Αφηρημένο

Ιστορικό

Ν

-butylidenephthalide (BP) παρουσιάζει αντικαρκινική δράση σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αποκτήσουν επιπλέον γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην BP που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι /Κύρια Ευρήματα

Δύο ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές, PC- 3 και LNCaP, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την BP, και στη συνέχεια αξιολογούνται για τα προφίλ της βιωσιμότητας και του κυτταρικού κύκλου τους. BP προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η σύλληψη φάση G0 /G1 συσχετίστηκε με τα επίπεδα αύξησης των αναστολέων της CDK (p16, p21 και p27) και μείωση των σημείων ελέγχου πρωτεϊνών. Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών ΒΡ-επαγόμενης διακοπή της ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη μικροσυστοιχίας για τον εντοπισμό αλλοιώσεων στην έκφραση των γονιδίων που προκαλείται από BP στα κύτταρα LNCaP. Αρκετές BP που προκαλείται από γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του GADD153 /CHOP, μια ενδοπλασματικού δικτύου στρες (ER στρες) -regulated γονιδίου, ταυτοποιήθηκαν. BP-επαγόμενη στρες ER αποδείχθηκε από την αυξημένη έκφραση των μορίων κατάντη GRP78 /ΒίΡ, IRE1-α και GADD153 /CHOP στις δύο κυτταρικές σειρές. Απόφραξη του IRE1-α ή έκφραση /CHOP GADD153 από siRNA μείωσε σημαντικά ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα LNCaP. Επιπλέον, απόφραξη του JNK1 /2 σηματοδότησης από JNK siRNA οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του IRE1-α και τα γονίδια GADD153 /CHOP, ενοχοποιώντας ότι η BP επαγόμενη στρες ER μπορεί να προκληθεί μέσω JNK1 /2 σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. BP κατέστειλε επίσης την ανάπτυξη όγκου ξενομοσχεύματος LNCaP σε NOD-SCID ποντικούς. Προκάλεσε μείωση 68% στον όγκο του όγκου μετά από 18 ημέρες θεραπείας.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ΒΡ μπορεί να προκαλέσει G0 /G1 φάση σύλληψης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη και του κυτταροτοξικότητα διαμεσολαβείται από ER επαγωγή του στρες. Έτσι, η BP μπορεί να χρησιμεύσει ως αντικαρκινικός παράγοντας με επαγωγή ER στρες στον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Chiu S-C, Chen S-P, Huang S-Υ, Wang Μ-J, Lin S-Z, Harn H-J, et al. (2012) επαγωγή της απόπτωσης συνδυασμό με Ενδοπλασμικό Δίκτυο στρες στα ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη Ο καρκίνος του

n

-butylidenephthalide. PLoS ONE 7 (3): e33742. doi: 10.1371 /journal.pone.0033742

Επιμέλεια: Ασράφ Β Abdel-Ναΐμ, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Ain Shams, την Αίγυπτο

Ελήφθη: 22 Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 16 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC-93-2320-Β-303-004, NSC-94-2320-Β-303-005, NSC-96-2113-M-303-001), και Γενικό Νοσοκομείο βουδιστική Tzu-Chi, Χουαλιέν, Ταϊβάν (TCSP-01-02, TCRD-I9801-03). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια στην αμερικανική άνδρες και η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο [1]. Οι επιλογές θεραπείας για τους ασθενείς περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, ορμονοθεραπεία, χημειοθεραπεία, και συνδυασμούς μερικών από αυτές τις θεραπείες. Ένα από τα πιο κοινά παράγοντα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη είναι οι ταξάνες, όπως η πρώτη γενιά paclitaxel φάρμακο (Taxol, ένα εμπορικό σήμα της Bristol-Myers Squibb) [2], [3]. Αυξημένες συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών φαρμάκων και υψηλότερες δόσεις ακτινοβολίας αποτυγχάνουν να βελτιώσουν την απόκριση στη θεραπεία και οδηγεί σε αντίσταση απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, νεοαποκτηθέντα αντικαρκινικών παραγόντων που είναι μη τοξικά και άκρως αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης κατά προτίμηση στα κύτταρα του όγκου είναι πολύτιμη.

Πρόσφατα, έχουν μη παραδοσιακές θεραπείες που χρησιμοποιούν βότανα και συμπληρώματα διατροφής έχουν θεωρηθεί ως εναλλακτικά φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου.

Angelica sinensis

(ονομάζεται επίσης danggui στα κινεζικά) είναι ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούνται παραδοσιακά βότανα στην Κίνα. Συνιστάται ως τονωτικό, αιμοποιητικό, σπασμολυτικό, και αναλγητικό φάρμακο στην κλινική πράξη [4]. Σε προηγούμενη μελέτη μας,

n

-butylidenephthalide (ΒΡ), μια ένωση που απομονώνεται από

Angelica sinensis

εκχύλισμα χλωροφορμίου, επιδεικνύει δραστηριότητα αναστολής αύξησης σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, των πνευμόνων και του ήπατος τα καρκινικά κύτταρα. BP προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα όγκου

in vitro

και

in vivo

[5] – [7]. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η BP είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα αντικαρκινική ένωση με δυνατότητα για κλινική εφαρμογή. Ωστόσο, η επίδραση της BP για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα δεν έχει αντιμετωπιστεί.

