Abstract

Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όπου, ζωντανά νεφρικά καρκινικά κύτταρα εμφυτεύθηκαν υπό την κάψουλα του νεφρού σε ποντικούς, αποκάλυψε ένα 30-πλάσια αυξάνουν σε όγκο του όγκου σε μια περίοδο 26 ημέρες και αυτό συνοδεύεται με ένα 32-πλάσια αύξηση στο επίπεδο του λακτοζυλοκεραμίδη (LacCer). Οι ποντικοί τρέφονται D- θρεο-1-φαινυλ-2-δεκανοϋλαμίνο-3-μορφολινο-1-προπανόλη (D-PDMP), ένας αναστολέας της συνθετάσης γλυκοζυλοκεραμίδης και λακτοζυλοκεραμίδη συνθάσης (LCS: β-1,4-ΟαΙΤ-V), έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στον όγκο του όγκου. Αυτό συνοδεύτηκε από μια μείωση στη μάζα του λακτοσυλκεραμίδιο και την αύξηση του επιπέδου γλυκοσυλιοκεραμιδίου (GlcCer). Μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι η D-PDMP ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση με αναστολή ρ44ΜΑΡΚ, ρ-ΑΚΤ-1 μονοπάτι και στόχος θηλαστικών για τη ραπαμυκίνη (mTOR). Με τη σύνδεση γλυκοσφιγγολιπιδίων σύνθεση με την ανάπτυξη του όγκου, η νεφρική εξέλιξη του καρκίνου και παλινδρόμηση μπορεί να αξιολογηθεί. Έτσι, αναστέλλοντας γλυκοσφιγγολιπιδίων σύνθεση μπορεί να είναι μια καλόπιστους στόχο την πρόληψη της εξέλιξης άλλων τύπων καρκίνου

Παράθεση:. Chatterjee S, Alsaeedi Ν, Χου J, Μπανταρού VVR, Wu L, Halushka ΜΚ, et al. (2013) Η χρήση ενός αναστολέα γλυκολιπίδια για καλυτέρευση Καρκίνος των νεφρών σε ένα μοντέλο ποντικού. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10.1371 /journal.pone.0063726

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26, Σεπ 2012? Αποδεκτές: πέμπτης Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2013

Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε μέσω TEDCO, μέλος της επιχορήγησης Μέριλαντ, θεσμική στήριξη Johns Hopkins University και National Institutes of Health χορηγούν PO-1-HL-107153-01. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SC χρησιμεύει στην επιστημονική συμβουλευτική επιτροπή της Amalyte Pharmaceuticals και δεν λαμβάνουν αμοιβή για τις υπηρεσίες του και αυτές οι πληροφορίες αποθηκεύονται σε θεσμικές αρχεία eOPC. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Όλοι οι άλλοι συντάκτες δεν έχουν ανταγωνιστικά οικονομικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι μπορεί να προκαλέσει σφιγγολιπίδια φαινοτύπους όπως πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση και την αγγειογένεση τις σφραγίδες στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [1] -. [ ,,,0],6]. Εφαρμογή των φαρμάκων που αναστέλλουν την σύνθεση γλυκοσφιγγολιπιδίων δώσει την ευκαιρία να εξεταστεί ο ρόλος αυτών των ενώσεων σε ζωικά μοντέλα ανθρώπινης ασθένειας. Εδώ αποδεικνύουμε ότι συνδέοντας γλυκοσφιγγολιπιδίων σύνθεση και την αναστολή της σε ένα μοντέλο ποντικού νεφρικό καρκίνο, είναι δυνατό να παρατηρηθεί το αποτύπωμα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ φαρμάκου και γλυκοσφιγγολιπιδίων ένζυμα που μεταβολίζουν και να προβλέψει την εμφάνιση της ασθένειας /εξέλιξης του όγκου και υποχώρηση του όγκου. Ο αποκλεισμός της γλυκοζυλίωσης του κεραμιδιού τη θεραπεία του καρκίνου έχει τεκμηριωθεί σε κύτταρο και σε μοντέλα ζώων [2], [3].

Οι όγκοι απαιτούν τον σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχοντες (αγγειογένεση) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην επαγωγή της αγγειογένεσης σε μία ποικιλία όγκων [4], [5]. Ως εκ τούτου, ορθολογικά ότι η στόχευση ενδοθηλιακά κύτταρα που ευθυγραμμίζουν τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου, τα οποία είναι εμπλουτισμένα με ένα ισομορφή του LCS μπορεί να έχει διάφορες θεωρητικά πλεονεκτήματα όπως η στόχευση διανομής φαρμάκου σε διάφορους τύπους καρκίνου. σκεπτικό μας προέρχεται από την προηγούμενη ευρήματά μας, όπου ο VEGF έχει δειχθεί ότι διεγείρει LCS: β-1,4-ΟαΙΤ-V δραστικότητα σε ανθρώπινα αρτηριακά ενδοθηλιακά κύτταρα να παράγουν LacCer, και ότι είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της «οξυγόνο ευαίσθητα» μονοπάτι που οδηγεί σε σηματοδότηση αγγειογένεση [4]. Επιπλέον, η χρήση των μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για να προκαλέσει LCS: β-1,4-ΟαΙΤ-V γονίδιο εκτομή ή φαρμακολογική χειρισμό από τη χρήση του D-PDMP, ένας αναστολέας της φωσφορικής ουριδίνης κεραμιδιού γλυκόζη γλυκοζυλοτρανσφεράσης (UGCG), και LCS [7], αισθητά μετριάζονται VEGF-επαγόμενη αγγειογένεση [5]. Επίσης, παρατηρήσαμε ότι η D-PDMP μπορεί σημαντικά (

P

& lt? 0,0005) μετριασμό VEGF /β-FGF επαγόμενη αγγειογένεση

in vivo

σε γυμνούς ποντικούς [4] και αναστέλλει την πειραματική μεταστάσεις του ποντικού καρκίνωμα του πνεύμονα Lewis [8].

