Αφηρημένο

Pim-1 κινάση, μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης που κωδικοποιείται από το

PIM

πρωτο-ογκογονίδιο, εμπλέκεται σε αρκετές οδούς σηματοδότησης όπως η ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση. Πολλοί τύποι καρκίνου του δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης του Pim κινασών και ειδικότερα Pim-1 έχει συνδεθεί με την έναρξη και την πρόοδο του κακοήθους φαινοτύπου. Σε αρκετούς ιστούς καρκίνου έχουν σωματικών μεταλλάξεων Pim-1 έχουν ταυτοποιηθεί. Αυτές οι φυσικές παραλλαγές είναι nonsynonymous πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου, παραλλαγές ενός μόνο νουκλεοτιδίου που συμβαίνουν στην περιοχή κωδικοποίησης και οδηγούν σε υποκαταστάσεις αμινοξέων. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε το αποτέλεσμα της υποκατάστασης αμινοξέος επί της δομικής σταθερότητας και της δραστηριότητας των Pim-1 κινάση. Εκφράσαμε και καθαρίστηκε μερικά από τα μεταλλάγματα του Pim-1 κινάση που εκφράζονται σε καρκινικούς ιστούς και αναφέρθηκαν στην ενιαία βάση δεδομένων νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Οι σημειακές μεταλλάξεις στις παραλλαγές επηρεάζουν σημαντικά την διαμόρφωση της φυσικής κατάστασης του Pim-1. Όλες οι μεταλλάξεις, που εκφράζονται ως διαλυτές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, δείχνουν μια μειωμένη θερμική και θερμοδυναμικής σταθερότητας και ένα κατώτερο τιμές ενέργειας ενεργοποίηση για τη δράση κινάσης. Η μειωμένη σταθερότητα συνοδεύεται από αυξημένη ευελιξία υποδηλώνει ότι Pim-1 παραλλαγών μπορεί να εμπλέκεται σε ένα ευρύτερο δίκτυο αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης. Όλες οι μεταλλάξεις δεσμεύεται μιμητικών αναστολέων ΑΤΡ και ΑΤΡ με συγκρίσιμες τιμές IC50 που υποδηλώνει ότι οι σπούδασε Pim-1 μεταλλάξεις της κινάσης μπορούν να απευθύνονται αποτελεσματικά με αναστολείς έχουν αναπτυχθεί για την πρωτεΐνη άγριου τύπου

Παράθεση:. Lori C, Lantella Α, Pasquo Α , Αλέξανδρος LT, Knapp S, Chiaraluce R, et al. (2013) Επίδραση της Ενιαίας υποκατάσταση αμινοξέος Παρατηρήθηκε στον Καρκίνο σε Pim-1 κινάσης θερμοδυναμικής σταθερότητας και δομή. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10.1371 /journal.pone.0064824

Επιμέλεια: Annalisa Pastore, Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 23 Ιανουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 18 Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Lori et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Pim-1 κινάσης ανήκει σε μια οικογένεια της σερίνης /θρεονίνης κινασών πρωτεΐνης (ΕΚ 2.7.11.1) που κωδικοποιείται από το

pim

πρωτο-ογκογονίδια [1] – [3]. Pim-1 locus έχει αρχικά αναγνωρίστηκε ως ένα κοινό προϊού θέση εισαγωγής σε Moloney Τ-κυτταρικά λεμφώματα που προκαλούνται από ιούς λευχαιμίας ποντικού σε ποντικούς [4]. Η κωδικοποιημένη πρωτεΐνη κινάση εμπλέκεται σε αρκετές οδούς σηματοδότησης, όπως η ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Τα τρία μέλη της οικογένειας Pim Pim-1, Pim-2 και Pim-3 προσδιορίζονται σε ανθρώπους έχουν αναφερθεί ως σηματοδότηση πρωτεϊνικών κινασών που παίζουν σημαντικό ρόλο στην βιολογία του όγκου [5], [6]. Επιπλέον, πολλοί τύποι καρκίνου του δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης του Pim κινασών. Για παράδειγμα Pim-1 και Pim-2 έχουν αναφερθεί ότι εκφράζεται υψηλά σε λευχαιμία, το λέμφωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πολλαπλού μυελώματος και θεωρούνται ότι εμπλέκονται στην έναρξη και την πρόοδο της κακοήθους φαινοτύπου [7]. Επιπλέον, Pim-1 έχει αναγνωριστεί ως ένα βασικό συμπαράγοντα που ρυθμίζουν την έκφραση του ογκογόνου παράγοντα μεταγραφής c-Myc με φωσφορυλίωση σερίνης 10 ιστόνης Η3 στην περιοχή ενισχυτή του τόπου Myc και γονιδίων-στόχων του [8].

η έκφραση του Pim-1 κινάση μπορεί να προκληθεί από μία ποικιλία παραγόντων ανάπτυξης. Pim-1 ομοιόσταση είναι σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων. δραστικότητα Pim-1, ως εκ τούτου ρυθμίζεται αυστηρά σε διάφορα επίπεδα περιλαμβανομένων μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό, μεταφραστική και μετα-μεταφραστική. Αρκετές οδοί μεταγωγής σήματος έχουν συσχετιστεί με τη ρύθμιση του Pim-1 έκφρασης. Για παράδειγμα Pim-1 έκφραση διεγείρεται από την ενεργοποίηση του /STAT οδού JAK το οποίο ρυθμίζει επίσης την υποβάθμιση του μέσω αρνητικών βρόχος ανάδρασης. Pim-1 υπερεκφράζεται σε πολλούς αιματολογικές κακοήθειες και πρόσφατες μελέτες Pim οικογένεια κινασών δείχνουν ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους επίσης εκτός του αιμοποιητικού συστήματος, όπως στα κύτταρα πολλών συμπαγών όγκων [6]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε διάφορους ιστούς του καρκίνου σωματικών μεταλλάξεων Pim-1 έχουν ταυτοποιηθεί [9] – [12]. Πολλές από αυτές τις παραλλαγές είναι nonsynonymous πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (nsSNPs), και μόνο παραλλαγές νουκλεοτιδίου που συμβαίνουν στην περιοχή κωδικοποίησης και οδηγεί σε μια πολυπεπτιδική αλληλουχία με υποκαταστάσεις αμινοξέων [13]. Είναι σημαντικό ότι, μετά τον αυξητικό παράγοντα διέγερσης επίπεδα Pim-1 πρωτεΐνη είναι παροδικές και η πρωτεΐνη έχει μια σύντομη ημι-ζωή σε κύτταρα που αποικοδομούνται ταχέως από το σύστημα ουμπικουιτίνης.