Η πρωτεΐνη αναδίπλωση στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) έχει υποστεί απομείωση σύμφωνα με διάφορες φυσικές και παθολογικές καταστάσεις, που ονομάζονται ER στρες. Ένα συγκεκριμένο μονοπάτι σηματοδότησης, η ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνη (UPR), έχει καταδειχθεί σε κύτταρο για να ξεπεραστούν ER στρες [8]. Επαγωγή της πρωτεΐνης που ρυθμίζεται από γλυκόζη GRP78 /ΣΣΕ έχει αναγνωριστεί ευρέως ως δείκτης για ER στρες και την έναρξη της UPR. Οι UPR σήματα από τρεις διακριτές αισθητήρες στρες που βρίσκεται στην μεμβράνη ER: πρωτεϊνικής κινάσης RNA-σαν ER κινάση (PERK), ινοσιτόλη-απαιτώντας πρωτεΐνη-1 α (IRE1-α) και την ενεργοποίηση της μεταγραφής του παράγοντα-6 (ATF6) [9]. Μεταξύ αυτών, IRE1 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) συμβάλλει σε κυτταρικό θάνατο με φωσφορυλίωση και αδρανοποιώντας την αντι-αποπτωτική ρυθμιστής BCL-2 [10]. Η ομόλογους πρωτεΐνη παράγοντα μεταγραφής CCAAT /πρωτεΐνη ενισχυτή δεσμευτική (C /EBP) (CHOP? Επίσης γνωστή ως DDIT3 /GADD153) λειτουργεί στη σύγκλιση του PERK, IRE1-α και μονοπάτια ATF6 [11], [12]. Η υπερέκφραση του CHOP παίζει σημαντικό ρόλο στην απόπτωση [13] μέσω αποφωσφορυλιώνει την προ-αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bad και ρυθμίζει προς τα κάτω Bcl-2 έκφρασης [14]

Αυτή η παρούσα μελέτη επιδιώκεται:. 1) για τον προσδιορισμό του αντι -proliferative επίδραση της ΑΠ

in vitro

και

in vivo

, 2) για την ανάλυση των συνεπειών της BP στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, 3) για να διερευνήσει ER στρες ως μια πιθανή μοριακό στόχο του ΒΡ, και 4) να διαπιστώσει κατά πόσον σηματοδότηση ΜΑΡΚ /ER στρες ενέχεται στην ΒΡ-απόπτωση στον καρκίνο του προστάτη. Τα αποτελέσματα της BP στον καρκίνο του προστάτη αξιολογήθηκαν

in vitro

σε LNCaP και PC-3 κυτταρικές σειρές. LNCaP-NOD-SCID ποντίκια πείραμα ξενομόσχευμα χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η αντικαρκινική δράση του ΑΠ

in vivo

.

Αποτελέσματα

BP ανέστειλε πολλαπλασιασμό και μεταβολές που προκαλούνται μορφολογία στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κύτταρα

BP έχει μια ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί των κυττάρων GBM και προκάλεσε G0 /G1 σύλληψη φάση και απόπτωσης σε ένα χρόνο και τη συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Για να προσδιοριστεί η επίδραση κυτταροτοξικότητα της ΒΡ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την αύξηση της συγκέντρωσης της BP για 24 και 48 ώρες, και αξιολογήθηκαν με την δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και Β, η BP μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των DU-145, PC-3 και LNCaP κύτταρα σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Θεραπεία των LNCaP και κυττάρων με 75 μg /ml BP επί 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα 24,48% και 45,88% επιβίωση των κυττάρων, αντίστοιχα (Εικ. 1Β) 3 PC-. Με βάση αυτά τα δεδομένα, χρησιμοποιήσαμε 70 μg /ml BP για μεταγενέστερες μελέτες. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το αποτέλεσμα κυτταροτοξικότητα της BP επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη, επιλέχθηκαν LNCaP (εξαρτώμενη από ανδρογόνο) και κυττάρων (ανεξάρτητο από ανδρογόνο) PC-3 για περαιτέρω έρευνα. BP-θεραπεία LNCaP και PC-3 κύτταρα έδειξαν εμφανή συρρίκνωση των κυττάρων και στρογγυλοποίηση, διαθέτει χαρακτηριστική των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση (Σχ. 1D και F).

DU-145 (μαύρο), PC-3 (γκρι) , κύτταρα LNCaP (λευκό) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενη συγκέντρωση ΑΠ (25 έως 100 μg /ml) για 24 (Α) και 48 ώρες (Β) και αναλύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. LNCaP και κυττάρων PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,2% DMSO (C και Ε, αντίστοιχα) ή 70 μg /ml BP (D και F, αντίστοιχα) για 24 ώρες, έδειξαν.