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν αναστέλλουν γλυκοσφυγγολιπίδιο σύνθεση θα αναστέλλει επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /μείωση του όγκου του όγκου

in vitro

και

in vivo

. Η μελέτη αυτή επιτεύχθηκε ο στόχος ότι η αναστολή γλυκοσφυγγολιπίδιο σύνθεση θα αναστέλλει επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /μείωση του όγκου του όγκου

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Ιατρική Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση Επιτροπή Johns Hopkins, άδεια # MO03M615. Οι σχετικές προσπάθειες που καταβάλλονται για τη βελτίωση ταλαιπωρία των ζώων, συμπεριλαμβανομένων αναισθησία (κεταμίνη και ξυλαζίνη) και μετά τη χειρουργική επέμβαση παρακολούθησης (περιοδικό έλεγχο των ζώων για διάστημα έως 8 ώρες μετά τη χειρουργική επέμβαση). Αντιβιοτική αλοιφή χορηγήθηκε στο site της τομής και ένα οπτικό αλοιφή εφαρμόστηκε για την πρόληψη μάτια τους από το στέγνωμα κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης.

Πειράματα με ποντίκια

Ο καρκίνος του νεφρού ποντικού (RENCA) κυτταρικό εναιώρημα φορτώθηκε σε μία σύριγγα του 1 ml. Τα ποντίκια δέκτες (BALB /c ποντίκια) προ-αναισθητοποιούνται με ε.π. ένεση (100 uL) ενός αποθεματικού διαλύματος κεταμίνης /ξυλαζίνης (8 mg /kg), ασφαλίζεται σε μια γειωμένη πλάκα με την πλάτη δέρμα ξυρίζεται και προετοιμάζεται με στείρο τρόπο. Μια τομή έγινε στο αριστερό πλευρό και το αριστερό νεφρό και εξωτερικεύεται. 100 uL του κυτταρικού εναιωρήματος όγκου (1 × 10

6 κύτταρα /εμβόλιο) εγχύθηκε στο subcapsular χώρο του αριστερού νεφρού. Το νεφρό στη συνέχεια τοποθετήθηκε στην αρχική θέση και η τομή έκλεισε με αποστειρωμένα μέταλλο ασφαλή κλιπ. Πειραματική θεραπεία ξεκίνησε 2 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου subcapsular. Τα ποντίκια τροφοδοτήθηκαν με από του στόματος καθετηριασμό D-PDMP (3 και 10 mg /kg σωματικού βάρους) ημερησίως. D-PDMP διαλύθηκε σε 5% Tween-80 σε φυσιολογικό ορό. Δέκα ποντικοί (Ν = 10) χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα.

Η placebo ομάδα των ποντικών που έχει την εμφύτευση του όγκου έλαβαν ημερησίως, ίσο όγκο 100 uL του οχήματος. Μετά από αυτή τη διαδικασία, τα ζώα παρακολουθούνται καθημερινά. Τέλος σημείο αυτής της σειράς πειραμάτων ήταν όγκου εκτίμηση ανάπτυξη στο νεφρό. Tumor παρακολούθηση της ανάπτυξης στα ζώα εμφυτεύονται ορθοτοπικά στο νεφρό διεξήχθη με ψηλάφηση δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από 4 εβδομάδες, (ημέρες 26-28 εμφύτευση μετά όγκου), τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 και αυτοψία. Η ανάπτυξη του όγκου μέτρηση διεξήχθη με εκτίμηση βάρος του όγκου σε απευθείας το τέλος του πειράματος.

Οι ιστολογικές μελέτες

Πρωτογενή καρκινώματα στάλθηκαν για ιστολογική εξέταση (Ν = 4). Οι τομές ιστών χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη -eosin και με αντισώματα έναντι CD31 (ένας σημαντικός δείκτης για αγγειογένεση) και κασπάσης-3 (ένας σημαντικός δείκτης για απόπτωση). Λακτοζυλοκεραμίδη αντίσωμα (CD17) αγοράστηκε από την Ancell Laboratories και χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του εντοπισμού των LacCer στο νεφρικό ιστό. Οι ιστοί συλλέχθηκαν από τις άλλες 4 ποντικών και χρησιμοποιούνται σε Biochemical /μοριακές αναλύσεις που περιγράφονται στο κείμενο.

Εκχύλιση του D-PDMP και σφιγγολιπίδια

εξαγωγή του δείγματος διεξήχθη με τη χρήση ενός τροποποιημένου Bligh και Dyer διαδικασία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Κάθε δείγμα ομογενοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε 10 όγκους απιονισμένου νερού. Τρεις όγκοι 100% CH

3OH που περιέχει 53 mM HCOONH

4, 17 ng /ml C

12:00 κεραμιδιού, και 17 ng /ml C

12:00 σφιγγομυελίνη (εσωτερικά πρότυπα, IS ) προστέθηκε, και το μίγμα στροβιλίστηκε. Τέσσερις όγκοι ΟΗΟΙ

3 προστέθηκαν, στροβιλίζεται, και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 1000 χ

g

για 10 λεπτά. 100 μΙ του ΟΗΟ

3 στιβάδα διαχωρίστηκε, στέγνωσε υπό ένα ρεύμα αζώτου και το υπόλειμμα διαλύθηκε σε 100% μεθανόλη που περιείχε 10 ng /ml C

δύο η ώρα κεραμίδιο ως εσωτερικό πρότυπο για τον ποσοτικό προσδιορισμό του D -PDMP. Στη συνέχεια, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε ένθετα γυάλινο φιαλίδιο για LC ανάλυση /MS /MS? 10 μλ εγχύθηκε εντός του LC /MS /MS. Όλοι οι διαλύτες και τα χημικά ήταν ποιότητας HPLC. εκχυλίσεις λιπιδίων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας γυάλινους σωλήνες και σιφώνια βοριοπυριτικό επικαλυμμένα, για να μειωθεί προσκόλληση των λιπιδίων σε επιφάνειες.

