Αφηρημένο

φαιναιθυλο ισοθειοκυανικό (PEITC) είναι ένα πολλά υποσχόμενο συστατικό του καρκίνου χημειοπροληπτικές βρώσιμων σταυρανθή λαχανικά με

in vivo

αποτελεσματικότητα εναντίον του καρκίνου του προστάτη σε πειραματικά τρωκτικά. Καρκίνος απόκριση χημειοπροληπτική να PEITC χαρακτηρίζεται από την ικανότητά της να αναστέλλει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης ογκογόνο, συμπεριλαμβανομένης της πυρηνικής παράγοντας-κΒ, Akt, και υποδοχέα ανδρογόνου. Η παρούσα μελέτη καταδεικνύει για πρώτη φορά, ότι η θεραπεία PEITC ενεργοποιεί Notch σηματοδότηση σε κακοήθη όσο και φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη. Η έκθεση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη (LNCaP, PC-3, DU145 και) και μια κανονική επιθηλιακή κυτταρική σειρά προστάτη ανθρώπου (PrEC) να PEITC οδήγησε σε διάσπαση (δραστική μορφή) της Notch 1 και Notch2 και αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα του Notch. Στο PC-3 και LNCaP κύτταρα, η θεραπεία PEITC προκάλεσε επαγωγή συνδετήρων Notch Jagged1 και Jagged2 (PC-3), η υπερέκφραση του γ-σεκρετάσης πολύπλοκα συστατικά Presenilin1 και νικαστρίνη (PC-3), πυρηνικού εμπλουτισμού του διασπάται Notch2, και /ή επάνω -Κανονισμός του

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, και /ή

Jagged2

mRNA. PEITC επαγόμενη απόπτωση σε LNCaP και κυττάρων PC-3 ήταν σημαντικά εξασθενημένη με παρεμβολή RNA του Notch2, αλλά όχι από φαρμακολογική αναστολή του Notch 1. Αναστολή της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση που προκύπτουν από την έκθεση PEITC σημαντικά αυξηθεί με knockdown του Notch2 πρωτεΐνης, καθώς και φαρμακολογική αναστολή της ενεργοποίησης Notch 1. Πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης που διασπάται Notch2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PC-3 ξενομοσχεύματα από PEITC αγωγή ποντίκια και dorsolateral προστάτες από PEITC τρέφονται ποντίκια TRAMP σύγκριση με τις αντίστοιχες ελέγχου. Επειδή η σηματοδότηση Notch έχει εμπλακεί σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης και μετάσταση, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι τα αντι-μεταστατική επίδραση της PEITC μπορεί να αυξηθεί από ένα σχήμα συνδυασμού που περιλαμβάνει έναν αναστολέα Notch

Παράθεση:. Kim SH, Sehrawat Α, Sakao Κ, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch ενεργοποίησης από φαιναιθυλο ισοθειοκυανική εξασθενεί ανασταλτική του δράση για τον Καρκίνο του προστάτη κυτταρική μετανάστευση. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10.1371 /journal.pone.0026615

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 29 Σεπ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 24, Οκτώβρη του 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου RO1 επιχορήγηση CA101753-08. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρακτική και ασφαλής λεπτομέρειες για χημειοπροφύλαξη του καρκίνου του προστάτη είναι κλινικά ελκυστική λόγω της υψηλής θνησιμότητας που σχετίζεται με αυτή την κακοήθεια στην αμερικανική άνδρες [1]. Φυτικά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων συστατικά των φρούτων και των λαχανικών, συνεχίζουν να προσελκύουν την προσοχή για την ανακάλυψη νέων καρκίνο chemopreventive παράγοντες [2]. Φαιναιθυλ ισοθειοκυανικό (PEITC) είναι ένα τέτοιο ελπιδοφόρος παράγοντας καρκίνος χημειοπροληπτική άφθονη σε εδώδιμα σταυρανθή λαχανικά όπως κάρδαμο [3]. Αποδεικτικά στοιχεία για την προστατευτική δράση των σταυρανθή λαχανικά και τα συστατικά τους, συμπεριλαμβανομένων PEITC, κατά του καρκίνου του προστάτη προέρχεται από τον πληθυσμό με βάση μελέτες παρατήρησης, καθώς και εργαστηριακές έρευνες [3] – [9]. Για παράδειγμα, μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων με βάση τον πληθυσμό πρότεινε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της πρόσληψης των σταυρανθών λαχανικών και του κινδύνου καρκίνου του προστάτη [4].

In vivo

χημειοπροληπτικές αποτελεσματικότητα του PEITC κατά του καρκίνου του προστάτη έχει πλέον καθιερωθεί σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού (διαγονιδιακά αδενοκαρκίνωμα του ποντικιού μοντέλο του προστάτη? Εφεξής χάριν συντομίας TRAMP) [5], [6]. Σίτιση των 3 μmol PEITC /g δίαιτας μειώθηκε σημαντικά συχνότητα καθώς και επιβάρυνση (πληγείσα περιοχή) των κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη ραχιοπλευρικό της TRAMP ποντικών [6]. Καρκίνος απόκριση χημειοπροληπτική να PEITC δεν περιορίζεται στον καρκίνο του προστάτη, όπως η αναστολή της χημικής καρκινογένεσης ή καταστολή της αυθόρμητης ανάπτυξης του καρκίνου και άλλων τόπων (

π.χ.

, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και του οισοφάγου) από αυτό το διαιτητικό συστατικό έχει επίσης τεκμηριωθεί [7] – [9]. Επιπλέον, η αύξηση της υποδόριας ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη σε αθυμικούς ποντικούς ήταν σημαντικά επιβραδύνεται με χορήγηση PEITC ή του

N

-acetylcysteine ​​συζυγούς [10] – [12]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, από του στόματος χορήγηση PEITC επαυξημένης προαποπτωτικής απάντηση docetaxel

in vivo

σε ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη [13].

Ασφάλεια, η βιοδιαθεσιμότητα, η εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα, και την ικανότητα να στοχεύουν πολλαπλά μονοπάτια ογκογόνο είναι επιθυμητές χαρακτηριστικά ενός κλινικά χρήσιμος παράγοντας του καρκίνου χημειοπροληπτικές. Η έρευνα δείχνει μέχρι στιγμής ότι PEITC πληροί όλα αυτά τα κριτήρια. Πρώτον, PEITC είναι καλά ανεκτή από πειραματικά τρωκτικά [6] – [9]. Δεύτερον, οι φαρμακοκινητικές προσδιορισμοί δείχνουν εξαιρετική βιοδιαθεσιμότητα της PEITC [14], [15]. Τρίτον, PEITC δείχνει επίσης εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα στην πρόκληση απόπτωσης και autophagy [11], [16], [17]. Τέλος, PEITC είναι ικανή να καταστέλλει πολλαπλές οδούς ογκογόνους σηματοδότησης που είναι υπερκινητικά στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη [18], συμπεριλαμβανομένων πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) [19], Akt [20], μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3 .) [21], και του υποδοχέα ανδρογόνων [22]

Η παρούσα μελέτη επεκτείνει τις παρατηρήσεις αυτές [19] – [22] και εξετάζει την επίδραση της θεραπείας PEITC στην ενεργοποίηση του Notch 1 και Notch2, τα οποία ανήκουν σε μια οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και τη μετάσταση [23], με τη χρήση καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (LNCaP, PC-3, LNCaP-C4-2, και DU145), ένα φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή (PrEC), PC- 3 ξενομοσχεύματα από τον έλεγχο και PEITC-ποντίκια με αγωγή [13], [16], και dorsolateral του προστάτη από τον έλεγχο και PEITC τρέφονται με ποντίκια TRAMP [6].

Αποτελέσματα

PEITC αυξήσεις θεραπείας επίπεδα διασπασμένου Notch 1 και Notch2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

εξαρτώμενη από συνδετήρα ενεργοποίηση του Notch είναι πολύπλοκη απαιτεί διάσπαση από γ-σεκρετάσης σύμπλοκο [23], [24]. Οι υποδοχείς Notch ενεργοποιούνται κατά την σύνδεση του παρακείμενα συνδέτες τους (

π.χ.

, Jagged1 και Jagged2), η οποία πιστεύεται ότι επάγει διαμορφωτική αλλαγή εντός του υποδοχέα Notch ως αποτέλεσμα την έκθεση του θέση διάσπασης S2 για παράγοντα νέκρωσης όγκων-α μετατρεπτικού ενζύμου [23], [24]. Στη συνέχεια, οι υποδοχείς Notch υποβληθούν σε μια άλλη διάσπαση που διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο γ-σεκρετάσης σε μία θέση που βρίσκεται εντός της περιοχής του Notch διαμεμβράνης [24]. Καθαρό αποτέλεσμα αυτής της διάσπασης είναι η απελευθέρωση του Notch ενδοκυττάρια περιοχή στο κυτταρόπλασμα, η οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου [23], [24]. Επίπεδο διασπάται πρωτεΐνη Notch 1 αυξήθηκε κατά την επεξεργασία με PEITC τόσο LNCaP (Εικ. 1Α) και PC-3 κύτταρα (Σχ. 1Β), αν και με διαφορετικές κινητικές και η ένταση. Αντίθετα, η θεραπεία PEITC προκάλεσε μια ισχυρή και παρατεταμένη αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης που διασπάται Notch2 τόσο LNCaP (Εικ. 1Α) και PC-3 κυτταρικές γραμμές (Σχ. 1Β) ειδικά στην δόση των 5 μΜ. Με βάση τα δεδομένα παρεμβολή RNA Notch2 παρουσιάζεται αργότερα, η κατώτερη ζώνη του δυτικού στυπώματος Notch2 φαίνεται στο Σχ. 1Β είναι μη ειδική. Επίδραση της θεραπείας PEITC επί έκφρασης πρωτεΐνης Jagged1 και Jagged2 ήταν διαφορετική μεταξύ LNCaP και PC-3 κύτταρα. PEITC επεξεργασμένου κυτταρική γραμμή LNCaP γενικά παρουσίασαν μείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών Jagged1 και Jagged2 (Εικ. 1Α). Σε έντονη αντίθεση με LNCaP, παροδική (Jagged1) ή παρατεταμένης (Jagged2) επαγωγή της Jagged έκφρασης πρωτεΐνης ήταν σαφώς ορατή στο PEITC επεξεργασμένα PC 3-κύτταρα (Σχ. 1Β). απαντήσεις διαφορικό ήταν επίσης αισθητή σχετικά επίδραση της θεραπείας PEITC σε πρωτεΐνες Presenilin1 και νικαστρίνη μεταξύ LNCaP και κυττάρων κυρίως στο χρονικό σημείο 8 ωρών 3 PC-.

