Αφηρημένο

Το γλυκολυτικό ανταπόκριση των υποξικών κυττάρων προκαλείται κυρίως από την υποξία επαγώγιμου παράγοντα άλφα (HIF-1α), αλλά ακόμη και με την παρουσία άφθονου οξυγόνου όγκων παρουσιάζουν συνήθως υψηλά ποσοστά της γλυκόλυσης. Τα υψηλότερα επίπεδα του HIF-1α σε όγκους που συνδέονται με μια χειρότερη πρόγνωση και ανιούσα ρύθμιση των δεικτών των επιθηλιακών μετάβασης μεσεγχυματικών (ΕΜΤ) λόγω δράσεις HIF-1α. Δείξαμε πρόσφατα ότι ΕΜΤ συμβαίνει εντός της CD44

υψηλή καρκίνος βλαστοκυττάρων (CSC) κλάσμα και εν επιθηλιακά και EMT ΚΕΠ διακρίνονται από υψηλή και χαμηλή έκφραση ESA, αντίστοιχα. Εμείς εδώ δείχνουν ότι η υποξία προκαλεί μια έντονη στροφή του κλάσματος CSC προς EMT που οδηγεί σε μεταβολή της κυτταρικής μορφολογίας, ένα αυξημένο ποσοστό των CD44

υψηλή /ESA

χαμηλή κύτταρα, τα πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης χαρακτηριστική της EMT, και ενισχυμένη sphere- ικανότητα σχηματισμού. Το μέγεθος των κλασμάτων EMT επέστρεψαν στα επίπεδα ελέγχου σε νορμοξία δείχνουν μία αναστρέψιμη διαδικασία. Παραδόξως, όμως, ακόμη και κάτω από συνθήκες ορθοξικές ένα κλάσμα του ΕΜΤ ΚΕΠ ήταν παρούσα και διατήρησαν υψηλά επίπεδα HIF-1α, προφανώς λόγω της δράσης των κυτοκινών όπως ΤΝΡα. Λειτουργικά, αυτή η ΕΜΤ κλάσμα CSC παρουσίασαν μειωμένη μιτοχονδριακή δυνητικής μάζας και της μεμβράνης, καταναλώνονται πολύ λιγότερο οξυγόνο ανά κύτταρο, και παράγονται σημαντικά μειωμένα επίπεδα αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Αυτές οι διαφορές στα πρότυπα του μεταβολισμού του οξυγόνου του υπο-κλάσματα των καρκινικών κυττάρων να παρέχει μία εξήγηση για τη γενική θεραπευτική αντίσταση των ΚΕΠ και για την ακόμη μεγαλύτερη αντίσταση του EMT ΚΕΠ. Μπορούν επίσης να εντοπίσει πιθανούς μηχανισμούς χειραγώγησης των ΚΕΠ

Παράθεση:. Gammon L, Biddle Α, Heywood Χονγκ Κονγκ, Johannessen AC, Mackenzie IC (2013) υποσύνολα καρκινικά βλαστικά κύτταρα διαφέρουν εγγενώς στα μοτίβα τους μεταβολισμού του οξυγόνου . PLoS ONE 8 (4): e62493. doi: 10.1371 /journal.pone.0062493

Επιμέλεια: Yao Liang Τανγκ, Πανεπιστήμιο του Cincinnati, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 22 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Gammon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Αναιμία Fanconi Έρευνας, NC3Rs, Barts και το London φιλανθρωπία, και το Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας Νορβηγικά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι όγκοι είναι άκρως γλυκολυτικό ακόμη και με την παρουσία άφθονων οξυγόνου, το λεγόμενο «φαινόμενο Warburg» [1], [2]. Υποξία διεγέρσιμο παράγοντα 1 άλφα (HIF-1α) είναι ο κύριος παράγοντας που ρυθμίζει την κυτταρική υποξικές ανταποκρίσεις [3]. Σε υψηλά επίπεδα οξυγόνου, ο HIF-1α είναι ουβικουιτινωμένης και στοχευμένες για την αποικοδόμηση ενώ σε χαμηλότερα επίπεδα οξυγόνου αποικοδόμηση αναστέλλεται και HIF-1α μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου διμερίζεται με υποξία διεγέρσιμο παράγοντα 1 βήτα (HIF-1β) και συνδέεται με την απόκριση υποξίας στοιχεία (HREs) των γονιδίων στόχων που βοηθούν την κυτταρική προσαρμογή στην υποξία [4]. Η υπερέκφραση του HIF-1α παρουσιάζεται σε ένα ευρύ φάσμα των πρωτογενών και μεταστατικών καρκίνων [5], και είναι υπεύθυνη για μια σειρά ιδιοτήτων όγκου που σχετίζονται μεταξύ άλλων μείωση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [6], η αυξημένη ραδιο-αντίσταση [7] – [ ,,,0],9], και την προστασία των κυττάρων από προκαλούμενη από φάρμακο απόπτωση [10] και γήρανση [11].

