Αφηρημένο

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση microRNA στον καρκίνο μπορεί να ρυθμίζεται από επιγενετικές γεγονότα. Πρόσφατα, διαπιστώσαμε ότι σε καρκίνο του πνεύμονα miR-212 ήταν έντονα κάτω-ρυθμίζονται. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης miR-212 είναι άγνωστες. Ως εκ τούτου, απευθύνεται σε αυτό το σημείο με τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της miR-212 αποσιώπηση στον καρκίνο του πνεύμονα. Εντοπίσαμε τροποποιήσεις των ιστονών και όχι DNA υπερμεθυλίωση ως επιγενετική γεγονότα που ρυθμίζουν τα επίπεδα miR-212 στο NSCLC. Επιπλέον, βρήκαμε ότι το miR-212 αποσιώπηση in vivo είναι στενά συνδεδεμένο με τη σοβαρότητα της νόσου

Παράθεση:. Incoronato M, L Urso, Portela Α, Laukkanen ΜΟ, Soini Υ, Quintavalle C, et al. (2011) Επιγενετική κανονισμού του miR-212 έκφρασης στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (11): e27722. doi: 10.1371 /journal.pone.0027722

Επιμέλεια: Tobias Eckle, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25, Ιούλ, 2011? Αποδεκτές: 24, Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 15, Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Incoronato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από κεφάλαια: Fondazione IRCCS SDN www.sdn-napoli.it, 5 × 1000 έως Istituto di Ricerca e Diagnostica Nucleare Fondazione IRCCS SDN, Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AIRC) (επιχορήγηση n.ro 10620) www.airc .it και MERIT (RBNE08E8CZ_002) www.miur.it με GC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο πιο συχνός καρκίνος όσον αφορά τόσο την επίπτωση και τη θνησιμότητα (1,35 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις ανά έτος και 1.180.000 θάνατοι), με τα υψηλότερα ποσοστά στην Ευρώπη και τη Βόρεια Αμερική. Οι κύριοι τύποι καρκίνου του πνεύμονα είναι

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

καρκίνωμα (SCLC) και

μη μικροκυτταρικό

καρκίνωμα του πνεύμονα (NSCLC). Τα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα περιλαμβάνουν αδενοκαρκινώματα, πλακωδών κυττάρων πνεύμονα καρκίνωμα, και μεγάλες καρκινώματα του πνεύμονα. Οι όγκοι αυτοί έχουν μόνο 20-30% θετική κλινική ανταπόκριση, όμως η αιτία της ανθεκτικότητας θεραπείας είναι ακόμη άγνωστη.

microRNAs (miRNAs) είναι εξελικτικά συντηρημένη, ενδογενή μη κωδικεύουσα RNA περίπου 22 νουκλεοτιδίων (nt) μήκους εμπλέκονται στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [1]. Με την έλευση των miRNA προφίλ έκφρασης, σημαντική προσπάθεια έχει γίνει για να συσχετίσει την έκφραση των miRNAs με την πρόγνωση του όγκου [2], [3]. Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός κάτω-ρυθμίζονται miRNAs βρέθηκαν στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών [4], [5], [6] και με θεραπευτική ανταπόκριση [7]. Η διαπίστωση αυτή οδήγησε πολλές ερευνητικές ομάδες για τον εντοπισμό των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για την απελευθέρωση αυτών των miRNAs σε ανθρώπινους καρκίνους.

Επιγενετική αναφέρεται σε αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που συμβαίνουν χωρίς μεταβολή στην αλληλουχία του DNA. Υπάρχουν δύο κύρια και διασυνδεδεμένων επιγενετικών μηχανισμών: DNA μεθυλίωση των CpG νησίδων εντός περιοχών προαγωγού και μετα-μεταφραστική τροποποίηση των ουρών των ιστονών ως ακετυλίωση, φωσφορυλίωση, μεθυλίωση και ubiquitilation [8], [9], [10]. Εκτός από τα γνωστά γενετικές μεταλλάξεις που εμπλέκονται στην νεοπλασματικό μετασχηματισμό, πολλές αποδείξεις υποδεικνύουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια αλλαγμένη επιγενετικές μηχανήματα αφού είτε μεθυλίωσης DNA ή ιστόνης τροποποιήσεις τροποποιημένο σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [11].

Πρόσφατα βρήκαμε δύο

in vivo

και

in vitro

που miR-212 ήταν έντονα προς τα κάτω σε καρκίνο του πνεύμονα και ότι η έκτοπη έκφραση της αυξήθηκαν (παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση) TRAIL ευαισθησία του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων [ ,,,0],12]. Δεδομένου ότι πολλοί microRNAs μειωτικά στον καρκίνο έχουν σφιχτά που σχετίζονται με το νησί CpG υπερμεθυλίωση ή /και αλλοίωση σήματα των ιστονών τροποποιήσεις [13], [14], [15] αναρωτηθήκαμε αν οι ίδιες τροποποιήσεις θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε miR-212 αποσιώπηση στον καρκίνο του πνεύμονα . Ως εκ τούτου, σε αυτό το χειρόγραφο ερευνήσαμε τις δύο μοτίβα μεθυλίωσης του DNA και τροποποιήσεις των ιστονών του περιοχή υποκινητή miR-212 σε Calu-1 (NSCLC) και MRC5 (φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών που προέρχονται από εμβρυϊκό πνεύμονα ινοβλάστες) κυττάρων που φέρουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης miR-212. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αν και η θέση έναρξης της μεταγραφής miR-212 είναι ενσωματωμένο σε ένα νησί CpG, μεταγραφική απενεργοποίηση του στον καρκίνο του πνεύμονα δεν συνδέεται με το καθεστώς υπερμεθυλίωση του DNA αλλά αντίθετα σε μια αλλαγή στην κατάσταση μεθυλίωσης του ουρές των ιστονών που συνδέονται με την περιοχή υποκινητή αυτού του microRNA. Επιπλέον, με τη χρήση δειγμάτων ιστών του καρκίνου του πνεύμονα σε διαφορετικές στάσης TNM αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του miR-212 και βρήκαν ότι σίγηση του συνδέεται στενά με τη σοβαρότητα της νόσου.