ανοσοαποτύπωσης για διασπασμένου Notch1, σχισμένα Notch2, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 , και νικαστρίνη χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από το (Α) LNCaP, (Β) PC-3, και (C) κύτταρα LNCaP-C4-2 μετά 8-, 16-, ή 24-ωρη αγωγή με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή PEITC (2,5 ή 5 μΜ). Βέλος στο πάνελ Β προσδιορίζει διασπάται Notch2, η κάτω ζώνη είναι μη-ειδική, βάσει των αποτελεσμάτων siRNA που φαίνεται στο Σχ. 4Α. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα αντι-ακτίνης. Ανοσοκηλίδωση για κάθε πρωτεΐνη έγινε τουλάχιστον δύο φορές χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα παρασκευάζονται προϊόντα λύσης. Οι αριθμοί πάνω από μπάντα αντιπροσωπεύουν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης σε σχέση με αντίστοιχο έλεγχο DMSO-αγωγή.

Η

PC-3 κυτταρική γραμμή, η οποία είναι ανεξάρτητος από ανδρογόνο, είναι σχετικά πιο επιθετική σε σύγκριση με αποκρίνονται στο ανδρογόνο LNCaP κυττάρων με σεβασμό στον πολλαπλασιασμό,

in vivo

ανάπτυξης σε μοντέλο ξενομοσχεύματος, και τη μετανάστευση των κυττάρων. Εμείς ερωτήθηκαν αν διαφορική απόκριση του LNCaP

έναντι

PC-3 κύτταρα για να PEITC μεσολάβηση μεταβολές στα συστατικά σηματοδότηση Notch σχετιζόταν με ανδρογόνα ανεξάρτητο φαινότυπο. Έχουμε ασχοληθεί με το θέμα χρησιμοποιώντας ένα ανδρογόνο-ανεξάρτητες παραλλαγή των κυττάρων LNCaP (LNCaP-C4-2). Απόκριση των κυττάρων LNCaP-C4-2 να PEITC αλλαγές που προκαλούνται σε πρωτεΐνες σηματοδότησης Notch ήταν γενικά παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στα γονικά κύτταρα LNCaP (Εικ. 1 C). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι ενώ PC-3 και LNCaP κύτταρα διαφορικά ανταποκρίθηκαν στην PEITC αλλαγές που προκαλούνται σε συνδέτες Notch και πολύπλοκες γ-σεκρετάσης, η διάσπαση των πρωτεϊνών Notch 1 και Notch2 κατά την έκθεση PEITC ήταν συνεπής σε κάθε κυτταρική γραμμή δοκιμάστηκε. Επίσης, η μετάβαση των κυττάρων LNCaP σε ανδρογόνο ανεξαρτησίας (LNCaP-C4-2) δεν έχει καμία ουσιαστική επίδραση στις PEITC μεσολάβηση αλλαγές στα επίπεδα των συστατικών σηματοδότησης Notch.

PEITC θεραπεία αυξήσεις μεταγραφική δραστικότητα Notch

Εμείς αμφισβήτησε το κατά πόσον PEITC μεσολάβηση διάσπαση των Notch 1 και Notch2 μεταφράζεται σε αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα του Notch. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η θεραπεία της LNCaP και, PC-3 κύτταρα με 5 μΜ PEITC οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης ανταποκριτή του RBP-Jk (μεταγενέστερος ρυθμιστής της σηματοδότησης Notch) σε σύγκριση με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) κατεργασμένους ελέγχους. Χρησιμοποιήσαμε μια άλλη καλά χαρακτηρισμένη ευνουχισμός ανθεκτικά ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή (DU145) για να προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας PEITC για μεταγραφική δραστικότητα του Notch. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 2Α, η θεραπεία PEITC αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης Π.Ε.Π.-Jk στα κύτταρα DU145, καθώς και. Επιπλέον, PEITC κατεργασμένα κύτταρα DU145 παρουσίασαν παρόμοια κινητική της Notch 1 και διάσπασης Notch2 (Εικ. 2Β), όπως παρατηρείται στην κυτταρική σειρά PC-3 (Σχ. 1Β).

(Α) Επίδραση της θεραπείας PEITC επί RBP-jk δραστικότητα λουσιφεράσης (ένα μέτρο της μεταγραφικής δραστικότητας του Notch) σε LNCaP, PC-3, τα κύτταρα DU145, και PrEC μετά τη θεραπεία 8- ή 16-ώρες με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 5 μΜ PEITC. Τα αποτελέσματα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± SD (η = 3). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένο έλεγχο από μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμασία του Dunnett (LNCaP και PC-3) ή του Student t-test (DU145 και PrEC). (Β) Ανοσοστύπωμα για διασπάται Notch 1 και διασπάται Notch2 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από κύτταρα DU145 και PrEC αγωγή με DMSO (έλεγχος) ή PEITC (2,5 ή 5 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα αντι-ακτίνης. Βέλος στο πλαίσιο Β (κύτταρα DU145) αναγνωρίζει διασπάται Notch2, η κάτω ζώνη είναι μη-ειδική, βάσει των αποτελεσμάτων siRNA που φαίνεται στο Σχ. 4Α. Ανοσοκηλίδωση για κάθε πρωτεΐνη έγινε τουλάχιστον δύο φορές χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα παρασκευάζονται προϊόντα λύσης. Οι αριθμοί πάνω από ζώνες αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές στα επίπεδα πρωτεΐνης σε σχέση με αντίστοιχο έλεγχο DMSO-θεραπεία. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Η