LC /MS /MS ανάλυση για σφιγγολιπίδια και D-PDMP

Ταυτοποίηση των ειδών και σφιγγολιπιδίου D-PDMP εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο ηλεκτροψεκασμού ιονισμού διαδοχικό μάζας υγρής χρωματογραφίας 3000 ΡΕ Sciex, που λειτουργεί σε θετικό τρόπο (LC-ESI /MS /MS? Applied Biosystems, Thornhill, Οντάριο, Καναδάς), και σύμφωνα με τις μεθόδους που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες μελέτες [ ,,,0],10]. Το σύστημα αποτελείται από δύο Perkin Elmer LC αντλίες συνδεδεμένοι σε HTC PAL αυτόματης έγχυσης (CTC Ανάλυση, Zwingen, Switzerland) εφοδιασμένο με ένα βρόγχο δείγματος 50 μλ. Ρυθμός ροής ήταν 400 μl /min για κεραμίδια και 1 ml /min για σφιγγομυελίνες. Η ροή από τον εγχυτήρα δείγματος οδήγησε σε μια στήλη 2.6 μm C για κεραμίδια και D-PDMP, και ένα 5 μm, C

18 στήλη για σφιγγομυελίνες (Phenomenex, Torrance, CA). Η στήλη προ-εξισορροπήθηκε για 0.1 λεπτά με διαλύτη Α που αποτελούνταν από CH

3OH: dH

2O (85:15, ν /ν) με 5 mM ΕΤ

2ΝΗ

4 και η δείγμα εκλούστηκε με διαλύτη Β που αποτελούνταν από CH

3OH: HCOOH (99:1, ν /ν) με 5 mM ΕΤ

2ΝΗ

4. Το εκλουσμένο δείγμα αυτομάτως εισάγεται εντός της πηγής ιόντων. Οι παράμετροι του οργάνου για LC-ESI /MS /MS βελτιστοποιήθηκαν χωριστά για κάθε είδος του κεραμιδιού, κεραμίδιο 1-φωσφορική, σφιγγοσίνη, σφινγκανίνης, sphigosine-1-φωσφορική, σφιγγομυελίνη, και D-PDMP με πολλαπλές παρακολούθησης αντίδραση. Ceramides και σφιγγομυελίνες ποσοτικοποιήθηκαν με εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (AUC) του αριθμήσεις ανά δευτερόλεπτο (CPS) κανονικοποιημένη σε εσωτερικά πρότυπα (κεραμίδιο C

δώδεκα η ώρα και σφιγγομυελίνη C

δώδεκα η ώρα). Οι συγκεντρώσεις D-PDMP προσδιορίσθηκαν με τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης που κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τις αναλογίες των προτύπων αναφοράς (D-PDMP? 0.1-100 μg /ml) για IS (κεραμίδιο C

δύο η ώρα? 10 ng /ml) συναρτήσει κατά τις αναλογίες της αναφοράς και από πειραματικά δείγματα. Όλα τα μητρικά διαλύματα αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C και σταθερό πάνω από 6 μήνες.

γλυκοζυλοτρανσφεράση και τη δραστηριότητα glycosylhydrolase δοκιμασίες

δραστηριότητα LCS σε παρασκευάσματα νεφρό μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο που επεξηγήθηκε προηγουμένως [11] με την ακόλουθες τροποποιήσεις. Εν συντομία, κατεψυγμένα φλας νεφρικού ιστού ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό Tris-HCl (ρΗ 7.4) που περιέχει Triton-X-100 και φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 rpm για 15 λεπτά. Η μάζα πρωτεΐνης στο υπερκείμενο μετρήθηκε και 100 μg πρωτεΐνης δείγμα χρησιμοποιήθηκε σε ενζυματικές δοκιμασίες, εις τριπλούν. 14C-UDP-γαλακτόζη (American ραδιοτιτλοφόρηση Company, St. Louis, ΜΟ) χρησίμευσε ως δότης της γαλακτόζης. Και γλυκοσυλιοκεραμιδίου (Matreya Chemicals, ΡΑ) χρησιμοποιήθηκε ως δέκτης σε αυτή τη δοκιμασία. 14C-LacCer που παράγεται από αυτή τη δοκιμασία ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία σπινθηρισμού. δραστηριότητα συνθάσης γλυκοσυλοκεραμίδιο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κεραμίδιο ως δέκτης και [3Η] UDP- γλυκόζη ως δότης γλυκόζη. δραστηριότητα γλυκοσυλοκεραμίδιο υδρολάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας [3Η] γλυκοσυλοκεραμιδίου (American ραδιοτιτλοφόρηση Company), καθώς το υπόστρωμα σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα.

Western μελέτες ανοσοκηλίδος

νεφροί συλλέχθηκαν από τον έλεγχο, με εικονικό φάρμακο, 3 MPK και 10 MPK του D-PDMP τρέφονται από το στόμα και καθημερινά σε ποντικούς. Οι ιστοί νεφρού ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma Aldrich), τοποθετήθηκε σε πάγο για 15 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στα 13000 RPM, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης, Bradford Assay χρησιμοποιήθηκε. Σε ένα πήκτωμα 4-15% (Bio-Rad Ready Gel), φορτώθηκαν 45-90 μg δειγμάτων πρωτεΐνης και 10 μι προτύπου πρωτεΐνης χαμηλού μοριακού βάρους (Bio-Rad Διπλή Color Precision Plus). Μετά την ηλεκτροφόρηση γέλης για 1,5 ώρες, Immuno-Blot PVDF μεμβράνες (Bio-Rad) εμβαπτίστηκαν σε κρύα μεθανόλη, dH

2O, και ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Bio-Rad). Στη συνέχεια, η πηκτή μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad), στα 30 V επί μία νύκτα. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 3% γάλα, 1 × TBST (0,05% Tween-20), επωάστηκαν σε πρωτογενή αντισώματα έναντι: β-1,4-ΟαΙΤ-V, Beta ακτίνη, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (γλυκεραλδεϋδη 3- φωσφορική αφυδρογονάση, US Biological), ρ44ΜΑΡΚ (Thr202 και Tyr204), ρ-ΑΚΤ-1 (Thr308) (Cell Signaling Technologies), και mTOR (Sigma-Aldrich) σε 1 × TBS με 1:200 αραίωση και 0,5% BSA, και επωάζονται σε δευτερογενές αντίσωμα, γίδινο αντι-κουνελιού IgG HRP συζυγούς (Sigma Aldrich) σε 5% γάλα, 1 × TBST με 1:1000 αραίωση. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα που απαιτείται από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C ενώ τα δευτερογενή αντισώματα που απαιτείται από 1 ώρα επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε 1 × TBST για 5-10 λεπτά και επαναλήφθηκε 2 φορές και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ECL (Amersham ECL Plus ™ Western Blotting Ανίχνευσης Αντιδραστήρια).