Αποτελέσματα

έκφραση του miR-212 σε διαφορετικά στάδια του καρκίνου του πνεύμονα

Πρόσφατα έχουμε δείξει τόσο

in vitro

και

in vivo

ότι το miR-212 έκφρασης σε καρκίνο του πνεύμονα είναι κάτω-ρυθμίζονται σε σύγκριση με φυσιολογικό πνεύμονα [12]. Για να ελεγχθεί αν ή όχι αποσιώπηση του συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου, δείγματα ιστών συλλέχθηκαν από 34 ασθενείς με NSCLC που πλήττονται σε διαφορετικές στάσης ΤΝΜ (τα κλινικά χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 1). Στη συνέχεια αναλύθηκαν έκφραση miR-212 με qRT-PCR (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται, στα δείγματα Τ1 /Τ2, η έκφραση του miR-212 είναι ως επί το πλείστον ετερογενής. Αντίθετα, στα δείγματα Τ3 /Τ4, miR-212 έκφραση ήταν ομοιογενώς ρυθμισμένα προς τα κάτω. Το σχήμα 1Β δείχνει το μέσο όρο των δειγμάτων Τ1 /Τ2 σε σύγκριση με Τ3 /Τ4. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποσιώπηση του miR-212 είναι στενά συνδεδεμένη με τη βαρύτητα της νόσου.

(Α) Το συνολικό RNA εκχυλίζεται από δείγματα ιστού που συλλέχθηκαν από 34 άτομα NSCLC-επηρεάζονται σε διαφορετικές ΤΝΜ σταδιοποίηση (Τ1-Τ2 -T3-Τ4) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση miR-212 έκφρασης από την Real-Time PCR. (Β) Μέση ± SD του miR-212 έκφραση της πισίνας Τ1 /Τ2 vs T3 /T4. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD. * Ρ & lt? 0,05, με t τεστ. Όπως φαίνεται, στην Τ1 /Τ2 σταδιοποίηση την έκφραση του miR-212 είναι σαφώς ετερογενής, ενώ στην Τ3 /Τ4 σταδιοποίηση την έκφραση του miR-212 είναι έντονα σιωπήσει και συσχετίζεται με τη βαρύτητα της νόσου.

Η

ο ρόλος των επιγενετικών για miR-212 εκφάνσεις Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CpG νησί Searcher (https://www.cpgislands.com/) βρήκαμε ότι το miR-212 τόπου ήταν ενσωματωμένο σε ένα νησί CpG. Είναι γνωστό ότι πολλές miRNAs οι επιγενετικώς σιγήσει σε συνδυασμό με CpG νησιού υπερμεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα [16], [17]. έτσι Ερευνήσαμε κατά πόσο η απώλεια της έκφρασης miR-212 σε NSCLC συνδέθηκε με DNA υπερμεθυλίωση. Αναλύσαμε με διθειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των προβλεπόμενων μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης (TSSs) του PRI-miR-212 [18], [19] σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν διαφορετικές ποσότητες του miR-212 Calu-1 και MRC5 (Εικόνα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, σε Calu-1, η περιοχή αναλύθηκε μεθυλιώθηκε υπό-σε μεγάλο βαθμό. Για να επιβεβαιωθεί ότι η μεταγραφική σίγηση του miR-212 στον καρκίνο του πνεύμονα δεν συσχετίστηκε με CpG μεθυλίωση, κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του αναστολέα μεθυλίωσης DNA 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5’Aza) όπως υποδεικνύεται . έκφραση miR-212 στην συνέχεια αξιολογήθηκε με Q-RT-PCR (Σχ. 2C-D). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C-D, κατά την κατεργασία 5’Aza, τα επίπεδα έκφρασης miR-212 παρέμειναν αμετάβλητες. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεθυλίωση δεν έχει σχέση με miR-212 σίγηση σε NSCLC.