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ένα φυσιολογικά επιθηλιακά προστάτη κυτταρική γραμμή ανθρώπου (PrEC) για να προσδιοριστεί εάν PEITC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Notch 1 και Notch2 ήταν μοναδική για τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Αυτό ήταν ένα άξιο έρευνας στόχο την εξέταση εντυπωσιακές διαφορές έχουν σημειωθεί σε σχέση με την επίδραση της PEITC μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων του προστάτη. Για παράδειγμα, έχουμε δείξει παλαιότερα ότι η κυτταρική γραμμή PrEC είναι σημαντικά ανθεκτική σε PEITC διαμεσολαβούμενη αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, αντιδραστική παραγωγή ειδών οξυγόνου, και επαγωγή απόπτωσης σε σύγκριση με το PC-3 και LNCaP κύτταρα [11], [17]. Επιπλέον, PC-3 και τα κύτταρα PrEC ανταποκρίνονται διαφορικά να PEITC μεσολάβηση αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων αντιοξειδωτική άμυνα [25]. Παρόμοια με τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα (Εικ. 1), η θεραπεία PEITC οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα του Notch 1 διασπάται και Notch2 σε κύτταρα PrEC ειδικά στο χρονικό σημείο 16 ωρών και στα δύο 2.5 και 5 μΜ συγκεντρώσεις (Σχ. 2Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα, PEITC μεσολάβηση αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης RBP-jk παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα PrEC μετά από θεραπεία 16 ώρες με 5 μΜ PEITC (Εικ. 2Α). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι PrEC και καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC-3, LNCaP, LNCaP-C4-2, και DU145) συμπεριφέρονται παρόμοια σε σχέση με PEITC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Notch.

Επίδραση της PEITC θεραπεία για την πυρηνική επίπεδα διασπαστεί Notch2

Επειδή η επίδραση της θεραπείας PEITC ήταν σχετικά πιο έντονη και παρατεταμένη σε Notch2 διάσπαση σε σύγκριση με το διασπασμένο Notch1, προχωρήσαμε για να καθορίσει διασπαστεί επίπεδα Notch2 σε DMSO-θεραπεία ελέγχου και PEITC επεξεργασμένο LNCaP και PC-3 κύτταρα. PEITC επεξεργασμένου LNCaP και PC-3 κύτταρα εμφάνισαν μια αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων πυρηνικής διασπάται Notch2 σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία PEITC οδήγησε σε πυρηνικό εμπλουτισμό διασπάται Notch2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία είναι συνεπής με την παρατηρούμενη αύξηση στην μεταγραφική δραστικότητα του Notch με κατεργασία PEITC (Εικ. 2Α).

(Α) μικροσκοπική ανοσοφθορισμού εικόνες που απεικονίζουν την πυρηνική σχάση επίπεδα πρωτεΐνης Notch2 σε LNCaP και PC-3 κύτταρα μετά την αγωγή 8 ωρών με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 5 μΜ PEITC στους 100 × αντικειμενική μεγέθυνση. Η ποσοτικοποίηση του

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, και

Jagged2

επίπεδα mRNA με πραγματικού χρόνου RT-PCR στο (Β) LNCaP και ( C) κύτταρα PC-3 μετά την αγωγή 8 ωρών με DMSO (έλεγχος) ή PEITC (2,5 ή 5 μΜ). Τα αποτελέσματα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± SD (η = 3). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένο έλεγχο από μονόδρομη ANOVA με προσαρμογή Dunnett. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Η

Επίδραση της θεραπείας PEITC στο

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, και

Jagged2

επίπεδα mRNA

Τα δεδομένα για την επίδραση της θεραπείας PEITC στα επίπεδα του mRNA της

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, και

Jagged2

φαίνονται στο Σχ. 3Β (LNCaP) και στο Σχ. 3C (PC-3). Έκφραση του

Jagged1

(5 μΜ PEITC) mRNA αυξήθηκε σημαντικά κατά 8 ωρών θεραπεία των κυττάρων LNCaP με PEITC (Σχ. 3Β) Notch1

(2,5 και 5 μΜ PEITC) και. Μια παρόμοια μεταχείριση PEITC οδήγησε σε καταστολή

Notch2

(5 μΜ PEITC) και

Jagged2

(5 μΜ PEITC) επίπεδα mRNA σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 3Β). Από την άλλη πλευρά, PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται για 8 ώρες με 5 μΜ PEITC παρουσίασαν σημαντική επαγωγή του

Notch 1

,

Notch2

,

Jagged1

, και

Jagged2 έκφραση

mRNA σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχ. 3C). Σημαντική διέγερση

Notch 1

,

Jagged1

, και

Jagged2

mRNA με 2.5 μΜ θεραπεία PEITC παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα PC-3 (Σχ. 3C). Για άλλη μια φορά, αυτά τα αποτελέσματα στραμμένο προς κυτταρική σειρά-ειδικές διαφορές στην PEITC μεσολάβηση μεταβολές στην έκφραση του

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, και

Jagged2

mRNA.