Ένας αριθμός ερευνών έχουν ασχοληθεί με την επίδραση της nsSNPs επί πρωτεΐνη σταθερότητα, αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και της πρωτεΐνης λειτουργίες [14]. Ταυτόχρονα, έχουν φυσικές παραλλαγές έχουν καταγραφεί με σκοπό να γίνει διάκριση μεταξύ φυσικά γενετικές διαφορές, προφανώς χωρίς λειτουργικές συνέπειες (μεταλλάξεις επιβατών) όπως αυτά που συλλέγονται στη βάση δεδομένων SNP, και εκείνων που συνδέονται με την ανάπτυξη ασθενειών (μεταλλάξεων οδηγός) [15], όπως η βάση δεδομένων ΟΜΙΜ [16], την ανθρώπινη βάση δεδομένων γονιδιακής μετάλλαξης [17], και ιδίως εκείνα που βρέθηκαν να σχετίζονται με τον καρκίνο (COSMIC) [11].

Υπολογιστική ανάλυση εντοπίστηκαν μεταλλάξεις έχει προβλέψει ότι περίπου το 30% των παραλλαγών πρωτεΐνης που προκύπτει από nsSNPs είναι λιγότερο σταθερή από την παραλλαγή αγρίου τύπου [18] ωστόσο, ένα πειραματικό αξιολόγηση της σταθερότητας των κοινών παραλλαγών είναι ακόμη απαραίτητη για να προσδιοριστεί η επίδραση των μεταλλάξεων επί της δομής των πρωτεϊνών και τη λειτουργία [19].

σε αυτή τη μελέτη επιλέξαμε nsSNPs με αποτέλεσμα Pim-1 παραλλαγές που εκφράζονται σε καρκινικούς ιστούς και αναφέρθηκαν σε βάση δεδομένων SNP [9], [11], [20]. Αυτές οι παραλλαγές Pim-1 έχουν πλήρως χαρακτηριζόμενη να διερευνηθεί η επίδραση της υποκατάστασης ενός και μοναδικού αμινοξέος σε Pim-1 θερμική και θερμοδυναμικής σταθερότητας και τη δομή σε διάλυμα. Η μελέτη μας έδειξε ότι όλες οι μεταλλάξεις που μελετήθηκαν οδηγούν σε σημαντική αποσταθεροποίηση του Pim-1 κινάση.

Αποτελέσματα

φασματοσκοπικές Χαρακτηρισμός του Pim-1 άγριου τύπου και Μεταλλάξεις βρέθηκαν στον Καρκίνο

Αυτή η μελέτη επιλέξαμε τέσσερις μεταλλάξεις (Y53H, E124Q, E135K και E142D) ότι όλα έχουν ανιχνευθεί στον καρκίνο για μια λεπτομερή σταθερότητα της πρωτεΐνης και δομική ανάλυση χρησιμοποιώντας φασματοσκοπικές τεχνικές (Εικ. 1). Οι μεταλλάξεις που βρίσκονται στην καταλυτική περιοχή της Pim-1 κινάσης (Εικ. 1Α). Y53 βρίσκεται στο Ν-τερματικό λοβός κινάση στην κεντρική βάση β-φύλλου και τις μορφές αζώτου αμιδίου του ένας δεσμός υδρογόνου με I66 καρβονυλομάδα επί βήτα-κλώνο 3 (Σχ. 1Β). Το Ε124 κατάλοιπο βρίσκεται στην περιοχή άρθρωσης κινάση και σχηματίζει μια γέφυρα άλατος με R122 (Σχ. 1 C). Η περιοχή άρθρωσης είναι ένα βασικό στοιχείο για τη ρύθμιση της C-τελικής κίνησης λοβό που μπορεί να επηρεαστούν από τη μετάλλαξη E124Q. Ε135 βρίσκεται στην έλικα αd σχηματίζει ένα δεσμό υδρογόνου με Q127 η οποία είναι πιθανό να είναι σημαντική για τη σταθεροποίηση αυτής της έλικας (Εικ. 1 C). Τέλος, Ε142 είναι εκτεθειμένη στην επιφάνεια κατάλοιπο και η συντηρητική υποκατάσταση με και ασπαρτικό δεν είναι πιθανό να έχουν σημαντική επίδραση στη σταθερότητα της πρωτεΐνης, τη δυναμική και τη δομή

(Α) Διάρθρωση του Pim-1 (κωδικός ΠΠ:. 1XWS ) εμφανίζεται ως διάγραμμα ταινίας. Τα μεταλλαγμένα κατάλοιπα τονίζονται και τα κύρια στοιχεία δευτεροταγούς δομής που φαίνεται. Η ΑΤΡ αναστολέας μιμητικό συγκρυσταλλωμένο σε αυτή τη δομή δείχνεται στο μπάλα και να κολλήσει αναπαράσταση. (Β) Λεπτομερής όψη του τοπικού δομικό περιβάλλον γύρω από το μεταλλαγμένο Y53 υπόλειμμα. (C) Λεπτομερής όψη του τοπικού δομικό περιβάλλον γύρω από το μεταλλαγμένο Ε135 υπόλειμμα. (D) εγγύς-υν CD φάσματα καταγράφηκαν σε ένα κυψελίδα χαλαζία 1,0 cm στα 1,4 mg /ml συγκέντρωση πρωτεΐνης σε 20 mM Tris /HCl, ρΗ 7.5 που περιέχει 0.2 Μ NaCl και 2 mM DTT. (Ε) φάσματα εκπομπής ενδογενούς φθορισμού καταγράφηκαν στα 0,04 mg /ml συγκέντρωση πρωτεΐνης (295 nm μήκος κύματος διέγερσης) στους 10 ° C σε 20 mM Tris /HCl, ρΗ 7.5 που περιέχει 0.2 Μ NaCl και 200 ​​μΜ DTT. (F) Far-υν CD φάσματα καταγράφηκαν σε ένα κυψελίδα χαλαζία 0,1 cm στα 0,2 mg /ml σε 20 mM Tris /HCl, ρΗ 7.5 που περιέχει 0.2 Μ NaCl και 0.4 mM DTT.