όγκου εισβολή και μετάσταση έχουν γίνει όλο και σχετίζεται με τον καρκίνο βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ), ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων τα οποία είναι ικανή να αυτο-ανανέωση, έχει την ικανότητα ογκογενή, και είναι ανθεκτική σε θεραπεία [12], [13]. Τόσο οι τοπικές εισβολή και μετάσταση όγκου σε απομακρυσμένες θέσεις απαιτούν μεταναστευτικών ικανότητες που αποκτώνται μέσω της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) του ΚΕΠ [14], κατά την οποία χάνονται επιθηλιακά χαρακτηριστικά και επιθηλιακά πρωτεΐνες όπως Ε-καδερίνης είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω και των μεσεγχυματικών πρωτεϊνών όπως vimentin και περιστρέφοντας προς τα επάνω-ρυθμίζονται [15]. Διέγερση EMT σε κυτταρικές σειρές μαστού αποτελέσματα σε κύτταρα αποκτούν τον φαινότυπο δείκτη τυπικό ΚΕΠ μαστού, μεγαλύτερη κινητικότητα, και αντοχή σε θεραπευτικούς παράγοντες [16], [17].

HNSCC και διάφορα άλλα καρκινώματα, υπο- πληθυσμούς των ΚΕΠ έχουν υψηλή έκφραση του CD44 [18] – [21]. Δείξαμε πρόσφατα ότι σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το στόμα και το δέρμα καρκινώματα, ΕΜΤ συμβαίνει εντός της CD44

υψηλό κλάσμα CSC καταλήγοντας σε δύο φαινοτύπους CSC, μια που είναι επιθηλιακά και δείχνει υψηλή έκφραση των επιθηλιακών ειδικού αντιγόνου (ESA), και ένα άλλο ότι έχει χαρακτηριστικά EMT και χαμηλή έκφραση του ESA [22]. ΚΕΠ να εναλλάσσεστε μεταξύ των επιθηλιακών και των φαινοτύπων EMT και τα δύο κλάσματα ξεκινήσει όγκους μετά από

in vivo

ποντικού μεταμόσχευση [22]. Καθώς αρκετές μελέτες έχουν πλέον συνδέονται άμεσα υποξία και υψηλής HIF-1α σε EMT [23] – [26], θελήσαμε να μάθουμε αν υπάρχουν έμφυτες μεταβολικές διαφορές που σχετίζονται με την αξιοποίηση του οξυγόνου μεταξύ του επιθηλίου και φαινοτύπων EMT CSC. Δείχνουμε ότι τα χαμηλά επίπεδα οξυγόνου αυξάνουν αναστρέψιμα το μέγεθος των κλασμάτων ΕΜΤ εντός κυτταρικών γραμμών HNSCC και ότι, σε σύγκριση με τα επιθηλιακά ΚΕΠ (Epi CSC), EMT ΚΕΠ έχουν υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης υποξική απόκριση HIF-1α, ακόμη και κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Υπάρχουν επίσης σημαντικές διαφορές στο μεταβολισμό της παρούσας υποπληθυσμού με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης HIF-1α σε ΕΜΤ ΚΕΠ συσχέτιση με τα πάνω ρύθμιση του γλυκολυτικά γονίδια, μια σημαντική μείωση στην κατανάλωση οξυγόνου, μειωμένη μιτοχονδριακή δυνητικής μάζας και της μεμβράνης, και μειωμένη παραγωγή αντιδραστικών είδη οξυγόνου (ROS).

