Αφηρημένο

Για να αξιοποιηθεί πλήρως το δυναμικό της γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου αυτοκτονίας που επιτρέπει την ακριβή έκφραση του γονιδίου αυτοκτονίας στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε ένα συγκεκριμένο μόριο επιθηλιακά ιστών κυττάρων (EpCAM) προαγωγός (EGP- 2) η οποία κατευθύνει διαγονίδιο ιός του απλού έρπητα-θυμιδίνης κινάσης (Ηδν-ΤΚ) έκφραση κατά προτίμηση σε EpCAM υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα. επίπεδα EpCAM είναι σημαντικά υψηλότερα σε ρετινοβλάστωμα (RB), μια παιδική ηλικία καρκίνος μάτι με περιορισμένη έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα. Χρήση της ρύθμισης miRNA, δίπλα στη χρήση του υποκινητή ιστού-ειδικό, θα παρέχει το δεύτερο στρώμα του ελέγχου στην έκφραση διαγονιδίου μόνο στα κύτταρα όγκου ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα. Για να εξεταστεί αυτή η υπόθεση θα κλωνοποιηθεί αφήσουμε-7b στόχους miRNA στην περιοχή 3’UTR του γονιδίου αυτοκτονίας HSV-ΤΚ οδηγείται από τον υποστηρικτή EpCAM γιατί ας-7 οικογένεια miRNAs, συμπεριλαμβανομένων ας-7b, βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω στους όγκους RB και κυτταρικές γραμμές. Χρησιμοποιήσαμε EpCAM πάνω έκφραση και αφήστε-7 προς τα κάτω ρύθμιση RB κυτταρικές σειρές Υ79, weri-Rb1 (EpCAM

+ ve /ας-7b

κάτω-ρυθμιζόμενες), EpCAM τα κάτω ρύθμιση, ας-7 που υπερεκφράζουν την κανονική του αμφιβληστροειδούς Müller νευρογλοιακά κυτταρική σειρά MIO-M1 (EpCAM

κη /ας-7b

up-ρύθμιση), και EpCAM μέχρι ρυθμίζονται, αφήστε-7b επάνω ρυθμισμένη κανονική θυρεοειδούς κυτταρική σειρά Ν-Thy-Ori-3.1 (EpCAM

+ ve /ας-7b

up-ρύθμιση) στη μελέτη. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ, η απόπτωση μετρήθηκε με ανίχνευση διασπάται Caspase3, EpCAM και έκφραση ΤΚ προσδιορίστηκαν ποσοτικά με στύπωμα Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η EGP2-υποκινητή HSV-ΤΚ (EGP2-ΤΚ) κατασκευή με 2 ή 4 αντίγραφα ας-7b στόχους miRNA εκφράζονται γονίδιο ΤΚ μόνο σε Υ79, weri-Rb-1, ενώ το γονίδιο ΤΚ δεν εκφράζουν το MIO -m1. Εν ολίγοις, έχουμε αναπτύξει μια ιστο-ειδική, miRNA-ρυθμίζονται φορέα διπλού ελέγχου, το οποίο εκφράζει επιλεκτικά το γονίδιο αυτοκτονίας στην EpCAM πάνω από τα κύτταρα που εκφράζουν

Παράθεση:. Danda R, Krishnan G, Ganapathy Κ, Krishnan UM, Vikas Κ, Elchuri S, et al. (2013) στοχευμένη έκφραση των γονιδίων αυτοκτονίας με ιστο-ειδική υποστηρικτής και microRNA κανονισμού για Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10.1371 /journal.pone.0083398

