Αφηρημένο

Λόγω της σημαντικής φυλετικής και εθνοτικής ποικιλομορφίας στην γενετική παραλλαγή, είμαστε περιέργεια να μάθετε αν το μόνο νουκλεοτίδιο πολυμορφισμοί (SNPs) που προσδιορίζονται σε μελέτες σύνδεσης γονιδίωμα-ευρεία καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ευαισθησία σε πληθυσμούς της Ανατολικής Ασίας είναι επίσης σχετικές με τον πληθυσμό της Ταϊβάν. Επιπλέον, η απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με το πώς οι παραλλαγές αλλάξει CRC κινδύνου και πώς ρυθμιστικά στοιχεία έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης. Για τη διερεύνηση της φυλετικής και εθνοτικής ποικιλομορφίας των γενετικών παραλλαγών CRC-ευαισθησία και τη συνάφειά τους με τον πληθυσμό της Ταϊβάν, είμαστε ο γονότυπος 705 CRC περιπτώσεις και 1.802 υγιείς μάρτυρες (Ταϊβάν Βιοτράπεζα) για δεκαπέντε αναφερθεί στο παρελθόν της Ανατολικής Ασίας CRC-ευαισθησία SNPs και τέσσερις νέες γενετικές παραλλαγές που προσδιορίζονται με αλληλούχιση ολόκληρου exome. Βρήκαμε ότι rs10795668 στο

FLJ3802842

και rs4631962 στο

CCND2

συσχετίστηκε σημαντικά με τον CRC κινδύνου στον πληθυσμό της Ταϊβάν. Το παρελθόν λαθραία rs1338565 συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση του κινδύνου της CRC. Επιπλέον, ο γονότυπος επίσης ιστό όγκου και αντιστοιχισμένο παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από αυτές τις 705 περιπτώσεις CRC για αναζήτηση για LOH, καθώς και τον κίνδυνο που συνδέεται με και προστατευτικά αλληλόμορφα. Ανάλυση ΑΕ αποκάλυψε προνομιακή διατήρηση των τριών SNPs, rs12657484, rs3802842 και rs4444235, σε ιστούς όγκων. rs4444235 έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι είναι ένας cis-δράσης ρυθμιστής του

ΒΜΡ4

γονίδιο? σε αυτή τη μελέτη, το αλληλόμορφο Ο προτίμηση συγκρατείται σε ιστούς όγκων (p = 0,0023). rs4631962 και rs10795668 συμβάλλουν στην CRC κινδύνου της Ταϊβάν και της Ανατολικής Ασίας πληθυσμούς, και τα πρόσφατα εντοπίστηκαν rs1338565 ήταν ειδικά σχετίζεται με CRC, υποστηρίζοντας την εθνοτική πολυμορφία του CRC-ευαισθησίας SNPs. Ανάλυση ΑΕ πρότεινε ότι οι τρεις παραλλαγές κινδύνου CRC, rs12657484, rs3802842 και rs4444235, εμφάνισαν σωματικά αλληλόμορφο-ειδική ανισορροπία και θα μπορούσε να είναι κρίσιμη κατά τη διάρκεια της νεοπλασματικής εξέλιξη

Παράθεση:. Yang CY, Lu RH, Lin CH, Jen CH , Tung CY, Yang SH, et al. (2014) ενός νουκλεοτιδίου πολυμορφισμών που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου Ευαισθησία και απώλεια της ετεροζυγωτίας σε έναν πληθυσμό της Ταϊβάν. PLoS ONE 9 (6): e100060. doi: 10.1371 /journal.pone.0100060

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 22η Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις έρευνας NSC101-2321-B-075-001, NSC 102-2325-B-010-013 και NSC102-2319-B-010-001, Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και στόχος για το κορυφαίο πανεπιστήμιο σχεδίου από το Υπουργείο Παιδείας , Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) επηρεάζει 1,23 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο και προκαλεί 0,6 εκατ θανάτους ετησίως? γίνεται η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στις ανεπτυγμένες χώρες [1]. Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών, η συχνότητα εμφάνισης της CRC έχει αυξηθεί δραματικά στις αναπτυγμένες χώρες της Ασίας, συμπεριλαμβανομένης της Ιαπωνίας, του Χονγκ Κονγκ, τη Σιγκαπούρη, την Κορέα και την Ταϊβάν, και τώρα είναι συγκρίσιμη με εκείνη των δυτικών χωρών [2], [3]. Στην Ταϊβάν, CRC υπήρξε η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του από το 2007 [4], [5]. Ένας αριθμός γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων είναι γνωστό ότι προκαλούν CRC [6] – [9].

Υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ σποραδική εμφάνιση όγκου και επιδεκτικότητα παραλλαγές που φέρεται από ένα άτομο. Δύο τοις εκατό του πληθυσμού της Ευρώπης φέρει πολλαπλές κληρονόμησε αλληλόμορφα χαμηλού κινδύνου που αυξάνουν το ρυθμό της CRC συχνότητα περίπου τέσσερις φορές [10], [11]. Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών, πολλές μελέτες υποψήφιο γονίδιο έχουν αξιολογηθεί κοινή γενετικοί παράγοντες κινδύνου για CRC? Ωστόσο, μόνο μερικά από αυτά έχουν αντιγραφεί σε μεταγενέστερες μελέτες [12]. Πρόσφατες μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος-ευρεία (GWAS) εντοπίστηκαν 15 κοινούς γενετικούς τόπους επιδεκτικότητας για CRC [13] – [21]? Ωστόσο, λιγότερο από το 15% των CRC κληρονομικότητας θα μπορούσε να εξηγηθεί από αυτές τις πρόσφατα ταυτοποιημένα γενετικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των γνωστών παραλλαγών υψηλής διεισδυτικότητας σε γονίδια ευαισθησίας CRC [13], [14].

