας του παχέος εντέρου στον πρωτογενή καρκίνο περιλαμβάνεται σε κάθε σχήμα. (Γ) καμπύλη επιβίωσης των ασθενών CRC σύμφωνα με μεθυλιωμένα

CDO1

επίπεδα στο πλάσμα. (Δ) Οι αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις παρουσιάζουν οριακή θετική περίπτωση που φαίνεται.

Η

Συνδυασμός μεθυλιωμένο

CDO1

με αυξημένη CEA στον ορό /CA19-9 για την ανίχνευση των ιάσιμη φάση Ι, ΙΙ και ΙΙΙ του ορθοκολικού καρκίνου

από τους πάνω από 40 ασθενείς, 39 ήταν κατατοπιστική σχετικά με την προεγχειρητική τιμή της CEA στον ορό και CA19-9. CEA ήταν θετική (& gt? 5,0 ng /ml) σε 14 από αυτούς τους 39 ασθενείς (35,9%), ενώ CA19-9 ήταν θετική (& gt? 37.0 IU /ml) σε 9 από αυτούς τους 39 ασθενείς (23,1%). Το ποσοστό ανίχνευσης CRC σύμφωνα με το στάδιο υπολογίστηκε σε σχέση με το CEA, CA19-9, τον /CA19-9 συνδυασμό CEA, ή το CEA /CA19-9 /πλάσματος

CDO1

συνδυασμό μεθυλίωσης (Εικ. 5α ). Το ποσοστό ανίχνευσης του σταδίου IV CRC από το CEA, CA19-9, ή CEA /CA19-9 ήταν υψηλό. Ωστόσο, συνδυάζοντας πλάσμα

CDO1

δεδομένων μεθυλίωση με CEA /CA19-9 δεν αυξηθούν τα ποσοστά ανίχνευσης. Από την άλλη πλευρά,

CDO1

αυξηθούν τα ποσοστά ανίχνευσης της φάσης Ι, II, III και CRC, τα οποία θεωρούνται ως ιάσιμη (Σχ. 5α). Παρά το γεγονός ότι μόνο το 21% αυτών των ασθενών ιάσιμη θα μπορούσε να ανιχνευθεί με βάση τα επίπεδα του CEA,

CDO1

συνδυασμό αύξησε το ποσοστό ανίχνευσης τέτοιων ιάσιμη ασθενών σε 39,3% (Εικ. 5β).

(α) ποσοστό CRC ανίχνευση του CEA, CA19-9, ο συνδυασμός της ΟΕΑ /CA19-9, και ο συνδυασμός της ΟΕΑ /CA19-9 /πλάσματος

CDO1

μεθυλίωση σύμφωνα με το στάδιο CRC. (*) Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01. (**) Δηλώνει ρ & lt? 0,05. (Β) ιάσιμη CRC (στάδιο Ι έως ΙΙΙ) ποσοστό ανίχνευσης αυξήθηκε με το συνδυασμό του πλάσματος

CDO1

δεδομένων μεθυλίωσης.

Η

Συζήτηση

Επειδή διαπιστώθηκε ότι ο καρκίνος -ειδικές μεταβολές στο αίμα μπορούν να ανιχνευθούν σε ασθενείς με καρκίνο, έχουν πολυάριθμες καρκινικούς δείκτες έχουν αναπτυχθεί για κλινική εφαρμογή. Στο CRC, CEA και CA19-9 ορού είναι καλά αναγνωρίζονται ως τέτοια χρήσιμοι δείκτες [18], [19]. Δεδομένου ότι οι υψηλές τιμές του CEA ορού και CA19-9 συχνά ανιχνεύονται σε στάδιο IV ορθοκολικό καρκίνο, αυτοί οι δείκτες είναι χρήσιμοι για την πρόβλεψη της πρόγνωσης ή για την περίπτωση της έγκαιρης ανίχνευσης της υποτροπής στο κέντρο εξωτερικών ασθενών [18]. Επειδή αυτοί οι δείκτες μπορούν μερικές φορές ανίχνευση υποτροπής της νόσου νωρίτερα από ό, τι διαγνωστικής απεικόνισης, όπως η αξονική ή ηχώ, που είναι απαραίτητη για τους γιατρούς που αντιμετωπίζουν CRC ως κλινικό εργαλείο. Από την άλλη πλευρά, δυστυχώς αυτοί οι δείκτες δεν επαρκούν για την ανίχνευση του καρκίνου, όταν εφαρμόζεται στην ανίχνευση ιάσιμη CRC. Οι προεγχειρητική ποσοστά ανίχνευσης CRC της CEA και CA19-9 είναι περίπου 30-50% ή Στάδιο Ι CRC και 10~20% για το στάδιο ΙΙΙ CRC [20]. Εάν ένας νέος δείκτης όγκου στο αίμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τέτοια κλασική καρκινικούς δείκτες, αυτό θα αυξήσει το ποσοστό ανίχνευσης ιάσιμη CRC και αυτοί οι δείκτες θα δείξει υπόσχεση για το σκοπό της εξέτασης CRC σε ιατρικές εξετάσεις [21].