Επιμέλεια: Rajiv R. Mohan, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιούν του 2013? Αποδεκτές: 5 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Danda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο ινδική Ιατρικής Έρευνας, δεν χορηγούν 35/6 /2010 /-BMS Νάνο για την εκτέλεση κλωνοποίηση, επιμόλυνση και λειτουργική ανάλυση. Εν μέρει το έργο αυτό υποστηρίζεται από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, η κυβέρνηση της Ινδίας, δεν χορηγούν BT /01 /CE1B /11 /V /16 για την εκτέλεση του προφίλ οικογένεια αφήνω-7miRNA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι συμβατικές θεραπείες όπως η χημειοθεραπεία, ραδιόφωνο και χειρουργική θεραπεία είναι τα πιο αποτελεσματικά μέσα για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο [1]. Με βάση τα στάδια της νόσου, οι τρέχουσες μέθοδοι θεραπείας για ρετινοβλάστωμα (RB) το συχνότερο νεόπλασμα του οφθαλμού κατά την παιδική ηλικία, περιλαμβάνουν εντατική χημειοθεραπεία, ακτινοβολία, ενοποίηση με αυτόλογα αιμοποιητικά διάσωση των βλαστικών κυττάρων και χειρουργική εκτομή. Ωστόσο, οι ασθενείς με υαλοειδούς σπόρους, υπο αμφιβληστροειδούς σπόρους, και διμερείς προηγμένες πολυεστιακή ασθένειες είναι μια σημαντική πρόκληση με τις τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές [2], [3]. Πρόσφατη ανακάλυψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων, ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με το οποίο είναι εν μέρει υπεύθυνος για την ανάπτυξη του όγκου με διαφορετικές ιδιότητες σε σύγκριση με διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου αυξάνονται τις πολυπλοκότητες της θεραπείας του καρκίνου [1]. Ως εκ τούτου, οι νέες μέθοδοι θεραπείας για την καταπολέμηση του καρκίνου. Μεταξύ των διαφόρων προσεγγίσεων, η γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική στρατηγική, δεδομένου ότι η έκφραση του γονιδίου αυτοκτονίας μπορεί να ρυθμιστεί σε ένα συγκεκριμένο ιστό [4], [5]. γονίδιο αυτοκτονίας θεραπεία περιλαμβάνει την ενδοκυτταρική απελευθέρωση ενός γονιδίου που κωδικοποιεί για ένα ένζυμο που μετατρέπει ένα προφάρμακο σε ένα κυτταροτοξικό προϊόν [6], [7]. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο γονίδιο αυτοκτονίας είναι ο τύπος του ιού του απλού έρπητα Ι θυμιδίνη κινάση (HSV-ΤΚ). Διάφορες μελέτες είχαν χρησιμοποιήσει γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας HSV-TK για τη θεραπεία της RB και άλλων καρκίνων [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Μη ειδική έκφραση του γονιδίου αυτοκτονίας σε φυσιολογικά κύτταρα είναι ένας σοβαρός περιορισμός στις υπάρχουσες στρατηγικές γονίδιο αυτοκτονίας για θεραπεία του καρκίνου.

Προκειμένου να ελεγχθεί αποτελεσματικά την έκφραση διαγονιδίου μόνο σε κύτταρα-στόχους, διάφορες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει διαφορετικά ιστού ειδικούς προαγωγούς [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Ένας τέτοιος προαγωγός είναι επιθηλιακά γλυκοπρωτεΐνη-2 //17-1 (EGP2) προαγωγό ΕρΟΑΜ που σκοτώνει επιλεκτικά το EpCAM επί κυττάρων που εκφράζουν σε πολλούς καρκίνους με περιορισμένη έκφραση του ΤΚ (κινάση θυμιδίνης) που ακολουθείται από Ganciclovir (GCV) θεραπεία [21], [ ,,,0],22]. ΕρΟΑΜ /CD326 είναι ένας Ι trans μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη τύπου που εκφράζεται σε κορυφαία μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων και δείχνει Baso-πλευρική έκφραση σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται ειδικά σε επιθηλιακό ιστό, και πάνω που εκφράζεται σε πλειονότητα των ανθρώπινων επιθηλιακών καρκινωμάτων, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του μαστού, του προστάτη, κεφαλής και λαιμού, ηπατικά καρκινώματα και ρετινοβλάστωμα [23], [24]. Ελεγχόμενη έκφραση γονιδίου στα στοχευμένες ιστούς είναι ζωτικής σημασίας για την γονιδιακή θεραπεία ιδιαίτερα στο πλαίσιο της γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου αυτοκτονίας. Ακόμα κι αν η γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας οδηγείται ιστού ειδικό προαγωγό έδειξαν υποσχόμενα αποτελέσματα, διαρροές έκφραση των ειδικών ιστού προαγωγών σε μη στοχευόμενα κύτταρα, έχει αναφερθεί [21]. Ως εκ τούτου, εναλλακτικές στρατηγικές είναι απαραίτητες εκτός από την ειδική ρύθμιση ιστικό υποκινητή του γονιδίου αυτοκτονίας θεραπείας