(Α) ανάλυση Έκφραση miR-212 σε NSCLC (Calu-1) και φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών που προέρχονται από εμβρυϊκό πνεύμονα (MRC5 ) με PCR Πραγματικού χρόνου. (Β) Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση αναλύσεων του miR-212 CpG νησίδα σε Calu-1 και MRC5 κύτταρα. Οκτώ μόνο κλώνοι αντιπροσωπεύονται για κάθε δείγμα. Μαύρο και λευκά τετράγωνα αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων CpG αντίστοιχα, και κάθε κάθετη γραμμή απεικονίζει ένα ενιαίο CpG. (C) Ανάλυση έκφρασης του ώριμου miR-212 με πραγματικού χρόνου PCR σε Calu-1 κύτταρα σε απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 1 μΜ (αριστερό πάνελ) και 5 μΜ (δεξί πάνελ) του αναστολέα μεθυλίωσης DNA 5-αζα- 2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-2dC), όπως υποδεικνύεται. Στο NSCLC, DNA υπερμεθυλίωση του νησιού CpG δεν ανιχνεύεται γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η επιγενετική τροποποίηση δεν είναι υπεύθυνη του miR-212 αποσιώπηση. Μέσοι όροι ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν δίνονται.

Η

Η μεθυλίωση και ανάλυση ακετυλίωση των ιστονών σχετίζεται με το TSS του miR-212

Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον οι τροποποιήσεις σε πρωτεΐνες ιστονών θα μπορούσε αντιπροσωπεύουν miR-212 προς τα κάτω ρύθμιση με NSCLC. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση chip χρησιμοποιώντας τέσσερα αντισώματα έναντι συγκεκριμένων τροποποιήσεων ιστονών: H3K4me3 και H3K9Ac, γενικά συνδέεται με μεταγραφικά ενεργή χρωματίνη, και H3K27me3 /H3K9me2 γενικά συνδέεται με μεταγραφικά ανενεργή χρωματίνη. Στη συνέχεια, συγκρίναμε το ιστόνης σηματοδοτεί μοτίβο της προβλεπόμενης miR-212 TSS τόσο σε Calu-1 και MRC5 κύτταρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην κατάσταση μεθυλίωσης του H3K27 και H3K9 και στην κατάσταση ακετυλίωση H3K9 (Σχήμα 3). Συγκεκριμένα, σε Calu-1 κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του miR-212, TSS του miR-212 εμπλουτίζεται με την παρουσία πρωτεϊνών ιστόνης με ομοιοπολικές τροποποιήσεις που εμπλέκονται στη γονιδιακή σίγηση (H3K27me3 και H3K9me2). Αντιθέτως, η υψηλή miR-212 που εκφράζουν MRC5 κύτταρα παρουσίασαν αύξηση σε τροποποιήσεις των ιστονών που σχετίζεται με ενεργοποίηση γονιδίων (H3K9Ac) σε σύγκριση με τα κύτταρα Calu-1. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι επιγενετικές τροποποιήσεις στις ιστόνες σε miR-212 TSS συμβάλλουν στην επιγενετική αποσιώπηση του σε NSCLC.

τσιπ και Real-Time PCR χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη, το Calu-1 και MRC5 κύτταρα, τροποποιήσεις ιστονών στην περιοχή προαγωγέα του miR-212 χρησιμοποιώντας αντισώματα που κατευθύνονται έναντι H3K4me3, H3K27me3, H3K9me2 και H3K9Ac. Ένα αρνητικό συγκριτικό αντίσωμα (IgG) συμπεριελήφθη στην δοκιμασία chip. Μέσοι όροι ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν δίνονται.

Η

Altered miR-212 έκφρασης σε NSCLC συνδέεται με τις αλλαγές στο τροποποιήσεις των ιστονών

Η ιστόνης μεθυλ τρανσφεράσης ΕΖΗ2, μια συγκεκριμένη H3K27 μεθυλ-τρανσφεράσης, είναι συχνά υπερεκφράζεται στον ανθρώπινο καρκίνο [20]. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι G9a, ειδικό μεθυλτρανσφεράση H3K9, ήταν εντόνως εκφρασμένο σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα ιστό σε σύγκριση με τα κανονικά δείγματα πνεύμονα [21].

Με βάση αυτά τα ευρήματα, αναλύσαμε με Q-RT-PCR ο επίπεδα έκφρασης του ΕΖΗ2 και G9a ένζυμα σε Calu-1 και MRC5 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα κύτταρα Calu-1 επέδειξαν αυξημένες ποσότητες του ΕΖΗ2 (Α) και G9a (Β) σε σύγκριση με κύτταρα MRC5. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του H3K9 de-ακετυλάσης HDAC δεν διέφεραν στις δύο κυττάρων τύπου Σχήμα 4Γ.

(Α) ανάλυση Έκφραση ΕΖΗ2, (Β) G9a και (C) ένζυμα HDAC από Σε πραγματικό Time PCR σε Calu-1 και MRC5 κύτταρα. (Δ) Ανάλυση έκφρασης του ώριμου miR-212 σε Calu-1 κύτταρα χωρίς αγωγή (-) ή επεξεργασμένα (+) με siEZH2 και TSA αναστολέα ή (Ε) με TSA και αναστολείς (BIX) BIX01294. κύτταρα (D) Calu-1 επιμολύνθηκαν με ειδικές ΕΖΗ2-siRNA για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 ng /ml του TSA για 24 ώρες και miR-212 έκφραση αξιολογήθηκε με qRT-PCR. Down-ρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2 μετά siEZH2 διαμόλυνση εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα. Για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση η μεμβράνη ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης. κύτταρα (Ε) Calu-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml TSA για 16 ή 24 ώρες σε παρουσία ή απουσία 10 μΜ BIX για 16 ώρες και miR-212 έκφραση αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σε κύτταρα Calu-1, η προς τα πάνω ρύθμιση του ΕΖΗ2 και G9a ένζυμα συμβάλλει στην αύξηση της ιστόνης μεθυλίωση και έτσι να μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης miR-212. Μέσα ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν είναι δεδομένη.

