Αφηρημένο

Η λειτουργία καταστολής όγκου p53 μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο σε πολλούς όγκους από την κυτταρική ανταγωνιστή HDM2 και των ανθρωπίνων θηλωμάτων ογκογονίδιο Ε6 ότι επάγει την υποβάθμιση p53. Αποκατάσταση της δραστηριότητας p53 έχει ισχυρές θεραπευτικές δυνατότητες. Εδώ, ταυτοποιήσαμε TSC-22 ως μία νέα πρωτεΐνη p53-αλληλεπιδρούν και να δείξει τα νέα λειτουργία του ως θετικός ρυθμιστής της ρ53. Βρήκαμε ότι η TSC-22 επίπεδο ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, η υπερέκφραση του TSC-22 ήταν επαρκής για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, προάγουν την κυτταρική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας και να καταστείλει την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος σε ποντίκια. Έκφραση της επίσης TSC-22 ενισχύεται το επίπεδο της πρωτεΐνης του p53, προστατεύοντας το από πολυ-ουβικουϊτινίωση. Όταν συνδέεται με το μοτίβο μεταξύ των αμινοξέων 100 και 200 ​​της ρ53, TSC-22 ανέστειλε την HDM2- και Ε6 μεσολάβηση ρ53 πολυ-ουβικουϊτινίωση και υποβάθμιση. Κατά συνέπεια, έκτοπη υπερέκφραση του TSC-22 ενεργοποιήσει τη λειτουργία της ρ53, που ακολουθείται από αυξημένη έκφραση του p21

WAF1 /Cip1 και PUMA σε ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές. Είναι ενδιαφέρον ότι, TSC-22 δεν επηρέασε την αλληλεπίδραση μεταξύ ρ53 και HDM2. Knock-down του TSC-22 με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ενισχύεται σαφώς την πολυ-ουβικουϊτινίωση του p53, οδηγώντας στην αποικοδόμηση του ρ53. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TSC-22 δρα ως καταστολέας των όγκων με τη διασφάλιση p53 από πολυ-ουβικουϊτινίωση μεσολάβηση-υποβάθμιση

Παράθεση:. Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, το Park J, Jang IS, et al. (2012) κρίσιμο ρόλο των TSC-22 στην Πρόληψη Η υποβάθμιση του πρωτεασώματος του p53 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10.1371 /journal.pone.0042006

Επιμέλεια: Qian Τάο, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 29 του Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 1, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Yoon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε κυρίως από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (20.110.026.217) και μερικώς επικουρείται από τη χορήγηση Κορέα Basic Science Institute ΝΑΡ (T3278B) και την εσωτερική επιχορήγηση από korea National Institute of Health. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και την ανάλυση δεδομένων, dicision να δημοσιεύει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ΤΟΡ

β

διεγείρονται κλώνος 22 (TSC-22) αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως TGF-β

β

-inducible γονιδίου σε οστεοβλαστικά κύτταρα ποντικού. έκφραση TSC-22 επάγεται σε μία ποικιλία κυτταρικών σειρών από ΤΟΡ-

β

, εστέρα φορβόλης, ορό, και προγεστίνης και θετικά ρυθμίζει ο ΤΟΡ-

β

σηματοδότηση [1], [2 ]. TSC-22 περιέχει ένα φερμουάρ λευκίνης που μοιάζει μοτίβο, αλλά δεν έχει μια μοτίβο δέσμευσης DNA στο Ν-τερματική περιοχή. TSC-22 μπορεί να homodimerize και ετεροδιμερίσει με TSC-22 ομόλογο γονίδιο-1 (THG-1), και έχει μεταγραφική δραστηριότητα καταστολέα [3].

Μερικοί ερευνητές έχουν εντοπίσει οι φυσιολογικοί ρόλοι των TSC-22 στην αναπτυξιακή διαδικασία. TSC-22 είναι απαραίτητη για την γαστριδίωση κατά την πρώιμη εμβρυογένεση στο

Xenopus laevis

[4] και για την ωογένεση σε

Drosophila

[5]. Έχει επίσης προταθεί ότι TSC-22 επάγει ερυθροειδή κύτταρα, και Cardiac διαφοροποίηση μυοϊνοβλάστη μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφική δραστικότητα Smad3 και Smad4, και ανταγωνίζεται την Smad7 σε απόκριση σε ΤΟΡ-

β

-εξαρτώμενη σηματοδότηση [6], [ ,,,0],7].

Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στις λειτουργίες καταστολή του όγκου των TSC22. TSC22 πιστεύεται ότι είναι ένας ισχυρός καταστολέας όγκων σε σιελογόνους καρκινικά κύτταρα [8], [9] ανθρώπινα κύτταρα γαστρικού καρκινώματος [10], ηπατικό καρκίνωμα [11], τα ανθρώπινα αστροκυτταρικές όγκους [12], και μεγάλα κοκκώδη λευχαιμίας λεμφοκυττάρων [13]. Οι λεπτομερείς μηχανισμοί της λειτουργίας καταστολής του όγκου του TSC22 έχουν αναφερθεί μαζί με την υπόθεση ότι η TSC-22 καταστέλλει την έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων

Gadd45b

και

Lzts2

[11], αρνητικά ρυθμίζει Ras /Raf σηματοδότησης [14] και να συμμετέχουν στην TGF-β-μεσολάβηση θάνατο γαστρικού καρκινώματος σε ένα caspase3-εξαρτώμενο τρόπο [10]. Από την άλλη πλευρά, TSC22 μεσολάβηση αποπτωτική δραστικότητα αναστέλλεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ TSC-22 και fortillin, ακολουθούμενη από οδηγώντας σε TSC-22 αποσταθεροποίηση [15].