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία από μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs. (& Gt? 1000 σε κύτταρα θηλαστικών) που ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες που κυμαίνονται από την κυτταρική διαίρεση, μεταγωγή σήματος και το μεταβολισμό. Η μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω miRNA μεσολάβηση παρεμβολή RNA (RNAi) είναι καλά γνωστό [25]. miRNAs είναι γνωστό να μπλοκάρει μετάφραση mRNA ή να μειώσει τη σταθερότητα του mRNA μετά τέλεια σύνδεση του κλώνου οδηγός για τα στοιχεία miRNA-αναγνώρισης (MRes) εντός του 3

luntranslated περιοχή (UTR) των γονιδίων στόχων [26], [27], [28], [29]. ας-7 είναι μια κατηγορία miRNAs τα οποία εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού και την καταστολή του όγκου. Προηγούμενες μελέτες σε προστάτη, του πνεύμονα και του μαστού, έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση των let-7 οικογένεια miRNAs [30], [31]. Πρόσφατα, γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη (GFAP) προαγωγό οδηγείται φορείς έκφρασης ιστού ειδικό γονίδιο μαζί με τις αλληλουχίες στόχους για την απορυθμισμένη miRNA (mir122a, mir31, mir127, mir143) εισήχθησαν στην περιοχή 3’UTR του διαγονιδίου [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε την έκφραση διαγονιδίου μόνο στη στοχευμένη καρκίνο γλοιοβλαστώματος κύτταρα χωρίς καμία έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα αστροκύτταρα από το ίδιο γένος [34].

Σε αυτή τη μελέτη, κατασκευάσαμε ένα φορέα έκφρασης κυττάρου θηλαστικού, που φιλοξενεί υποκινητή EpCAM (EGP2) οδηγείται γονίδιο αυτοκτονίας HSV-ΤΚ ρυθμίζεται από την έκφραση της απελευθερωμένης επίπεδα miRNA. Ο στόχος είναι να εκφράσει το γονίδιο αυτοκτονίας μόνο σε EpCAM

+ ve κυττάρων με πολύ ελάχιστη ή καθόλου έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα από το ίδιο γένος. Η miRNA ας-7b είναι υπό εκφράζεται σε Υ79, weri-Rb-1 κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Κάναμε EGP2-ΤΚ κατασκευή με 2 και 4 αντίγραφα ας-7b αλληλουχίες στόχους miRNA. Η έκφραση του γονιδίου ΤΚ περιορίζεται σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως Υ79, weri-Rb-1, MDA-MB-453, και MCF-7, ενώ ΤΚ γονιδιακή έκφραση είναι ελάχιστη σε κυτταρική γραμμή ΜΙΟ-Μ1. Δείξαμε για πρώτη φορά η χρήση του υποκινητή EpCAM οδηγείται miRNA ρυθμιζόμενη ΤΚ γονίδιο αυτοκτονίας στην EpCAM θετικά και ας-7 προς τα κάτω ρύθμιση των κυττάρων. Η στρατηγική αυτή προσφέρει ένα επίπεδο ελέγχου δύο επιπέδων του διαγονιδίου που μπορεί να οδηγήσει σε επιλεκτική έκφραση του διαγονιδίου στα καρκινικά κύτταρα, χωρίς καμία έκφραση στα φυσιολογικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