Η

BP επαγόμενη κελί σύλληψη του κύκλου στο G0 /G1 φάση και άλλαξε τα επίπεδα έκφρασης της G0 /G1 ρυθμιστικές πρωτεΐνες

για να αποσαφηνιστεί ο τρόπος δράσης, εξετάσαμε τις επιδράσεις της BP στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η θεραπεία BP είχε ως αποτέλεσμα την συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G0 /G1 σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 2Α και Β). Ποσοτικοποίηση των πολλαπλασιαζόμενων μη επεξεργασμένων κυττάρων έδειξε ότι 67,95% των κυττάρων ήταν στην φάση G0 /G1, 24.96% των κυττάρων ήταν στην φάση S, και 7,73% των κυττάρων ήταν στην φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου 12 ώρες μετά την επίστρωση σε LNCaP κύτταρα? 62.71% των κυττάρων ήταν στην φάση G0 /G1, 17.78% των κυττάρων ήταν στην φάση S, και 19.50% των κυττάρων ήταν στην φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου 12 ώρες μετά την επίστρωση σε PC-3 κύτταρα. Η επεξεργασία των κυττάρων με 70 μg /ml BP επί 12 ώρες αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση Ο0 /Ο1 προς 81,94% και μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στην S και G2 /φάσεις Μ έως 10,6 και 8%, αντίστοιχα, σε LNCaP κύτταρα. Σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP επί 12 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G0 /G1 αυξήθηκε σε 69,94%, και τα κύτταρα στο S και G2 /φάσεις M μειώθηκε σε 18,11 και 11,97%, αντίστοιχα .

Η BP που προκαλείται από τον κυτταρικό κύκλο G0 /G1 σύλληψη στο (Α) LNCaP και (Β) κύτταρα PC-3. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 8 × 10

5 (LNCaP) και 6 × 10

5 (PC-3) ανά 6-cm πλάκα εις τριπλούν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP για 12-24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.D. από τρία διαφορετικά πειράματα. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. Η ανάλυση στυπώματος Western της κυκλίνης D1, CDK2, ρ16, ρ21, ρ27 και φωσφο-Rb (Ser807 /811) διεξήχθη σε κύτταρα LNCaP (C) και PC-3 κύτταρα (D). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Η ανάλυση στυπώματος Western της φωσφο-Ακί (Ser473), Akt, φωσφο-GSK-3β (Ser9) και GSK-3β διεξήχθη σε κύτταρα LNCaP (Ε) και PC-3 κύτταρα (F). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

Για τον προσδιορισμό των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται η G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από την ΒΡ, εξετάσαμε την έκφραση ορισμένων G0 /G1 ρυθμιστική πρωτεϊνών σε LNCaP και PC-3 κύτταρα σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP. Εξετάσαμε πρώτα το επίπεδο της κυκλίνης D1, το κύριο κυκλίνης έλεγχο του οδοφράγματος G0 /G1. θεραπεία BP οδήγησε σε ταχεία μείωση του επιπέδου της κυκλίνης D1 πρωτεΐνης (Εικ. 2C και D). Προς τα πάνω ρύθμιση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ16, ρ21, ρ27, και προς τα κάτω ρύθμιση της CDK2 παρατηρήθηκαν επίσης σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2C και D) Εμείς παρατηρείται επίσης ταχεία μείωση του επιπέδου φωσφορυλίωσης Rb (Σχ . 2C και D) που δείχνει τη παραβιαστεί ενεργοποίηση της CDK4 /6.

έχει αποδειχθεί ότι η φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 προκαλείται από την Akt-GSK-3β οδό. Ενεργοποιημένος Akt φωσφορυλιώνει και αναστέλλει τη λειτουργία GSK-3β, οδηγώντας στην απο-φωσφορυλίωση και σταθεροποίηση της κυκλίνης D1. Επομένως, εξετάσαμε αν η οδός Akt-GSK-3β-Κυκλίνη D1 είχε εμπλακεί σε ΒΡ-επαγόμενη αποικοδόμηση της κυκλίνης D1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η ΒΡ ταχέως και αξιοσημείωτα κατέστειλε φωσφορυλίωση της Akt, μόλις σε 10 λεπτά (Σχ. 2Ε και F). Σε συμφωνία με την αναστολή της Akt δραστηριότητα, μειωμένη φωσφορυλίωση της Ser9 σε GSK-3β, ένας στόχος της Akt κινάσης, παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. 2Ε και F), γεγονός που υποδηλώνει ότι η BP προάγει τη φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 μέσω καταστολής της Akt και ενεργοποίηση των GSK- 3β. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΒΡ καταστέλλει μονοπάτι Akt-GSK-3β σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και προκαλεί G0 /G1 διακοπή αύξησης επηρεάζοντας την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών G0 /G1.

BP επαγόμενη απόπτωση σε LNCaP και PC-3 κύτταρα

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της απόπτωσης σε ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, western blotting και χρώση TUNEL διενεργήθηκαν. Η ενεργοποίηση των κασπασών είναι ζωτικής σημασίας για τους μηχανισμούς επαγωγής απόπτωσης. Κασπάση -8 και -3 ήταν κλειδί πρωτεάση που συνδέεται με τον υποδοχέα του θανάτου που προκαλείται-απόπτωσης και τη συμμετοχή τους στη ΒΡ-επαγόμενη απόπτωση διερευνήθηκε σε αμφότερα LNCaP και PC-3 κύτταρα. BP-επαγόμενη κασπάσης -8 και -3 σχάσεις αυξημένη δόση-εξαρτώμενο τρόπο τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 3Α και Β). Τα προ-αποπτωτικά μέλη οικογένειας Bcl-2, Βαχ, αυξήθηκε επίσης μετά τη θεραπεία ΒΡ οι οποίες έχουν σημαντική σύνδεση μεταξύ IRE1 και ER-στρες που προκαλείται από απόπτωση. TUNEL χρώση στις 48 ώρες μετά από 70 μg /ml θεραπεία BP αποκάλυψε επίσης αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων σε αμφότερα LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 3D και F, αντιστοίχως).