Υπολογιστών υποβοηθούμενη ποσοτικοποίηση της κασπάσης-3 και CD31 θετικών κυττάρων

Όλα τα ανοσοϊστοχημικά χρωματισμένο πλάκες ψηφιακά σαρωθεί χρησιμοποιώντας ένα Aperio CS ScanScope (Vista, CA). Για κασπάσης-3 ανάλυση, το σπάνιο γεγονός και η πυρηνική αλγόριθμοι της Aperio Box Tool Kit χρησιμοποιήθηκαν. Η σπάνια ανιχνευτής εκδήλωση που προσδιορίζονται κασπάσης θετικά κύτταρα, τα οποία επιβεβαιώθηκαν από το χέρι-επιμέλεια. Η τιμή αυτή διαιρείται με το συνολικό αριθμό των κυττάρων της περιοχής που καθορίζεται από την πυρηνική αλγόριθμο. περιοχή CD31 ταυτοποιήθηκε με τη διαίρεση CD31 θετικό περιοχή μάσκα από το βιώσιμο περιοχή μάσκα του όγκου για κάθε διαφάνεια, όπως περιγράφεται παρομοίως [12].

Στατιστικές μελέτες

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση και ως μέσο πρότυπο μέτρησης σφάλματος ±. Η σημαντική διαφορά μεταξύ του ελέγχου, με εικονικό φάρμακο, και πειραματική ομάδα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το μαθητή

t

δοκιμής και ένας τρόπος ANOVA. Ζεύγος σοφό σύγκριση έγινε για να προσδιοριστεί η σημαντικότητα μεταξύ διαφορετικές θεραπείες. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Παρατηρήσαμε ότι η D-PDMP αλλά όχι L-PDMP ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων RENCA (Βλέπε Σχήμα S1 ). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η αναστολή LCS δραστηριότητας και τη μείωση του φορτίου LacCer μπορεί επίσης να μειώσει τη νεφρική καρκίνο σε ποντίκια. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε D-PDMP δεδομένου ότι είναι μη-τοξικό και παραλαμβάνεται από τα νεφρά, τον εγκέφαλο και το ήπαρ όταν χορηγείται από του στόματος σε ποντικούς [13]. Επίσης, απομακρύνεται γρήγορα από το σύστημα του κυτοχρώματος P450, όπως t του

1/2 είναι περίπου 50 λεπτά [13]. Αν και D-PDMP συντέθηκε για τον μετριασμό της νόσου του Gaucher με την αναστολή της δραστικότητας UGCG, δείξαμε ότι ανέστειλε επίσης την παραγωγή LCS δραστηριότητα LacCer και έτσι την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

, σε γυμνά ποντίκια [5]. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι αναστέλλοντας τη δράση LCS και η παραγωγή LacCer συγκεκριμένα είναι κεντρικής σημασίας για τη σηματοδότηση γεγονότων, όπως η αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό που οδηγούν σε σημαντική μείωση του όγκου του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού του καρκίνου του νεφρού.

Μία εβδομάδα μετά την εφαρμογή, ο πρωτογενής όγκος ήταν μακροσκοπικά ορατές? μετά από 10 ημέρες αυθόρμητη μετάσταση αναπτυχθεί στην περιφερειακή λεμφαδένες, πνεύμονα, περιτόναιο, και το ήπαρ, επιτρέποντας στο μοντέλο RENCA να ανέβηκε παρόμοια με ανθρώπινο καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων. Ο μέσος χρόνος επιβίωσης των RENCA φέρουν ποντικούς είναι 32 ημέρες, όταν τα κύτταρα 10