(Α) Ολικό RNA παρασκευάστηκε από ασθενείς ‘ δείγματα του καρκίνου και το

επίπεδο TSC-22

mRNA στη συνέχεια αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Cx? αύξων αριθμός δειγμάτων ιστού του ασθενούς. (Β)

HeLa

και

Caski

κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-

TSC-22

ή Ad-

LacZ

. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με ανάλυση ΜΤΤ για να αναλύσει τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων. (C)

HeLa

κύτταρα μολυσμένα με Ad-

TSC22

ή Ad-

LacZ

καλλιεργήθηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ ). Ο πληθυσμός υπο-G1 κυττάρων (νεκρών κυττάρων) και το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των ΡΙ-βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά ΡΙ-χρώση. δοκιμασία (D) κατάτμηση του DNA πραγματοποιήθηκε με την απομόνωση χρωμοσωμικού DNA από 1 × 10

6 αριθμό

HeLa

και

Caski

κύτταρα μολυσμένα με Ad-

TSC22

ή ad-

lacZ

για 72 ώρες (αριστερά). Μετά τη μόλυνση 3 ημερών Διοικητικής

TSC-22,

p53, Puma, p21, Ε6 και έκφραση TSC22 αναλύθηκαν με Western υβριδισμού (δεξιά).

Η

p53 είναι μια καλά γνωστό καταστολέα γονίδιο όγκων που δρα ενεργοποιώντας τη μεταγραφή των στοχευμένων γονιδίων του όπως ρ21, Puma,, PKR και ΒΑΧ [16] – [18]. Οι λειτουργίες του ρ53 ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως φωσφορυλίωση, ακετυλίωση, και ουβικιτινίωση. Είναι καλά κατανοητό ότι η ρ53 επίπεδα ρυθμίζονται αυστηρά από MDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση μέσω ενός αυτόματου ρυθμιστικών βρόχος ανάδρασης [19], [20]. Περιστασιακά, η ρύθμιση της έκφρασης p53 συσχετίζεται με ογκογένεση μέσω λοίμωξης από τον ιό του ανθρώπινου θηλώματος εκφράζει Ε6, η οποία οδηγεί σε διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη αποικοδόμησης της ρ53 [21], [22]. Ακόμη και αν η ρύθμιση της ρ53 έχει εξεταστεί μέσω πολλαπλών διαδρομών που σχετίζονται με ογκογένεση, πολλά ερωτήματα παραμένουν σχετικά με το μηχανισμό αναστολής όγκου της οδού ρ53.

Δεδομένου ότι ο μηχανισμός που υπογραμμίζει το δίκτυο των ογκοκατασταλτικών γονιδίων δεν έχει ακόμη ρητά διευκρινιστεί, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών του προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε καρκινικό ιστό για να βρουν νέα γονίδια των όγκων που σχετίζονται με. Βρήκαμε ότι TSC-22 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τη νέα λειτουργία του TSC-22 κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Ως εκ τούτου, εκτελείται μία δύο-υβριδίων ζυμομύκητα δοκιμασία στην οθόνη για νέες πρωτεΐνες TSC-22-δέσμευσης. Από αυτό, p53 ταυτοποιήθηκε ως TSC-22 πρωτεΐνη δέσμευσης. Βρήκαμε επίσης ότι η TSC-22 θα μπορούσε να ενισχύσει τις δραστηριότητες της ρ53 μέσω της αναστολής της HDM2 και Ε6 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση με απευθείας σύνδεση προς ρ53. Από την άλλη πλευρά, TSC-22 υπερ-έκφραση σταθεροποιημένο επίπεδο πρωτεΐνης ρ53, οδηγώντας σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο και αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τέλος, ο ρυθμός ανάπτυξης των όγκων μειώθηκε ισχυρά με την έκφραση του TSC-22 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι TSC-22 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μέσω της ρύθμισης της ρ53 ουβικουϊτινίωση.