ανάλυση στυπώματος Western των δραστικών κασπάσης 8 , δραστική κασπάση 3 και Bax διεξήχθη σε κύτταρα LNCaP (Α) και PC-3 κύτταρα (Β). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. LNCaP κύτταρα και PC-3 κύτταρα επωάστηκαν με την απουσία (C και Ε, αντίστοιχα) ή παρουσία (D και F, αντιστοίχως) 70 μg /ml BP επί 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία TUNEL.

Η

ανάλυση έκφρασης γονιδίου από cDNA microarray σε LNCaP κύτταρα

για να αποκτήσετε εικόνα για το μηχανισμό της ΒΡ που προκαλείται αναστολή της ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου, χρησιμοποιήσαμε ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο που βασίζεται μικροσυστοιχιών για τον εντοπισμό ΒΡ-μεσολαβούμενη γονιδιακή έκφραση BP-κατεργασία . LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 70 μg /ml BP για 3 και 24 ώρες, και το RNA εκχυλίζεται και χρησιμοποιείται στην ανάλυση μικροσυστοιχίας. Προσδιορίστηκε ότι πάνω ρυθμισμένα σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Πίνακας 1) Genes συμπεριλαμβανομένων GADD153 /CHOP. Εμείς επικυρωθεί το up-ρύθμιση των γονιδίων GADD153 /CHOP με κηλίδα western. BP προκάλεσε αυξημένη έκφραση GADD153 /CHOP πρωτεΐνη σε τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 4Α και Β). Up-ρύθμιση του GADD153 /CHOP έχει οριστεί ως ER στρες-απόκρισης, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί σήματα για να επάγει απόπτωση. έτσι Ερευνήσαμε το ρόλο του ER στρες στην ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

ανάλυση στυπώματος Western των ΒίΡ, καλνεξίνη, PDI, ATF6, φωσφο-eIF2α (ser51), IRE1-α, GADD153 /CHOP, φωσφόρου ASK1 (Thr845), ASK1 και Fas διεξήχθησαν σε κύτταρα LNCaP (Α) και PC-3 κύτταρα (Β). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Η ανάλυση στυπώματος Western των ΒίΡ, IRE1-α, GADD153 /CHOP και Ero1-Lα διεξήχθησαν σε κύτταρα LNCaP (C) και PC-3 κύτταρα (D). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

BP που προκαλείται από το στρες ER σε LNCaP και PC-3 κύτταρα

Για να οριοθετηθούν την επαγωγή ER στρες με την BP στον προστάτη καρκινικά κύτταρα, μελετήθηκε η επαγωγή της UPR σχετικών γονιδίων μετά από θεραπεία ΒΡ σε LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 4Α και Β, αντίστοιχα). Έκφραση των ΣΣΕ αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία της BP, αλλά δεν βρέθηκαν διαφορές στα καλνεξίνη και εκφράσεις PDI (Εικ. 4Α και Β). Παρατηρήθηκε Up-ρύθμιση του ER στρες μετατροπέα IRE1-α αλλά όχι ATF6 και ρ-eIF-2α. BP επαγόμενη έκφραση IRE1-α ήταν εμφανής από 3 ώρες (1.16 πτυχώσεις) και αυξημένη έως 48 ώρες (2.47 πτυχώσεις) σε κύτταρα LNCaP. Τα επίπεδα του Fas αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία BP τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα και ήταν σύμφωνες με το εύρημα μικροσυστοιχία σε κύτταρα LNCaP. Επιπλέον, εκφράσεις του ΒίΡ, IRE1-α και GADD153 αυξημένη δόση εξαρτώμενο τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 4C και D). Η GADD153 μεταγραφικό στόχο, ER οξειδάσης 1 σαν α (ERO1-Lα) αυξήθηκαν επίσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από θεραπεία BP (Σχ. 4C και D).

BP-επαγόμενη πυρηνική μετατόπιση του GADD153 /CHOP σε LNCaP και PC-3 κύτταρα

για να μελετηθεί η συμμετοχή των GADD153 /CHOP στη θεραπεία της BP, πρέπει πρώτα να ερευνηθεί αν η BP προώθησε την μετατόπιση του GADD153 /CHOP πρωτεΐνης στον πυρήνα. GADD153 /CHOP πυρηνική μετατόπιση αντιπροσωπεύει την αξία του σήματος του στρες στον πυρήνα και επομένως μια λειτουργική ενεργοποίηση. Σε 12 ώρες μετά από 70 μg /ml θεραπεία BP, GADD153 /CHOP ήταν προφανώς πιο άφθονη στον πυρήνα του BP-αγωγή LNCaP και κυττάρων από ό, τι εκείνη των μαρτύρων (Εικ. 5Α και Β) 3 PC-.

(Α) κύτταρα LNCaP και (Β) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,2% DMSO (έλεγχος) ή 70 μg /ml BP επί 12 ώρες, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-GADD153 /CHOP. Χρησιμοποιήθηκε ΡΙΤΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (πράσινος φθορισμός) Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε φθορισμός). Οι εικόνες που συλλαμβάνονται από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ.