Η

Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα άλλο κυτταρική γραμμή NSCLC, Α549. Όπως φαίνεται στο σχήμα S2, κύτταρα Α549 παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα miR-212 (Α), προς τα πάνω ρύθμιση του ΕΖΗ2 (Β) και G9a (C) και παρόμοια επίπεδα HDAC (D), σε σύγκριση με MRC5.

προκειμένου να επιβεβαιωθεί η συμμετοχή των τροποποιήσεων ιστονών σε miR-212 αποσιώπηση στο NSCLC, θα αναστέλλεται τόσο έκφρασης και HDAC δραστηριότητα ΕΖΗ2 και στη συνέχεια ανέλυσε τις επιπτώσεις στην miR-212 έκφρασης σε κύτταρα Calu-1. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Calu-1 επιμολύνθηκαν με ΕΖΗ2-siRNA ή /και υποβάλλεται σε επεξεργασία με TSA, ένας ειδικός αναστολέας της HDAC. miR-212 στην συνέχεια αξιολογήθηκε με Q-RT-PCR. Όπως αναμενόταν, είτε siRNA μεσολάβηση knock-down του ΕΖΗ2 μεθυλάσης, ή TSA-διαμεσολαβούμενη αναστολή της HDAC de-ακετυλάσης δραστηριότητα συμβάλει στην αύξηση της miR-212 επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 4D). Είναι ενδιαφέρον ότι η επίδραση ήταν μεγαλύτερη (τετράδες) παρουσία και των δύο αναστολές. Το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 (Εικόνα S2E). Η αναστολή της ΕΖΗ2 και HDAC που παράγονται αύξηση (δύο φορές) του miR-212 και σε MRC5 κύτταρα (Σχήμα S2F).

Για να προσδιοριστεί ο ρόλος της G9a για miR-212 αποσιώπηση, Calu-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BIX01294, ένας ειδικός αναστολέας του G9a μεθυλάσης, με την παρουσία ή απουσία του TSA. miR-212 αξιολογήθηκε με Q-RT-PCR. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με τα δύο αντιδραστήρια, συνέβαλαν στην αύξηση των επιπέδων έκφρασης miR-212 έως και 5 αναδιπλώσεις (Σχήμα 4Ε). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξητική ρύθμιση του ΕΖΗ2 και G9a ένζυμα στον καρκίνο του πνεύμονα συμβάλλει στην αύξηση της ιστόνης μεθυλίωση και έτσι να μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης miR-212. Όταν χρησιμοποιείται συγχρόνως, siEZH2 /TSA ή BIX01294 /TSA παρήγαγε μεγαλύτερη επίδραση στην έκφραση miR-212 σε σύγκριση με το ενιαίο επώασης. Έτσι, είναι δυνατόν να υποθέσουμε ότι H3K27me3 ή H3K9me2 μεσολάβηση μηχανήματα αποσιώπηση απαιτεί δράση HDAC, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από Lachner Μ

et al

[22].

Συνέπειες της αναστολής της ΕΖΗ2, G9a και HDAC σε πρωτεΐνες ιστόνης

με βάση αυτά τα ευρήματα, αναρωτηθήκαμε αν η αναστολή της ΕΖΗ2, G9a και HDAC ένζυμα στα κύτταρα Calu-1 μπορεί να προκαλέσει μια αλλαγή στην H3K27me3, H3K9me2 και H3K9Ac ιστόνης σηματοδοτεί μοτίβο στο TSS του miR-212 επηρεάζοντας έτσι τα επίπεδα έκφρασης του miR-212. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siEZH2 και TSA και αναλύσεις τσιπ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας H3K27me3 και H3K9Ac αντισώματα, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι, αναστέλλοντας τόσο μεθυλάση (ΕΖΗ2) και απο-Ακετυλάση (HDAC), αυξήθηκε σημαντικά την ακετυλίωση H3K9 και μείωσε σημαντικά την μεθυλίωση της H3K27 του miR-212 TSS σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται με την ανοδική ρύθμιση του miR-212 στην ίδια πειραματική κατάσταση (σύγκρινε Σχήμα 4D με το Σχήμα 5Α). Επιπλέον, τα κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς BIX01294 και TSA και αναλύσεις τσιπ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας H3K9me2 και H3K9Ac αντισώματα, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε ότι η αναστολή της καταλυτικής δραστικότητας των δύο μεθυλάσης (G9a) ή απο-Ακετυλάση (HDAC), μειώθηκαν σημαντικά την μεθυλίωση της H3K9 και αύξησε σημαντικά την ακετυλίωση H3K9 σε Mir-212 TSS σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Β) . Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν έντονα ότι οι συγκεκριμένες αλλαγές στις τροποποιήσεις των ιστονών καθορίσει miR-212 αποσιώπηση στον NSCLC.