(Α) TSC-22 και ρ53 cDNA κατασκευάσματα συν-μετασχηματιστούν σε κύτταρα ζύμης EGY48 να δοκιμή για την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μέσα στο σύστημα δύο υβριδίων ζύμης. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μέσο που στερείται λευκίνης (αριστερά) και για έκφραση β-γαλακτοσίδη (δεξιά). (Β)

HeLa κύτταρα και

Caski

κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-

TSC-22

για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδα Western με το αντίσωμα DO-1 έναντι ρ53, το αντίσωμα αντι-TSC-22, και αντι-β-ακτίνης αντίσωμα ως έλεγχος φόρτωσης. (C)

HeLa

κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μα Flag-TSC-22 φορέα έκφρασης. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, ρ53, Puma, ρ21, και η έκφραση TSC22 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western και ημι-ποσοτική RT-PCR με πρωτεΐνη και το ολικό RNA ελήφθη από κάθε κυτταρική γραμμή. (D)

HeLa

κύτταρα που εκφράζουν σταθερά shRNA ειδικό για TSC-22 και μη-στόχευσης ελέγχου shRNA αναλύθηκαν για να προσδιοριστούν τα επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA έκφραση της ρ53 και Puma. (Ε) Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της p53RE (υπεύθυνος στοιχείο) καθοδηγούμενου προαγωγού αξιολογήθηκαν με την επιμόλυνση των αναφερόμενων ποσότητα Flag-TSC-22 πλασμιδίου σε

HeLa

κυττάρων (άνω πάνελ). Δραστηριότητα του p53RE-προαγωγός αξιολογήθηκε σε

sh-con

και

sh-TSC-22

εκφράζουν

HeLa

κύτταρα (κάτω τμήμα) από δοκιμασίες λουσιφεράσης. (F) Ένα μg Σημαία-TSC-22 ή Flag-παρωδία φορέας επιμολύνθηκε σε

p53

+ /+ ή

p53

– /-

HCT116

κύτταρα. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα κυττάρων αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (G) Σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 αξιολογήθηκε σε

HeLa

κύτταρα μολυσμένα με Ad-

TSC-22

ή Ad-

LacZ

. 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κυκλοεξιμίδιο (50 μg /mL) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1) με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης.

Η

Αποτελέσματα

TSC22 αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου

προκειμένου να αναλυθεί το ιδιαίτερο προφίλ γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του τραχήλου, πραγματοποιήσαμε ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών με cDNA παρασκευασμένη από καρκίνο του τραχήλου καρκινικούς ιστούς των ασθενών. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας έδειξαν ότι το

TSC-22

γονιδιακή έκφραση ήταν αισθητά μειωμένη σε όλα τα δείγματα καρκίνου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια διεξάγεται ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR) για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων μικροσυστοιχίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α,

επίπεδα TSC 22-

έκφραση mRNA σε καρκινικούς ιστούς των ασθενών ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με εκείνες σε φυσιολογικό ιστό.

Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν σε περαιτέρω ερωτήσεις. Το πρώτο ερώτημα ήταν εάν TSC-22 θα μπορούσε να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ή όχι. Ως εκ τούτου, έχουμε μολυνθεί

HeLa

(HPV-18) και

Caski

(HPV-16) κυττάρων με αδενοϊό που εκφράζει

TSC-22

ή

LacZ

(έλεγχος λοιμώξεων). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, οι αναλογίες του πολλαπλασιασμού αμφοτέρων των κυττάρων μειώθηκαν σημαντικά από μόλυνση με Ad-

TSC-22

. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον TSC-22 θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης στο

HeLa

κύτταρα. Βρήκαμε ότι ο πληθυσμός G0 /G1 αυξήθηκε δραματικά μεταξύ των Ad-

TSC-22-

μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη σε Ad-

LacZ-

μολυσμένα κύτταρα μέσα σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση. Επιπλέον, τα περισσότερα Ad-

TSC-22-

κύτταρα μολυσμένα υπέστησαν απόπτωση σε προχωρημένο στάδιο (Εικόνα 1Γ). Είμαστε δίπλα αξιολόγησε τον κατακερματισμό χρωμοσωμικό-DNA για να παρατηρήσουν το TSC-22-επαγόμενη απόπτωση σε

HeLa

και

Caski

κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Δ, χρωμοσωμικό DNA από Ad-

TSC-22

-μολυσμένα

HeLa

και

Caski

κύτταρα έδειξαν πολύ υψηλό επίπεδο κατακερματισμού. Εκτός αυτού, τα επίπεδα έκφρασης p21 (αναστολέας του κυτταρικού κύκλου) και PUMA (απόπτωση επαγωγέα) ήταν σημαντικά αυξημένη σε Ad-

TSC-22

μολυνθεί

HeLa

και

Caski

κυττάρων (Σχήμα 1D δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν πιο σημαντική σε χρονίως HPV18 μολυσμένα

HeLa

κυττάρων. p53 και το επίπεδο TSC22 σε κύτταρα HeLa μόλις που ανιχνεύθηκαν συγκρίσεις (δ) CaSki κύτταρα (Σχήμα 1D δεξιό πλαίσιο). Θεωρούμε ότι οι διαφορετικές εκφράσεις τους, που προκαλούνται από το διαφορετικό ορότυπο του ιού HPV. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπερ-έκφραση της επαγόμενης TSC-22 υψηλά επίπεδα κυτταρικού θανάτου. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι TSC-22 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αυχενική την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου.