Η

Ο ρόλος της ER στρες στην BP-μεσολάβηση αντι-πολλαπλασιασμού

χρησιμοποιηθούν περαιτέρω μια προσέγγιση siRNA να προσδιοριστεί ο ρόλος της GADD153 στην αντικαρκινικά δυναμικό της ΒΡ στον καρκίνο του προστάτη. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs για GADD153 και IRE1-α, αντίστοιχα, με ή χωρίς τελική επεξεργασία του 70 μg /ml BP επί 48 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι η επιμόλυνση του si-GADD153 /CHOP οδήγησε σε καταστολή της έκφρασης /CHOP GADD153 που προκαλείται από BP σε κύτταρα LNCaP, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο ελέγχου siRNA (Σχ. 6Α). Ο κυτταρικός θάνατος που επάγεται με αγωγή BP διασώθηκε από 21,18% σε κύτταρα επιμολυσμένα με GADD153 /CHOP siRNA σε σύγκριση με μπερδεμένο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 6Β). Από γονίδιο GADD153 /CHOP προαγωγέα περιέχει θέσεις σύνδεσης για όλες τις μεγάλες επαγωγείς του UPR, και μόνο IRE1-α διεγέρθηκε μετά την κατεργασία BP (Σχ. 4), χαρακτηρίσαμε περαιτέρω το ρόλο της IRE1-α σε ΒΡ-επαγόμενη κυτταρική ανάπτυξη σύλληψη και κυτταρικό θάνατο. Εμείς σιγήσει έκφραση IRE1-α από si-IRE1-α επιμόλυνση πριν από 70 μg /ml θεραπεία BP. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, IRE1-α siRNA μπλοκάρει σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης IRE1-α που επάγεται με αγωγή BP κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, GADD153 /CHOP επίσης καταστάλθηκε από IRE1-α siRNA διαμόλυνση. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι 11,67 και 20,8% του κυτταρικού θανάτου ανεστάλη με 20 και 50 ηΜ IRE1-α siRNA διαμόλυνση μετά την έκθεση των κυττάρων σε 70 μg /ml ΒΡ, αντίστοιχα (Εικ. 6D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η BP-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μπορεί να εμπλέκεται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της επαγωγής των ER στρες και το πάνω ρύθμιση IRE1-α και η έκφραση πρωτεϊνών /CHOP GADD153.

( Α) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με σκαρφάλωμα siRNA (

#), 20, ή 40 ηΜ siRNA GADD153, αντίστοιχα, για 48 ώρες με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης RNAiFect. Μετά από 24 ώρες αγωγή με 70 μg /ml BP, ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκε για GADD153. (Β) Η BP επαγόμενη αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με σκαρφάλωμα siRNA (

#) ή 20 ηΜ siRNA GADD153 για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP για 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ***

P

& lt? 0.001. (Γ) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με σκαρφάλωμα siRNA (

#), 20, ή 50 ηΜ IRE1-α siRNA, αντίστοιχα, για 48 ώρες με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης RNAiFect. Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με 70 μg /ml BP, ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκε για IRE1-α και GADD153, αντίστοιχα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (D) BP-επαγόμενη αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με σκαρφάλωμα siRNA (

#), 20, ή 50 ηΜ IRE1-α siRNA, αντίστοιχα, για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP για 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ***

P

& lt?. 0,001 έναντι του οχήματος

Η

Ο ρόλος της ΜΑΡΚ για την BP που προκαλείται από το στρες ER και κυτταρικό θάνατο

Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ έχει εμπλέκονται στη ρύθμιση της επαγόμενης ER-στρες κυτταρικού θανάτου. Ερευνήσαμε την επίδραση της ΑΠ επί της ενεργοποίησης ΜΑΡΚ. Η έκθεση των LNCaP και PC-3 κύτταρα σε 70 μg /ml BP είχε σαν αποτέλεσμα φωσφορυλίωση της JNK και ERK 1/2 1/2, αλλά όχι p38 ΜΑΡΚ (Σχ. 7Α και Β). Η ERK 1/2 φωσφορυλίωση μετά την επεξεργασία BP έλαβε χώρα σε 10 λεπτά και τα κάτω ρύθμιση εμφανίστηκε σε 30 λεπτά. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της JNK 1/2 υπέστη στα 10 έως 180 λεπτά. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του ρόλου της JNK 1/2 σε θεραπεία BP, έχουμε σιγήσει JNK 1/2 έκφραση από συγκεκριμένους διαμόλυνση siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, JNK 1/2 έκφρασης και φωσφορυλίωσης μετά τη θεραπεία BP μειώνεται κατά si-JNK επιμόλυνση. Επιπλέον, η BP-επαγόμενη έκφραση IRE1-α και GADD153 μειώνεται επίσης με SI-ΙΝΚ διαμόλυνση. BP-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο διασώθηκε από SI-ΙΝΚ επιμόλυνση, σε σύγκριση με την επιμόλυνση κωδικοποιημένο siRNA (siRNA1: 26,14%, siRNA2:. 20,95%, Σχήμα 7D). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση ΙΝΚ εμπλέκεται σε ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και συμμετέχει σε IRE1-α και η ενεργοποίηση GADD153.