Μεταβολές που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες όγκου πρέπει να είναι καρκίνος ειδικό. Η μεθυλίωση του

CDO1

περιοχή προαγωγού που αναλύθηκε στην παρούσα μελέτη ταυτοποιήθηκε αρχικά με ισχυρή διαλογή μιας φαρμακολογικής μικροσυστοιχιών αποκάλυψης που διενεργείται με τη διερεύνηση του καρκίνου επιρρεπείς μεθυλίωσης [1], [2], [ ,,,0],9]. Με τη χρήση μιας τέτοιας συστοιχίας έχουμε εντοπίσει πολυάριθμες νέα γονίδια με επιρρεπή σε καρκίνο μεθυλίωση.

NMDAR2A

[6],

DFNA5

[7],

OSMR

[8], και

CDO1

[9]. Από αυτά τα γονίδια,

CDO1

ξεχώρισε όσον αφορά την ευαισθησία και ειδικότητα για τη διαφορική ανίχνευση της CRC από το αντίστοιχο κανονικό βλεννογόνο. Παρόμοια

CDO1

γνωρίσματα μεθυλίωση επιβεβαιώθηκαν σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, όπως του μαστού, του οισοφάγου, του πνεύμονα, της ουροδόχου κύστης, και γαστρικού καρκίνου. Επειδή, όπως ο καρκίνος-επιρρεπής μεθυλίωση είναι σπάνια, η ανάλυση των

CDO1

μεθυλίωση έχει μεγάλη κλινική δυνατότητες για την ανίχνευση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου σε υγρά του ανθρώπινου σώματος, όπως το αίμα.

SEPT9

θεωρείται ότι είναι το πρώτο μόριο στο οποίο συχνή μεθυλίωση ανιχνεύθηκε επιτυχώς στο πλάσμα των ασθενών CRC χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR [16], [17]. Το ποσοστό ανίχνευσης των μεθυλιωμένων

SEPT9

στο πλάσμα των ασθενών ιάσιμη CRC με σταδίου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ είναι εξαιρετικά υψηλή, όντας πάνω από το 60% [22]. Είναι ενδιαφέρον, ένα τόσο υψηλό ποσοστό ανίχνευσης ενός μεθυλιωμένου DNA στο πλάσμα των ασθενών με ιάσιμη CRC επίσης δείχθηκε χρησιμοποιώντας κάποια άλλη μέθοδο. Έτσι, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μεθυλο ακτινοβολούν, Li et al. έδειξαν ότι το πλάσμα μεθυλιωμένα

βιμεντίνης

μπορούσε να ανιχνευθεί στο περίπου 40-60% των ιάσιμη CRC στο στάδιο Ι έως III, και ότι η ευαισθησία της ανίχνευσης ήταν υψηλότερη από εκείνη της αξίας του ορού του CEA [21]. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, η ανάλυση των μεθυλιωμένου DNA είναι ένα πολύ ελπιδοφόρο εργαλείο υποψήφιος για τη διάγνωση του καρκίνου του αίματος και το πλάσμα

CDO1

μεθυλίωσης που ήταν το επίκεντρο αυτής της μελέτης θεωρείται ως ένα τέτοιο υποψήφιο DNA. ιδιαιτερότητα του καρκίνου και την ευαισθησία του

CDO1

methyaltion έχει αποδειχθεί ότι είναι ίσα με εκείνα του είτε

SEPT9

ή

βιμεντίνης

μεθυλίωσης στο CRC, όπου η AUC της καμπύλης ROC για τη διαφοροποίηση καρκινικούς ιστούς από το αντίστοιχο κανονικό βλεννογόνο ήταν 0.96 [9].