τσιπ και qRT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση, το Calu-1 κύτταρα, τροποποιήσεις των ιστονών στην προβλεπόμενη ΜΙΚ 212 TSS (Α) σε απουσία (scrb) ή παρουσία TSA και siEZH2, και (Β) σε απουσία (scrb) ή σε παρουσία αναστολέων TSA και BIX, αντίστοιχα. (Α-Β) κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε παρουσία των υποδεικνυόμενων αναστολέων όπως περιγράφεται στη λεζάντα του σχήματος 4. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τροποποίηση της ιστόνης καταλύεται από ΕΖΗ2, G9a και HDAC θέσεις ένζυμα εμπλέκονται σε miR-212 σίγηση σε NSCLC. Μέσα ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν είναι δεδομένη.

Η

Επίδραση της αναστολής της ΕΖΗ2, G9a και HDAC επί της απόπτωσης σε κύτταρα Calu-1

Είναι γνωστό ότι η αναστολή της HDAC με TSA, προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα διαφόρων ως γλοίωμα, καρκίνο ουροδόχου κύστης, λευχαιμικά κύτταρα και SCLC [23], [24]. Εκτός αυτού, σε ανθρώπινα κύτταρα bronchoepithelial, επιμόλυνση των G9a και ΕΖΗ2 από siRNAs που προκαλείται απόπτωση και G1 σύλληψη, αντίστοιχα [25]. πρόσφατα ευρήματα μας απέδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-212 ευαισθητοποιεί κύτταρα Calu-1 προς TRAIL επαγόμενη απόπτωση [12]. Ως εκ τούτου, επαληθεύεται κατά πόσον η αναστολή της ΕΖΗ2, G9a και HDAC ενζύμων μπορεί να αυξήσουν την ευαισθησία TRAIL κυττάρων Calu-1. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BIX01294 και TSA να αναστέλλουν G9a και HDAC ένζυμα και απόπτωση εκτιμήθηκε με ανάλυση western blot της κασπάσης-8 ενεργοποίησης κατά την κατεργασία TRAIL. Όπως αναφέρεται στο Σχήμα 6Α, η κασπάση-8 σαφώς ενεργοποιείται σε παρουσία G9a ή HDAC αναστολή. Επιπλέον, κασπάσης-8 ενεργοποίηση περαιτέρω αυξήσεις στην παρουσία και των δύο αναστολής ενζύμων, κατάσταση που συσχετίζεται με προς τα πάνω ρύθμιση του miR-212 (σύγκρινε Σχήμα 6Α με το Σχήμα 4Ε). Για τον ίδιο σκοπό, η επαγωγή απόπτωσης αξιολογήθηκε με αναστολή των ενζύμων ΕΖΗ2 και HDAC από siEZH2 και TSA. Διαφορετικά από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ανωτέρω, κασπάση-8 ενεργοποιείται μόνο σε παρουσία της αναστολής HDAC και όχι σε παρουσία ΕΖΗ2 knock-down (Σχήμα 6Β). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων εκτελέσαμε Annexin V δοκιμασία απόπτωσης (Εικόνα S1)

(Α) κύτταρα Calu-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε απουσία. (-) Ή παρουσία (+) 100 ng /ml TSA και /ή 10 μΜ BIX, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, τότε τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 ng /ml του Super-Killer TRAIL για 3 ώρες. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με western αποτύπωση με αντι-κασπάση-8 αντισώματος. Διάσπαση της κασπάσης-8 ήταν περισσότερο εμφανής σε Calu-1 κύτταρα αντιμετωπίζονται με παρουσία και των δύο αναστολέων. (Β) κύτταρα Calu-1 επιμολύνθηκαν με siEZH2 και αντιμετωπίζονται με απουσία ή παρουσία 100 ng /ml TSA, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, τότε τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 ng /ml TRAIL. β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Τα microRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs μόρια που λειτουργούν ως ενδογενής μετα-μεταγραφική σιγαστήρες των γονιδίων στόχων και είναι σημαντικοί ρυθμιστές των διαφορετικών κυτταρικών διαδικασίες που περιλαμβάνουν την απόπτωση [26], [27]. Ελαττώματα στην αποπτωτική πρόγραμμα μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση της θεραπείας και την εξέλιξη του όγκου, και μπορεί να προκληθεί από την απορυθμισμένη έκφραση αντι-αποπτωτικών μορίων. Ο αριθμός των ανακάλυψαν microRNAs και τους στόχους τους αναπτύσσεται γρήγορα δείχνοντας ουσιαστικό ρόλο τους στη διατήρηση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Δείξαμε πρόσφατα για πρώτη φορά την προ-αποπτωτική ρόλος του miR-212 στον καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι miR-212 ήταν σε θέση να στοχεύσουν την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη PED ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του πνεύμονα [28] υποδηλώνοντας ότι η δράση της μπορεί να συμβάλει στην καταστολή του όγκου, δεδομένου ότι αναστέλλει αρνητικά ένα μόριο που εμπλέκονται στην αντοχή απόπτωση [12]. Επιπλέον, η ανάλυση των ανθρώπινων ιστών δείγματα φυσιολογικών και καρκίνο των πνευμόνων βρήκαμε ότι η αυξητική ρύθμιση του PED πρωτεΐνης στον πνεύμονα καρκινικούς ιστούς συσχετίστηκε με miR-212 σίγηση και

in vitro

με αντίσταση απόπτωση. Παρ ‘όλα αυτά, η σχέση μεταξύ του miR-212 φίμωση με την εξέλιξη και τη σοβαρότητα της νόσου ήταν ακόμα άγνωστη. Για το σκοπό αυτό, με τη χρήση δειγμάτων ιστών από ασθενείς με NSCLC που πλήττονται στην Τ1-Τ2-Τ3 και Τ4 στάσης, διαπιστώσαμε ότι σε Τ1 /Τ2 η έκφραση του miR-212 ήταν ετερογενής ενώ στην Τ3 /Τ4 όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν έδειξαν ΜΙΚ 212 προς τα κάτω ρύθμιση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σίγηση του miR-212 στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται στενά με τη σοβαρότητα της νόσου. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην miR-212 αποσιώπηση στον καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμη άγνωστη, και αυτό ήταν το επίκεντρο της μελέτης μας.