Η

Η εγγύς-υν φάσμα CD του άγριου τύπου Pim-1 δείχνει τη φασματική συμβολή όλων των αρωματικών υπολειμμάτων και χαρακτηρίζεται από δύο ισχυρό αρνητικό κορυφές με κέντρο στα 290 nm και στα 269 nm που συνοδεύονται από εκλεκτά χαρακτηριστικά δομής σε 275-280 nm (Σχ. 1D) . Το μεταλλαγμένο E124Q εμφανίζει ένα φάσμα εγγύς-υν CD στενά παρόμοια με εκείνη του άγριου τύπου εκτός από μια μικρή μείωση του προστίμου δομή σε 275-280 nm. E142D εμφανίζει ένα φάσμα CD εγγύς-UV που διαφέρει έκπληξη από την άγρια ​​φάσματος τύπου στην περιοχή 275-280 nm. Το εγγύς-υν CD φάσμα των Y53H είναι δραματικά διαφορετική από την άγρια ​​φάσμα τύπο και τις άλλες μεταλλάξεις: η λεπτή δομή στα 275-280 nm χάνεται, η συμβολή στα 290 nm μειώνεται σημαντικά και η αρνητική ελλειπτικότητα σε περίπου 269 nm είναι σημαντικά μεταβληθεί. E135K φάσμα εγγύς-UV CD μοιάζει με εκείνη του Y53H με σημαντικά μειωμένη διχροϊκό δραστηριότητα στην περιοχή 290-275 nm και με θετική συνεισφορά στην περιοχή κάτω από 275 nm. Τα φάσματα εκπομπής φθορισμού του άγριου τύπου και μεταλλάγματα είναι όλα επικεντρώνονται στην ίδια μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής 345 nm περίπου και δείχνουν διαφορές στις εντάσεις φθορισμού εκπομπής (Σχ. 1Ε). Far-UV CD φασμάτων όλων των μεταλλάξεων είναι σχεδόν υπερθέσιμα με εκείνα που του Pim-1 άγριου τύπου και τυπικά μία άλφα και βήτα πρωτείνης, που δείχνει ένα τοπικό ελάχιστο σε περίπου 208 nm, ένα nm μηδέν τομής 200 και μία αναλογία 1,52 του 208 /222 ζώνες (Εικ. 1 F).

θερμοκρασία εξάρτηση της κινάσης δραστηριότητας

Η εξάρτηση από τη θερμοκρασία της δραστικότητας κινάσης του Pim-1 άγριου τύπου και μεταλλάγματα του εξετάστηκε σε εύρος θερμοκρασίας από 10- 42 ° C (Εικ. 2Α). Οι βέλτιστες θερμοκρασίες για κατάλυση, σε σταθερή συγκέντρωση ΑΤΡ, εκτιμήθηκε ότι ήταν στους 37 ° C για τον άγριο τύπο και E142D, στους περίπου 35 ° C για E124Q και Y53H, και σε περίπου 30 ° C για E135K (Πίνακας 1 και Σχ. 2Α). Συγκεκριμένα, η δραστικότητα της κινάσης σε 37 ° C του συνόλου των μεταλλακτών Pim-1 μειώνεται σημαντικά και αντιστοιχεί στο 57, 37, 16 και 3% εκείνου του άγριου τύπου πρωτεΐνη για E142D, E124Q, Y53H και E135K, αντίστοιχα. Η ενέργεια ενεργοποίησης,

E

a

‡, προσδιορίζεται από την εξίσωση Arrhenius (1) στην περιοχή θερμοκρασιών μεταξύ 10 ° C και η βέλτιστη θερμοκρασία της κάθε πρωτεΐνης είναι μικρότερη από εκείνη του άγριου τύπου (Πίνακας 1 και Εικ. 2Β). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει μία αυξημένη ευκαμψία του όλες τις παραλλαγές σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου, ιδιαίτερα προφανής για E135K. Η σύγκριση της εξάρτησης θερμοκρασίας της δραστικότητας κινάσης με το δομικό θερμική εκτύλιξη παρακολουθήθηκε στα 209 nm (Σχ. 3Α) δείχνει σαφώς ότι όλα οι παραλλαγές είναι σημαντικά λιγότερη θερμική ανθεκτικά και πιο ευέλικτη από τον άγριο τύπο.

(Α) εξάρτηση θερμοκρασίας της δραστικότητας κινάσης του Pim-1 άγριου τύπου και μεταλλαγμένους. (Β) Μη γραμμική προσαρμογή της θερμοκρασίας εξάρτηση της δραστηριότητας κινάσης με την εξίσωση Arrhenius (Εξ. 1)? Το ένθετο δείχνει τη γραμμική γραφική παράσταση Arrhenius για τα ίδια δεδομένα. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι, με τη χρήση του ενζύμου 2,7 μΜ.

Η

(Α) Pim-1 άγριου τύπου και μεταλλάγματα θερμάνθηκαν από 10 ° C έως 72 ° C σε 0.1- cm κυψελίδα χαλαζία σε 0,2 mg /ml σε 20 mM Tris /HCl, ρΗ 7.5 που περιέχει 0.2 Μ NaCl και 0.4 mM DTT. Η δραστηριότητα διχρωματικού στα 209 nm παρακολουθήθηκε συνεχώς κάθε 0.5 ° C. (Β) πρώτη παράγωγο των ίδιων δεδομένων όπως στο (Α). (C) δεδομένα PMTV καταχωρείται στα ίδια πειράματα φαίνεται στο (Α).