σε αντίθεση με αυτούς τους ελπιδοφόρους αναφορές, υπήρξαν ορισμένα απογοητευτικά αναφορές σε σχέση με τα ποσοστά ανίχνευσης των μεθυλιωμένων γονιδίων σε πλάσμα [14]. Το ποσοστό ανίχνευσης των μεθυλιωμένων

CDO1

στο πλάσμα είναι ένα απογοητευτικό 20% του συνόλου των ασθενών CRC προσδιορίστηκαν, και είναι περίπου 35% στο στάδιο IV CRC. Στην παρούσα μελέτη μας, κάναμε τα πρότυπα του DNA από το

CDO1

υποστηρικτής των κυττάρων DLD1, θετικός έλεγχος για

CDO1

μεθυλίωση, αραιώνεται το DNA μέχρι και 100.000 φορές, και σε σύγκριση με το

CDO1

επίπεδο ανίχνευσης μεθυλίωσης διαφορετικές αραιώσεις. Η δοκιμή αυτή δείχνει ότι όσο μικρότερη είναι η ποσότητα του εκμαγείου DNA που εφαρμόζεται, η φτωχότερη είναι η αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης PCR. Επιτρέποντας για την αποτελεσματικότητα ακτίνη ενίσχυση, η ποσότητα του DNA στο συνολικό περιεχόμενο DNA πλάσματος που θα μπορούσε να λειτουργήσει ως πρότυπο για ενίσχυση Q-MSP PCR

του CDO1

»ήταν απροσδόκητα εξαιρετικά μικρό (η αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε ως 1 /100 έως 1/1000). Στην τρέχουσα μελέτη μας, η ευαισθησία του μεθυλιωμένου

CDO1

με συμβατικές Q-MSP είναι πάνω από 1/1000 αραίωση του DNA εκχυλίζεται (Σχ. 1 d), η οποία είναι πολύ κατώτερη από εκείνη της ανιχνεύσεως ακτινοβολούν (η οποία έδειξε 1 /10.000 ευαισθησία αραίωση) [23]. Όταν ο όγκος του πλάσματος που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA αυξήθηκε κατά 3Χ (που ορίζεται ως τρεις όγκους πρότυπο), σαφέστερο σήμα ελήφθη σε Q-MSP. Ωστόσο, η αύξηση του όγκου του πλάσματος που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA από 10Χ (δέκα τόμους πρότυπο) δεν παρέχει τόσο καλή ποσοστό ανίχνευσης, όπως αυτή που λαμβάνεται με τη χρήση 3 όγκου πρότυπο. Από 10 έως 12 όγκοι εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση Q-MSP PCR του μεθυλιωμένου

SEPT9

[16], ο αριθμός των προτύπων DNA της μελέτης μας δεν ήταν τόσο μικρά όσο αυτά που χρησιμοποιούνται στη μελέτη SEPT9. Ωστόσο, τα ποσοστά ανίχνευσης μετουσιωμένο DNA ήταν πολύ χαμηλότερο στην παρούσα μελέτη σε σχέση με το

SEPT9

μελέτη, δεδομένου μεθυλιώνεται

SEPT9

εντοπίστηκε σε περίπου 60% των ιάσιμη CRC [16].

Λόγω της χαμηλής ευαισθησίας για τη δοκιμασία (20%) του πλάσματος μεθυλιωμένο

CDO1

, η χρησιμότητα της δοκιμής για τον έλεγχο του πληθυσμού για CRC θα απαιτήσει βελτιωμένη ευαισθησία για την ανίχνευση των πρώιμων καρκίνων και προηγμένα αδενώματα. Μπορεί να υπάρχουν τρόποι για να επιτευχθεί πιθανές βελτιώσεις ως εξής? 1) 3.5 έως 5 ml του πλάσματος πρέπει να συλλέγονται για την εκχύλιση του DNA. 2) Οι συγκεντρώσεις ασταριού CDO1 PCR ήταν αυξημένες. 4) Ένα θέμα ήταν θετική εάν οποιοδήποτε από τα τρία PCR επαναλήψεις ήταν θετικά, επειδή μια τρίτη μέτρηση PCR αυξάνει αναγκαστικά την ευαισθησία και μειώνει ειδικότητα. Η επόμενη πρόκληση θα επιτευχθεί από τέτοιες επινοεί για να βελτιωθεί η ευαισθησία για την ανίχνευση των λεπτών καρκινικών κυττάρων. Αν μπορούμε να αυξήσουμε την ευαισθησία των παραπάνω διατάξεων, θα συλλέξει το πλάσμα από υγιή άτομα και μπορεί να προσδιορίσει τη βέλτιστη τιμή αποκοπής του μετουσιωμένο CDO1 σε ασθενείς CRC.