παρεμβολή RNA του Notch2 παρέχει προστασία έναντι PEITC απόπτωση

O’Neill et al [26] έχουν δείξει προηγουμένως ότι Notch2 ρυθμίζει απόπτωση σε MDA-MB-231 κύτταρα. Επειδή η θεραπεία PEITC αυξάνεται σταθερά τα επίπεδα της πρωτεΐνης που διασπάται Notch2 σε κάθε κυτταρική σειρά δοκιμάστηκε, ήταν λογικό να καθοριστεί εάν Notch2 συνέβαλαν στην PEITC απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, πρωτεϊνικό επίπεδο του διασπασμένου Notch2 μειώθηκε κατά περίπου 40-60% κατά παροδική επιμόλυνση των LNCaP και PC-3 κυττάρων με μία Notch2 στόχευση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μάρτυρα (μη-ειδική) siRNA. PEITC μεσολάβηση αύξηση των επιπέδων του διασπάται πρωτεΐνης Notch2 ήταν σαφώς ορατή σε έλεγχο siRNA επιμολυσμένα LNCaP και κυττάρων PC-3, η οποία ήταν σχεδόν πλήρως καταργήθηκε με παρεμβολή RNA του Notch2 (Σχ. 4Α). Εξόντωση Notch2 πρωτεΐνη από μόνη της δεν είχε καμία ουσιαστική επίδραση στην απελευθέρωση θραύσμα DNA ιστόνης σχετιζόμενη στο κυτοσόλιο, η οποία είναι μία καλά αποδεκτή μέθοδος για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης, σε κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 4Β). Από την άλλη πλευρά, PEITC επαγόμενη απόπτωση ήταν σχετικά πιο έντονη σε LNCaP και PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με Notch2 στόχευσης siRNA (Σχ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Notch2 knockdown προσέφερε προστασία έναντι PEITC επαγόμενη απόπτωση.

(Α) Ανοσοκηλίδωση για διασπάστηκε πρωτεΐνη Notch2 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από LNCaP και PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με έναν έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch2 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 5 μΜ PEITC. Οι αριθμοί πάνω από ζώνες αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές στα επίπεδα πρωτεΐνης σε σχέση με τον έλεγχο των siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DMSO. Βέλος (PC-3) Χαρακτηρίζει διασπαστεί Notch2, η κάτω ζώνη είναι μη ειδική. (Β) ιστόνη σχετιζόμενη απελευθέρωσης θραύσμα DNA στο κυτταρόπλασμα (ένα μέτρο της απόπτωσης) σε LNCaP και PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα siRNA ελέγχου ή ένα Notch2 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με DMSO (έλεγχος) ή 5 μΜ PEITC. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο εμπλουτισμός απόπτωση συγκριτικά με έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DMSO. (C) Ανοσοκηλίδωση για διασπάται Notch 1 και διασπάται πρωτεΐνες Notch2 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από LNCaP και PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται για 8 ώρες ή 24 ώρες με DMSO (έλεγχος) ή 5 μΜ PEITC απουσία ή παρουσία 50 μΜ DAPT. Οι αριθμοί πάνω από ζώνες αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές στα επίπεδα πρωτεΐνης σε σχέση με αντίστοιχο έλεγχο DMSO-θεραπεία. (D) ιστόνη σχετιζόμενη αποπτωτικά απελευθέρωσης θραύσμα DNA στο κυτταρόπλασμα σε LNCaP και PC-3 κύτταρα σε αγωγή για 24 ώρες με DMSO (έλεγχος) ή 5 μΜ PEITC απουσία ή παρουσία 50 μΜ DAPT. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο εμπλουτισμός απόπτωση σε σχέση με τον έλεγχο DMSO-θεραπεία. Αποτελέσματα (πάνελ Β και D) είναι μέσες ± SD (η = 3). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) μεταξύ των ομάδων υποδεικνύονται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, και τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα τέτοιο πείραμα παρουσιάζονται.

Η

Σχεδιάσαμε πειράματα χρησιμοποιώντας μία φαρμακολογική αναστολέας της γ-σεκρετάσης {Ν- [Ν- (3,5-difluorophenacetyl-L αλανυλ)] – S-φαινυλογλυκίνη-τ-βουτυλεστέρα? εφεξής συντετμημένο ως DAPT} για περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του Notch σε PEITC επαγόμενη απόπτωση. PEITC μεσολάβηση αύξηση των επιπέδων του διασπάται πρωτεΐνης Notch 1, αλλά δεν διασπάται Notch2, ήταν αξιοσημείωτα κατέστειλε με συν-κατεργασία με 50 μΜ DAPT (Εικ. 4C). Όπως ήταν αναμενόμενο, DAPT θεραπεία μόνη μειωμένα επίπεδα διασπασμένου Notch 1 και Notch2 τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα, αν και σε διαφορετικό βαθμό (Εικ. 4C). PEITC επαγόμενη απόπτωση είτε δεν μεταβάλλονται σε όλα τα (κύτταρα PC-3) ή ελαφρώς αυξημένη (LNCaP κύτταρα) με συν-κατεργασία με DAPT (Εικ. 4D). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση του Notch2, αλλά όχι Notch 1, συμβάλλει στην PEITC απόπτωση τουλάχιστον σε PC-3 κύτταρα.