(Α) κύτταρα LNCaP και κυττάρων (Β) PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 70 μg /ml BP για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Φωσφο-ERK1 /2, σύνολο ERK1 /2, φωσφο-JNK1 /2, σύνολο JNK1 /2 φωσφογλυκόζης ρ38, και ολική ρ38 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western αντίστοιχα. (C) LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με αγωνίζομαι (

#) ή 20 nM JNK1 /2 siRNA για 48 ώρες χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο επιμόλυνσης RNAiFect. Μετά την επεξεργασία με 70 μg /ml BP για 24 ώρες, ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκε για φωσφο-JNK1 /2, σύνολο JNK1 /2, IRE1-α και GADD153. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (D) BP-επαγόμενη αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με μπάλα (

#) ή JNK1 /2 siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 70 μg /ml BP για 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ***

P

& lt?. 0,001 έναντι του οχήματος

Η

BP αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε LNCaP-NOD-SCID ξενομόσχευμα

Για να αξιολογηθεί η αντικαρκινική δράση ΒΡ

in vivo

, ξενομοσχεύματος ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη καθορίστηκαν με υποδόρια ένεση 5 × 10

5 LNCaP κυττάρων στον ραχιαίο υποδόριο ιστό NOD-SCID ποντικούς. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8Α, ο σχετικός όγκος του όγκου σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με 500 mg /kg ΒΡ ήταν σημαντικά 68% χαμηλότερη από τους ποντικούς ελέγχου υπό αγωγή με όχημα κατά την ημέρα 18. Το βάρος του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη 56% στην ομάδα BP-θεραπεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου την ημέρα 18 (Εικ. 8Β). Οι όγκοι στα ζώα ελέγχου βαθμολογήθηκαν ως Gleason 5Β αφού δεν αδενικό ιστό βρέθηκε (Εικ. 8C). Στα ζώα BP-θεραπεία, ακανόνιστη λιωμένο αδένων παρατηρήθηκαν και οργανώθηκαν Gleason 4Α (Σχ. 8D). Έτσι, οι βαθμοί της διαφοροποίησης του όγκου της ομάδας BP-αγωγή ήταν καλύτερα από την ομάδα ελέγχου. Εκτός αυτού, πάνω ρύθμιση του GADD153 /CHOP στον όγκο ΒΡ-θεραπείας παρατηρήθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 8Ε και F) και ανάλυση κηλίδος western (Σχ. 8G), αντίστοιχα. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 παρατηρήθηκε επίσης σε ΒΡ-θεραπεία των όγκων (Σχ. 8G). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές του σωματικού βάρους και στα δύο ελέγχου και ΒΡ-αγωγή ομάδες. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΒΡ που προκαλείται προστάτη θανάτου καρκινικών κυττάρων συσχετίστηκε με ER στρες

in vivo

.

(Α) NOD-SCID εγχύθηκαν με περίπου 5 × 10

5 LNCaP κυττάρων στον ραχιαίο υποδόριο ιστό. Όταν ο όγκος έφθασε 100-250 mm

3, LNCaP φέροντα-όγκους ποντίκια χορηγήθηκαν s.c. με τον έλεγχο του οχήματος (▪) ή 500 mg /kg BP (•) για 5 ημέρες ημέρες 0-4. Οι σχετικοί όγκοι των όγκων ελέγχου καθώς και τις ΒΡ-αγωγή ομάδες εμφανίζονται ως μέσο ± S.D. του όγκου του όγκου σε κάθε χρονικό σημείο. (Β) Οι όγκοι του ελέγχου και της θεραπευτικής ομάδες αφαιρέθηκαν και σταθμίζονται κατά την ημέρα 18. Μέσο βάρος όγκου από την ομάδα της BP-θεραπεία ήταν 56% μικρότερη από την ομάδα ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. του βάρους του όγκου του ελέγχου και των BP-αγωγή ομάδες. **

P

& lt? 0,01. (C, D) τομές όγκων ιστού με HE χρώση του ελέγχου (C) και θεραπευτικές ομάδες (D) .GADD153 εκφράσεις ανοσοϊστοχημικά εντοπίστηκαν στον έλεγχο (Ε) και την ομάδα BP-αγωγή (F). Οι GADD153-θετικά κύτταρα χρωματίστηκαν καφέ. Έκφραση των GADD153 και δραστική μορφή της κασπάσης-3 στον ιστό ξενομοσχεύματος όγκου LNCaP ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά την χορήγηση της BP, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με κηλίδωση Western ανάλυση (G).

Η

Συζήτηση

Σήμερα ορισμένες πολλά υποσχόμενες φυσικώς που συμβαίνει διαιτητικές θεραπευτικές ενώσεις περιλαμβάνουν ρεσβερατρόλη, κουρκουμίνη, genistein, διαλλύλιο σουλφίδιο και άλλες ουσίες που έχουν από κοινού την ικανότητα να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων έχουν αξιοποιηθεί [15]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, αποδείξαμε ότι η BP πράξη έντονα κατά πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) όγκων του εγκεφάλου και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) όγκους

in vitro

και

in vivo

[5], [6] , [16]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της BP σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη δεν έχουν προσδιοριστεί. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι η ΒΡ είναι κυτταροτοξική για τα τρία διαφορετικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Επειδή και οι δύο από τις εξαρτώμενων από ανδρογόνα και ανεξάρτητη από κύτταρα καρκίνου του προστάτη έδειξε παρόμοια ευαισθησία σε θεραπεία ΒΡ, η εμπλοκή των ανδρογόνων οδού αγνοήθηκε σε αυτή τη μελέτη.