Η

Η θερμική εκτύλιξη

Η θερμική σταθερότητα των Y53H, E124Q, E135K και E142D ερευνήθηκε από παρακολουθεί συνεχώς τις αλλαγές ελλειπτικότητας σε 209 nm στην περιοχή θερμοκρασιών μεταξύ 10 και 72 ° C. Τα δεδομένα των προϊόντων μετάλλαξης συγκρίθηκαν με εκείνη του άγριου τύπου πρωτεΐνη (Εικ. 3Α). Η παράμετρος επέλεξαν να συγκρίνουν τις μετάβαση καμπύλες του Pim-1 άγριου τύπου και μεταλλαγμάτων είναι η θερμοκρασία τήξης (Τ

m) ορίζεται ως το μέσο σημείο της διαδικασίας μετουσίωσης όπως υπολογίζεται με γραφική παράσταση την πρώτη παράγωγο των μοριακών τιμών ελλειπτικότητα ως συναρτήσει της θερμοκρασίας (σχ. 3Β). Η θερμοκρασία που προκαλείται από τις αλλαγές ελλειπτικότητα στα 209 nm, όπου παρατηρήθηκε η κύρια πλάτος, συμβαίνουν σε μια προφανή συνεταιρισμό μετάβασης για E124Q και E142D, με Τ

τιμές m 40,0 για E124Q και 44,0 ° C για E142D. Για E135K η μετάβαση εμφανίζεται λιγότερο συνεργάσιμη με ένα T

m αξία των 45,0 ° C και μη ανιχνεύσιμη συσσώρευση του ξεδιπλώματος ενδιαμέσου (ων), γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποκατάσταση του Ε135 με ένα κατάλοιπο λυσίνης μπορεί να επάγει μία μερική τοπική ξεδίπλωμα ή /και ότι αυτή η παραλλαγή μπορεί να υπάρχει ως ένας ετερογενής πληθυσμός διπλωμένο μελών. Για άγριου τύπου και Y53H, τα προφανή τριών κρατικών θερμικές μεταβάσεις υποδηλώνουν τη συσσώρευση των εκτυλίσσεται ενδιάμεσα με δύο Τ

τιμές m. Η πρώτη μετάβαση πραγματοποιείται με Τ

τιμές m (T

m1) στους 40,5 και 40,0 ° C, η δεύτερη (Τ

m2) στους 54,0, 52,0 ° C για τον άγριο τύπο και Y53H, αντίστοιχα (Πίνακας 2 ). Η θερμοκρασία που προκαλείται από τις αλλαγές ελλειπτικότητα για άγριου τύπου και μεταλλάγματα είναι όλα συμπίπτει με τη θερμότητα που προκαλείται από αύξηση της τάσης σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή (PMTV) παραπάνω 370 V (Σχ. 3C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η θερμοκρασία που προκαλείται ξεδίπλωμα συνοδεύεται από πρωτεΐνη συσσωμάτωσης [ ,,,0],21]. Συνάθροιση συνέβη και όταν θερμικές σαρώσεις πραγματοποιήθηκαν σε χαμηλότερο ρυθμό θέρμανσης με μια μετατόπιση της εμφανούς Τ

m σε χαμηλότερες θερμοκρασίες? οι διαφορές μεταξύ της εμφανούς Τ

m του άγριου τύπου και παραλλαγές ήταν οι ίδιες με εκείνες που μετρήθηκαν στο υψηλότερο ποσοστό θέρμανσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι παρατηρούμενες μεταβάσεις είναι μη αναστρέψιμη, όπως υποδεικνύεται από τα φάσματα που μετράται στο τέλος της φάσης ψύξης που διαφέρουν από εκείνες των φυσικών πρωτεϊνών μετράται κατά την έναρξη των θερμικών μεταπτώσεων. Επιπλέον, ο έλεγχος της κυψελίδας στο τέλος της φάσης ψύξης αποκάλυψε την παρουσία μιας μεγάλης ποσότητας ιζήματος σε όλα τα δείγματα.

Η

Επιδράσεις της Pim-1 Μεταλλάξεις σε ΑΤΡ και Αναστολέας

Binding

οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στον καρκίνο είναι μια συχνή αιτία αντοχής φαρμάκου. Ως εκ τούτου, μας ενδιαφέρει αν αναστολέας δεσμευτική θα επηρεαστούν από τις μελέτησε μεταλλάξεις. Για να αντιμετωπιστεί αυτό μπορούμε διαλογή αρκετές γνωστούς αναστολείς Pim-1 της β-καρβολίνης και imidazopyridazole τάξη [22], [23] με δοκιμασίες μετατόπιση θερμοκρασίας [24]. Η διαλογή έναντι μιας σειράς παραγώγων αναστολέα δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στις τιμές μετατόπιση θερμοκρασίας που υποδηλώνει ότι όλα τα μεταλλάγματα δεσμεύονται αυτών των αναστολέων με παρόμοιες σταθερά δέσμευσης (Πίνακας S1 και S2 Πίνακας). Για να επιβεβαιωθεί αυτό μετρήσαμε ένζυμο κινητικά δεδομένα σε ένα υποσύνολο αναστολέων. Οι τιμές IC50 του Pim-1 αναστολείς K00487, K018444a και K00207a ήταν 0.048, 0.010 και 0.007 mM, αντιστοίχως, για Pim-1 άγριου τύπου. Αυτές οι τιμές ήταν πολύ παρόμοιες για τις παραλλαγές Pim-1 με εξαίρεση τις τιμές IC50 για K00487 και K00207a που ήταν 1.8- και 1.4-φορές αυξημένη για Y53H. Ως εκ τούτου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η συγκεκριμένη δέσμευση του αναστολέα δεν επηρεάζεται σημαντικά από τις μελέτησε μεταλλάξεις.