παρεμβολή RNA του Notch2 αυξάνει PEITC μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης

Επειδή σηματοδότηση Notch εμπλέκεται στην κυτταρική εισβολή και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [27], [28], σχεδιάσαμε λειτουργική πειράματα για να προσδιορίσουν τις συνέπειες της ενεργοποίησης Notch στην ικανότητα PEITC να αναστέλλει LNCaP και PC-3 κυττάρου μετανάστευση. Παροδική επιμόλυνση με Notch2 στοχευμένες siRNA μόνος είχε σαν αποτέλεσμα καταστολή της LNCaP (Εικ. 5Α) και PC-3 (Εικ. 5C) κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία θαλάμου Boyden. Η μετανάστευση του ελέγχου siRNA-επιμολυσμένα LNCaP (Εικ. 5Β) και PC-3 κύτταρα (Σχ. 5D) μειώθηκε επίσης σημαντικά κατά την επεξεργασία με 5 μΜ PEITC. Επιπλέον, PEITC μεσολάβηση αναστολή των LNCaP (Εικ. 5Β) και PC-3 (Εικ. 5D) μετανάστευση των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξηθεί από νοκ ντάουν της πρωτεΐνης Notch2.

Εκπρόσωπος εικόνες (Boyden δοκιμασία θαλάμου) που απεικονίζει τη μετανάστευση (α) LNCaP και (C) PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με έναν έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch2 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 5 μΜ PEITC στα 200 × μεγέθυνση. Η ποσοτικοποίηση του μετανάστευσαν (Β) κύτταρα LNCaP και (D) κύτταρα PC-3 από πειράματα φαίνεται στα πλαίσια Α και C. Τρεις έως τέσσερις τομείς για κάθε φίλτρο βαθμολογήθηκαν για κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο στα 200 × μεγέθυνση. Τα αποτελέσματα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± SD (η = 3). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) μεταξύ των ομάδων υποδεικνύονται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, και τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα τέτοιο πείραμα παρουσιάζονται.

Η

Φαρμακολογική καταστολή της ενεργοποίησης Notch 1 αυξάνει PEITC μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης

DAPT μόνη προκάλεσε μια μέτρια μείωση σε LNCaP (Εικ. 6Α) και PC-3 (Εικ. 6C) κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ελέγχου DMSO-θεραπεία. Παρόμοια με τα δεδομένα χρησιμοποιώντας Notch2 siRNA, συν-θεραπεία με DAPT επαυξημένης PEITC μεσολάβηση αναστολή της LNCaP (Εικ. 6Β) και PC-3 (Εικ. 6D) κυτταρική μετανάστευση. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Notch1 και Notch2 ενεργοποίηση από PEITC επηρεάζει αρνητικά την ικανότητά του να αναστέλλει προστάτη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Εκπρόσωπος εικόνες LNCaP και (C) κύτταρα PC-3 (Boyden δοκιμασία θαλάμου) που απεικονίζουν τη μετανάστευση των (Α) μετά την αγωγή 24 ωρών με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 5 μΜ PEITC απουσία ή παρουσία 50 μΜ DAPT στα 200 × μεγέθυνση. Η ποσοτικοποίηση του μετανάστευσαν (Β) κύτταρα LNCaP και (D) κύτταρα PC-3 μετά την αγωγή 24 ωρών με DMSO ή 5 μΜ PEITC και /ή 50 μΜ DAPT. Τρεις με τέσσερις τομείς για κάθε φίλτρο βαθμολογήθηκαν για κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± SD (η = 3). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) μεταξύ των ομάδων υποδεικνύονται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, και αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα τέτοιο πείραμα παρουσιάζονται.

Η

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση για την επίδραση των PEITC για διασπαστεί πρωτεΐνη Notch2

in vivo

Η

χρησιμοποιήσαμε αρχειοθετημένα ιστούς από προηγουμένως ολοκληρώσει τις μελέτες μας [6], [13], [16] για να καθορίσει

in vivo

ενδιαφέρον των κυτταρικών ευρήματα (Εικ. 1). Επειδή η επίδραση της θεραπείας PEITC ήταν πιο συνεπής και διατηρούμενη επί διασπασμένο Notch2, η ανοσοϊστοχημική ανάλυση περιορίστηκε σε αυτή την πρωτεΐνη. Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημικές εικόνες για διασπασμένου Notch2 έκφραση σε PC-3 τμήματα ξενομοσχεύματος όγκου από τον έλεγχο και την PEITC-ποντίκια με αγωγή που φαίνεται στο Σχ. 7Α. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που φαίνονται σε καλλιεργημένα κύτταρα PC-3 (Εικ. 3Α) πυρηνική έκφραση του διασπασμένου Notch2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PC-3 ξενομοσχεύματα από ποντικούς PEITC αγωγή σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 7Α). Ομοίως, η πυρηνική επίπεδο διασπάται πρωτεΐνης Notch2 στον πλαγιοπίσθιο προστάτη ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PEITC τρέφονται ποντίκια TRAMP σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 7Β).