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και Υποξική επαγωγή

κυτταρικές σειρές HNSCC αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Με την εξαίρεση του H357 [27], όλες οι κυτταρικές γραμμές (CA1, LuC4, CaLH2, CaLH3) και φυσιολογική στοματική κερατινοκύτταρα (NOK2 κυτταρομετρίας αναλύσεις που δείχνει μια μετατόπιση χρώση για CD44 (άξονας y) και της ESA (άξονας x) των κυττάρων που προκύπτουν από υποξία. ΝΤΟ; ανάλυση των αυξήσεων των EMT που προκύπτουν από υποξία. ΡΕ; ανάπτυξη της κυτταρικής σειράς Ca1 για 21 ημέρες με 1 mM DMOG αποτέλεσμα μορφολογικές αλλαγές (κορυφή), αντίστοιχες αλλαγές σε CD44 και χρώση ESA (μεσαίο), σταθεροποίηση HIF-1α, αλλά μικρή αλλαγή σε HIF-2α (κάτω αριστερά) και ένα αύξηση του κλάσματος EMT (κάτω δεξιά). ΜΙ; χρόνος μείωση εξαρτάται από το μέγεθος των κλασμάτων EMT υποξία που προκαλείται μετά την επιστροφή στο ορθοξικές συνθήκες.

Η

η υποξία επάγει ένα πληθυσμό κυττάρων με EMT που σχετίζονται με πρότυπα έκφρασης γονιδίων και αυξημένη Σφαίρα ικανότητα σχηματισμού

Για να καθοριστεί αν η διευρυμένη CD44

υψηλή /ESA

χαμηλό κλάσμα που προκαλείται από υποξία είχε πρότυπα γονιδιακής έκφρασης χαρακτηριστική της EMT, υποπληθυσμών κυττάρων CA 1 είχαν FACS ταξινομημένο πριν από την εκχύλιση RNA. Σε σύγκριση με την ESA

υψηλή /CD44

υψηλή (Epi CSC) κλάσμα, CD44

υψηλή /ESA

χαμηλή (EMT) κλάσματα έδειξε, όπως έχει ήδη αναφερθεί [22], μεγαλύτερη έκφραση της EMT- σχετικά γονίδια συστροφή και βιμεντίνης και μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης (Εικ. 3Α). δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρα, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο προσδιορισμούς για ΚΕΠ [30], έγιναν για να καθοριστεί αν η αύξηση του ΕΜΤ που επάγεται από την υποξία αύξησε τον αριθμό των κυττάρων με αυτό το βλαστοκύτταρο γνώρισμα. Για όλες τις κυτταρικές σειρές, μη κλασματοποιημένα πληθυσμούς κυττάρων διατηρούνται σε συνθήκες υποξίας για 21 ημέρες που σχηματίζεται ένα μεγαλύτερο αριθμό σφαιρών από κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες ορθοξικές (σχήμα 3Β αντιπροσωπευτικά δείγματα των καλλιεργειών που σχηματίζει σφαίρα μετά από 21 ημέρες ανάπτυξης σε νορμοξικά και υποξικές συνθήκες. ΝΤΟ; αυξήσει το σχηματισμό σφαίρα μετά από υποξική πολιτισμού. ΡΕ; μειώνονται σε βασικά επίπεδα HIF-1α σε νορμοξικά καλλιέργειες H357 μετά την προσθήκη YC-1. ΜΙ; μείωση του σχηματισμού ορθοξικές σφαίρα μετά την προσθήκη του YC-1 (αριστερά) και μικροσκοπία φάσης (δεξιά) ελέγχου και YC-1 (10 μΜ) καλλιέργειες της σφαίρας.

Η

EMT Υπο-κλάσματα Αυξημένα HIF -1α και Up-ρύθμιση της αναερόβιας Μεταβολική γονίδια