Ουρία που προκαλείται Ισορροπία Ξεδιπλώνοντας Μεταβάσεις

Pim-1 άγριου τύπου και παραλλαγές αναστρέψιμα ξεδιπλωθεί σε ουρίας στους 10 ° C σε 20 mM TrisHCl, ρΗ 7.5, που περιέχει 200 ​​μΜ διθειοθρεϊτόλη (DTT) και 0.2 Μ NaCl. Η επίδραση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων ουρίας (0-8 Μ) για τη δομή του Pim-1 μεταλλάγματα αναλύθηκε με άπω-υν CD και φασματοσκοπία φθορισμού και σύγκριση με την επίδραση που ασκείται επί του άγριου τύπου. Η εγγενής ένταση εκπομπής φθορισμού στα 345 nm του Pim-1 άγριου τύπου και παραλλαγές οι αλλαγές μετά από 30 λεπτά επώασης στους 10 ° C, ένα χρόνο αρκετό για να επιτευχθεί ισορροπία (Εικ. 4). Το οικόπεδο των σχετικών αλλαγών ένταση φθορισμού έναντι αυξανόμενη συγκέντρωση μετουσίωσης δείχνει συγκρότημα προφίλ για τον άγριο τύπο και όλες τις μεταλλάξεις (Εικ. 4), γεγονός που υποδηλώνει μια μη διαδικασία που εκτυλίσσεται δύο κρατών και τον πληθυσμό των ενδιάμεσων μετουσίωση (s). Η πολυπλοκότητα των εκτυλίσσονται προφίλ μπορούν να αποδοθεί στην αρχιτεκτονική multi-domain του Pim-1 που περιέχει κατάλοιπα τρυπτοφάνης σε αμφότερες τις Ν-τερματικές και Ο-τερματικές λοβούς της πρωτεΐνης. Στο τέλος της μετάβασης, πάνω από 7 Μ ουρία, η εγγενής ένταση εκπομπής φθορισμού στα 345 nm μειώνεται περίπου 1,3 φορές (Σχ. 4) και οι μέγιστες φθορισμού μήκους κύματος εκπομπής μετατοπίσεις σε περίπου 357 nm είτε για τον άγριο τύπο και όλες τις παραλλαγές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ίδια δείγματα που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση των αλλαγών εκπομπής φθορισμού (Εικ. 4) κατά τη διάρκεια της μετάβασης ξεδιπλώματος χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση άπω-υν κυκλικού διχρωϊσμού ελλειπτικότητα (Εικ. 5) για να καταστεί δυνατή η άμεση σύγκριση με τα δεδομένα φθορισμού. Οι ουρίας-επέφερε αλλαγές στα 222 nm ελλειπτικότητα όλων των μεταλλάξεων είναι παρόμοια με εκείνη του άγριου τύπου, δείχνουν μια σιγμοειδή εξάρτηση από την συγκέντρωση της ουρίας και ακολουθεί μια φαινομενική δύο μεταβατικής κατάστασης χωρίς καμία ανιχνεύσιμη ενδιάμεσο (Εικ. 5). Η διαδικασία ξεδιπλώματος είναι πλήρως αναστρέψιμη κατά την αραίωση της μετουσιωτή είτε για τον άγριο τύπο ή για όλα τα μεταλλάγματα (Εικ. 5) με μετάβαση midpoints μεταξύ 4.23 και 5.34 Μ ουρία (Πίνακας 2). Ο Πίνακας 2 δείχνει τις θερμοδυναμικές τιμές παραμέτρων που λαμβάνονται για άγριου τύπου και μεταλλαγμένων μορφών Pim-1 από τα στοιχεία μετάπτωσης CD άπω-υν. Pim-1 άγριου τύπου είναι σημαντικά πιο σταθερό από όλες τις παραλλαγές, όπως υποδεικνύεται από τη σύγκριση των Δ

G

αξίες που στην περίπτωση της E135K είναι περίπου 3,5 φορές μικρότερη από εκείνη του άγριου τύπου (Πίνακας 2) . Η μείωση του Δ

G

μπορούν να αναφέρονται κυρίως στα κατώτερα

τιμές m

παρατηρούνται για όλες τις παραλλαγές σε σχέση με τον άγριο τύπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αλλαγή στον διαλύτη εκτεθειμένη περιοχή επιφάνειας πάνω ξεδίπλωμα είναι μικρότερη για όλες τις παραλλαγές Pim-1 από ό, τι για την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Ειδικότερα, οι

m

τιμές που προσδιορίζονται για Pim-1 άγριου τύπου και τις παραλλαγές του (Πίνακας 2) είναι πέντε φορές χαμηλότερη από αυτή που προβλέπεται για μια μονομερής πρωτεΐνη υπολειμμάτων 272 αμινοξέων εκτυλίχθηκε σε ουρία [25]. Οι χαμηλές τιμές του

m

μπορεί να σχετίζεται με multi-κατάσταση ισορροπίας εκτυλίσσεται, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που επιτεύχθηκαν την παρακολούθηση της διαδικασίας που εκτυλίσσεται από την εγγενή ένταση εκπομπής φθορισμού (Εικ. 4).

Κανονικοποιημένη σχετική εντάσεις φθορισμού στα 345 nm? οι συνεχείς γραμμές αντιπροσωπεύουν την μη γραμμική προσαρμογή παλινδρόμησης των σχετικών εντάσεων φθορισμού στα 345 nm προς Εξ. 5 υπολογίζονται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα σημεία αναστρεψιμότητα εμφανίζεται κενό κύκλους και δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης. Όλα τα φάσματα καταγράφηκαν στους 10 ° C όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Α-Γ) Το κλάσμα των ιθαγενών (

στ

N), το πρώτο ενδιάμεσο (

στ

Ι1), δεύτερο ενδιάμεσο (

στ

I2) και εκτυλίχθηκε (

στ

U) κρατών, που υπολογίζεται όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι χρησιμοποιώντας τις θερμοδυναμικών παραμέτρων που λαμβάνονται από τις κρίσεις της ισορροπίας εκτυλίσσεται μεταβάσεις στην Εξ. 5, παρουσιάζονται για τον άγριου τύπου (Α), E124Q (πράσινο) (Β) και E135K (ροζ) (C).