(Α) Αντιπροσωπευτική Η &?. Ε χρώση και ανοσοϊστοχημική χρώση για έκφραση του διασπάται πρωτεΐνης Notch2 σε PC-3 ξενομοσχεύματα από τρεις ποντικούς των υποδεικνυόμενων ομάδων (bar κλίμακα, 50 μm? μεγέθυνση, 400 Χ). Η ενίσχυση του επιλεγμένης περιοχής παρουσιάζεται στο ένθετο. Η ποσοτικοποίηση των πυρηνικών έκφραση της πρωτεΐνης σε Notch2 PC-3 ξενομοσχεύματα από τον έλεγχο και ισοθειοκυανικό φαιναιθυλ (PEITC) κατεργασμένα ποντίκια φαίνεται στο γράφημα ράβδου (μέση ± SD? N = 3). (Β) Η ανοσοϊστοχημεία που δείχνουν διασπαστεί έκφραση της πρωτεΐνης Notch2 στα ραχιοπλευρικό προστάτες από τέσσερα ποντίκια TRAMP των αναφερόμενων ομάδων (κλίμακα bar, 50 μm? Μεγέθυνση, 400 ×). Η ενίσχυση του επιλεγμένης περιοχής παρουσιάζεται στο ένθετο. Η ποσοτικοποίηση των πυρηνικών έκφραση της πρωτεΐνης που διασπάται Notch2 στον πλαγιοπίσθιο προστάτες ελέγχου και PEITC τρέφονται ποντίκια TRAMP παρουσιάζεται στο ραβδογράφημα (μέση ± SD? N = 4). Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με t-test του Student.

Η

Συζήτηση

ακριβής ρόλος της σηματοδότησης Notch στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη είναι ακόμα ασαφής, αλλά οι μελέτες έχουν προσπαθήσει να επιλύσετε αυτό το ζήτημα με τη χρήση κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη και του ανθρώπινου βιοψίες καρκίνου του προστάτη. Κάτω ρύθμιση των Jagged1 έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [29]. Η ίδια ομάδα ερευνητών ανέφερε αργότερα ότι το RNA παρεμβολής του Notch1 παρέχει προστασία έναντι του καρκίνου του προστάτη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή [30]. Ταυτόχρονα, η υπερέκφραση μόνιμα ενεργών Notch 1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP [31]. Επειδή η σηματοδότηση Notch είναι αρκετά περίπλοκη περιλαμβάνει αλληλεπίδραση μεταξύ τεσσάρων υποδοχέων (Notch 1-Notch4) και πέντε συνδέτες [Jagged1, Jagged2, Delta-όπως συνδέτες (Dll1, Dll3 και Dll4)] [23], [24] και για κάθε συστατικό της σηματοδότησης Notch δεν είναι συνήθως μελετηθεί [29] – [31], είναι εύλογο ότι η διαφορά πηγάζει από αντισταθμιστικές αλλαγές σε άλλα στοιχεία που προκλήθηκε από νοκ ντάουν του Notch 1 ή Jagged1. Παρ ‘όλα αυτά, η έκφραση σε προστάτη Jagged1 βιοψίες καρκίνος σχετίζεται με αυξημένη μετάσταση και την επανάληψη [32]. Η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει ότι PEITC ενεργοποιεί Notch 1 και Notch2 σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, η διοίκηση PEITC προκαλεί σημαντική αύξηση της πυρηνικής επίπεδα διασπαστεί Notch2

in vivo

σε όγκους του προστάτη από δύο διαφορετικά μοντέλα τρωκτικών. Έχουμε αποδείξει επίσης ότι η ενεργοποίηση του Notch 1 και Notch2 μειώνει την ικανότητα PEITC να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, μπαίνουμε στον πειρασμό να υποθέσουμε ότι η αντι-μεταστατική επίδραση της PEITC μπορεί να αυξηθεί από ένα σχήμα συνδυασμού που περιλαμβάνει έναν αναστολέα Notch.

LNCaP και PC-3 κύτταρα εμφανίζουν σημαντικές διαφορές σε σχέση με PEITC μεσολάβηση μεταβολές στην Notch σηματοδότηση συστατικά, ειδικά Notch συνδετήρες και τα συστατικά γ-σεκρετάσης. Δύο προφανείς δυνατότητες αξίζουν την προσοχή για να εξηγήσει τις διαφορές αυτές σε απάντηση PEITC μεταξύ των κυττάρων LNCaP που αποκρίνονται στο ανδρογόνο (άγριου τύπου ρ53)