Η νεοπλασματική εξέλιξης συνδέεται συχνά με τη συσσώρευση γενετικές αλλαγές σωματικών κυττάρων καθώς ο όγκος εξελίσσεται [13] – [20]. Απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) μπορεί να προκληθεί από μετάλλαξη ενός αλληλόμορφου και την απώλεια του άλλου αλληλόμορφου μέσω μιτωτικής μη αποσύνδεση, χρωμόσωμα μη αποσύνδεση, ή φυσική διαγραφή, ακολουθούμενη από reduplication του υπόλοιπου μιτωτικού, χρωμόσωμα ανασυνδυασμό, και μετατροπή του γονιδίου [21] – [23 ]. Ταυτοποίηση των προτύπων LOH γονιδιώματος σε επίπεδο σε όγκους μπορεί να αποκαλύψει τη συγκεκριμένη περιοχή που αγκυροβολεί ογκοκατασταλτικών γονιδίων και προτείνουν νέα μοριακοί μηχανισμοί για καρκινογένεση.

GWAS προσδιορίσει SNPs ότι ανισορροπία σύνδεσης ετικέτα (LD) μπλοκ στο γονιδίωμα, συλλαμβάνοντας έτσι ένα μεγάλο μέρος των κοινών γενετικών παραλλαγών. Δεκαπέντε SNPs που σχετίζονται με CRC στους πληθυσμούς της Ανατολικής Ασίας (rs6687758, rs10936599, rs647161, rs10505477, rs6983267, rs7014346, rs10795668, rs1665650, rs3802842, rs107742124, rs4444235, rs4779584, rs9929218, rs4939827 και rs961253) αξιολογήθηκαν σε ένα πληθυσμό της Ταϊβάν [24] . Ο έλεγχος ελάσσονα συχνότητα αλληλόμορφου του rs10774214, rs647161, και rs16656650 σε 653.291 SNPs στην Ταϊβάν ειδικά προσαρμοσμένη σειρά SNP (Affymetrix Inc.) δεν ήταν διαθέσιμα στη βάση δεδομένων Ταϊβάν βιοτράπεζα? ψάξαμε στην Ταϊβάν τράπεζα, καθώς και προσδιορίζονται rs4631962, rs12657484 και rs1665645, που βρίσκονται σε ισχυρή LD (r

2≥0.8) με τις αρχικές SNPs.

Σε αυτή τη μελέτη, ο όγκος και τα γειτονικά μη-όγκου ιστούς 705 ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο στην Ταϊβάν συλλέχθηκαν και ο γονότυπος σε μια προσπάθεια να αναπαράγουν τα ευρήματα GWAS και αξιολογήσει τη δυνατότητα του αλληλόμορφου ειδικής ανισορροπία σε ιστούς όγκων. Βρήκαμε μια νέα SNP (rs1338565) και δύο που δημοσιεύθηκε SNPs (rs10795668 και rs464631962) που σχετίζονται με CRC κινδύνου και τρεις SNPs (rs12657484, rs3802842 και rs4444235) δείχνει στατιστική σημαντικότητα σε συγκεκριμένες κατακράτηση αλληλόμορφο σε όγκους.

Υλικά και μέθοδοι

πληθυσμός μελέτης και προετοιμασίας του DNA

Η μελέτη περιλάμβανε μια βασισμένη στον πληθυσμό σειρά από 705 ζεύγη όγκων CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών που συλλέγονται από το 2006 στην Ταϊπέι Βετεράνων Γενικά Νοσοκομεία. Όλα τα δείγματα ιστού FFPE διαγνώστηκαν από έμπειρους παθολόγους. Οι ιστοί όγκου αποτελούνται από 50% ή περισσότερο καρκινικά κύτταρα για τη συλλογή DNA. Βλαστικής σειράς DNA που εξάγεται από RNAlater-βυθισμένο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέως εντέρου και των αντίστοιχων όγκων DNA ήταν διαθέσιμα. Τα 1802 άτομα της ομάδας ελέγχου ήταν ανώνυμο υγιείς δότες αίματος από την Ταϊβάν Βιοτράπεζας (https://taiwanview.twbiobank.org.tw/taiwanview/search.do). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων, Ταϊπέι, Ταϊβάν. Το γονιδιωματικό DNA του ζεύγη όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας QIAamp Mini Kit σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Qiagen).

exome Βιβλιοθήκη Παρασκευή και Sequencing

σύλληψη αλληλουχία exome εκτελέσθηκε ακολουθώντας την διαδικασία που προβλέπονται για το SureSelect Πλατφόρμα Agilent (κιτ SureSelect Ανθρωπίνων Όλα εξόνιο V4). Η κατέλαβε βιβλιοθήκη έγινε με ζευγαρωμένα-end 90 βάσης διαβάζει στην πλατφόρμα Illumina HiSeq 2000. Το μέσο βάθος αλληλουχίας είναι πάνω από 100 φορές, και η κάλυψη της περιοχής στόχου είναι τουλάχιστον 99%