Η

μοριακή ελλειπτικότητα σε 222 nm ([Θ]

222 ) που αναφέρθηκαν μετά την αφαίρεση του θορύβου υψηλής συχνότητας και χαμηλής συχνότητας τυχαίο σφάλμα από SVD. Συνεχής γραμμές είναι η μη γραμμική παλινδρόμηση σε Εξ. 3 από τα δεδομένα σε διάφορες συγκεντρώσεις μετουσίωσης, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα σημεία αναστρεψιμότητα (άδειο σύμβολα) παρουσιάζεται, για λόγους σαφήνειας, μόνο για τον άγριο τύπο και δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης. Όλα τα φάσματα καταγράφηκαν στους 10 ° C όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Η ουρία που προκαλείται εκδίπλωση μεταβάσεις ελέγχονται από σχετικές μεταβολές ένταση φθορισμού (Σχ. 4) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μετάβαση τεσσάρων κατάσταση στην εξίσωση 5, όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι θερμοδυναμικών παραμέτρων σε σχέση με την διαδικασία που εκτυλίσσεται αναφέρονται στον Πίνακα 3. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η πρώτη μετάβαση από τη φυσική κατάσταση (Ν) με το πρώτο ενδιάμεσο (Ι

1) λαμβάνει χώρα για Pim-1 άγριου τύπου και όλες οι μεταλλάκτες κάτω από 1 Μ ουρίας με μια μεγαλύτερη Δ

G

αξία για E124Q και ένα χαμηλότερο Δ

G

αξία για E135K. Η δεύτερη μετάβαση από το I

1 έως το δεύτερο ενδιάμεσο (Ι

2) εμφανίζεται σε ένα πολύ παρόμοιο εύρος συγκέντρωσης ουρίας για όλα τα Pim-1 μεταλλάξεις που εξετάστηκαν και η Δ

G

τιμές για E142D και Y53H υποδηλώνουν σταθεροποίηση του ενδιαμέσου για αυτές τις δύο παραλλαγές (Πίνακας 3). Ο Δ

G

αξία σε σχέση με την τελευταία μετάβαση στην μετουσιωμένη κατάσταση (U) είναι σημαντικά μεγαλύτερη για τον άγριο τύπο σε σχέση με τις παραλλαγές. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από άπω-υν CD σιγμοειδή μεταβάσεις (Πίνακας 2), το άθροισμα της Δ

G

τιμές για τις τρεις μεταβάσεις είναι μεγαλύτερη για τον άγριο τύπο, σε σύγκριση με τις άλλες μεταλλάξεις, με την εξαίρεση E142D των οποίων Δ

G

tot είναι παρόμοια με εκείνη του άγριου τύπου. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο Δ

G

tot της E135K είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη όλων των άλλων παραλλαγών. Η διαφορά μεταξύ των θερμοδυναμικών παραμέτρων που λαμβάνονται από πολύ-UV CD και η ένταση φθορισμού υποστηρίζει σθεναρά την παρουσία εκτυλίσσεται ενδιάμεσα. Η έλλειψη μιας ανιχνεύσιμης ενδιαμέσου μακράν-UV CD μπορεί να υποδεικνύει ότι οι ενδιάμεσες καταστάσεις ανιχνεύονται με φθορισμό αντιπροσωπεύουν διαμορφωτικές αλλαγές οι οποίες συμβαίνουν στην εγγύτητα οποιουδήποτε από τα υπολείμματα τρυπτοφάνης, με εναλλακτικές τριτογενή διευθετήσεις. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ένταση του φθορισμού είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στο περιβάλλον ενός φθοροφόρου και θεωρείται ως ένα από τα πιο άμεσος σήματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση θερμοδυναμική του ξεδιπλώματος μεταβάσεων [26]. Για να αξιολογηθεί η κλασματική συσσώρευση των διαφόρων ειδών κατά ουρία επαγόμενη ξεδίπλωμα, την κατανομή ισορροπίας των τεσσάρων ειδών, Ν, Ι

1, I

2 και U ως μια συνάρτηση της συγκέντρωσης μετουσιωτή μπορούσε να ανασυσταθεί χρησιμοποιώντας το εφοδιασμένο αξίες της Δ

G

1, Δ

G

2, Δ

G

3,

m

1,

m

2 και

m

3 αναφέρονται στον πίνακα 3. Η κατανομή ισορροπίας της Ν, Ι

1, Ι

2 και U είναι παρόμοια για άγριου τύπου (σχ. 4Α) και όλες τις παραλλαγές, ωστόσο, ορισμένες διαφορές μπορούν να παρατηρηθούν (Σχ. 4Β-C). Το κλάσμα του Ν (

f

N) αυξάνεται για E124Q (Εικ. 4Β) και σημαντικά μικρότερη για E135K (Εικ. 4C), και παρόμοια με εκείνη του άγριου τύπου (σχ. 4Α ) για όλες τις άλλες παραλλαγές Pim-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το κλάσμα του Ι

1 (

f

I1), η οποία συσσωρεύεται στο 1,0 Μ ουρία για όλα τα είδη, είναι ελαφρώς μεγαλύτερη για E135K και μικρότερα για E124Q. Η κλασματική κατανομή του δεύτερου μετουσίωσης ενδιάμεσο Ι

2 (

f

Ι2), η οποία συσσωρεύεται εις περίπου 4.0 Μ ουρία, εμφανίζεται ελάχιστα αυξημένη για Y53H, E124Q και E135K, σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι, για τον άγριο τύπο και όλες οι παραλλαγές τους που εκτυλίσσονται ενδιάμεσα I

1 δείχνουν την ίδια μέγιστη μήκος κύματος εκπομπής του Ν επικεντρώνεται σε περίπου 345 nm, ενώ εκείνο της Ι