Σύμφωνα με ορθοξικές συνθήκες, καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως οι όγκοι καταγωγής τους, παρουσιάζουν συνήθως ένα αυξημένο ποσοστό της ενέργειας που προέρχεται από γλυκολυτικό διαδικασίες μαζί με υψηλότερα επίπεδα των HIF-1α [ ,,,0],5]. Normoxic καλλιέργειες κυτταρικών σειρών HNSCC έδειξαν υψηλότερα βασικά επίπεδα του HIF-1α από ΝΟΚ (Σχ. 4Α). Η περαιτέρω αύξηση σε κύτταρα ΕΜΤ που επάγεται από την υποξία πρότειναν ότι η έκφραση του HIF-1α μπορεί να διαφέρουν μεταξύ CSC υπο-κλάσματα. Ως εκ τούτου, τα κλάσματα ΕΜΤ και Epi CSC διαχωρίστηκαν από τις κυτταρικές γραμμές Ca1 και LuC4 για σύγκριση με μη-κλασματοποιημένη πληθυσμών τους. Σε σύγκριση με Epi ΚΕΠ ή των γονικών πληθυσμών, τα κύτταρα ΕΜΤ έδειξαν υψηλότερα επίπεδα HIF-1α ενώ HIF-2α ήταν υψηλότερη στο κλάσμα Epi CSC (Εικ. 4Β). Καθώς τα υψηλότερα επίπεδα HIF-1α σε κλάσματα ΕΜΤ θα μπορούσε να παραχθεί είτε με μειωμένη αποικοδόμηση ή αυξημένη παραγωγή της πρωτεΐνης, εκτιμήσαμε την πρωτεΐνη Von Hippel-Lindau (pVHL) που στοχεύει HIF-1α για την αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Ωστόσο, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ των κλασμάτων για τα επίπεδα pVHL πρωτεΐνη (σχήμα 4Γ). Εξετάζοντας την παραγωγή HIF-1α εντός του κλάσματος EMT βρήκαμε ότι το μήνυμα για HIF-1α ήταν αυξημένα (Εικ. 4D), υποδεικνύοντας ότι η αύξηση της παραγωγής αντί να μειωθεί η υποβάθμιση οδηγεί στα αυξημένα επίπεδα των κυττάρων EMT. Παραγωγή HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες αυξάνεται σε απόκριση της φλεγμονώδους κυτοκίνης ΤΝΡ-α, [31] και αυτή η κυτοκίνη είναι επίσης ένας ισχυρός επαγωγέας της ΕΜΤ [32]. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του TNFa στην HIF-1α εντός γραμμών κυτταρικές γραμμές μας κάτω από νορμοξικές συνθήκες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ΤΝΡα επί 6 ή 24 ώρες. Και στα δύο χρονικά σημεία, και στις δύο γραμμές που εξετάστηκαν, αυξημένα επίπεδα του HIF-1α παρατηρήθηκαν (Εικ. 4Ε). Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον οι Epi και EMT υπο-κλάσματα απάντησε διαφορικά σε TNFα και διαπίστωσε ότι τα υψηλότερα αρχικά επίπεδα του HIF-1α υπάρχουν σε κλάσματα EMT αυξήθηκαν ακόμη περισσότερο από TNFα (Σχήμα 4F). Δεν επηρεάζει το υποπληθυσμό Epi CSC θεωρήθηκε δείχνει μια επιλεκτική επίδραση στο κλάσμα EMT, ίσως λόγω των υψηλότερων ποσών του υποδοχέα TNFα 1 (TNFR1) που εκφράζονται από αυτά τα κύτταρα

Α.? σύγκριση με την δυτική αποτύπωση της ορθοξικές έκφραση του HIF-1α σε κυτταρικές σειρές ΝΟΚ και HNSCC. ΣΙ; HIF-1α και έκφραση HIF-2α σε ταξινομημένη γονική, ΕΜΤ CSC και Epi CSC κλάσματα των κυτταρικών γραμμών Ca1 και LuC4 υπό φυσιολογική οξυγόνωση. ΝΤΟ; Western Blot για τα επίπεδα pVHL σε ταξινομημένη κλάσματα της κυτταρικής γραμμής Ca1. ΡΕ; αξιολόγηση PCR του HIF-1α εκφράζονται ως επίπεδα EMT CSC σχέση με τα επίπεδα Epi CSC για την κυτταρική γραμμή Ca1. ΜΙ; απόκριση του HIF-1α επίπεδα Ca1 και LuC4 γραμμές σε θεραπεία με 10 ng /ml ΤΝΡα επί 6 ή 24 ώρες κάτω από νορμοξικές συνθήκες. ΦΆ; Western blots για για HIF-1α και TNFR1 σε επιμέρους κλάσματα της κυτταρικής γραμμής Ca1 μετά την αγωγή TNFa. ΣΟΛ; αξιολόγηση PCR της γλυκόλυσης στόχους γονίδιο εκφράζεται ως επίπεδα EMT CSC σε σχέση με τα επίπεδα του Epi CSC, κατά την κυτταρική σειρά Ca1. H? αντιπροσωπευτική φάση μικροσκοπικές εικόνες των Epi και κυττάρων EMT (αριστερά) και η σύγκριση της πρόσθιας σκέδασης για κλάσματα EMT και Epi CSC (δεξιά).