εκτοπικά εξέφρασε TSC-22 αλληλεπιδρά με εκτοπικά εξέφρασε p53 σε

Η1299

κύτταρα. Δύο μα Flag-TSC-22 φορέα έκφρασης συνδιαμολύνθηκε με φορέα έκφρασης Flag-p53 (Α) ή ένα μη-tagged φορέα έκφρασης ρ53 (Β) σε

Η1299

κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 100 mm. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, κυτταρικά λύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ρ53 (DO-1) (Α) ή αντι-Flag (Β) μονοκλωνικό αντίσωμα. Τα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο με HRP αντι-Flag (Α) ή αντι-ρ53 (FL393) (Β) μονοκλωνικό αντίσωμα. (C-D) TSC-22 αλληλεπιδρά με ενδογενή ρ53. Εκτοπικά εκφραζόμενη TSC-22 αλληλεπιδρά με ενδογενή ρ53 σε κύτταρα. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2 μα Flag-TSC-22 πλασμίδιο για 48 ώρες. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-ρ53 (DO-1) μονοκλωνικό αντίσωμα, ανοσοσφαιρίνη ποντικού G (IgG) (C), ή (D) μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Flag. Τα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο με HRP αντι-Flag (C) ή αντι-ρ53 αντίσωμα (FL393).

Η

TSC-22 Συνδέεται προς

σ

53 σε ένα δύο-υβριδίων ζυμομύκητα Δοκιμασία

Όπως φαίνεται από τα δεδομένα μας, TSC-22 συμβάλλει στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και κυτταρικό θάνατο. Αυτό ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν ότι TSC-22 είναι ένας δυνητικός καταστολέας όγκων [8] – [11], [13], [23] – [25]. Για να φωτιστούν οι μηχανισμοί που διέπουν τη λειτουργία αυτή, θα διαλογή για TSC-22-δεσμευτικές πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας μία δύο υβριδίων ζύμης δοκιμασίας. Μέσω αυτού, p53 ταυτοποιήθηκε ως TSC-22-δέσμευσης πρωτεΐνης (Εικόνα 2Α, αριστερό πάνελ). Η αλληλεπίδραση μεταξύ TSC-22 και ρ53 έτσι αποδεικνύεται

in vitro

τόσο κυτταρική ανάπτυξη και μία δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης (Σχήμα 2Α, δεξί πάνελ).

Προσδιορισμός των επιπτώσεων TSC- 22 στο

σ

53

για την καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων της TSC-22 για ρ53,

HeLa

και

Caski

κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-

TSC-22

ή

LacZ

για την αύξηση χρονικές περιόδους. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα της ενδογενούς ρ53 ήταν σημαντικά αυξημένα με επιμόλυνση του Ad-

TSC-22

σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Η ενίσχυση της έκφρασης p53 ήταν πιο σημαντική στο

HeLa

κύτταρα από ό, τι στο

Caski

κύτταρα. Για να τηρηθεί η ενίσχυση της δραστηριότητας του γονιδίου στόχου p53 από την έκφραση της TSC22, Flag-tagged TSC-22 εισήχθη στο

HeLa

κύτταρα. πρωτεΐνη ρ53 και τα γονίδια-στόχους της, συμπεριλαμβανομένων των ρ21 και πούμα, ήταν σαφώς επάγεται από Flag-

TSC-22

έκφρασης (Σχήμα 2C). Αντίθετα, χτυπώντας κάτω TSC-22 στο

HeLa

κύτταρα μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης του p53 και PUMA (Σχήμα 2D). Ωστόσο, το επίπεδο του mRNA p53 δεν επηρεάστηκε από νοκ-κάτω και πάνω-έκφραση της TSC-22 (Σχήμα 2C και 2D, κάτω πίνακα).

Για να προσδιορίσετε αν δραστηριότητας ρ53 ρυθμίζεται από TSC-22 έκφρασης στο

HeLa

κύτταρα, εκτιμήσαμε την

p53RE

(υπεύθυνη στοιχείο) δραστηριότητα καθοδηγούμενου υποκινητή με TSC-22 έκφρασης και knock-down της TSC-22 στο

HeLa κύτταρα

. Ένας υποκινητής που φιλοξενούν ένα

p53RE

ενεργοποιήθηκε με TSC-22 έκφραση σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Από την άλλη πλευρά, η δραστικότητα προαγωγέα μειώθηκε με TSC-22 knock-down. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρ53-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική δραστηριότητα ρυθμίζεται από TSC-22 (Σχήμα 2Ε). Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι μειώσεις σε PUMA και ρ21 που προκαλείται από την άμεση ρύθμιση του p53 με TSC-22, Flag-tagged

TSC-22

πλασμίδιο εισήχθη στο

HCT116 p53

+ /+

και

p53

– /-

κύτταρα. Ενισχυμένη έκφραση της PUMA παρατηρήθηκε σε

p53

+ /+

αλλά όχι

p53

– /-

κύτταρα (Σχήμα 2F). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η ρύθμιση της PUMA και p21 από TSC22 εξαρτάται από την p53. Για να διερευνήσουν περαιτέρω την ενίσχυση της p53 με TSC-22, αξιολογήσαμε τη σταθερότητα p53 σε Ad-

TSC-22

ή Ad-

LacZ

μολυνθεί

HeLa

κυττάρων μετά τη θεραπεία κυκλοεξιμίδιο . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 G, Ad-