Υπάρχουν 2 πιθανές εξηγήσεις για το γεγονός ότι το ποσοστό ανίχνευσης των

CDO1

μεθυλίωση ήταν πολύ κατώτερα από αυτά του

SEPT9

μεθυλίωσης στο πλάσμα των ασθενών CRC. Έτσι, το ποσοστό ανίχνευσης όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας Q-MSP θα μπορούσε να είναι αυξημένα με τη μείωση του επιπέδου κατωφλίου. Για παράδειγμα, στο Σχ. 4δ, αυτό το στάδιο IV κρίθηκε ως αρνητικό για

CDO1

μεθυλίωσης. Ωστόσο, το όριο μειώθηκε, αυτή η περίπτωση θα μπορούσε να θεωρηθεί ως θετική. Είναι πιθανό ότι το όριο μπορεί να μειωθεί περαιτέρω. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε τον ποσοτικό προσδιορισμό του πλάσματος του ένα υγιές άτομο, το όριο θα πρέπει να καθοριστεί σε σύγκριση με το ποσοστό ανίχνευσης ενός υγιούς ελέγχου, όπως φαίνεται προηγουμένως [16]. Η δεύτερη εξήγηση είναι ότι το επίπεδο της μεθυλιωμένο

CDO1

στο πλάσμα είναι μικρότερη από εκείνη του μεθυλιωμένο

SEPT9

. CDO1 εμπλέκεται στο μεταβολισμό κυστεΐνη, και κυστεΐνη βιολογία έχει κερδίσει πρόσφατα την προσοχή από την άποψη της θεωρίας του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Η XCT κυστεΐνη μεταφορέας συνδέεται με, το CD44 δείκτη βλαστικών κυττάρων του καρκίνου, και με αυξημένη συγκέντρωση κυστεΐνης στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, με αποτέλεσμα την αναστολή της παραγωγής και χημειοαντίσταση ROS. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα πιστεύεται ότι επιβιώνουν πλέον στην πρωτοβάθμια καρκινικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι λιγότερο DNA μπορεί να προέρχεται από καρκίνο βλαστικά κύτταρα, παρά από τα άλλα κύτταρα. Εάν η τελευταία θεωρία είναι σωστή, μεθυλιωμένη

CDO1

δεν είναι κατάλληλη για χρήση ως δείκτη όγκου του πλάσματος. Εάν η πρώτη θεωρία είναι σωστή, τα ποσοστά ανίχνευσης των καρκινικών κυττάρων με βάση το πλάσμα μεθυλιωμένα

CDO1

μπορούσε να αυξηθεί με τη βελτίωση του συστήματος ανίχνευσης. Στην τρέχουσα μελέτη μας, η ποσότητα του DNA που είναι χρήσιμη για την ανίχνευση τέτοιων δείχθηκε να είναι χαμηλή στο πλάσμα. Επομένως, η χρήση του ένθετη PCR είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τέτοια ανάλυση στο εγγύς μέλλον.

Εν κατακλείδι, η ανάλυση του μεθυλιωμένου

CDO1

στο πλάσμα απογοητευτική όσον αφορά το ποσοστό ανίχνευσης. Ωστόσο πλάσμα μεθυλιωμένα

CDO1

είναι ανεξάρτητη από CEA ορού /CA19-9, έτσι ώστε ο συνδυασμός αυτών των δεικτών θα μπορούσε να αυξήσει το ποσοστό ανίχνευσης του ιάσιμη CRC. Από την άλλη πλευρά, το ποσοστό ανίχνευσης CRC δεν αυξήθηκε με συνδυασμό πλάσματος μεθυλιωμένου

CDO1

δεδομένων με τα επίπεδα CEA /CA19-9 στο Στάδιο IV CRC. Ως εκ τούτου, εάν το ποσοστό ανίχνευσης CRC με βάση μεθυλιωμένο

CDO1

στο πλάσμα ήταν να αυξηθεί με τη χρήση του νέου συστήματος ανίχνευσης που περιγράφεται παραπάνω, το πλάσμα μεθυλιωμένη

CDO1

ανάλυση θα ήταν ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για την ανίχνευση της ιάσιμη CRC από ιατρική εξέταση του αίματος. Επιπλέον, δεδομένου ότι

CDO1

μεθυλίωση είναι καθολικά βρέθηκαν σε άλλες μορφές καρκίνου, η τεχνική αυτή μπορεί να είναι μια ευρέως εφαρμόσιμη μέθοδος για την ανίχνευση του καρκίνου με τη χρήση του αίματος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. παραγωγή

PCR και η ακολουθία των εκκινητών και φθορίζοντα ανιχνευτή

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113546.s001

(XLSX)