έναντι

ευνουχισμό ανθεκτικά και p53-null κύτταρα PC-3. Μία τέτοια δυνατότητα αναφέρεται σε διαφορά στην κατάσταση της ρ53 μεταξύ LNCaP και PC-3 κυττάρων σαν Notch 1 έχει δειχθεί ότι είναι ένας άμεσος στόχος της ρ53 [33]. Αποκατάσταση της έκφρασης p53 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν την έκφραση της Notch 1 [33]. Επειδή PC-3 και DU145 κύτταρα, τα οποία στερούνται λειτουργικής ρ53, συμπεριφέρονται παρόμοια σε σχέση με PEITC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Notch 1 και Notch2, δυνατότητα που διαφορική απόκριση μεταξύ LNCaP και ευνουχισμού-ανθεκτικών κυττάρων (PC-3 και DU145) εκδηλώνεται, μερικώς αν όχι εντελώς, από την ρ53 δεν μπορεί να απορριφθεί επί του παρόντος. Ταυτόχρονα, γνωρίζουμε ότι η ρύθμιση της έκφρασης, καθώς και την ενεργοποίηση του Notch 1 είναι διαμεσολαβείται από άλλους παράγοντες εκτός από την p53, συμπεριλαμβανομένων των Nrf2, ETS μεταγραφή οικογένεια παράγοντα PEA3 μέλος, επιδερμική σηματοδότησης υποδοχέα αυξητικού παράγοντα, και Akt για να αναφέρουμε ένα αρκετά πολύπλοκο λίγοι [34] – [37]. Αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιλύσετε αυτό το ζήτημα γύρω p53, είναι λογικό να συμπεράνουμε ότι η διαφορική απόκριση μεταξύ LNCaP και κυττάρων-3 PC δεν έχει σχέση με τα ανδρογόνα ανταπόκριση επειδή τα κύτταρα LNCaP και ανδρογόνα-ανεξάρτητους της παραλλαγής LNCaP-C4-2 έκθεμα γενικά συγκρίσιμη απόκριση σε PEITC μεσολάβηση αλλαγές στα συστατικά σηματοδότηση Notch. Στο πλαίσιο αυτό, είναι σημαντικό να αναφέρουμε ότι

Notch

στοχεύουν HEY (τριχωτές /Enhancer της διαίρεσης σχετίζονται με YRPW μοτίβο) είναι ένα εκλεκτικό συν-καταστολέα υποδοχέων των ανδρογόνων [38].

Ενεργοποίηση του Notch2 από υπερέκφραση του ενδοκυτταρικού τομέα του προάγει απόπτωση σε MDA-MB-231 κύτταρα [26]. Ήταν ενδιαφέρον να προσδιορίσουν τις συνέπειες της ενεργοποίησης Notch επί προαποπτωτικών απόκριση σε PEITC στο μοντέλο μας. Σε αντίθεση με Notch 1 [30], ένα 40-60% νοκ ντάουν της Notch2 πρωτεΐνη δεν έχει καμία ουσιαστική επίδραση στην απόπτωση σε LNCaP ή PC-3 κύτταρα. Ωστόσο, η απόπτωση που προκύπτει από την έκθεση PEITC σημαντικά εξασθενημένο από Notch2 knockdown τουλάχιστον σε PC-3 κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, η καταστολή της ενεργοποίησης Notch 1 με DAPT δεν έχει επίδραση επί προαποπτωτικών απόκριση σε PEITC. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι Notch1 είναι περιττή για τον κυτταρικό θάνατο που προκύπτουν από την έκθεση PEITC σε PC-3 και LNCaP κύτταρα. Μηχανισμός με τον οποίο Notch2 knockdown παρέχει προστασία από PEITC επαγόμενη απόπτωση δεν είναι ακόμη σαφής. Αναστολή διαφόρων αντι-αποπτωτικών οδών, όπως NF-κΒ και STAT3, σε συνδυασμό με μεταβολές στην έκφραση του Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας έχουν εμπλακεί στην επαγωγή απόπτωσης από PEITC [10], [11], [17], [19] , [39]. Είναι πιθανό ότι Notch2 νοκ ντάουν αλλάζει επίδραση της PEITC σε ορισμένα από αυτά τα μονοπάτια για να παρέχουν προστασία από την απόπτωση.

Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο του προστάτη. Αξιοσημείωτα, Notch έχει ενοχοποιηθεί σε ΕΜΤ [27], το οποίο προωθεί μετάσταση [40]. Επιπλέον, η θεραπεία των LNCaP και PC-3 κύτταρα με γ-σεκρετάσης αναστολέας DAPT έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την κυτταρική κινητικότητα [41]. Η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει ότι κινητικότητα τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα μειώνεται σημαντικά με knockdown πρωτεΐνης Notch2 χρησιμοποιώντας siRNA (μειωμένη αλλά όχι σημαντική σε LNCaP), καθώς και DAPT μεσολάβηση αναστολή της ενεργοποίησης Notch 1 (μειωμένη αλλά όχι σημαντική σε PC- 3). Επιπλέον, PEITC μεσολάβηση αναστολή της LNCaP και PC-3 κυτταρική μετανάστευση αυξάνεται με knockdown του Notch2 πρωτεΐνης, καθώς και φαρμακολογική αναστολή της διάσπασης Notch 1 (PC-3 μόνο). Μηχανισμός με τον οποίο Notch2 νοκ ντάουν αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων παραμένει άπιαστο, αλλά το θέμα αυτό έχει μελετηθεί για Notch 1 [28]. Στοχευμένη εξάντληση του Notch 1 αναστέλλει την PC-3 και η κυτταρική μετανάστευση 22Rυ1 από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 και ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης [28]. Είναι πιθανό ότι Notch2 νοκ ντάουν προκαλεί παρόμοια απάντηση σε μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 και ενεργοποιητής πλασμινογόνου ουροκινάσης.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η θεραπεία PEITC προωθεί τη διάσπαση των Notch 1 και Notch2 που οδηγούν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής τους σε δύο καρκινικές ( LNCaP, PC-3, DU145 και) και φυσιολογικά (PrEC) κύτταρα του προστάτη. PEITC επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη συγκρατημένα εξασθενημένος από knockdown του Notch2, αλλά όχι από φαρμακολογική αναστολή της ενεργοποίησης Notch 1.