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον τα υψηλότερα επίπεδα HIF-1α του παρόντος μέσα στα κύτταρα EMT υπό ορθοξικές συνθήκες συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση του HIF-1 καθοδικά γονίδια, εξετάστηκαν 3 γλυκολυτικά στόχους. Εξοκινάσης II (Hex2), πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης κινάση 1 (ΡϋΚ1), και Γαλακτική αφυδρογονάση Α (LDHA), βρέθηκαν όλες να αυξηθεί στο κλάσμα ΕΜΤ σε σύγκριση με το κλάσμα Epi CSC (Σχ. 4G). Όπως ΡϋΚ1 φέρεται να επηρεάσει την αναλογία της γλυκόζης που χρησιμοποιείται για τη ζύμωση σε γαλακτικό ερευνήσαμε αν οι παρατηρούμενες αυξήσεις σε HIF-1α και στόχος γλυκολυτικά γονίδια του συσχετίζονται με αλλαγές στον μεταβολισμό γλυκόζης και την παραγωγή γαλακτικού. (Εικ. S1 Α) δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα πρωτεΐνης ΡϋΚ1 μεταξύ των κλασμάτων και εξέταση κατανάλωσης γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή αποκάλυψε μια παρόμοια αναλογία γλυκόζης αναερόβια μεταβολίζονται για κάθε κλάσμα, ανεξάρτητα της έκφρασης HIF-1α (Εικόνα S1B ανοσοφθορισμού εικόνες συγκρίνοντας τα επίπεδα ROS σε EMT και Epi ΚΕΠ αντίθετα με τη Hoechst. ΝΤΟ; κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις μέσων επιπέδων ROS του ΕΜΤ και Epi ΚΕΠ σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. ΡΕ; PCR φορές διαφορές για SOD2 μεταξύ EMT και Epi ΚΕΠ. ΜΙ; Western blots για HIF-1α και SOD2 για τις 3 υπο-κλάσματα κυτταρικής γραμμής Ca1. ΦΆ; σημαίνει μιτοχονδριακή μάζα του EMT και Epi ΚΕΠ σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. ΣΟΛ; σύγκριση IMMP της EMT και Epi ΚΕΠ σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. H? προφίλ του κυτταρικού κύκλου για EMT και Epi CSC κλάσματα των κυτταρικών σειρών 3.

Η

Για να διαπιστωθεί αν μειωθεί η κατανάλωση οξυγόνου συσχετίζεται με τα μειωμένα επίπεδα ROS κυττάρων EMT, ζωντανά EMT και τα κύτταρα Epi CSC συγκρίθηκαν με τη χρήση του ROS δείκτη CellRox ™ Red αντιδραστηρίου Deep. Πολύ λιγότερο χρώση για αυτό το δείκτη παρατηρήθηκε για τα κύτταρα EMT (Εικ. 5Β) και κυτταρομετρίας ποσοτικοποίηση των ROS στα κύτταρα τριπλή χρώση για τον ΕΟΔ, CD44 και CellRox ™ επιβεβαίωσε λιγότερο ROS στον πληθυσμό EMT CSC (Εικ. 5C). QPCR (Σχ. 5D). Κηλίδωση Western (Σχήμα 5Ε) έδειξε την ROS καθαριστή υπεροξειδική δισμουτάση 2 (SOD2) που πρόκειται να εκφράζεται έντονα μέσα EMT ΚΕΠ.