αλληλουχίας δεδομένων ανάλυσης:. Ευθυγράμμιση, Variant Κλήση και σχολιασμού

Η ακολουθία του προσαρμογέα στην τα ακατέργαστα δεδομένα απομακρύνθηκε, και η χαμηλή ποιότητα διαβάζει απορρίφθηκαν. Ακολουθία διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς (hg19) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BWA [25]. Η ευθυγράμμιση πληροφορίες αποθηκεύονται σε αρχεία μορφής BAM και για περαιτέρω επεξεργασία, σε συνδυασμό με τον καθορισμό των πληροφοριών σύντροφο ζεύγους να προσθέσετε ανάγνωσης πληροφοριών ομάδας και εις διπλούν σήμανση διαβάζει προκαλείται από αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Η παραλλαγή κάλεσμα και σχολιασμό των επεξεργασμένων αρχείων BAM πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση διαφορετικών προγραμμάτων. Μονού Νουκλεοτιδίου πολυμορφισμοί (SNPs) ανιχνεύθηκαν με SOAPsnp [26] και τα μικρά Insertion /Οι διαγραφές (indels) που ανιχνεύεται από SAMtools και Single νουκλεοτιδίων παραλλαγές (SNVs) ανιχνεύθηκαν με Varscan [27] και τα σωματικά indels ανιχνεύθηκαν με GATK [28].

SNP επιλογής και γονοτυπική

Δεκαεννέα CRC- SNPs ευαισθησία γονότυπος σε όλα τα δείγματα, και ανάμεσά τους, 15 έχουν αναφερθεί να είναι άμεσα ή έμμεσα (LD γ2 & gt? 0.8) που συνδέεται με CRC ευαισθησία σε Ανατολή Ασιάτες [24]. Για την αποσαφήνιση διαστρωμάτωση του πληθυσμού κατά περιπτώσεις και οι έλεγχοι, 44 που χρησιμοποιούνται συχνά ασύνδετες SNPs επίσης ο γονότυπος σε όλες τις περιπτώσεις και τους ελέγχους [29]. SNP γονοτυποποίηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Sequenom MassARRAY. Οι εκκινητές PCR επέκταση και μίας βάσης σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας την Δοκιμασία MassARRAY 3.1 λογισμικό (Sequenom, San Diego, CA). Οι αντιδράσεις PCR σε ένα τελικό όγκο 5 μΐ περιείχε 1 pmol των αντίστοιχων εναυσμάτων, 5 ng γονιδιωματικού DNA και μείγμα αντίδρασης (Sequenom) σε πλάκες 384-φρεατίων. Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 94 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 94 ° C (20 s), 56 ° C (30 s), 72 ° C (60 s), και μία τελική επέκταση 72 ° C για 3 λεπτά. Στη διαδικασία επέκτασης του εκκινητή, κάθε δείγμα μετουσιώθηκε στους 94 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 94 ° C (5 s), 52 ° C (5 s), 72 ° C (5 s). Το φάσμα μάζας από χρονικής ανάλυσης φάσματα ανακτήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο μάζας MassARRAY (Sequenom), και κάθε φάσμα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Sequenom Typer 4,0 λογισμικού (Sequenom) για να εκτελέσει την κλήση γονότυπο SNP.

Στατιστικές αναλύσεις

τεστ χ2

κατά Pearson χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τη διαφορά των SNP αλληλόμορφο και γονότυπο συχνότητες μεταξύ ασθενών και μαρτύρων καλά τον αγώνα. Hardy-Weinberg ισορροπία του κάθε SNP ελέγχθηκε με τη δοκιμασία χ2 καλοσύνη-of-fit για να συγκρίνουν την αναμενόμενη συχνότητα των γονότυπων σε ελέγχους. Οι επιδράσεις των πολυμορφισμών σχετικά με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου εκφράστηκαν ως αναλογίες πιθανοτήτων (OR) με διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (95% ΠΙ), που αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την άνευ όρων ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης. Για την ταυτοποίηση συγκεκριμένων αλληλόμορφων ανισορροπία, ο γονότυπος κάθε SNP (που ονομάζεται με βάση την προεπιλεγμένη αλγόριθμο Sequenom) συγκρίθηκε σε όγκο και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου, και μόνο ασθενείς με βλαστική γραμμή SNP ετερόζυγη κλήσεις χρησιμοποιήθηκαν για ακόλουθη ανάλυση. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των SNP LOH σε καρκινικούς ιστούς. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) χρησιμοποιήθηκε για να διευκρινίσει τη διαστρωμάτωση του πληθυσμού, χρησιμοποιώντας 44 αποσυνδεθεί SNPs. Bonferroni και μετάθεση μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για την προσαρμογή ρ-τιμές σε πολλαπλές συγκρίσεις. Όλες οι παραπάνω στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση έκδοση SAS /STAT 8 λογισμικό (SAS Institute, Cary, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Αποτελέσματα

CRC-ευαισθησία SNP ένωση ανάλυση

Δύο πόροι του CRC υποψηφίων SNPs χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ένα επιλέχθηκε από προηγούμενες Ανατολικής Ασίας άρθρο συνδέσμου CRC-επιδεκτικότητα [24], και ένα άλλο ταυτοποιείται με βάση τα δεδομένα exomic αλληλουχίας σε λίγες καρκινικούς ιστούς σε αυτήν την μελέτη. Με βάση τα αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης [24], 15 SNPs, συμπεριλαμβανομένων rs6687758, rs10936599, rs647161, rs10505477, rs6983267, rs7014346, rs10795668, rs1665650, rs3802842, rs107742124, rs4444235, rs4779584, rs9929218, rs4939827 και rs961253, συσχετίστηκαν με ευαισθησία CRC στην ασιατική πληθυσμού Ανατολή. Παρά το γεγονός ότι μόνο τρεις SNPs έδειξαν περισσότερες στατιστικές συσχετίσεις με ευαισθησία CRC μετά Bonferroni αυστηρή p-value ρυθμιστεί (rs6983267, rs10795668, rs4939827). Λόγω της τρέχουσας περιορισμό των δημόσιων Ταϊβάν Biobank, τρεις από αυτές τις SNPs (3/15) δεν περιλαμβάνονταν στη βάση δεδομένων. Έχουμε επιλέξει rs4631962, rs12657484 και rs1665645 να εκπροσωπεί rs10774214, rs647161 και rs16656650, αντίστοιχα, λόγω της ισχυρής LD (r

2≥0.8) μεταξύ τους.