6 RENCA εγχυθεί. Για να καθοριστεί εάν μεταβολή στο προφίλ γλυκοσφιγγολιπιδίων είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό σε καρκίνο του νεφρού, συγκρίναμε το επίπεδο αυτών των λιπιδίων στο νεφρό ελέγχου (που δεν φέρουν RENCA) έναντι ποντικών placebo νεφρού (που φέρει RENCA). Ταυτόχρονα, εξετάσαμε τις επιδράσεις της σίτισης D-PDMP στα επίπεδα του όγκου του όγκου και των λιπιδίων στον ιστό του νεφρού. Παρατηρήσαμε ότι η εμφύτευση των κυττάρων RENCA στο subcapsular χώρο στο αριστερό νεφρό (ποντίκια placebo, και καμία θεραπεία) συνέβαλαν στην ~ 30-φορές αύξηση στον όγκο του όγκου, σε μια περίοδο -26 ημέρες (Σχήμα 1Α). Το σωματικό βάρος δεν μεταβλήθηκε (Εικόνα 1Β) και 20% των ποντικών στην ομάδα placebo πέθαναν. Από του στόματος διατροφή των 3 MPK D-PDMP και 10 MPK D-PDMP για την πειραματική περίοδο μείωσε τον όγκο του όγκου σε περίπου 50% του εικονικού φαρμάκου όγκων του νεφρού του ποντικιού. Αυτή η δόση-ανεξάρτητη μείωση D-PDMP στον όγκο του όγκου θα μπορούσε, εν μέρει, να εξηγηθεί από την παρατήρηση μας ότι το επίπεδο της D-PDMP (μετριέται χρησιμοποιώντας LC-MS /MS) στο νεφρικό ιστό ήταν παρόμοια (Σχήμα 1 C) όπως μπορεί έχουν απεκκρίνεται γρήγορα. Λεπτομερής tandem LC-MS /MS αποκάλυψε ότι C24, C16 και C22 ήταν οι σημαντικότεροι λιπαρό οξύ μοριακά είδη σε κεραμίδιο, μονο και δι hexosylceramide και σφιγγομυελίνης στον έλεγχο, το εικονικό φάρμακο, και D-PDMP τρέφονται ποντίκια νεφρικό ιστό. Και C20, C18 και C26 ήταν τα ανήλικα σφιγγολιπίδια λιπαρών οξέων που περιέχουν (Εικόνα S2). Το συνολικό επίπεδο κεραμιδιού αυξήθηκε περίπου 2,5 φορές σε νεφρό ποντικού εικονικού φαρμάκου έναντι του ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, η σίτιση 3 MPK D-PDMP δεν άλλαξε το επίπεδο του κεραμιδιού στο νεφρό σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, σε 10 MPK D-PDMP τρέφονται ποντίκια, το επίπεδο του κεραμιδιού μειώθηκε για τον έλεγχο της επίπεδο. Έτσι, αν και D-PDMP φέρεται να είναι ένας ειδικός αναστολέας της UGCG και συμβάλλοντας έτσι στην αύξηση των επιπέδων κεραμιδιού, σε αυτή τη μελέτη δεν αυξήσει τα επίπεδα ιστού του κεραμιδιού στο νεφρό ποντικού. Και η παρατήρηση αυτή είναι σε συμφωνία με προηγούμενη έκθεση που έδειξε ότι η D-PDMP (100 MPK) μειωμένη νεφρική κεραμιδιού level~9% 5 ώρες αργότερα [13]. Ένεση 40 MPK D-PDMP δύο φορές την ημέρα για 4 ημέρες οδήγησε επίσης σε μείωση κατά 23% σε κεραμίδιο στο νεφρό [13]. Σε μία άλλη μελέτη με τη χρήση του ιμινοσάκχαρο Ν- (5-adamantinane-1′-υλ-μεθοξυ) πεντυλ-1-deoxynoijirimycin (ΑΜΡ-ϋΝΜ), ένας αναστολέας της UGCG επίσης δεν αυξάνουν τα επίπεδα κεραμιδιού στο ήπαρ και διατήρησε το επίπεδο του κεραμιδιού πλάσμα να βασικό επίπεδο σε διατροφή που προκαλείται υπερλιπιδαιμίας σε apoE – /- ποντίκια [14]. Οι λόγοι για τη μεσολάβηση μείωση D-PDMP στο κεραμιδιού επίπεδο στο νεφρό ποντικού δεν είναι σαφές από αυτή τη μελέτη. Δεδομένου κεραμίδιο είναι ένας άμεσος πρόδρομος της σύνθεσης σφιγγομυελίνης, αναμέναμε ένα υψηλότερο επίπεδο σφιγγομυελίνης σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή D-PDMP. Ωστόσο, το επίπεδο της σφιγγομυελίνης στη μελέτη μας και σε μια προηγούμενη μελέτη [13] δεν μεταβλήθηκε σημαντικά (Σχήμα 2Η). Αυτό μπορεί να οφείλεται ενώ μια υψηλότερη πισίνα του κεραμιδιού μπορούσε να προκαλέσει μια αύξηση στη σύνθεση σφιγγομυελίνη? Ωστόσο, δεδομένου ότι D-PDMP αυξάνει επίσης την δραστηριότητα του σφιγγομυελινάσης, μπορεί να βοηθήσει στη διατήρηση της ομοιόστασης σφιγγομυελίνη [13]. Ceramide θα μπορούσε επίσης να υδρολυθεί για να δημιουργήσει σφιγγοσίνη και τα παράγωγά του (Σχήμα 2C-Ε). Για παράδειγμα, πρόσθετες μελέτες μας αποκαλύπτουν ότι το επίπεδο του κεραμιδίου 1-φωσφορικής (Σχήμα 2Β), σφιγγοσίνη (Σχήμα 2C), σφιγγοσίνη-1-φωσφορική (Σχήμα 2D) και σφινγκανίνης (Σχήμα 2Ε) μεταβάλλεται σε νεφρό ποντικού placebo σε σύγκριση με τον έλεγχο και κατά την αγωγή με D-PDMP. Ειδικότερα, αύξηση κατά 20 φορές στο επίπεδο της σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής στο εικονικό φάρμακο ποντικού έναντι ελέγχου σημειώθηκε. Η θεραπεία με 3 MPK D-PDMP δεν μείωσε το επίπεδο της σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής σε σύγκριση με το νεφρό ποντικού εικονικό φάρμακο. Ωστόσο, κατά την τροφοδοσία 10 MPK D-PDMP, παρατηρήσαμε μία μείωση κατά 50% του επιπέδου του παρόντος λιπιδίου. Το επίπεδο της monohexosylceramides ανυψώθηκε 5-φορές σε ποντικό εικονικού φαρμάκου σε σύγκριση με εκείνη του νεφρού ποντικού ελέγχου, αλλά δεν άλλαξε κατά την σίτιση 3 MPK D-PDMP (Σχήμα 2F). Παραδόξως, το επίπεδο αυτού του λιπιδίου αυξήθηκε κάπως κατά την τροφοδοσία 10 MPK του D-PDMP. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να ερμηνευθεί για να υποδείξει μια αντισταθμιστική μείωση του επιπέδου των LacCer σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 10 MPK του D-PDMP οποία μειώθηκε η δραστηριότητα της συνθάσης LacCer. Έτσι, ένα απροσδόκητο αποτέλεσμα σε αυτή τη μελέτη είναι ότι η μακροχρόνια (26 ημέρες) σίτιση D-PDMP δεν μείωσε το επίπεδο της monoglycosylceramides στο νεφρό ποντικού παρόλο D-PDMP έχει προηγουμένως δειχθεί για να χρησιμεύσει ως ένας αναστολέας της σύνθεσης γλυκοσυλοκεραμιδίου. Η μεγαλύτερη αύξηση του επιπέδου των dihexosylceramide, ~32 φορές, συνέβη σε νεφρό εικονικού φαρμάκου σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Ωστόσο, το επίπεδο της λακτοζυλοκεραμίδη μειώθηκε δοσοεξαρτώμενο σε ποντίκια που τρέφονταν 3 MPK και 10 MPK του D-PDMP (Σχήμα 2G). Αυτό συνοδεύτηκε από D-PDMP δοσοεξαρτώμενη μείωση στη δραστηριότητα της συνθάσης LacCer (Σχήμα 3C), αλλά όχι GlcCer συνθάσης (Εικόνα 3Α). Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε ότι η δραστηριότητα της υδρολάσης γλυκοσυλιοκεραμιδίου μειώθηκε, με αύξηση της δόσης του D-PDMP από 3 έως 10 ΜΡΚ ΜΡΚ (Σχήμα 3Β). Μειωμένη δραστηριότητα των γλυκοσυλκεραμιδίου γλυκοσιδάσης σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 10 MPK D-PDMP (Εικόνα 3Β) μπορούν να έχουν συμβάλει στην αύξηση του επιπέδου της GlcCer (Σχήμα 2F). Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της σφιγγομυελίνης δεν άλλαξε τον έλεγχο, το εικονικό φάρμακο, και D-PDMP τρέφονται νεφρό ποντικού (Σχήμα 2Η). Εν ολίγοις, η αύξηση του όγκου των νεφρών του όγκου σε ποντικούς που φέρουν RENCA και μείωση του κατά την αγωγή με D-PDMP συσχετίζονται καλύτερα με τα επίπεδα του LacCer μάζας, σε σύγκριση με οποιαδήποτε άλλη σφιγγολιπίδιο διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Ποντίκια (BALB /C) προ-αναισθητοποιούνται και εναιώρημα RENCA κυττάρου όγκου (10