δείγματα όγκων ρετινοβλάστωμα συλλέχθηκαν από εξορυγμένος μπάλες μάτι, ως μέρος της θεραπείας και χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς, γραπτή γενική συγκατάθεση λήφθηκε από τους γονείς /κηδεμόνες του που υποβάλλεται enucleation ασθενή. Η μελέτη διεξήχθη μετά από έγκριση από την Υπο-επιτροπή (Board κριτική Θεσμικό) Ηθική του Sankara Nethralaya νοσοκομείο μάτι [Ηθικές κάθαρση χωρίς: 147 (Α) -2009-P].

δείγματα όγκων και παθολογικών λεπτομέρειες

για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 10 φρέσκα όγκους ρετινοβλάστωμα, Clinocopathological στοιχεία για τους όγκους βασίστηκαν στην ομάδα εργασίας του διεθνούς ρετινοβλάστωμα στάσης (IRSWG) [37], [38] και δόθηκαν στον πίνακα S1. Συγκεντρωτικά ενήλικο αμφιβληστροειδή 50-55 (n = 3) ετών χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρας και ελήφθησαν από πτωματικό μάτια δώρισε στο CU Shah Eye Bank, Sankara Nethralaya.

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ρετινοβλάστωμα κυτταρική σειρά Υ79, weri-Rb1, και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές MDA-MB-453, MCF-7 ελήφθησαν από το Κέντρο Πληροφόρησης RIKEN Bio (Ιαπωνία). Ανθρώπινα αμφιβληστροειδούς Müller νευρογλοιακά κυτταρική σειρά MIO-M1 που προέρχονται από τον νευρικό αμφιβληστροειδή ήταν προικισμένος από τον Ο.Α. Άκρων, UCL Institute of Ophthalmology, Λονδίνο, Αγγλία [39]. Ανθρώπου θυρεοειδούς ωοθυλακίων επιθηλιακών κυττάρων γραμμή Nthy-ori 3-1 ήταν προικισμένος από Dr.Omer Ugur, Hacettepe Ινστιτούτο Ογκολογίας [40], [41]. ΜΙΟ-Μ1, MDA-MB-453, MCF-7 καλλιεργήθηκαν σε τροποποίηση του Dulbecco του μέσου Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει γλουταμίνη, συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), πενικιλλίνη (100 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (100 IU /ml). Nthy-ori 3-1 και Υ79, weri-Rb1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορρό εμβρύου μόσχου, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, και 4,5% δεξτρόζη και αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα στους 37 ° C σε 5% CO

2-υγροποιημένο εκκολαπτήριο.

In vitro

διαγονιδίου έκφραση ανάλυση

(EGP2-ΤΚ) παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ MG Rots, Τμήμα του θεραπευτικού γονιδίου Modulation, Πανεπιστήμιο Κέντρο Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο του Γκρόνινγκεν, στην Ολλανδία. Ο φορέας έκφρασης pUT649 που περιέχει ένα ανθεκτικό γονίδιο Zeocin και φέρει το γονίδιο HSV-ΤΚ κάτω από τον έλεγχο του ανθρώπινου προαγωγέα κυτταρομεγαλοϊού (CMV-ΤΚ) [που παράγεται από τον καθηγητή G.Tiraby (Πανεπιστήμιο της Τουλούζης), Cayla, France] επιμολύνθηκαν παροδικά σε Υ79 , weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, ΜΙΟ-M1 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη TM 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κλωνοποίηση των στόχων miRNA στο πλασμίδιο EGP2-ΤΚ

Για την κατασκευή των πλασμιδίων με αφήσει-7 αλληλουχίες στόχους miRNA, EGP2-ΤΚ χρησιμοποιήθηκε ως ραχοκοκαλιά που περιέχει HSV-ΤΚ στο κατάντη της EGP2 υποκινητή. Για την κατασκευή των στόχων των miRNAs, τα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν με στόχους ας-7b (τέλεια αλληλουχία συμπλήρωμα του ας-7b miRNA λήφθηκε από την προσχώρηση miRBase μη MIMAT0000063) ακολουθούμενο από