Εμείς αρχικά έψαξε ένα σύνολο γονιδίων και μεταλλάξεις σε πολύποδες του παχέος για την εκτίμηση μετέπειτα κίνδυνο καρκινογένεσης των ασθενών. Πραγματοποιήσαμε πειράματα exomic-αλληλουχίας σε ζεύγη ιστών από τους επτά ασθενείς CRC (δηλαδή τους ιστούς του καρκίνου, ο καρκίνος-σύγχρονη πολύποδες, και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών) και έξι περιπτώσεις συμπτωματική, μη σχετιζόμενη με τον καρκίνο πολύποδες. Μετά διαφορική ανάλυση, επιλέξαμε 62 CRC καρκινογένεση που σχετίζονται με παραλλαγές γονιδίων που υπάρχουν σε όγκους και καρκίνο σύγχρονη πολυπόδων αλλά απουσιάζει σε φυσιολογικούς ιστούς και παρεπόμενα πολύποδες να επαληθευθεί κατά 47 ζεύγη CRC όγκου και αντιστοιχισμένο κανονική παρακείμενων ιστών από Sequenom MassArray (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ). Εμείς εντοπίστηκαν τέσσερις υποψήφιες SNPs που σχετίζονται με την ευαισθησία CRC σε σύγκριση με το 1802 υγιείς μάρτυρες από την Ταϊβάν Βιοτράπεζα.

συνδυάσαμε 15 αναφερθεί και 4 πρόσφατα εντοπίστηκαν SNPs σε γονοτυπική ανάλυση αυτών των SNPs σε 705 ανεξάρτητα ζεύγη CRC του όγκου και σε συνδυασμό κανονική γειτονικούς ιστούς. Παρά το γεγονός ότι η Ταϊβάν Βιοτράπεζα είναι μια βάση δεδομένων στην οποία εντάχθηκαν τυχαία δείγματα του πληθυσμού και χρησιμεύει ως καλή και δημόσια ελέγχους για άλλα έργα. Λόγω του πληθυσμού διαστρωμάτωση σε αυτούς CRC τους ασθενείς και τους ελέγχους, που ο γονότυπος 44 χρησιμοποιούνται συχνά ασύνδετες SNPs (Πίνακας S1 στο αρχείο S1) και πραγματοποιείται ανάλυση PCA. Δεν υπήρχε διαστρωμάτωση του πληθυσμού μέσα σε αυτά τα δείγματα (Σχήμα S1 στο S1 File), καθώς και το εκτιμώμενο συντελεστή πληθωρισμού (λ = 1.001) ήταν πολύ μικρές, υποδεικνύοντας περιπτώσεις είναι γενετικά ταιριάζουν με τη βάση δεδομένων δημόσιο έλεγχο. Δεκαεννέα SNPs γονότυπος χρησιμοποιώντας το σύστημα MassARRAY στον ιστό μη-όγκου των 705 ασθενών CRC, και σε σύγκριση με τα δεδομένα του 1802 ελέγχων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση του κινδύνου CRC (μη διορθωμένη τιμή p & lt? 0,05) για rs10795668 (OR = 1,13, μη διορθωμένη p-value = 0,03) σε FLJ3802842, rs4631962 (OR = 1.143, μη διορθωμένη p-value = 0.016) σε CCND2 και τα πρόσφατα εντοπίστηκαν rs1338565 (OR = 1,16, μη διορθωμένη p-value = 0,005) σε αλληλόμορφους και αναλύσεις γονοτύπου-based. Για το σκοπό της αντιγραφής αυτών των γνωστών SNPs επιδεκτικότητα CRC, Bonferroni διόρθωση ρ-τιμή ήταν ίσως πολύ αυστηρή καθώς το μέγεθος του δείγματος των ασθενών CRC σε αυτή τη μελέτη ήταν περιθωριακή και αυτά τα SNPs συσχετίστηκαν με CRC. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο αντιμετάθεσης (bootstrap n = 1.000) για να ρυθμίσετε τις p-τιμές, και rs4631962 (προσαρμοσμένη τιμή p = 0,043) και rs1338565 (προσαρμοσμένη τιμή p = 0,015) έδειξαν οριακή σημασία των διαφορών συχνότητας αλληλόμορφου μεταξύ 705 περιπτώσεις και 1802 ελέγχους (Τραπέζι 1). Ένας από τους σκοπούς της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει και να εντοπίσει SNPs που είναι έντονα επιρρεπείς σε CRC στον πληθυσμό της Ταϊβάν, έτσι ώστε το μέγεθος του δείγματος της παρούσας μελέτης είναι αρκετά μεγάλο (& gt? 0,8) για τον εντοπισμό SNP με μεγάλο μέγεθος επίδρασης (αλληλόμορφο διαφορά συχνότητας & gt? 0,05 , τύπου Ι σφάλμα = 0,05) σε μελέτη συσχετισμού περίπτωση ελέγχου. Ωστόσο, μόνο 705 περιπτώσεις και 1.802 έλεγχοι ενδέχεται να είναι ανεπαρκής για τον εντοπισμό CRC-ευαισθησία SNPs με μικρά μεγέθη επίδρασης.