Αρκετές μελέτες έχουν αναλύσει την έκφραση του miR-212 σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, ώστε να προσδιοριστεί ο ρόλος του στην ιστοειδική φυσιολογία. miR-212 επίπεδα έκφρασης βρέθηκαν υψηλότερα σε προσθεγκεφάλου περιοχές του εγκεφάλου ενήλικα αρουραίου [29] έντονα μειωτικά στους ιστούς των εμβρύων με ανεγκεφαλία [30] και, σε συνδυασμό με miR-132, υψηλότερη σε νευρώνες του ιππόκαμπου. Επιπλέον, miR-212 έχει περιγραφεί ως εμπλέκονται στην κανονική δενδριτών ωρίμανση σε νεογέννητα νευρώνες στα ενήλικα ιππόκαμπο [31].

Μέχρι σήμερα, λίγες εκθέσεις δείχνουν εμπλοκή του miR-212 στον καρκίνο, αλλά όλα αυτά δείχνουν ότι αυτό το miRNA απορυθμίζεται σε διαφορετικά ανθρώπινα καρκινικά. Ειδικότερα, η έκφραση του miR-212 μειώνεται σε αμφότερες γαστρικά κύτταρα καρκινώματος (GC) και σε ανθρώπινα πρωτογενή ιστούς GC προτείνοντας ότι προς τα κάτω ρύθμιση της μπορεί να σχετίζεται με το γαστρικό καρκινογένεση μέσω γονιδίων-στόχων της, όπως μεθυλο-CpG-δεσμευτική πρωτεΐνη [32]. Σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ιστών miR-212 υπερεκφράζεται και στοχεύει το καταστολέα ρετινοβλαστώματος όγκου [33] Χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών δεκατρία miRNA, συμπεριλαμβανομένων miR-212, βρέθηκαν σημαντικά υπερεκφράζεται σε όγκους του στόματος [34]. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση του ΗΒ-EGF (EGF δέσμευσης ηπαρίνης αυξητικός παράγοντας) λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση του miR-212 στο κεφάλι και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του λαιμού (HNSCC) έχει περιγραφεί ως πιθανός μηχανισμός του cetuximab ανθεκτικότητας [35 ].

Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια συγκεκριμένη επιγονιδιώματος. Κατά την τελευταία δεκαετία και πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η εκτροπή των επιγενετικών σημάτων όπως το DNA μεθυλίωσης CpG νησίδες και ομοιοπολικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών ιστόνης που εμπλέκονται στην οργάνωση της χρωματίνης, συμβάλλουν σημαντικά στην κακοήθη μετασχηματισμό. Από την άλλη πλευρά, έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση των miRNAs μπορεί να επηρεάζεται από επιγενετικές μεταβολές. Σε όγκους της ουροδόχου κύστης, διαπιστώθηκε ότι το miR-127 είναι σιγήσει μέσω μεθυλίωσης υποκινητή και η έκφρασή της θα μπορούσε να αποκατασταθεί με παράγοντες υπομεθυλίωσης [16]. Lujambio

et al

αντιμετωπίζονται πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μεταστάσεις λεμφαδένα με παράγοντες απομεθυλίωσης DNA και τη χρήση miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση διαπίστωσε ότι το miR-148a, miR-34b /c, και miR-9 οικογένεια έδειξε συγκεκριμένο καρκίνο νησί CpG υπερμεθυλίωση [36]. Ομοίως, σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου miR-124a σίγηση συνδέθηκε με CpG νησίδα υπερμεθυλίωση [17]. Χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική προγράμματα βρήκαμε μια CpG νησίδα στον προαγωγέα του γονιδίου miR-212. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του υποκινητή CpG νησιωτική περιοχή είναι ένα κοινό επιγενετική μηχανισμό για την μεταγραφική σίγηση. Συνεπώς, μετρήσαμε τα αποτελέσματα του ΑΖΑ στην μεταγραφική ρύθμιση του miR-212 σε Calu-1 κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του miRNA. Παραδόξως, αν και το στοιχείο προαγωγέα του miR-212 κατοικεί μέσα σε νησί CpG βρήκαμε ότι Calu-1 θεραπεία με ειδικό αναστολέα για το DNA μεθυλάση δεν άλλαξε την έκφραση του miR-212.