TSC-22

ενισχύεται σημαντικά και σταθεροποιήθηκε ενδογενή επίπεδα ρ53. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι TSC-22 προάγει την λειτουργία καταστολέα όγκου της ρ53 με την ενίσχυση της σταθερότητας της πρωτεΐνης ρ53.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα δείχνει το cDNA κατασκευάσματα για τη σημαία-tagged μεταλλάξεις απαλοιφής ρ53 και πλήρους μήκους ρ53 , και υποδεικνύει την περιοχή δέσμευσης TSC22. (Β)

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια που κωδικοποιούν Flag-tagged μεταλλάξεις διαγραφής ρ53 μαζί με το Flag-TSC-22 πλασμίδιο. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με τον πολυκλωνικό FL393 αντίσωμα αντι-ρ53 (αριστερά) ή DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την Ν-τερματική περιοχή (δεξιά), που ακολουθείται με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Προϊόντα λύσης (5%) επίσης φορτώθηκαν σε πηκτώματος SDS για κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-Flag (κάτω μέρος της κάθε πίνακα). (C) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τα κατασκευάσματα cDNA των Flag-tagged TSC-22 μεταλλάξεις διαγραφής (αριστερό πάνελ).

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια που κωδικοποιούν τις Flag-tagged TSC22 μεταλλάξεις απαλοιφής μαζί με το πλασμίδιο Flag-p53. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ρ53 (FL393)? συν-ανοσοκαταβυθίστηκε TSC22 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας το συζευγμένο με HRP-αντι Flag αντίσωμα (δεξιά, μεσαίο πλαίσιο). Λύμα (5%) αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-Flag (δεξιά, κάτω πίνακα).

Η

TSC-22 Συνδέεται με

σ

53

in vivo

η

Για να προσδιορίσετε αν TSC-22 αλληλεπιδρά με το p53 σε κύτταρα θηλαστικών, που επιμολύνονται

Η1299

ανθρώπινο πνεύμονα μη μικρών κυττάρων καρκίνωμα με το πλασμίδιο έκφρασης Σημαία-TSC22 και ^ έκφραση p53 πλασμίδιο, και στη συνέχεια διεξήχθη δοκιμασίες συν-ανοσοκαταβύθιση και Western blot. Βρήκαμε ότι TSC-22 ειδικά συν-ανοσοκαταβυθίζεται με ρ53 σε κύτταρα που εκφράζουν τόσο Flag-TSC22 και ρ53, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν είτε μόνη πρωτεΐνη (Σχήμα 3Α). Αντιστρόφως, ρ53 ειδικά συν-ανοσοκατακρημνίστηκαν με TSC-22 με το αντίσωμα αντι-Flag (Σχήμα 3Β), υποδηλώνοντας μία αλληλεπίδραση μεταξύ TSC-22 και ρ53. Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να επιβεβαιώσει την ενδογενή αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και TSC-22. Από τη στιγμή που δεν θα μπορούσε να αγοράσει ένα κατάλληλο TSC-22 αντίσωμα για χρήση σε ένα πείραμα συν-ανοσοκαταβύθιση, αυτή η αλληλεπίδραση επιβεβαιώθηκε με αμοιβαία συν-ανοσοκατακρήμνιση με ενδογενή ρ53 και εξωγενώς εκφράζονται Flag-tagged TSC-22 σε κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν υψηλά επίπεδα της ρ53 (Σχήματα 3C και D). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TSC-22 αλληλεπιδρά άμεσα με p53.

TSC-22 Συνδέεται με p53 στην Περιφέρεια συμπεριλαμβανομένων των αμινοξέων 100 έως 200

Για να καθορίσει περαιτέρω την περιοχή απαραίτητο για τη σύνδεση TSC-22 προς ρ53, δημιουργήσαμε αρκετές μεταλλάξεις διαγραφής ρ53 (Σχήμα 4Α). Έκφραση πλασμίδια των p53 και TSC-22 διαμολύνθηκαν σε

Η1299

κύτταρα μαζί ή μόνοι τους. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α και Β, TSC-22 ήταν σε θέση να συνδέεται με το ρ53 περισσότερες επιμέρους μεταλλάξεις διαγραφής συμπεριλαμβανομένων ρ53

1-300, ρ53

101 – 393, και ρ53

1-200. Ωστόσο, η περαιτέρω διαγραφή ενός τμήματος της εσωτερικής περιοχής του τομέα δέσμευσης DNA, όπως p53

1-100, p53

201-393, p53

301-393 και p53

201-300, κατήργησε δέσμευσης ρ53 TSC22 (Σχήματα 4Α και Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιοχή που περιλαμβάνει αμινοξέα 100-200, το οποίο είναι ένα μέρος του τομέως ρ53 δέσμευσης DNA, είναι απαραίτητη για την πρόσδεση TSC-22. Στη συνέχεια, για να προσδιορίσει την περιοχή σύνδεσης ρ53 της TSC-22, Flag-tagged κολοβωμένη TSC-22 μεταλλάκτες που το καθένα περιείχε ένα α-έλικα εκφράστηκαν με ρ53 όπως φαίνεται στο Σχ. 4C. Σε συνανοσοκαθίζησης πειράματα χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1), TSC-22

54-154 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με ρ53, αλλά TSC-22

1-110 και TSC-22

54-110 δεν ήταν. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρ53 συνδέει τα αμινοξέα 110 έως 154 της TSC-22. Δυστυχώς, δεν μπορέσαμε να επιβεβαιώσει περαιτέρω την λεπτομερή αλληλεπίδραση των p53-TSC-22, επειδή TSC-22

110-154 δεν ήταν εκφράστηκε στο πείραμά μας (Σχήμα 4C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι TSC-22 και p53 αλληλεπιδρούν σε συγκεκριμένους τομείς σε κάθε πρωτεΐνη.