Όπως οξειδωτική φωσφορυλίωση συμβαίνει εντός μιτοχόνδρια, αναμενόταν ότι αλλαγμένη κατανάλωση οξυγόνου μπορεί να σχετίζεται με αλλαγμένη μιτοχονδριακή μέλη εντός CSC υπο-πληθυσμούς. Ως εκ τούτου, οι διαφορές στο σύνολο των μιτοχονδρίων μάζας μεταξύ των κυτταρικών υποπληθυσμών αξιολογήθηκαν από τριπλό χρώση για τον ΕΟΔ, CD44 και Mitotracker Green ™. Για όλες τις κυτταρικές σειρές, τα κλάσματα EMT έδειξαν σημαντικά μικρότερη μιτοχονδριακό μάζα (~ 10%) από ό, τι το γονικό πληθυσμό και εντυπωσιακή μείωση 40% σε σύγκριση με τον πληθυσμό Epi CSC (Εικ. 5F). Ως δείκτης της functon, εσωτερικό δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (IMMP) αξιολογήθηκε με τη φόρτωση των κυττάρων με Dil

1C (5). Αυτό έδειξε μια χαμηλότερη IMMP (~ 10%) για κλάσματα EMT από τη γονική τους πληθυσμούς και ακόμη χαμηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με το Epi ΚΕΠ (Εικ. 5G). Αξιολόγηση των διαφορών του κυτταρικού κύκλου μεταξύ κλασμάτων κυττάρων έδειξαν ότι Epi ΚΕΠ είχαν την τάση να συσσωρεύονται στο G2, όπως φαίνεται στο παρελθόν [18], ενώ η πλειοψηφία των κυττάρων EMT ήταν παρόντες σε G1 (Σχ. 5Η).

Συζήτηση

Έχουμε περιέγραψε πρόσφατα ετερογένεια εντός της CSC υπο-πληθυσμού [22] και ότι, ενώ η πλειοψηφία των ΚΕΠ έχουν ένα CD44

υψηλή /ESA

φαινότυπο επιφάνειας υψηλής κυττάρων και εκφράζουν επιθηλιακά δείκτες, ένα μεταβλητά μεγέθους κλάσμα των ΚΕΠ έχει υποστεί EMT. Τόσο η Epi και EMT CSC πληθυσμοί είναι αυτο-ανανέωση

in vitro

και όγκου έναρξη εάν μεταμοσχευθούν

in vivo

(25). Ωστόσο, ΕΜΤ ΚΕΠ είναι ανθεκτικά σε anoikis και έχουν μεγαλύτερη ικανότητα να αυξάνεται σε εναιώρημα ως σφαίρες όγκου, μια ιδιότητα που παρέχει ένα υποκατάστατο προσδιορισμού για αυτόν τον πληθυσμό. Αξιολογείται είτε μορφολογικά είτε ως CD44

υψηλή /ESA

χαμηλή κύτταρα, το μικρό EMT κλάσμα τυπικά υπάρχει σε κυτταρικές σειρές υπό ορθοξικές συνθήκες αυξάνει σε μεγάλο βαθμό ως απάντηση στην υποξία ή μετά τη σταθεροποίηση της HIF-1α πρωτεΐνη, αλλάζει σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις [23] – [26]. Αυτή η διευρυμένη πληθυσμού εμφανίζει ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης χαρακτηριστική της EMT και έχει αυξημένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας. Μετά επιταχυνόμενη αποδόμηση του HIF-1α υπάρχει μια μείωση στο σχηματισμό σφαίρα. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι HIF-1α έχει ένα λειτουργικό ρόλο στην επαγωγή και τη διατήρηση του φαινοτύπου CSC EMT.