Η απώλεια της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου είναι το σήμα κατατεθέν του καρκίνου. Να διερευνήσει τους μηχανισμούς αντιπροσώπευε για την επίδραση της BP για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, κυτταρικούς κύκλους παρακολουθούνταν. BP-επαγόμενη διακοπή κύκλου κυττάρου αποδεικνύεται από τα πάνω ρύθμιση της ρ16, ρ21 και ρ27, και ρύθμιση προς τα κάτω της CDK2 και κυκλίνης D1. Οι πρωτεΐνες ρ16, ρ21 και ρ27 είναι αναστολείς CDK που ρυθμίζουν αρνητικά cdk ή κυκλίνης /cdk συμπλόκου [17]. Η πρωτεΐνη ρ16, μέλος της οικογένειας των ΙΝΚ4, δεσμεύεται σε CDK4 /6 για να εμποδίσει τη δράση κινάσης στη φάση G1 μέσα [18]. Η p21 (Cip1) και ρ27 (kip1) πρωτεΐνες συνδέονται προς το σύμπλοκο κυκλίνης /cdk, με αποτέλεσμα την αναστολή της G1 προς S μετάβαση φάσης μέσω της κατάργησης της Rb φωσφορυλίωσης από το σύμπλοκο κυκλίνης /cdk [19]. Έτσι, η μείωση του φωσφορυλιωμένου Rb πρέπει να οφείλεται σε ένα ΒΡ-ενεργοποιείται έκφραση των αναστολέων cdk, η οποία με τη σειρά της να μειώσει τη δραστικότητα του συμπλόκου κυκλίνης /cdk. Η συχνή ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Akt έχει αναφερθεί σε πολλούς καρκίνους του ανθρώπου [20], [21], και GSK-3β έχει αναγνωριστεί ως ένας από τους μοριακούς στόχους της Akt του. Akt απενεργοποιεί δραστικότητα κινάσης GSK-3β μέσω φωσφορυλίωσης site-specific στο Ser9 [22]. Η καταστολή της Akt που οδηγεί σε απο-φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της αιτίας φωσφορυλίωσης GSK-3β της κυκλίνης D1 στο Thr286 και την επακόλουθη αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [23]. Η κυκλίνη D1 έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του μαστού, της κεφαλής και του λαιμού, του οισοφάγου και του προστάτη [24],. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η ΒΡ είναι ικανό να αναστέλλει την ενεργοποίηση Akt φωσφορυλίωση μέσω της μείωσης Ser473, και αποκαθιστά δραστικότητα κινάσης GSK-3β, μειώνοντας φωσφορυλίωση Ser9 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η BP καταστέλλει τον καρκίνο του προστάτη πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου με τη ρύθμιση της κυκλίνης /CDK /ΟΚΙ κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικής πρωτεΐνης και στόχευση του άξονα Akt-GSK-3β-κυκλίνη D1 σηματοδότησης.

Για να διερευνήσουν το υποκείμενο μοριακούς μηχανισμούς ΒΡ-επαγόμενης καρκινικά κύτταρα προστάτη θάνατος, εξετάσαμε την BP-επαγόμενη αλλαγές στην έκφραση γονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία διαλογής μικροδέσμης ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο που βασίζεται. Αρκετά γονίδια που δείχνει μεγαλύτερο από δύο φορές αύξηση στην έκφραση στις 24 ώρες της θεραπείας ΒΡ προσδιορίστηκαν (Πίνακας 1). GADD153 /CHOP έδειξε δραματικά 11.89 πτυχώσεις αύξηση της έκφρασης μετά τη θεραπεία της BP. GADD153 /CHOP είναι ένα γονίδιο που μας ενδιαφέρει, όπως εμπλέκεται στο ER αποπτωτικό μονοπάτι του στρες με τη μεσολάβηση. Η ενεργοποίηση της UPR παίζει προστατευτικό ρόλο στα κύτταρα υπό ER στρες [26]. Ωστόσο, η παρατεταμένη ενεργοποίηση της UPR από υπερβολικό άγχος ER μπορεί να μετατρέψει το ρόλο της στην κυτταροτοξική από την ενεργοποίηση των πολλαπλών αποπτωτικών οδών σε κύτταρα θηλαστικών [27]. Οι πρωτεΐνες μορφοτροπέα ER στρες ATF6, IRE1-α και PERK αποτελούν τον πυρήνα ρυθμιστής άγχος της UPR, και μετάγουν σήματα από το ER στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα μετά ER στρες [28] – [30]. Στη μελέτη μας, η BP προκάλεσε μόνο IRE1-α ενεργοποίηση αλλά δεν ATF6 ή ρ-eIF2α στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Αύξηση και διατήρηση της έκφρασης του IRE1-α και προς τα κάτω στόχος GADD153 /CHOP της μετά τη θεραπεία BP παρατηρήθηκαν σε χρονο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ένας από τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην GADD153 /CHOP απόπτωση που διαμεσολαβείται είναι το οξειδωτικό στρες [31]. Οξείδωση του αυλού ER επάγεται από την GADD153 /CHOP προς τα κάτω στόχος ERO1-Lα. ERO1-Lα έχει σκεφτεί να hyperoxidize τον αυλό ER, και προκαλεί κυτταροτοξικές αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Ένας άλλος μηχανισμός συνδέθηκε με το ρόλο του Βαχ σε GADD153 /CHOP επαγόμενη απόπτωση. Στο ER-στρες που προκαλείται από aopotosis καρδιακών, Bax αυξάνονται με ER στρες σε ένα GADD153 /CHOP-εξαρτώμενο τρόπο [32]. Βαχ και Bak ρυθμίζουν επίσης UPR από μια άμεση αλληλεπίδραση με IRE1-α και είναι σημαντικό σύνδεσμο μεταξύ μεσολάβηση IRE1-α-ER στρες απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επιμόλυνση των siRNAs για IRE1-α ή GADD153 /CHOP κατέστειλε ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η BP μπορεί να ρυθμίζει ER στρες απόπτωση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη μέσω της ενεργοποίησης των IRE1-α-GADD153 /μονοπατιού σηματοδότησης CHOP.