(Α) TSC22 αναστέλλει HDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση p53.

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) για 5 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ. Ουβικουιτινωμένης ρ53 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1). Ουβικουιτινωμένης p53 υποδεικνύεται ως Ub (n) -ρ53 (άνω πάνελ). Η έκφραση του συνόλου των p53, οι πρωτεΐνες HDM2, Flag-TSC-22 και ΗΑ-Ub φαίνονται στο κάτω πάνελ. (Β) TSC-22 δεν διακόπτει την αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και HDM2.

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με Flag-p53 μαζί με Flag-TSC-22 ή Flag-mock φορέα υπό την παρουσία ενός φορέα έκφρασης HDM2. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με το αντι-p53 (DO-1) αντίσωμα που ακολουθείται από κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Lysate (5%) αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα (κάτω πλαίσιο). (C) TSC-22 αναστέλλει E6 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση ρ53.

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια παρουσία ενός φορέα έκφρασης ΗΑ-Ub. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) για 5 ώρες πριν από την συγκομιδή. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ. Ουβικουιτινωμένης ρ53 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με το αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1). Ουβικουιτινωμένης p53 υποδεικνύεται ως Ub (n) -ρ53 (άνω πάνελ). Η έκφραση του συνόλου των p53, οι Myc-E6, Flag-TSC-22, και ΗΑ-Ub πρωτεΐνες φαίνονται στο κάτω πάνελ. (D) TSC-22 διαταράσσει ουβικουϊτινίωση της p53 στο

HeLa

κύτταρα.

HeLa

κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με σημαία-TSC-22 ή Flag-παρωδία φορέα και φορέα έκφρασης ΗΑ-Ub. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ MG132 για 5 ώρες προ της συγκομιδής. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ. Ουβικουιτινωμένης ρ53 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1). (Ε) Stable TSC-22 knock-down ή ελέγχου

HeLa

κύτταρα επεξεργάστηκαν με 20 μΜ MG132 για 5 ώρες προ της συγκομιδής. Ουμπικουιτίνωση της p53 αναλύθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

Η

TSC22 Αναστέλλει HDM2 και Ε6 μεσολάβηση ρ53 πολυ-ουβικουϊτινίωση

Για να προσδιορίσετε αν ενίσχυση της σταθερότητας p53 με TSC-22 οφείλεται στην αναστολή του p53 ουμπικιτινίωσης,

Η1299

κύτταρα επιμολύνθηκαν με HDM2, ρ53, και TSC-22 πλασμίδια έκφρασης, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος επί 6 ώρες για τη διεξαγωγή

in vivo δοκιμασίες

ουβικιτινίωση . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, p53 ήταν ιδιαίτερα ουβικουιτινωμένης με την έκφραση του HDM2. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω HDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση p53 αναστάλθηκε σημαντικά με την έκφραση του TSC-22 (Σχήμα 5Α). Εμείς δίπλα ήθελε να προσδιοριστεί αν η αναστολή της HDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση ρ53 με TSC-22 προκαλείται από διακοπή της αλληλεπίδρασης μεταξύ HDM2 και ρ53. Ως εκ τούτου, εισαγάγαμε ρ53, HDM2, και TSC22 πλασμίδια έκφρασης σε

Η1299

κυττάρων όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β. ρ53 συνέχεια ανοσοκαταβυθίστηκαν από τα κυτταρικά εκχυλίσματα με το αντίσωμα DO-1. Είναι ενδιαφέρον, αυτό το πείραμα έδειξε ότι η p53 ήταν ταυτόχρονα δεσμεύεται να HDM2 και TSC-22. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση ρ53 HDM2 δεν διακόπηκε από την έκφραση του TSC-22. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TSC-22 μπορεί να προστατεύσει από ρ53 HDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση με απευθείας σύνδεση προς ρ53 σε μία περιοχή χωριστή από την θέση δέσμευσης HDM2.

(Α) και HDM2 Myc-E6 επιμολύνθηκαν με υποδεικνυόμενη πλασμιδίων σε

Η1299

κύτταρα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) για 5 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ. Ουβικουιτινωμένης ρ53 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1). Ουβικουιτινωμένης p53 υποδεικνύεται ως Ub (n) -ρ53 (άνω πάνελ). Η έκφραση του συνόλου των p53, οι πρωτεΐνες HDM2, Flag-TSC-22 και ΗΑ-Ub φαίνονται στο κάτω πάνελ. (Β) Flag-tagged αγρίου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένης TSC22

1-110 συν-επιμολύνθηκε με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια σε