HIF-1α αναγνωρίζεται να οδηγεί τα κύτταρα προς μια μεταβολική φαινότυπο με μειωμένη οξειδωτικό μεταβολισμό και την αυξημένη παραγωγή γαλακτικού, διαμεσολαβείται εν μέρει από την ρύθμιση προς τα πάνω του PDK-1 [6], [33]. Υπό ορθοξικές συνθήκες, βρίσκουμε ένα περίπου 50% μεγαλύτερο ρυθμό σύνθεσης του HIF-1α εντός του κλάσματος ΕΜΤ και ότι αυτό συσχετισμένης με υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης. Παρόμοια επίπεδα της πρωτεΐνης pVHL προταθεί καμία αλλαγή στο ρυθμό αποικοδόμησης και επομένως στο συμπέρασμα ότι το υψηλότερο επίπεδο του HIF-1α στο πλαίσιο EMT συντηρείται από την αύξηση της παραγωγής. EMT έχει αναφερθεί ότι προκαλείται από τον TGF-β1, ιντερλευκίνες και φλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως TNFa, το οποίο έχει επίσης αναφερθεί να αυξήσει την παραγωγή του HIF-1α [31]. Έχουμε επιβεβαιώσει παρόμοιες αποκρίσεις των κυτταρικών γραμμών μας και δείχνουν επίσης ότι τα κύτταρα ΕΜΤ ανταποκρίνονται επιλεκτικά σε TNFa αυξάνοντας το επίπεδο του HIF-1α. Αυτό εμπλέκει κυρίως επιδράσεις της μικροπεριβάλλον του όγκου σε μετατόπιση και τη διατήρηση του φαινοτύπου ΕΜΤ και ως εκ τούτου την εξέλιξη και την εισβολή των όγκων.

HIF-1α παραγωγή έχει επίσης προταθεί λόγω μιας εμπρόσθιας τροφοδότησης βρόχου με PDK-1 [ ,,,0],34]. Ωστόσο, αν και βρήκαμε αυξημένη μήνυμα για PDK-1 εντός της EMT CSC υπο-πληθυσμού βρήκαμε καμία αλλαγή στα επίπεδα της πρωτεΐνης. Επίσης δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ των κλασμάτων επιθηλιακών και EMT στην αναλογία της γλυκόζης μεταβολίζεται σε γαλακτικό το οποίο ήταν περίπου 60% για όλα τα υποπληθυσμών, ένα ποσοστό παρόμοιο με αυτό που αναφέρθηκε από Warburg πάνω από 80 χρόνια [1]. Ωστόσο, ανάλογη προς το μέγεθος EMT ΚΕΠ, το ποσό της χρήσης της γλυκόζης θα είναι υψηλότερες και αυτό σε συνδυασμό με τη σημαντική μείωση στην κατανάλωση οξυγόνου, προτείνει μια μειωμένη εξάρτηση από οξειδωτική φωσφορυλίωση με κύτταρα ΕΜΤ είναι λιγότερο δραστικό από μεταβολικά Epi ΚΕΠ. Οι αλλαγές του κυτταρικού κύκλου που διαπιστώθηκαν είναι επίσης υποδηλώνουν μια πιο ηρεμίας φαινότυπο EMT όπως έχει δειχθεί προηγουμένως για τα κύτταρα ΕΜΤ στις γραμμές HNSCC [35].

Σύμφωνα με την υποξία, HIF1 ενεργώντας μέσω ΡϋΚ1 [6] οδηγεί σε μείωση στο μιτοχονδριακό κατανάλωση οξυγόνου [33] και η μειωμένη παραγωγή των ROS. Υπερ-έκφραση του ΡϋΚ1 συσχετίζεται επίσης με φτωχή πρόγνωση [36]. Υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του HIF-1α και PDK1 βρέθηκαν εντός του ορθοξικές πληθυσμού CSC ΕΜΤ συνοδεύεται από μείωση στην κατανάλωση οξυγόνου και χαμηλότερα επίπεδα ROS, αλλαγές παρόμοιες με αυτές που έχουν αναφερθεί για τα κύτταρα υπό συνθήκες υποξίας. Τα υψηλά επίπεδα του SOD2 σε ΕΜΤ ΚΕΠ θα λειτουργεί επίσης για την απενεργοποίηση όπως ROS όπως θα μπορούσε να παραχθεί. Παπανδρέου και οι συνεργάτες του [33], εξετάζοντας μη κλασματοποιημένη πληθυσμούς όγκου, ανιχνεύεται κανένα διαρθρωτικές αλλαγές στα μιτοχόνδρια. Ωστόσο, αναλύοντας τις διαφορές μεταξύ των CSC υπο-κλάσματα έδειξαν μείωση στο μιτοχονδριακό μάζα σε EMT ΚΕΠ μαζί με χαμηλότερη σχετική IMMP που δείχνει μειωμένη μιτοχονδριακή λειτουργία. Zhang et al [37] έχουν αναφέρει κατασταλτικές ενέργειες της HIF1 στη μιτοχονδριακή βιογένεση μέσω της καταστολής της μεταγραφής από c-myc [38], [39] και έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν κάτω ρύθμιση της c-myc στην υπο-πληθυσμού ορθοξικές EMT [ ,,,0],22]. PCR αναλύσεις (τα δεδομένα δεν φαίνονται) δείχνουν επίσης ρύθμιση προς τα κάτω του c-myc εντός της διευρυμένης υποξικών κλάσματα EMT.