6 κύτταρα) εγχύθηκε στο subcapsular χώρο του αριστερού νεφρού. Πειραματική θεραπεία ξεκίνησε δύο ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου subcapsular. Οι ποντικοί τροφοδοτούνται με από του στόματος καθετηριασμό D-PDMP (3 και 10 mg /kg σωματικού βάρους, ΜΡΚ) ημερησίως. D-PDMP διαλύθηκε σε 5% Tween-80 σε φυσιολογικό ορό. ποντίκια εικονικού φαρμάκου έλαβαν το όχημα (5% Tween-80 σε αλατούχο διάλυμα μόνο 100 μΐ). Μετά από 26 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν. Το δεξί νεφρό χρησίμευσε ως έλεγχος, και ο αριστερός νεφρός χρησίμευσε ως εικονικό φάρμακο ή φάρμακο που έλαβαν θεραπεία με 3 και 10 MPK του D-PDMP. Α: Μια σημαντική αύξηση στον όγκο των όγκων του νεφρού ποντίκι μειώθηκε απότομα κατά τη σίτιση D-PDMP. B. D-PDMP (3 και 10 MPK) δεν μείωσε το συνολικό σωματικό βάρος σε ποντίκια. Γ: Το επίπεδο της D-PDMP στο νεφρό ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 3 και 10 MPK του D-PDMP ήταν παρόμοιες

Η

Το επίπεδο των διαφόρων σφιγγολιπιδίων μετρήθηκαν με συνδυασμό LC-MS /MS.. A: D-PDMP μείωσε το επίπεδο του κεραμιδιού, Β: κεραμίδιο-1-φωσφορικό και D: σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής. D-PDMP αυξήθηκε σε μέτριο βαθμό το επίπεδο της σφιγγοσίνης? C, E: σφινγκανίνης και F: monohexosylceramide. G: D-PDMP μειώθηκε δοσοεξαρτώμενο το επίπεδο dihexosylceramide σε ποντίκια καρκίνο του νεφρού. H: D-PDMP δεν άλλαξε το επίπεδο της σφιγγομυελίνης σε ασθενείς με νεφρική καρκίνο του ποντικιού. (* Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 N = 4).

Η

Μέτρηση της δραστικότητας συνθάσης λακτοζυλοκεραμίδη σε νεφρό ποντικού διεξήχθη χρησιμοποιώντας UDP [14C] γαλακτόζη ως δότης γαλακτόζη και GlcCer καθώς η δέκτη, όπως περιγράφεται λεπτομερώς [11]. Παρατηρήσαμε ότι η διατροφή D-PDMP δοσοεξαρτώμενο μείωσε την δραστικότητα αυτού του ενζύμου Α: δραστικότητα συνθάσης του γλυκοσυλοκεραμιδίου μειώθηκε στον ίδιο βαθμό, ανεξάρτητα από το αν 3 ΜΡΚ ή ​​10 MPK του D-PDMP τροφοδοτήθηκε σε ποντικούς με καρκίνο νεφρού, Β: glucosylceramidehydrolase δραστικότητα μειώθηκε με κατεργασία D-PDMP και C:. δραστηριότητα συνθάσης λακτοζυλοκεραμίδη ήταν δοσοεξαρτώμενο μειώθηκε σε D-PDMP τροφοδοτείται ποντικών με καρκίνο του νεφρού (Ν = 4? * ρ & lt? 0,05)

η

Επόμενο , χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι LacCer, προσδιορίσαμε αν LacCer ήταν ένα σημαντικό λιπίδιο που συσσωρεύεται στα καρκίνο του νεφρού. ανοσοϊστοχημικές μελέτες μας αποκάλυψαν τη συσσώρευση μεγάλων ποσοτήτων λακτοζυλοκεραμίδη εντός κυτταροπλασματική κυστίδια (λευκά βέλη) αποκλειστικά σε καρκινικά κύτταρα (σύγκρινε Σχήμα S3A? DAPI κηλίδα εναντίον Σχήμα S3b? CD17 αντίσωμα χρωματισμένα κύτταρα). Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι σε ανθρώπινο νεφρό όγκου εγγύς σωληνοειδή κύτταρα, η ενεργότητα του LCS είναι αυξημένη, και αυτό συνοδεύεται με αύξηση του επιπέδου των LacCer σε σύγκριση με φυσιολογικό ανθρώπινο νεφρό [15]. Αυξημένο επίπεδο LacCer έχει επίσης αναφερθεί σε ανθρώπινο καρκίνο του νεφρού [16]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι στο μοντέλο ποντικού του καρκίνου του νεφρού, η αύξηση της μάζας λακτοζυλοκεραμίδη καλύτερα συσχετίζεται με την αύξηση του όγκου και την εξέλιξη της νόσου του όγκου. Έτσι, η στόχευση γλυκολιπιδίου σύνθεση, ιδίως LCS και LacCer μπορεί να είναι ένας bonafide θεραπευτική προσέγγιση για την άμβλυνση καρκίνο του νεφρού.