Επιγενετικές σίγηση σε κύτταρα θηλαστικών είναι διαμεσολαβείται από τουλάχιστον δύο διαφορετικές τροποποιήσεις ιστονών: H3K27 trimethylation και H3K9 διμεθυλίωση [37]. Η σχέση μεταξύ υπερμεθυλίωση του DNA και αυτών των τροποποιήσεων ιστονών δεν είναι πλήρως κατανοητός. Είναι ενδιαφέρον, Kondo

et al

παρουσίασαν πρόσφατα εντοπίστηκαν επιγενετική πτυχή του γονιδίου απορρύθμισης των καρκινικών κυττάρων [38]. Βρήκαν ότι έως και 5% των γονιδίων στη μικροσυστοιχία CpG σίγησαν σε καρκινικά κύτταρα με εκσεσημασμένη αύξηση σε H3K27me3 συνδέονται με σχετικά χαμηλά επίπεδα του DNA προαγωγού μεθυλίωση. Επιπλέον, βρέθηκε πρόσφατα ότι miR-22 σίγηση εμπλέκει συσσώρευση H3K27me3 ανεξάρτητη από προαγωγέα DNA μεθυλίωσης στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία [39]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι H3K27me3 αποτελεί εναλλακτικό τρόπο γονιδιακής σίγησης στον καρκίνο ανεξάρτητα από το DNA μεθυλίωση. Σύμφωνα με αυτές τις πρόσφατες μελέτες εκτελέσαμε ανάλυση τσιπ καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Calu-1) και σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες που προέρχονται από εμβρυϊκό πνεύμονα (MRC5) για να διερευνήσει τις αλλαγές των τροποποιήσεων ιστονών συνδέεται με μεταγραφικά ενεργή και /ή ανενεργή χρωματίνη του miR-212 προαγωγό περιοχή. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε αυξανόμενες ποσότητες H3K27me3 και H3K9me2 (ομοιοπολική τροποποίηση που εμπλέκονται στη γονιδιακή σίγηση) στην περιοχή προαγωγού του miR-212 σε Calu-1 σε σύγκριση με MRC5 κύτταρα και αυξανόμενες ποσότητες H3K9Ac (ομοιοπολική τροποποίηση που εμπλέκονται στην έκφραση του γονιδίου) στο περιοχή προαγωγέα του miR-212 σε MRC5 σε σύγκριση με κύτταρα Calu-1. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι αναστολείς των ενζύμων που εμπλέκονται στην τροποποιήσεις των ιστονών, δηλ siEZH2, TSA και BIX01294, ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση miR-212 σε κύτταρα Calu-1. Στο σύνολό τους αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, αν και η υπερμεθυλίωση του DNA φαίνεται να είναι απαραίτητη για την αδρανοποίηση των γονιδίων, η μεταγραφική αποσιώπηση του miR-212 στο NSCLC περιλαμβάνει H3K27me3 /H3K9Ac ή H3K9me3 /H3K9Ac που σχετίζεται με την τροποποίηση των ιστονών ανεξάρτητα από προαγωγέα DNA μεθυλίωση.

Δοκιμάσαμε επίσης τα αποτελέσματα στο μονοπάτι που προκαλείται από κύτταρα θάνατο σε NSCL των διαφόρων αναστολέων.

στην πραγματικότητα, τα τελευταία ευρήματά μας κατέδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-212 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα Calu-1 σε TRAIL-επαγόμενη απόπτωση [12]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ευαισθησία του TRAIL Calu-1, αξιολογήθηκε με την ανάλυση κηλίδος western της κασπάσης 8 και με ανάλυση FACS, ήταν μεγαλύτερη αυξήθηκε από την αναστολή της G9a τότε εκείνη του ΕΖΗ2. Η απουσία της επίδρασης της siEZH2 στην ευαισθησία TRAIL σε κύτταρα Calu-1 μπορεί να αποδοθεί σε διαφορετικούς μηχανισμούς. Είναι πιθανό ότι: (i) τη μείωση του 70% του ΕΖΗ2 λαμβάνεται με την κατεργασία με το ειδικό siRNA δεν είναι επαρκής για να αυξήσει απόκριση TRAIL (ii) ΕΖΗ2 knock-down, εκτός miR-212, μπορεί να ρυθμίζει άλλες σημαντικές μόρια σηματοδότησης που εμπλέκονται σε σηματοδότηση TRAIL (iii) για να ρυθμίζει ρυμουλκουμένων οδό σηματοδότησης, ΕΖΗ2 μπορεί να χρειάζεται την ταυτόχρονη αναστολή HDAC που μπορεί να ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης των διαφορετικών μορίων που εμπλέκονται στην απόκριση TRAIL. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διερευνήσει αυτές τις διαφορετικές υπόθεση.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το miR-212 αποσιώπηση συσχετίζεται με τη βαρύτητα της νόσου, δεδομένου ότι είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε Τ3 /Τ4 στάσης και όχι σε T1 /T2 στάσης και ότι αποσιώπηση της στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με τροποποιήσεις των ιστονών και όχι DNA υπερμεθυλίωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Calu-1 (NSCLC) και MRC5 (φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών που προέρχονται από εμβρυϊκό πνεύμονα ινοβλάστες) κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM. Μέσα συμπληρώθηκαν με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη και 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη.