2 μετατοπίζεται σε περίπου 348 nm. Η λεπτομερής ανάλυση των Pim-1 εκτυλίσσεται μεταβάσεις δείχνει ότι σημαντικές διαφορές στην πλαστικότητα τομέα και το άνοιγμα συμβαίνουν σε Pim-1 μεταλλάξεις σε σύγκριση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη αντιπροσωπεύει, με τις γνώσεις μας, η πρώτη φασματοσκοπική και θερμοδυναμική χαρακτηρισμός της ανθρώπινης κινάσης Pim-1 και μερικά από ασθένεια σχετική μεταλλακτών του βρίσκονται στον καρκίνο. Ερευνήσαμε το αποτέλεσμα της υποκατάστασης αμινοξέος επί της θερμικής και θερμοδυναμική σταθερότητα του άγριου τύπου Pim-1 και συγκρίνονται αυτά τα αποτελέσματα με τέσσερα Pim-1 παραλλαγές, Y53H, E124Q, E135K και E142D, αναφέρθηκαν σε βάση δεδομένων SNPs [9] – [12] , [15], [20]. Η εξέταση της κρυσταλλικής δομής Pim-1 έδειξε ότι οι περισσότερες μεταλλάξεις που βρίσκονται κοντά στο δομικά στοιχεία σημαντικά για τη λειτουργία της κινάσης και αυτή τη μορφή πολικές αλληλεπιδράσεις με γειτονικά κατάλοιπα.

Οι μεταλλάξεις σημείου στις παραλλαγές επηρεάζουν σημαντικά την διαμόρφωση της φυσικής κατάσταση της Pim-1. Οι διαφορές στην εγγύς-UV CD μεταξύ μεταλλαγμένα και άγριου τύπου δείχνουν ότι οι τριτοβάθμια επαφές αλλάξει σημαντικά για όλες τις μεταλλάξεις και ότι το ενιαίο αμινοξύ υποκατάστασης επηρεάζει Pim-1 τριτοταγή δομή και να οδηγήσει σε βαθιές αλλαγές στη συνολική πρωτεΐνη τριτογενή φορές. Ειδικότερα, η υποκατάσταση του Y53 με ιστιδίνη οδηγεί σε δραματικές αλλαγές τριτοταγή δομή, όπως αποκαλύφθηκε από την απώλεια του προστίμου δομής σε 260-280 nm (Σχ. 1D). Η Ν-τερματικό λοβός μεταλλαγμένο Y53H εμφανίζει τις πιο σημαντικές αλλαγές στην τριτοβάθμια επαφές, όπως κρίνεται βάσει του φάσματος CD εγγύς UV. Αξιοσημείωτα, ο εγγύς-υν CD φάσμα της μεταλλαγμένης E124Q φαίνεται περισσότερο παρόμοια με εκείνη του άγριου τύπου, πιθανώς επειδή η μεταβολή ενός φορτισμένου πολικού υπολείμματος Glu στη μη φορτισμένες πολικές υπόλειμμα Gln έχει μικρή μόνο επίδραση στην τριτοταγή δομή και τη σταθερότητα του .

το υπόλειμμα Tyr53 τοποθετείται στη μέση του βήτα-κλώνου 2 και άζωτο αμιδίου της είναι υδρογόνο-συνδεδεμένο με την καρβονυλ I66 για βήτα-κλώνο 3. στο Y53H, η υποκατάσταση του Y53 με ένα πολικό ιστιδίνης μπορεί να οδηγήσει σε μια νέα δεσμό υδρογόνου με Η68 (Εικ. 1). Επιπλέον, η εγγύτητα των Y53 να σύνδεσης φωσφορικών Ρ-βρόχος, μια περιοχή που παίζει σημαντικό ρόλο στην ειδικότητα και συγγένεια των αναστολέων [27], προτείνει ότι η μετάλλαξη του υπολείμματος αυτού μπορεί να επηρεάσει τη δέσμευση του αναστολέα.

Η άλλη μετάλλαξη που βρέθηκαν στον καρκίνο, E124Q, αφορά ένα υπόλειμμα που βρίσκεται στην περιοχή άρθρωσης (121-126). Η ΟΕ2 του Ε124 σχηματίζει μια γέφυρα άλατος με το Η11 της γειτονικών R122 (Σχ. 1). Η υποκατάσταση του Ε124 για γλουταμίνη (E124Q) καταστρέφει τη γέφυρα άλατος στην περιοχή άρθρωσης που μπορούν να καθορίσουν την κινητικότητα του Ν-τερματικού (33-121) και C-τερματικού (128-305) λοβούς. Αξίζει να σημειωθεί ότι, δεδομένου ότι οι λοβοί συχνά περιστρέφονται ή κοντά γύρω από την άρθρωση κατά αναστολείς δεσμεύουν την μετάλλαξη του Ε124 μεταβάλλει σημαντικά τις δυναμικές ιδιότητες του Pim-1 και μπορεί να αλλάξει αναστολείς συγγένειας. Είναι ενδιαφέρον, αυτό γλουταμινικού-αργινίνη γέφυρα άλατος δεν είναι παρόν στο Pim-2 ισομορφή πιθανόν συμβάλλοντας στην χαμηλότερη σταθερότητα της πρωτεΐνης αυτής [28].

Η αναστρεψιμότητα της επαγόμενης ουρίας ισορροπία εκδίπλωση σε χαμηλή θερμοκρασία επιτρέπει μια ποσοτική προσδιορισμός της επίδρασης των μεταλλάξεων επί της θερμοδυναμικής του Pim-1 ξετυλίγεται. Όλες οι μεταλλάξεις, που εκφράζονται ως διαλυτές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, δείχνουν μια μειωμένη θερμική και θερμοδυναμική σταθερότητα (Πίνακας 2 και 3). Η αποσταθεροποιητική επίδραση όλων των υποκαταστάσεις αμινοξέων είναι ιδιαίτερα εμφανής από την μείωση της θερμοκρασίας τήξεως παρακολουθείται από δευτερογενείς αλλαγές δομής που δείχνουν μια υψηλότερη ευκαμψία των παραλλαγών σε σχέση με τον άγριο τύπο. Η μείωση της θερμοκρασίας τήξεως όλων των Pim-1 παραλλαγών που μελετήθηκαν παραλληλίζεται με μία σημαντική μείωση της Δ