Για να κατανοήσουμε τις μοριακές οδοί που συμβάλλουν στη μείωση στον όγκο του όγκου λόγω της D-PDMP σίτιση σε ποντικούς, εμείς διεξάγεται δυτική προσδιορισμούς ανοσοαποτύπωσης αρκετών βιολογικών δεικτών, που δείχνεται από άλλους και εμάς [5], [17], [18], [19] για να συμβάλει στην κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση, και την απόπτωση. μηχανιστικές μελέτες μας έδειξαν ότι η D-PDMP επηρεάζονται σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου με μείωση της έκφρασης των διαφόρων μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται στις οδούς που συμβάλλουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση. Για παράδειγμα, υπήρξε μια αξιοσημείωτη αύξηση της μάζας του LCS σε νεφρό ποντικού placebo σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου και αυτή η παρατήρηση μπορεί να εξηγήσει μια αξιοσημείωτη αύξηση στο επίπεδο LacCer σε placebo νεφρό vs ελέγχου. D-PDMP μειώθηκε δοσοεξαρτώμενο τη μάζα του LCS (Σχήμα 4Α). Αντίθετα, το επίπεδο της UGCG ήταν αυξημένη σε D-PDMP τρέφονται ποντίκια (Σχήμα 4Α). Βιοδείκτες για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση, π.χ. ρ44ΜΑΡΚ και ρ-ΑΚΤ-1 ήταν όλα μειώθηκε στο νεφρό ποντικών τροφοδοτείται D-PDMP σε σύγκριση με εκείνη του placebo νεφρού (Σχήμα 4Β). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η D-PDMP επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση με αναστολή της δραστικότητας του LCS και παραγωγής LacCer. Παράλληλα

in vitro μελέτες

, έχουμε παρατηρήσει ότι η D-PDMP αλλά όχι L-PDMP μειώθηκε δοσοεξαρτώμενο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RENCA, πιθανώς λόγω της σύλληψης των κυττάρων στη φάση G2-M του κυτταρικού κύκλος, κατά την αγωγή με D-PDMP [20] (Εικόνα S1).

Αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα εκχυλισμάτων ιστού από BALB /c ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε όχημα (placebo συν RENCA κύτταρα /όγκου) και 3 και 10 MPK του D- PDMP για 26 ημέρες και τα νεφρά ελέγχου και των αντίστοιχων πυκνομετρικές σαρώσεις απεικονίζονται. A: D-PDMP δόση εξαρτώμενο μείωσε την πρωτεΐνη έκφραση του LacCer συνθάσης (β-1,4-ΟαΙΤ-V) (Ν = 3-6), σε καρκίνο του νεφρού ποντικού αλλά κάπως αυξημένη την πρωτεΐνη έκφραση του UGCG (Ν = 2) στη νεφρική καρκίνο του ποντικιού. Β: Western ανοσοαποτυπώματα των δεικτών για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (ρ44ΜΑΡΚ, Ν = 3), την αγγειογένεση (ρΑΚΤ-1, Ν = 3? MTOR, Ν = 3 για το εικονικό φάρμακο και 10 ΜΡΚ) και το σπίτι κρατώντας πρωτεΐνη GAPDH. θεραπεία D-PDMP μείωσε τις δείκτες για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν με μονόδρομη ANOVA.

Η

Η ιστολογική αξιολόγηση των νεφρών αποκάλυψε εκτεταμένη ανάπτυξη των επιθετικών RENCA, με αξιοσημείωτη νέκρωση. Νέκρωση, όπως ένα τοις εκατό του όγκου του όγκου μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση ψηφιακών εργαλείων ανάλυσης [21] και βρέθηκε να είναι 38,8%, 28,4% και 33,2% αντίστοιχα για το εικονικό φάρμακο, 10 MPK, και 25 ΜΡΚ ποντικούς που έλαβαν αγωγή (Σχήμα S4A-Η). Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η D-PDMP μπορεί να εμποδίσει αποτελεσματικά την επαγόμενη από VEGF αγγειογένεση

in vitro

σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας και τα ανθρώπινα αρτηριακά ενδοθηλιακά κύτταρα [4], [5]. Επίσης, σε μια προηγούμενη μελέτη, η προκαλούμενη από VEGF + β-FGF αγγειογένεση μετριάστηκε από D-PDMP σε ποντίκια [4]. Αυτό μετρήθηκε με μια αξιοσημείωτη μείωση στην έκφραση του CD31 και την αγγειογένεση. Για να καθοριστεί εάν η μείωση στον όγκο του όγκου των νεφρών οφειλόταν επίσης σε μείωση της παροχής αίματος μέσω της μείωσης αγγειογένεσης, εκτελέσαμε ανοσοχρώση για CD31 (Σχήμα S4i, J). Υπήρξε μια σημαντική μείωση της CD31 θετικό αγγειακή περιοχή σε βιώσιμες περιοχές του όγκου (0,3% έναντι 0,05% για το εικονικό φάρμακο έναντι 25 MPK ποντίκια που έλαβαν αγωγή), όπως προσδιορίζεται με τη χρήση ψηφιακών εργαλείων ανάλυσης [21]. Προηγουμένως, mTOR έχει καθιερωθεί ως ένας δείκτης της αγγειογένεσης και έχει ένα επικυρωθεί στόχος για την άμβλυνση διάφορους τύπους καρκίνου. Παρατηρήσαμε ότι η D-PDMP μειώθηκε σημαντικά η έκφραση της πρωτεΐνης mTOR (Σχήμα 4Β), υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της αγγειογένεσης, D-PDMP στερηθεί τον όγκο της προσφοράς αίματος και έτσι συνέβαλαν στη μείωση στον όγκο του όγκου. Ένα απροσδόκητο αποτέλεσμα ήταν ότι η D-PDMP μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε με κασπάση-3 ανοσοχρώση. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων κασπάσης ήταν 0,09%, 0,04% και 0,03% για το εικονικό φάρμακο, 10 MPK, και 25 ΜΡΚ ποντικούς που υπέστησαν αγωγή αντιστοίχως, όπως προσδιορίζεται από την ψηφιακή ανάλυση (Σχήμα S4K-Ν) [21]. Έτσι μας