δείγματα Καρκίνος του πνεύμονα

Ένα σύνολο 34 Φορμαλίνη -εκτιμήσεις, δείγματα (FFPE) ιστού εμπεδωθεί με παραφίνη που αποτελείται από δύο αδενο και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων συλλέχθηκαν από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Kuopio της Φινλανδίας. Την άδεια να χρησιμοποιήσετε το υλικό που ελήφθη από την Εθνική Εποπτική Αρχή για την Πρόνοια και την Υγεία της Φινλανδίας και η μελέτη έγινε δεκτή από την επιτροπή δεοντολογίας της Βόρειας Savo Νοσοκομείο District, Κουόπιο, Φινλανδία.

εκχύλιση RNA και Real-Time PCR

καλλιέργειας κυττάρων.

Σύνολο RNAs (miRNA και mRNA) της Calu-1 και MRC5 κύτταρα εξήχθη χρησιμοποιώντας miRNeasy μίνι κιτ (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δείγμα ιστού:

Ολικό RNA (miRNA και mRNA) από δείγματα ιστών FFPE εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid (Ambion) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αντίστροφη μεταγραφή του συνολικού miRNA και του mRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας 500 ng (από κυτταρική καλλιέργεια) ή 50 ng (από FFPE δείγματα ιστού) του συνολικού RNA /δείγμα από miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ποσοτική ανάλυση του miR-212, ΕΖΗ2, G9a και HDAC διεξήχθησαν με RealTime PCR χρησιμοποιώντας κιτ miScript SYBR Green PCR (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ως εσωτερική αναφορά που χρησιμοποιείται RNU5A και GAPDH. ΕΖΗ2 εκτός (Fw: CCACCATTAATGTGCTGGAA Rv: TTCCTTGGAGGAGTATCCACA) όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν αγοράστηκαν από την Qiagen. Η αντίδραση για την ανίχνευση των miRNA και mRNAs πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε σημείο δεδομένων, και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση λογισμικού (Bio-Rad)

Η μεθυλίωση του DNA ανάλυση

Το πρόγραμμα CpG νησί Searcher (http:. //www.cpgislands.com/) χρησιμοποιήθηκε για να αποδείξει ότι miR-212 περιοχή κωδικοποίησης είναι ενσωματωμένη σε μια CpG νησίδα. κατάσταση μεθυλίωσης του DNA εκτιμήθηκε με ανάλυση αλληλουχίας του θειώδους τροποποιημένου γενωμικού DNA που περιλαμβάνεται στο αντίστοιχο CpG νησίδα. Όξινο θειώδες θεραπεία προκαλεί χημική μετατροπή των μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη σε ουρακίλη αφήνοντας μεθυλιωμένη κυτοσίνη αμετάβλητες. Γονιδιωματικό DNA τροποποιήθηκε με την χρησιμοποίηση ΕΖ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για να ενισχυθεί η περιοχή, συμπεριλαμβανομένων θέση έναρξης της μεταγραφής miR-212 στην πίσω κλώνου χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-TTTTGGGTGGTATTTGAATTTT-3 ‘? RV 5’-CCCCTCCTCAATTCCTAAA-3 ‘. Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε ρ-ΟΕΜ-Τ Easy Vector System II (Promega), και αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία οκτώ ανεξάρτητοι κλώνοι από κάθε δείγμα.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση ανάλυση

προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης χρωματίνη διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lowcell ChIP Kit (Diagenode) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% φορμαλδεΰδη, ένα παράγοντα σταυρωτής σύνδεσης, για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, χρωματίνη ήταν ψαλιδισμένα με Bioruptor (Diagenode) σε μέσο μήκος των 0.4-0.8 kb. Ψαλιδισμένα χρωματίνη ανοσοκατακρημνίστηκε για 16 ώρες στους 4 ° C χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: anti-thrimethyl-Κ4 ιστόνης Η3, αντι-thrimethyl-K27 ιστόνης Η3, αντι-διμεθυλο-K9 ιστόνης Η3 και αντι-ακετυλο-K9 ιστόνη Η3 (Diagenode) . Επιπλέον, 1/100 του διαλύματος συλλέγονται πριν την προσθήκη του αντισώματος χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την ποσότητα του DNA εισόδου. Real-Time PCR πραγματοποιήθηκε σε 25 μΐ που περιέχει 5 μΐ του ανοσοκατακρημνίστηκε DNA, 12,5 μλ SYBR πράσινο κύριο μίγμα PCR (Qiagen) και 150 ηΜ ειδικών εκκινητών (FW 5′-GGAGTCCAGCTTCCTCTCCT-3 ‘? RV 5’-GCTCCTGGGGGTCTTCAC) . Το πρωτόκολλο της PCR συνεπάγεται 10 λεπτά στους 95 ° C και 40 κύκλους 15 sec στους 94 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε σημείο δεδομένων, και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση λογισμικού (Bio-Rad).

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Επιμόλυνση

Το siRNA διπόλου για αρνητικό έλεγχο και ΕΖΗ2 mRNA (Dharmacon) διαμολύνθηκαν παροδικά για 48 ώρες σε κύτταρα Calu-1 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, οι τιμές έκφραση ΕΖΗ2 και τα επίπεδα miR-212 αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση στυπώματος western. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε σημείο δεδομένων.

απομόνωσης πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό JS (50 mM HEPES ρΗ 7.5 που περιέχει 150 mM NaCl, 1% γλυκερόλη, 1% Triton Χ 100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, και 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford (Biorad) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (12,5% ακρυλαμίδιο). Τα πηκτώματα ηλεκτροστυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Bedford, ΜΑ).