G

H

2

O σχέση με την ουρία που προκαλείται αναδίπλωση σε σύγκριση με η άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα είναι εκπληκτικά αφού όλα τα μεταλλάγματα είναι λιγότερο σταθερά από τον άγριο τύπο και Pim-1 είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο, έτσι μπορεί κανείς να συμπεράνει ότι Pim-1 παραλλαγών είναι λιγότερο αποτελεσματικά ως ογκογονίδια από τον άγριο τύπο. Ωστόσο, η μειωμένη σταθερότητα συνοδεύεται από αυξημένη ευελιξία, όπως υποδεικνύεται από τις χαμηλότερες τιμές ενέργειας ενεργοποίηση για τη δράση της κινάσης που παρατηρείται σε όλες τις παραλλαγές σε σύγκριση με εκείνη του άγριου τύπου, υποδηλώνοντας ότι Pim-1 παραλλαγών μπορεί να εμπλέκεται σε ένα ευρύτερο δίκτυο αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η μετάβαση μεσοδιαστήματα των φασματικών μεταβολών όλων των μεταλλάξεων δεν μεταβάλλονται σημαντικά σε σχέση με τον άγριο τύπο.? ως εκ τούτου, η μείωση της Δ

G

H

2

O τιμών οφείλεται κυρίως στη μείωση των

m

τιμές. Έτσι, το αποτέλεσμα της υποκατάστασης αμινοξέος επί Pim-1 σταθερότητα μπορεί να αναφέρεται κυρίως σε μια μείωση στην μεταβολή του διαλύτη εκτεθειμένη επιφάνεια κατόπιν ξεδιπλώνεται για όλες τις παραλλαγές Pim-1.

Συμπερασματικά τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η επίδραση της μετάλλαξης που παρατηρείται σε καρκινικούς ιστούς κατευθύνονται προς τις τοπικές αλλαγές του τριτοταγούς δομής που ωστόσο δεν επηρεάζουν σύνδεση προς τον τύπο Ι αναστολείς κινάσης που μελετήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

η τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξογένεση

Pim-1 πλασμίδιο αυτοφυούς ενζύμου ελήφθη με SGC (Oxford). Γρήγορη αλλαγή του δικτυακού τόπου-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή των μονές μεταλλάξεις σε άγριου τύπου Pim1 πλασμίδιο που χρησιμοποιείται ως πρότυπο. Τα μεταλλαξογόνα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν απαριθμούνται στον Πίνακα 4.

Η

Protein Expression and Purification

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Pim-1 έχει εκφρασθεί και καθαρίστηκε όπως περιγράφεται στο [29] με μικρές τροποποιήσεις. Pim-1

άγριου τύπου και μεταλλαγμένα εκφράστηκαν σε

Ε. coli BL21

στέλεχος (DE3). 10 ml ολονύκτια καλλιέργεια αναπτύχθηκε στους 37 ° C σε 1 λίτρο μέσου LB που περιείχε αμπικιλλίνη ως αντιβιοτικό σε μία τελική συγκέντρωση 50 μg /ml μέχρι οπτική πυκνότητα OD

600 έφθασε το 0,6. Η καλλιέργεια ψύχθηκε επί πάγου για 20 λεπτά, στη συνέχεια η έκφραση της πρωτεΐνης προκλήθηκε όλη τη νύχτα με προσθήκη 0,5 mM ισοπροπυλο-β-D-θειογαλακτοσίδη (Sigma-Aldrich) και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα στους 15 ° C με ανακίνηση energic. Η καλλιέργεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε 50 ml ρυθμιστικού σύνδεσης (50 mM Hepes, 500 mM NaCl, 5 mM Ιμιδαζόλιο, 5% γλυκερίνη, ρΗ 7.5) που περιέχει 0.5 mM

τρις ​​

(2-καρβοξυαιθυλ) φωσφίνη (TCEP), και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Τα κύτταρα αποψύχθηκαν σε πάγο συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Complete, Roche) και διασπάσθηκαν με υπερήχους. Το κυτταρόλυμα διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο φορτώθηκε σε στήλη DE52 (GE Healthcare), που είχε προηγουμένως εξισορροπηθεί με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και 0,5 mM TCEP, προς απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων. Η διερχόμενη ροή φορτώθηκε σε Νί-ΝΤΑ (Νί

2 + – nitriltriacetate) στήλη συγγένειας (GE Healthcare) προ-εξισορροπημένης με ρυθμιστικό σύνδεσης. Η στήλη πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης για την έκλουση ασθενώς δεσμευμένο μολυντές. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε με πέρασμα πάνω από τη στήλη πρόσδεσης ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν συγκεντρώσεις αυξάνοντας ιμιδαζόλη (50 mM, 100 mM, 150 mM και 250 mM, αντιστοίχως). Τα συλλεγέντα εκλούσματα συμπληρωθεί με μια τελική συγκέντρωση 10 mM DTT και δοκιμάστηκαν ως προς την καθαρότητα σε SDS γέλη χρησιμοποιώντας προκατασκευασμένων σύστημα γέλης (Invitrogen). Τα καθαρά κλάσματα επωάστηκαν για μια νύχτα με πρωτεάσης του ιού των χαραγών του καπνού (Pro-TEV), για την απομάκρυνση του ετικέτα εξαϊστιδίνης. Μετά την πέψη, η πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε σε 2 ml χρησιμοποιώντας Millipore συμπυκνωτές και φορτώθηκε σε Superdex 200 300/10 στήλη διήθησης πηκτής επί AKTA FPLC σύστημα είχε προηγουμένως εξισορροπηθεί με 50 mM Tris /HCl, 0.25 Μ NaCl, 10 mM DTT, ρΗ 7.5 σε ένα ρυθμό 1,0 ml /min ροής. 2 ml κλασμάτων συλλέχθηκαν και ο καθαρή πρωτεΐνη αναγνωρίστηκε με SDS PAGE. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας μια μοριακή απορροφητικότητα των 48.930 Μ

-.

1 cm

-1at 280 nm βασίζεται σε μια μοριακή μάζα 35,685 kDa

φασματοσκοπικές