Δεκαπέντε αναφερθεί και τέσσερα πρόσφατα εντοπίστηκαν CRC-ευαισθησία SNPs γονότυπος σε 705 περιπτώσεις και σε σύγκριση με το 1802 υγιή ελέγχου στην Ταϊβάν Δείτε Βιοτράπεζας. Αλληλόμορφων και γονότυπο συχνότητες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας χ2 τεστ. Κόκκινη διακεκομμένη γραμμή δείχνει την p = 0,05. Ο αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική p-value.

Η

SNP γονότυπο-based Τα αλληλόμορφα Ανισορροπία Ανάλυση

Για την ανίχνευση αλληλομόρφων ανισορροπία που σχετίζονται με νεοπλασματικές εξέλιξη, αυτά τα 19 SNPs γονότυπος σε οι ιστοί του όγκου των ίδιων 705 ασθενείς CRC. Μία συντηρημένη μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό συγκεκριμένων αλληλόμορφων γεγονότα ανισορροπία σε αυτά τα δείγματα όγκων. Επειδή οι ιστοί του όγκου είναι εξαιρετικά ετερογενής, ένας απλός και άμεσος τρόπος για τον εντοπισμό αλληλομόρφων ανισορροπία είναι η εφαρμογή καθιερωμένη αλγόριθμο του γονότυπου να καλέσετε αξιόπιστη και εξαιρετικά διατηρημένη γονότυπους SNP. Ως εκ τούτου, εφαρμόζεται το προεπιλεγμένο αλγόριθμο για να καλέσετε τους γονότυπους των 15 SNPs σε δύο ιστούς όγκου και μη όγκου (τα δεδομένα Λεπτομέρεια του γονότυπου φαίνεται στο σχήμα S2 σε S1 αρχείου). Μόνο τα άτομα που μεταφέρουν ετερόζυγο γονότυπο σε μη καρκινικούς ιστούς παρέχονται πληροφορίες για τις ακόλουθες αναλύσεις. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε τους γονότυπους του κάθε SNP του κάθε συνδεδεμένο δειγμάτων για την ανίχνευση γεγονότων LOH, και το ποσοστό LOH κάθε SNP κυμάνθηκε μεταξύ 2 και 36% (Πίνακας 2). Επειδή χρησιμοποιήσαμε ένα συντηρημένο αλγόριθμο (Αλγόριθμος Sequenom Typer) για να καλέσετε SNP γονότυπο των δειγμάτων όγκου, μπορεί να υπάρχει μια προκατάληψη προς την απώλεια αριθμού αντιγράφων. Πενήντα όγκοι έξω από 276 (18%) που σχετίζεται με ετερόζυγη φυσιολογικό ιστό εμφάνισαν ΑΕ σε rs12657484 (Πίνακας 2). LOH στο rs3802842 και rs4444235 συνέβη σε μόνο 7% και 10% των όγκων (Σχήμα 2). Επιπλέον, μετρήθηκε η κατακράτηση μεγάλων αλληλόμορφο κάθε SNP, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Μεταξύ των SNPs, παρατηρήσαμε κάποιες συγκεκριμένες αλληλόμορφα SNPs είχαν άνισα διατηρούνται σε ιστούς όγκων. Σημαντική κατακράτηση του ειδικού αλληλίου ανισορροπία του rs4444235 βρέθηκε σε όγκο (Bonferroni -adjusted p-value = 0,0437? Μη διορθωμένη τιμή ρ = 0.0023), όπως φαίνεται στο σχήμα. 3Β.

Δεκαπέντε αναφερθεί και τέσσερα πρόσφατα εντοπίστηκαν CRC-ευαισθησία SNPs ήταν ο γονότυπος στον όγκο και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου σε 705 περιπτώσεις CRC. Μόνο περιπτώσεις με ετερόζυγη γονότυπους, τα οποία παρέχουν δι-αλληλομόρφων πληροφορίες, χρησιμοποιήθηκαν, και ο συνολικός αριθμός των ενημερωτικών περιπτώσεις που μεταφέρουν ομόζυγη κλήσεις σε ιστούς όγκων μετρήθηκε ως το ποσοστό ΑΕ.

Η

(Α) Το ποσοστό των όγκων με την κατακράτηση αλληλόμορφο κινδύνου. (Β) Η στατιστική σημαντικότητα των παρακρατήσεων αλληλόμορφο κινδύνου. Η διαφορά στην retenion συγκεκριμένων αλληλόμορφων συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας Fisher ακριβής δοκιμών. Κόκκινη διακεκομμένη γραμμή δείχνει p = 0.05. Ο αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική p-value.