Η1299

κύτταρα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) για 5 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ. Ουβικουιτινωμένης ρ53 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-ρ53 (DO-1). Ουβικουιτινωμένης p53 υποδεικνύεται ως Ub (n) -ρ53 (άνω πάνελ). Η έκφραση του συνόλου των p53, οι πρωτεΐνες HDM2, Flag-TSC-22 και ΗΑ-Ub φαίνονται στο κάτω πάνελ. (Γ) Nude ποντίκια εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6

HeLa κύτταρα

με υποδόρια ένεση. Υποδόρια όγκοι που προέρχονται από το

HeLa

κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορείς αδενοϊού όπως υποδεικνύεται. Οι όγκοι των όγκων δείχνονται ως μέση τιμή από τουλάχιστον πέντε ποντικούς ανά ομάδα (η = 10 έως 14 ανά ομάδα). Μπαρ = SD. (D) Επίδραση της TSC-22 αγωγή σχετικά με το επίπεδο έκφρασης της ρ53 σε όγκους που προέρχεται από κύτταρα HeLa αποκόπηκαν σε 27

ης ημέρας μετά τη θεραπεία, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωση από τα τρία δείγματα από κάθε ομάδα.

Η

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να δείξει ότι η TSC-22 μπορεί να προστατεύσει p53 από Ε6 μεσολάβηση ουμπικουιτίνωση επειδή η Ε6 και HDM2 τομείς της p53 επικάλυψη δεσμευτική. p53 ήταν ιδιαίτερα ουβικουιτινωμένης με την έκφραση του Ε6 σε

Η1299

κύτταρα (Σχήμα 5C, λωρίδα 3)? Ωστόσο, περαιτέρω έκφραση της TSC-22 μπλοκάρει σαφώς Ε6 μεσολάβηση ρ53 ουβικιτινίωση (Σχήμα 5C, λωρίδα 4). Εμείς επόμενο χρησιμοποιείται

HeLa

κύτταρα που εκφράζουν συντακτικά E6 να εξετάσει TSC-22-διαμεσολαβούμενη σταθερότητα p53 υπό φυσιολογικές συνθήκες. Ουβικιτινίωση ρ53 αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία MG132 στα κύτταρα. Αντίθετα, αυτή η ουβικιτινίωση εξαφανίστηκε σαφώς από υπερ-έκφραση του TSC-22 (Σχήμα 5 D). p53 ουβικιτινίωση διασώθηκε από την έκφραση των shRNA ειδικού για TSC-22 σε

HeLa

κυττάρων απουσία του MG132 (Σχήμα 5Ε, Λωρίδα 2). Ωστόσο, η διαφορά στο επίπεδο του p53 ουβικιτίνωσης δεν ήταν σημαντική μεταξύ των

sh-con

και

sh-TSC-22

κύτταρα παρουσία του MG132. Ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση της TSC-22 για p53 ουμπικουιτίνωση από την έκφραση τόσο HDM2 και Ε6. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, το επίπεδο της p53 ουβικιτινίωση δραματικά επάγεται τόσο από HDM2 και Ε6. Ωστόσο και τα δύο HDM2 και Ε6 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση ρ53 σφικτά διακόπτεται από TSC-22 έκφρασης (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, ελέγξαμε κατά πόσο η αλληλεπίδραση TSC-22-ρ53 είναι απαραίτητη για την αναστολή της ρ53 ουβικουϊτινίωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, C-τερματική διαγραφή μεταλλάγματος TSC-22

110 το οποίο δεν αλληλεπιδρά με ρ53 (Σχήμα 4C), δεν ανέστειλε την HDM2 και Ε6 μεσολάβηση-p53 ουβικιτινίωση (Σχήμα 6Β). Αυτό το αποτέλεσμα αποκαλύπτουν ότι TSC-22 αναστέλλει την ουμπικουιτίνωση p53 μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι TSC-22 αλληλεπιδρά άμεσα με την ρ53 και δεσμεύει την Ε6 και /ή HDM2-medidated ουβικουϊτινίωση ρ53, που ακολουθείται από τη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης ρ53.

TSC-22 καταστέλλει την ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια

επόμενο καθοριστεί αν TSC-22 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Εκθετικά αναπτυσσόμενα

HeLa

τραχήλου καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν υποδόρια σε ανοσολογική ανεπάρκεια BALB /c γυμνά ποντίκια. Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε περίπου 100 mm

3, 1 × 10

9 pfu του αδενοϊού που εκφράζουν TSC-22 ή

LacZ

εγχύθηκαν εντός των όγκων. Μετά από τρεις διαδοχικές ενδονεοπλαστική ενέσεις αδενοϊού, τα ζώα (5-7 ανά ομάδα) παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου. Η ανάπτυξη του όγκου και η μορφολογία αναλύθηκαν πάνω από 30 ημέρες. Το Σχήμα 6C δείχνει ότι η μάζα του όγκου σε ποντικούς που ενέθηκαν με Ad-TSC-22 ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους όγκους ενέθηκαν με Ad-

LacZ

ή που ήταν χωρίς θεραπεία. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της TSC-22 για τη σταθεροποίηση της ρ53 σε ιστούς όγκων που συλλέγονται από τον έλεγχο και ποντικούς που έλαβαν αγωγή TSC-22. TSC-22 διαμόλυνση παρατηρήθηκε να αυξήσει σημαντικά το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ρ53 (Σχήμα 6D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι TSC-22 μπορεί να είναι ένας ισχυρός καταστολέας όγκων σε αυτό το ζωικό μοντέλο.