Η θεραπεία με την BP προκάλεσε αυξημένη έκφραση του Fas, η οποία οδήγησε στην ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και -3 σε κακοήθη όγκο στον εγκέφαλο σε προηγούμενη μελέτη μας [5]. Fas υπερέκφραση επίσης αυξήθηκε στις 3 ώρες μετά την αγωγή της ΒΡ. Έτσι, BP-επαγόμενη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη θα μπορούσε να διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της οδού της απόπτωσης των υποδοχέων θανάτου.

Επιπλέον, η ενεργοποίηση των MAPKs έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στο στρες ER σηματοδότησης καταρράκτη και εμπλέκεται σε πολλές πτυχές του ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης. Η οδός JNK έχει επίσης δειχθεί ότι είναι ένας θετικός ρυθμιστής της ER στρες απόπτωση που επάγεται από [33]. Στη μελέτη μας, η φωσφορυλίωση της JNK παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία BP. Η αναστολή της έκφρασης JNK με siRNA οδήγησε στην προς τα κάτω ρύθμιση του IRE1-α και GADD153 /CHOP, και μερικώς διασώθηκε ΒΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. ER στρες ενεργοποιούμενη IRE1-α δεσμεύει τον υποδοχέα που σχετίζεται factor2 πρωτεΐνη προσαρμογέας παράγοντα νέκρωσης όγκου (TRAF2), μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης, το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί την απόπτωση σήμα ρύθμισης κινάσης 1 (ASK1? Επίσης γνωστή ως MAP3K5), στη συνέχεια προκαλεί JNK δραστηριοποίηση. Αυτά τα ευρήματα εμπλέκουν την έννοια ότι η BP επαγόμενη ER στρες-διαμεσολαβούν κυτταρικό θάνατο μέσω της συνεργασίας του μονοπατιού ΙΝΚ.

παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL) είναι ένας συνδετήρας υποδοχέα θανάτου που μπορεί προνομιακά κινήσει απόπτωση σε διάφορα κύτταρα όγκου. θεραπευτικά Πρόσφατα, TRAIL-based, συμπεριλαμβανομένης της γονιδιακής θεραπείας TRAIL, ανασυνδυασμένο TRAIL και TRAIL υποδοχέα-αγωνιστικά αντισώματα έχουν εισέρχονται κλινικές δοκιμές [34] – [37]. Ωστόσο, παρόμοια με πολλές άλλες μορφές καρκίνου, ο καρκίνος του προστάτη αναπτύσσουν ανθεκτικότητα στο TRAIL [38], [39]. Ως εκ τούτου, αναζητώντας ευαισθητοποιητές TRAIL σε θέση να υπερνικήσει την αντίσταση TRAIL σε καρκινικά κύτταρα είναι πολύτιμη. LNCaP είναι γνωστό ότι είναι ανθεκτικά σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση που σχετίζεται με την απουσία του ΡΤΕΝ που προωθούν συστατική ενεργοποίηση του μονοπατιού AKT /ΡΙ3Κ. Δεδομένου ότι η BP μείωσε αποτελεσματικά την Akt δραστηριότητα, μειώνοντας το επίπεδο της φωσφο-Akt Ser473, η οποία καθιστά BP έναν υποψήφιο του TRAIL ευαισθητοποιητή.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας έδειξε ότι η BP 1) προκαλεί σύλληψη του καρκίνου του προστάτη του κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 φάση με τη στόχευση του άξονα Akt-GSK-3β-Κυκλίνη D1 σηματοδότησης? 2) προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω ER-άγχους και JNK μεσολάβηση UPR? 3) πυροδοτεί την απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω πολλαπλών αποπτωτικών οδών

in vitro

και

in vivo

(Εικ. 9).

BP διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη μέσω πολλαπλών αποπτωτικών οδών, συμπεριλαμβανομένων σύλληψη κύκλου G0 /κύτταρο φάση G1, οδός υποδοχέων θανάτου και ER στρες που εξαρτώνται από μονοπάτι.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειες κυττάρων και αντιδραστήρια

Οι κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου προστάτη LNCaP και PC-3 αγοράστηκαν από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 U /ml στρεπτομυκίνη, 1% πυροσταφυλικό νάτριο, 2 mM Ε-γλουταμίνη (όλα από αυτά τα αντιδραστήρια είναι από την Invitrogen, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2.