Η

Συζήτηση

Η συχνότητα εμφάνισης της CRC έχει ραγδαία αύξηση τις τελευταίες δεκαετίες στις αναπτυσσόμενες χώρες της Ασίας. Ευρωπαϊκή GWAS της ευαισθησίας CRC έχουν αναπαραχθεί στις ανατολικές ασιατικές πληθυσμούς της Ιαπωνίας [30] – [32], τη Σιγκαπούρη [33], το Χονγκ Κονγκ [34], και την Κίνα [35]. Το Προεδρείο της Προαγωγής της Υγείας ανέφερε ότι CRC ήταν η πιο συχνή κακοήθεια στην Ταϊβάν, με την ηλικία τυποποιημένη συχνότητα των 37,1 ανά 100.000 άτομα το 2007 [4], [36]? Σε σύγκριση, το ίδιο έτος είδε ένα ποσοστό περίπου 45 περιπτώσεις ανά 100.000 άτομα στις ΗΠΑ [37]

Πολλά SNPs έχουν χαρακτηριστεί ως υψηλού ή χαμηλού παραλλαγές κινδύνου που συνδέεται με CRC [38] -. [40 ]. Ωστόσο, οι διαφορές μεταξύ των εθνοτήτων και των περιφερειών, γενετικές παραλλαγές (π.χ., LD και αλληλόμορφο συχνότητα), και περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ., το κάπνισμα, το αλκοόλ, και τις συνήθειες διατροφής) έχουν καταστήσει δύσκολο να εντοπιστούν κοινά CRC ευαισθησία τόπους [41], [42] .

σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι rs10795668 και rs4631962, έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως ως CRC ευαισθησία τόποι σε ένα Ανατολικής Ασίας GWAS, συνδέονται επίσης με CRC κινδύνου στον πληθυσμό της Ταϊβάν. Μια οθόνη γονιδίωμα-ευρεία της Ταϊβάν CRC και φυσιολογικά δείγματα παρήγαγε μια θέση υποψηφίου CRC ευαισθησία, rs1338565.

rs10795668 αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με CRC κινδύνου και παρέχει καλύτερη συνολική επιβίωση [34], [35], [43 ] – [45]. Ωστόσο, GWAS και αρκετές μελέτες αναπαραγωγής δεν βρήκε καμία συσχέτιση του κινδύνου αυτής της παραλλαγής στο CRC [46] – [52]. Επιπλέον, οι συχνότητες αλληλόμορφο rs10795668 διαφέρουν μεταξύ της Ευρώπης, της Ιαπωνίας και αφροαμερικάνων πληθυσμού [47]. rs10795668 χαρτογραφεί προς ένα μπλοκ LD 82-kb (8,73 – 8,81 Mb) εντός 10p14 [53], αλλά λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία του SNP και χωρίς γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες είναι παρούσες στην περιοχή που περιβάλλει kb 400. Όπως και οι περισσότερες παραλλαγές του κινδύνου που προσδιορίζονται από GWAS, rs10795668 κατοικεί επίσης έξω από μια περιοχή του γονιδίου κωδικοποίησης? το πλησιέστερο προβλέψει γονίδια είναι BC031880 και LOC389936 βρίσκεται 0,4 Mb και 0,7 Mb μακριά, αντίστοιχα. rs10795668 μπορεί να αυξήσει την έκφραση του

ATP5C1

, το οποίο κωδικοποιεί την υπομονάδα γάμμα του καταλυτικού πυρήνα (F1) του μιτοχονδριακού ΑΤΡ συνθάσης [54]. Το μιτοχονδριακό ΑΤΡ συνθάσης διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην κυτταρική αναπνοή. Το αποτέλεσμα Warburg, η μεταβολική αλλαγή από αναπνοή (στα μιτοχόνδρια) προς γλυκόλυση (στο κυτταρόπλασμα), εμφανίζεται συνήθως σε κύτταρα όγκου [55]. Αυξημένη έκφραση του

ATP5C1

συνδέεται με το Α αλληλόμορφο του rs10795668 θα ήταν συνεπής με τη διατήρηση των δραστηριοτήτων των συνθάσης ΑΤΡ και την κυτταρική αναπνοή και πιθανώς αναστέλλοντας την εξέλιξη του όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Η νέα θέση ευαισθησίας CRC rs10774214, περιφερικά βρίσκεται 150 kb ανάντη του

CCND2

, εντοπίστηκε στην Ανατολική Ασιάτες από GWAS [24]. Έδειξε ισχυρή LD (r

2 = 0,825) με rs4631962, για την οποία η κύρια συχνότητα αλληλόμορφο είναι γνωστή για την υγιή άτομα στην Ταϊβάν Βιοτράπεζα [56]. rs4631962 είναι εγγύτερα βρίσκεται μόλις 10 kb ανοδικά του

CCND2

, το οποίο κωδικοποιεί κυκλίνη D2, ένα μέλος της οικογένειας κυκλίνης D-τύπου.

CCND2

είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητής του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (από G1 προς S φάση) και υπερεκφράζεται σε ένα σημαντικό ποσοστό των ανθρώπινων ορθοκολικών όγκων [57] – [60]. Η υπερέκφραση του

CCND2

είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης σε άτομα με CRC [59].

PARP11

,

C12orf5

,

FGF6

, και

RAD51AP1

βρίσκονται επίσης σε κοντινή απόσταση από το SNP?

C12orf5

και

RAD51AP1

υπερεκφράζονται σε CRC ιστό [60]. rs461962 είναι σε ισχυρή LD με αρκετούς SNPs σε δυνητικές θέσεις παράγοντα δέσμευσης μεταγραφής στη βάση δεδομένων TRANSFAC [60].

Το πρόσφατα ταυτοποιημένα rs1338565 βρίσκεται σε ένα ιντρόνιο του

ZNF239

γονίδιο στο χρωμόσωμα 10q11.22. Δύο γειτονικές SNPs, rs2230660 και rs2230661, παράγουν παραλλαγές εσφαλμένου νοήματος στην περιοχή εξόνιο του

ZNF239

και είναι σε ισχυρή LD με rs1338565. Η βιολογική αιτιολογία για τη σύνδεση μεταξύ των

ZNF239

και CRC δεν έχει διερευνηθεί.