Συζήτηση

Στην αναζήτησή μας για την ταυτοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, μορφή έκφρασης αναλύσεις εξής πειράματα μικροσυστοιχιών cDNA και RT-PCR αποκάλυψε ότι το

TSC-22

γονίδιο μειώθηκε σταθερά σε ιστούς όγκων (Εικ. 1Α). Αρκετές προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι TSC-22 είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε όγκους του ανθρώπου σιελογόνων αδένων [23], οι όγκοι του ήπατος ποντικού [11], και ανθρώπινων όγκων του εγκεφάλου, όπως αστροκυτώματα [26]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κάτω ρύθμιση του TSC-22 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου σε διάφορους ιστούς. Ωστόσο, αυτές οι προηγούμενες εκθέσεις δεν αντιμετωπιστεί το πρόβλημα της TSC-22 μειώνεται στα καρκινικά κύτταρα. Μια λογική εξήγηση είναι ότι TSC-22 μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι TSC-22 πολλαπλασιασμού δραματικά ανέστειλε κυττάρων και κυτταρικό θάνατο που επάγεται όταν εκφράζεται με ένα σύστημα έκφρασης αδενοϊού (Σχήματα 1 C και D). Παρομοίως, η ενίσχυση της TSC-22 έκφραση συνδέεται με αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου γαστρικού καρκινώματος [10].

Δεδομένου ότι TSC-22 είναι ένας καταστολέας μεταγραφής [3], ο ρόλος του TSC-22 στην καταστολή των όγκων έχει προταθεί από Mari

et al

. [11]. Μέσω πειράματα χρησιμοποιώντας TSC-22 siRNA, η ομάδα αυτή έδειξε ότι το DNA βλάβη που επάγεται γονίδιο 45 β (Gadd45ß) και υποθετικές ογκοκατασταλτικών 2 (Lzts2) είναι υποθετική στόχοι TSC-22. Ωστόσο, οι σχέσεις μέσω των οποίων αυτοί οι στόχοι παίξει καθοριστικό ρόλο στην καταστολή όγκου με TSC-22 δεν ήταν άμεσα αποκαλύπτεται. Στην προσπάθειά μας να βρούμε μια νέα λειτουργία του TSC-22 στην καταστολή των όγκων, εντοπίσαμε μια δεσμευτική πρωτεΐνη σε δύο υβριδίων ζύμης πείραμα. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η TSC-22 συνδέεται απ ‘ευθείας προς ρ53 (Σχήμα 2Α). Παρατηρήσαμε επίσης ότι TSC-22 πάνω ρυθμισμένα τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 χωρίς να μεταβάλλει τα επίπεδα του mRNA p53. TSC-22 υπερ-έκφραση και knock-down πειράματα έδειξαν ότι TSC-22 διευκολύνει τη λειτουργία της ρ53 ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής των γονιδίων στόχων που μπορούν να αναστέλλουν ογκογένεση (Σχήμα 2C-G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 που σχετίζεται με μετα-μεταφραστική ρύθμιση από TSC-22. αλληλεπίδραση TSC22-p53 αξιολογήθηκε με

in vivo

δοκιμασίες στις οποίες ρ53 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με TSC-22 (Σχήμα 3-4).

Η υπερέκφραση του TSC-22 σαφώς απέτρεψε ουβικιτινίωση της p53 από HDM2, το οποίο ρυθμίζει τον κύκλο εργασιών p53 μέσω της δραστηριότητάς της Ε3. Αρκετοί ρυθμιστές ότι η λειτουργία επιρροή p53 μέσω της διαφοροποίησης της αλληλεπίδρασης HDM2-p53 έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων p14ARF [27], [28], ΥΥ1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Numb [ ,,,0],33], και Nucleostemin [34]. . Μεταξύ αυτών των ρυθμιστών, Numb είναι πιο παρόμοιο με TSC-22 επειδή Numb συνδέεται με ρ53 και HDM2, αποτρέποντας έτσι ουβικιτινίωση και αποικοδόμηση της ρ53 [33]

Πράγματι, εντοπίσαμε ένα τριαδικό σύμπλοκο που περιέχει όλα τα τρία πρωτεΐνες: TSC-22, HDM2 και p53. Έτσι, TSC-22 δεν ανταγωνίζονται με HDM2 για σύνδεση με ρ53. TSC-22 δεσμεύεται με τον τομέα δέσμευσης DNA της ρ53, η οποία είναι απαραίτητη για την λειτουργία της πρωτεΐνης ρ53. Ως εκ τούτου, απομένει να καθοριστεί αν αυτή η αλληλεπίδραση είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων του p53 στον πυρήνα.

Είναι ενδιαφέρον, αυξημένο κυτταρικό θάνατο και αναστολή του πολλαπλασιασμού με TSC-22 έκφρασης παρατηρήθηκαν πιο συχνά σε

420−1.75×A

550)]/(time×volume×A

600).

Co-immunoprecipitation

To