in vivo

μελέτες δείχνουν ότι η D-PDMP δεν μειώνει τον όγκο του όγκου με επαγωγή απόπτωσης σε ποντίκια στα νεφρά.

Συζήτηση

Οι ακόλουθες παρατηρήσεις μπορούν να αντληθούν από το παρόν μας μελέτη που εμπλέκουν το ρόλο των γλυκοσφιγγολιπιδίων σε ασθενείς με νεφρική βιολογία του όγκου. Πρώτον, υπάρχει μια ισχυρή και στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αύξησης του όγκου της νεφρικής όγκου ποντικού και παράλληλη αύξηση της μάζας του LacCer. Δεύτερον, η αναστολή της δραστικότητας γλυκοσφιγγολιπιδίου γλυκοζυλοτρανσφεράσης, και ιδιαίτερα τη μείωση της δραστηριότητας και της μάζας των LacCer συνθάσης συσχετίστηκε με μείωση στον όγκο του όγκου. Τρίτον, αν και D-PDMP είναι γνωστό ότι είναι ένας αναστολέας της UGCG, δεν αυξήσει τα επίπεδα των νεφρών του κεραμιδιού. Από κεραμιδίου εμπλέκεται στην απόπτωση, οι μελέτες μας δείχνουν ότι η D-PDMP δεν μειώνει τον όγκο του όγκου με επαγωγή απόπτωσης μέσω της οδού κεραμιδίου σε ποντικούς νεφρό. Μάλλον, D-PDMP ανέστειλε ένα μονοπάτι σηματοδότησης που προκαλείται από LacCer συμβάλλοντας έτσι σε μια αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης του όγκου. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η αναστολή της γλυκολιπίδιο γλυκοζυλοτρανσφεράσης μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό /αγγειογένεση σε ιστούς μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων απόπτωσης.

Στην παρούσα μελέτη, ένα ~ 30-φορές αύξηση στον όγκο του όγκου σε placebo νεφρό ποντικού (σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου) ήταν παράλληλη με ισόποση αύξηση φορές σε LacCer μάζα. Διατροφή D PDMP-αξιοσημείωτα μειωμένο όγκο όγκου με μέσο για τη μείωση της ενζυματικής δραστηριότητας του LCS, LCS μάζα, και κατά συνέπεια LacCer μάζα, και οι αγγειογόνες πρωτεΐνες όπως ρ-ΑΚΤ-1 και mTOR. Σε προηγούμενες μελέτες μας, παρατηρήσαμε ότι η χρήση του siRNA για LCS

in vitro σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα

[5] και

in vivo σε γλοιοβλάστωμα ποντίκι

[22] και τη χρήση του D- PDMP σε αυτή τη μελέτη μπορεί να μειώσει τον όγκο του όγκου από τον μετριασμό της αγγειογένεσης. Έτσι, η στόχευση των γλυκολιπιδίων σύνθεση γενικά και LacCer συνθάσης ιδίως [5], [22] είναι μια νέα προσέγγιση για το μετριασμό νεφρικού καρκίνου σε ποντίκια. Επίσης, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η L-PDMP, το οποίο ενεργοποιεί LacCer συνθάσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί επίσης να προκαλέσει angiogenensis με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [7] και επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RENCA στην παρούσα μελέτη (βλέπε παράρτημα). Έτσι, η ενεργοποίηση /απενεργοποίηση των LacCer συνθάσης από αγωνιστές /ανταγωνιστές μπορεί κάλλιστα να ρυθμίζουν την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

.

Οι μελέτες μας και των άλλων [13] έχουν δείξει ότι το D-PDMP είναι μη τοξικό όταν χορηγείται σε δόσεις δέκα φορές εκείνης της συγκεντρώσεως που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη. Το βάρος του σώματος σε αυτή τη μελέτη δεν διέφεραν στο εικονικό φάρμακο έναντι ποντίκια D-PDMP αγωγή. Το βάρος του όγκου μειώθηκε κατά 50% περίπου σε 3 MPK και 10 ΜΡΚ τροφοδοτείται ποντικούς σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο. Ωστόσο, όταν τα ποντίκια είχαν τραφεί υψηλότερες ποσότητες D-PDMP? 25 και 50 ΜΡΚ, δεν μειώνουν περαιτέρω τον όγκο του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε προηγούμενη μελέτη, δείχθηκε ότι ο t

1/2 του D-PDMP σε ποντικούς αίμα είναι περίπου 50 λεπτά [13]. Κατά συνέπεια, είναι εφικτό ότι πέρα ​​από ένα όριο 10 ΜΡΚ, το μεγαλύτερο μέρος αυτής της ένωσης απομακρύνεται ταχέως από την απέκκριση και ως εκ τούτου δεν παρατηρήθηκε περαιτέρω μείωση στον όγκο του όγκου. Προηγουμένως, D-PDMP έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για την εξέταση του ρόλου των γλυκοσφιγγολιπιδίων και των συναφών glycosytransferases σε αρτηριακό πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων [1], [23], [24], την επούλωση των πληγών [1], [23], [24], οστεοκλαστογένεση [25], πολυκυστική νόσος των νεφρών [26], [27], ελαστικότητα [28], αναπνευστικές ασθένειες [29], [30], την έρευνα γλοιοβλάστωμα [22], [31], [32] χοληστερόλη εκροής [33],