ZNF239

είναι μια πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που αναγνωρίζει τόσο το DNA και το RNA. Αυτή η διπλή συγγένεια υποδηλώνει

ZNF239

εμπλέκεται στη μεταγραφή και μετα-μεταγραφικής ρύθμισης. Ως δέσμευσης DNA μεταγραφικό καταστολέα, καταστέλλει το γονίδιο

IRBP

(interphotoreceptor πρωτεΐνη ρετινοειδή δεσμευτική) μέσω ανταγωνισμού με το

CRX

(κώνος-ράβδος ομοιοκυτίου πρωτεΐνη) μεταγραφικό ενεργοποιητή για τη δέσμευση του DNA [ ,,,0],61]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει

ZNF239

αλληλεπιδράσεις με λαμίνη A /C και το πυρηνικό πλέγμα μπορεί να είναι σημαντική για την ικανότητά του να καταστέλλει μεταγραφή [62], [63]. Πρόσθετες έρευνα μπορεί να δικαιολογείται για την κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους αυτό το SNP σχετίζεται με CRC κίνδυνο.

CRC ευαισθησία που σχετίζεται με γενετικές παραλλαγές έχουν βρεθεί να επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω μακρινά ρυθμιστικά στοιχεία. Η μελέτη μας έδειξε rs4939827 είχε το υψηλότερο ποσοστό του LOH σε ασθενείς CRC (36%). rs4939827 μειώνει

Smad7

έκφρασης, που οδηγούν σε παρεκκλίνουσα TGFβ σηματοδότηση [64]? Ωστόσο, καμία σημαντική διαφορά στα αλληλόμορφα στοχεύονται από ανισορροπία ανιχνεύθηκε σε rs4939827 στο 18q21 (p = 0.17) [64], [65]. Δεδομένου ότι οι ανεπαίσθητες αλλαγές στο μακρινό ρυθμιστικά στοιχεία οδηγήσει σε χαμηλή διεισδυτικότητα της ευαισθησίας του καρκίνου και να παίξουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων, μεταβολές σε αρκετές θέσεις του

BMP4

σε 14q22 και

GREM1

στο 15q13 επηρεάζουν TGFβ σηματοδότηση [43].

rs3802842 και rs4444235 έχουν συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο CRC σε διαφορετικούς πληθυσμούς, αλλά η συσχέτιση αυτή δεν επαναλήφθηκε στη μελέτη μας. rs12657484 έδειξε ισχυρή LD (r

2 = 0,926) με rs647161, το οποίο είναι ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε CRC θέση ευαισθησίας στην Ανατολική Ασία [24]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε rs3802842 και rs4444235 δεν έχουν καμία ανισορροπία αλληλομόρφων του πληθυσμού της Φινλανδίας [66]. Ωστόσο, η μελέτη μας απέδειξε rs12657484, rs3802842 και rs4444235 έκθεμα ΑΕ στον πληθυσμό της Ταϊβάν.

Rs1265484 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5q31.1, όπου μια συστάδα των SNPs σχετίζονται με CRC κίνδυνο [24]. Των γονιδίων σε αυτήν την περιοχή (συμπεριλαμβανομένων των

PITX1

,

CATSPER3

,

PCBD2

,

MIR4461

, και

H2AFY

),

PITX1

είναι πιο κοντά στην rs12657484 (περίπου 134 kb ανάντη) από rs647161 (περίπου 157 kb ανάντη). Η

PITX1

γονιδίου (που κωδικοποιεί ζεύγη που μοιάζει ομοπεδίου 1) έχει αναφερθεί ως ογκοκατασταλτικό και μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση πολλαπλών ανθρώπινων καρκίνων [67] – [70], συμπεριλαμβανομένων CRC [67], [ ,,,0],71]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει μειωμένη έκφραση του

PITX1

ιστών ανθρώπινου καρκίνου και κυτταρικές σειρές?

PITX1

καταστέλλει ογκογονικότητα με προς τα κάτω ρύθμιση της οδού της Ras [67] – [71]. Χαμηλότερη έκφραση του

PITX1

παρατηρήθηκε σε φυσιολογικό KRAS CRC ιστού, δεν

KRAS

μεταλλαγμένου ιστού [71].

PITX1

μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει

TP53

[72] και να ρυθμίζουν τη δράση της τελομεράσης [73]. Χαμηλή

PITX1

έκφρασης έχει συσχετισθεί με κακή επιβίωση σε ασθενείς με CRC [74].

Η ένωση του rs3802842 (11q23), που βρίσκεται στο ιντρόνιο του

C11orf93

, με CRC κινδύνου εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε μια GWAS [38]. Λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία του rs3802842, αλλά μπορεί να επηρεάσει

C11orf93

έκφραση μεταβάλλοντας την θέση δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής [75]. Μπορεί επίσης να μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων εκτός 11q23.1 μέσω cis- ή trans-ρυθμιστικών μηχανισμών [76]. Μέσα σε 100 kb του rs3802842 είναι ένα σύμπλεγμα από ORFs (

POU2AF1

,

C11orf53

,

FLJ45803

, και

LOC120376

) και ένα SNP (rs12296076) προσδιορίζονται ως πολυμορφικές θέσεις σύνδεσης για miRNAs σε υψηλή ανισορροπία σύνδεσης [38]. Τα γονίδια που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες ΠΟΥ είναι κοντά rs3802842 [38].