ΚΕΠ έχουν αρκετές μοναδικές ιδιότητες που τα διακρίνουν από το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού διαφοροποίησης κυττάρου [12], [18 ], [30] και πρόσφατες δημοσιεύσεις έχουν συσχετίσει την απόκτηση των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων με EMT. Για παράδειγμα, η επαγωγή της EMT σε μια μη ογκογόνων κυττάρων του μαστού γραμμή από τη θεραπεία με TGF-β1 οδηγεί στην απόκτηση του CD44

υψηλή /CD24

φαινότυπο επιφάνειας χαμηλής κυτταρικής τυπικό της ΚΕΠ του μαστού που έχουν όγκους έναρξη και όγκου -sphere ικανότητες σχηματισμού [16]. Η ακτινοθεραπεία χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία της HNSCC και χαμηλά επίπεδα οξυγόνου και κυτταρικής ROS, μαζί με τα υψηλότερα επίπεδα των αντιοξειδωτικών, είναι κρίσιμα μεσολαβητές της μειωμένης θανάτωσης κυττάρων με ακτινοβόληση [12]. Τα χαμηλά επίπεδα οξυγόνου που συνδέεται με την αποτυχία της ακτινοθεραπείας [40] και, ως εκ τούτου ιδιαίτερο κλινικό ενδιαφέρον που υποξική διέγερση του ΚΕΠ στο φαινότυπο EMT θα αυξήσει ακόμη περισσότερο τη γενική αντοχή σε διάφορες θεραπευτικές μεθόδους φαίνεται από ΚΕΠ [17] είναι. Η παρούσα δεδομένα επεκτείνει αυτά τα ευρήματα, πρώτα με την υποστήριξη της παρουσίας, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22], από δύο φαινοτύπους των βλαστοκυττάρων και, αφετέρου, με την επίδειξη αρκετές πρόσθετες ιδιότητες του φαινοτύπου ΕΜΤ CSC που είναι πιθανόν να σχετίζονται με αυξημένη θεραπευτική αντίσταση. Οι μεταβολικές ιδιότητες του κλάσματος ΕΜΤ CSC, και την αύξηση του μεγέθους σε υποξία, είναι πιθανό επομένως να δρουν για να ενισχυθεί η αντίσταση της ακτινοβολίας. Περαιτέρω, η πιο αργή κυτταρικού κύκλου και μιτοχονδριακή αναγωγή σε ΕΜΤ ΚΕΠ μπορεί να έχει συνέπειες για αποπτωτική αποκρίσεις σε τόσο ακτινοβολία και αντικαρκινικά φάρμακα. Φαίνεται ότι η θεραπευτική κατάργηση των λιγότερο μεταβολικά ενεργός πληθυσμός EMT θα απαιτήσει στοχευμένη θεραπεία και ότι τα μοντέλα της επαγωγής EMT, τόσο μέσω υποξία και κυτοκίνες μπορεί να παρέχει μια σημαντική πλατφόρμα για την ανάπτυξη τέτοιων θεραπειών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Υπο χρησιμοποίηση της γλυκόζης κλάσμα. ΈΝΑ; Western blots για τα επίπεδα ΡϋΚ1 υπο κλασμάτων. ΣΙ; χρήση γλυκόζης (αριστερά), γαλακτικό αποβάλλονται (κέντρο) και επί τοις εκατό της γλυκόζης μεταβολίζεται για να σχηματίσει γαλακτικό (δεξιά) στην κυτταρική σειρά Ca1 και Γ? στην κυτταρική σειρά LuC4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062493.s001

(ΔΕΘ)

Υποστήριξη Πληροφορίες S1.

QPCR Προϋποθέσεις και Αστάρια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062493.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Gary Warnes για την τεχνική βοήθεια του και ο Δρ Ντανιέλα Έλενα Κωστέα για κρίσιμες είσοδο της στο σχεδιασμό της μελέτης.