Προηγουμένως δημοσίευσε GWAS βρήκαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ CRC ευαισθησία και rs4444235 που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 14q22.2 εντός της οστικής μορφογενετικής πρωτεΐνης-4 (

BMP4

) γονίδιο [38], [42], [77]. rs4444235 είναι ένα cis-δράσης ρυθμιστής του

BMP4

έκφρασης. Δεδομένου ότι η υπερέκφραση των γονιδίων ΒΜΡ θα μπορούσε να καταστείλει το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt εμποδίζοντας την ενεργοποίηση β-κατενίνης και την αύξηση της μετανάστευσης και εισβολή του φαινοτύπου μεσεγχυματικών σε CRC [78] – [80], τον έλεγχο BMP σηματοδότηση είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της σηματοδότησης Wnt σχετίζεται με την ανάπτυξη CRC [81].

σε μια πρόσφατη μελέτη, 16 SNPs στο παρελθόν σχετίζεται με CRC κινδύνου για αλληλόμορφο-ειδική ανισορροπία ερευνήθηκαν [82]. Μόνο rs6983267 παραλλαγή έδειξε στατιστική σημασία των συγκεκριμένων αλληλόμορφων ανισορροπία από άτομο της ευρωπαϊκής καταγωγής. Αλλά το SNP δεν επαναλήφθηκε στη μελέτη μας και μπορεί να οφείλεται σε αριθμό όγκων μας περιορισμού LOH. Το ποσοστό της βάρδιας μεγάλων γονότυπο ήταν υψηλό (82%) για αυτό το SNP, αλλά ίσως επειδή μόνο 11 στο σύνολο όγκοι εμφάνισαν ΑΕ.

Εν κατακλείδι, αρκετές CRC-ευαισθησία SNPs που προσδιορίζονται σε μελέτες της Ανατολικής Ασίας συνδέονται επίσης με αυξημένο κίνδυνο CRC στον πληθυσμό της Ταϊβάν. Ωστόσο, οι ασύμφωνες μεταξύ των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης και των προηγούμενων Ασίας ενώσεις Ανατολή θα μπορούσε να αποδοθεί στις φυλετικές και εθνοτικές διαφορές των αντίστοιχων πληθυσμών της μελέτης, επειδή οι συχνότητες αλληλόμορφο αυτών των SNPs μπορεί να είναι διαφορετική. Ένας άλλος πιθανός λόγος ότι αυτά τα SNPs δεν βρέθηκαν να είναι ευαισθησία παραλλαγές για CRC μπορούσε να είναι ότι το μέγεθος του δείγματος δεν ήταν αρκετά μεγάλη για να παρέχει επαρκή στατιστική ισχύ στη μελέτη αυτή. Παρά το μικρό μέγεθος του δείγματος της μελέτης αυτής αντιγραφής, οι GWAS πιστοποιηθέν νέα rs1338565 SNP συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο CRC στον πληθυσμό μας. Η Ανατολικής Ασίας CRC-ευαισθησία SNPs rs10795668 και rs46310962 συμβάλλουν επίσης στον κίνδυνο του CRC στην Ταϊβάν. Ερευνήσαμε το 19 χαμηλή διεισδυτικότητα CRC τόπους και προσδιόρισε τρεις τόπους, rs12657484, rs3802842 και rs4444235, παρουσιάζουν ΑΕ σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενο ετερόζυγο φυσιολογικό ιστό. Η ΑΕ αποκαλύπτει αν μια παραλλαγή δρα ως καταστολέας των όγκων ή ένα ογκογονίδιο, και καθοδηγεί περαιτέρω λειτουργικές μελέτες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Στήριξη αρχείο πληροφοριών που περιέχει τα σχήματα S1 και S2? Πίνακας S1. Εικόνα S1: ανάλυση κύριων συνιστωσών των περιπτώσεων και ελέγχων με τη χρήση αποσυνδεθεί SNPs. Για να αποσαφηνιστεί η δυνατότητα διαστρωμάτωση του πληθυσμού, 44 χρησιμοποιούνται ευρέως ασύνδετες SNPs χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του γονότυπου μη καρκινικούς ιστούς 705 περιπτώσεις, και στη συνέχεια, σε συνδυασμό με τα αντίστοιχα δεδομένα SNP των 1.802 έλεγχοι από τη βάση δεδομένων Ταϊβάν Βιοτράπεζα για ανάλυση σε κύριες συνιστώσες. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι δεν υπάρχει προφανής διαστρωμάτωση του πληθυσμού μέσα σε όλα τα δείγματα. Εικόνα S2: Το σύμπλεγμα Sequenom των δεδομένων όγκου και μη όγκου. Δεκαεννέα SNPs που είχαν πληκτρολογήσει στο 705 ανεξάρτητα ζεύγη CRC του όγκου (Τ) και σε συνδυασμό κανονική γειτονικούς ιστούς (Ν) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του γονότυπου Sequenom iPlex και προεπιλογή καλώντας αλγόριθμο. Πίνακας S1:. Αλληλόμορφων συγκρίσεις της συχνότητας των 705 περιπτώσεις και 1802 ελέγχους χρησιμοποιώντας 44 ασύνδετες SNPs

doi: 10.1371 /journal.pone.0100060.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε τον Δρ Li-Li Li για τη γλώσσα αναθεώρηση του χειρογράφου.