Κρη

που χαρακτηρίζονται ως T1A (που έχει στόχους τέλεια αντίστροφη συμπληρωματική προς την αφήνω-7b miRNA) και Τ1 (απόλυτα συμπληρωματικό T1A) ανοπτήθηκαν και συνδέθηκαν μεταξύ

ΝοίΙ

και

ΒΙ

θέσεων περιορισμού με αποτέλεσμα EGP2-ΤΚ-2T που έχει 2 αντίγραφα οι στόχοι let-7b. Η

ΚρηΙ

/

BstBI

θραύσμα υπέστη πέψη με τα αντίστοιχα ένζυμα και συνδέθηκε με τα ολιγονουκλεοτίδια έχουν δύο περισσότερα αντίγραφα αλληλουχιών στόχου ας-7b. Η οποία έχει οριστεί ως T2A (που έχει στόχους ιδανικό συμπληρωματικό για να αφήσει-7b miRNA) και T2B (απόλυτα συμπληρωματικό T2A) αντίστοιχα. Αυτές ανοπτήθηκαν και συνδέθηκαν με αποτέλεσμα EGP2-ΤΚ-4Τ έχει 4 αντίγραφα αλληλουχιών στόχου ας-7b. Οι στόχοι του ελέγχου C1A, C1B και C2A, C2B δημιουργήθηκαν λαμβάνοντας το τέλειο αντίστροφη συμπληρωματική του στόχου miRNA ας-7b. Καθ ‘όλη τη χειρόγραφο EGP2-ΤΚ με 2 αντίγραφα των στόχων ας-7b θα αναφέρεται ως EGP2-ΤΚ-2Τ και 4 αντίγραφα των στόχων ας-7b ως EGP2-ΤΚ-4T. Με τον ίδιο τρόπο EGP2-ΤΚ με 2 αντίγραφα αλληλουχίας ελέγχου ας-7b θα αναφέρεται ως EGP2-ΤΚ-2C και 4 αντίγραφα του αλληλουχία ελέγχου θα συμβολίζεται ως ΕΟΡ-ΤΚ-4C. Τα κατασκευάσματα πλασμιδίου για δοκιμασία λουσιφεράσης (luc) ρεπόρτερ δημιουργήθηκαν με αντικατάσταση του γονιδίου HSV-ΤΚ με τη λουσιφεράση

Guassia

γονίδιο. Οι λουσιφεράσης κατασκευές ονομάστηκαν όπως αναφέρθηκε παραπάνω αντικαθιστώντας ΤΚ με Luc. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη.

Η

miRNA ανάλυση της έκφρασης

Το κιτ TaqMan® microRNA αντίστροφη μεταγραφή και η TaqMan® Οικουμενική PCR Master Mix χωρίς Amperase® UNG από την Applied Biosystems (CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ώριμων miRNA. Η ποσοτικοποίηση έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA δείγματος. Χρησιμοποιήσαμε RNU6 miRNA (προσδιορισμός ταυτότητας, 001093) ως μάρτυρας. TheTaqMan® microRNA (Applied Biosystems) μεμονωμένες αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για τις ακόλουθες εκτιμήσεις miRNA: HSA-ας-7α (ID δοκιμασία, 000.377), HSA-ας-7b (ID δοκιμασία, 2619), HSA-ας-7c (ID δοκιμασία, 000379), HSA-ας-7d (ID δοκιμασία, 002.283), HSA-ας-7ε (ID δοκιμασία, 2406), HSA-ας-7f (ID δοκιμασία, 000.382), και HSA-ας-7g (ID δοκιμασία, 0002282 ) και HSA-ας-7θ (ID δοκιμασία, 002221). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τιμές Ct για το σπίτι διατήρησης γονίδιο U6 σε κάθε δείγμα. Για τον υπολογισμό σχετικών ποσοτήτων των miRNA, η μέση τιμή Ct της U6 RNA αφαιρέθηκε από εκείνη των miRNA στόχου για να ληφθεί η μεταβολή της αξίας Ct. Το φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκε στη συνέχεια ως log2 σχετικές μονάδες. Τα προϊόντα της PCR ανιχνεύθηκαν με ένα σύστημα ανίχνευσης 7500 αλληλουχία ΑΒΙ PRISM και αναλύθηκαν με το λογισμικό ΑΒΙ PRISM 7500 SDS (Applied Biosystems).

προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς

Χρησιμοποιήσαμε προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης για υποστηρικτής ανάλυση δύναμη και τη μελέτη της ρύθμισης miRNA στην έκφραση του διαγονιδίου. pGluc πλασμίδιο που περιέχει τον προαγωγό CMV οδηγείται -luciferase κατασκεύασμα αγοράστηκε από (New England Biolabs, ΜΑ, USA). Ο υποκινητής EGP2 κλωνοποιήθηκε μπροστά από ένα γονίδιο λουσιφεράσης (EGP2-Ιυο) που αντικαθιστά τον προωθητή CMV. Τα 2 και 4 αντίγραφα αλληλουχιών στόχου ας-7b κλωνοποιήθηκαν στην περιοχή 3’UTR του κατασκευάσματος (EGP2-Luc). Η διαμόλυνση έγινε παροδικά με τα ακόλουθα πλασμίδια CMV-luc, EGP2-Ιυο, EGP2-luc-2Τ, EGP2-luc-4Τ, EGP2-Luc-2C και EGP2-luc-4C. Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση με κατασκεύασμα λουσιφεράσης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και αναπτύχθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάση δραστηριότητες σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (New England Biolabs).

Western ανάλυση κηλίδος

Για να αναλυθεί η έκφραση του ΤΚ και EpCAM πρωτεΐνες, ολικά εκχυλίσματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με λύση των κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [10 αναστολείς 7.2, 2% SDS, 10 mM διθειοθρεϊτόλη, 1% πρωτεάσης και φωσφατάσης mM Tris-HCl ρΗ κοκτέιλ (Sigma Aldrich, ΜΟ, USA)]. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Lowry του. Τα κυτταρολύματα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό φόρτωσης 5Χ Laemmli και έβρασαν για 5 λεπτά. Ίσες ποσότητες (50μg) της πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτρο-στυπώθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι κηλίδες μεμβράνης αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα. Το HSV-ΤΚ (που παρέχεται από τον Dr. William C. Summers, Yale University) και EpCAM (κυτταρική σηματοδότηση, MA, USA) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:100 και 1:150, αντίστοιχα. Οι κηλίδες πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας κατάλληλο (αντι-κουνελιού 1:5000? Αντι-ποντικού 1:2000 (Cell Signaling) για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιούνται με τετραμεθυλο βενζιδίνη υπεροξείδιο /υδρογόνου (ΤΜΒ /H

2O

2, Bangalore Genei, Ινδία) αντιδραστηρίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν με χρήση 100 mM γλυκίνη, ρΗ 2, για 40 λεπτά, μπλοκάρει, και επανα-διερευνήθηκαν για β-ακτίνη (Sigma). Τα στυπώματα σαρώθηκαν με ένα σύστημα UVP απεικόνισης BioDoc-IT (CA, USA) και ανάλυση πυκνομετρική των ψηφιοποιημένων εικόνων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό ImageJ (ΝΙΗ). Η ένταση για κάθε ζώνη ομαλοποιήθηκε με την ένταση της αντίστοιχης ζώνης β-ακτίνης μετά η ομαλοποίηση φόντο.

η μέτρηση της ευαισθησίας σε Ganciclovir (GCV)

το Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση σε πυκνότητα 10.000 κυττάρων ανά φρεάτιο για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Η διαμόλυνση έγινε παροδικά με πλασμίδια που περιέχουν CMV-ΤΚ, EGP2-ΤΚ, EGP2-ΤΚ-2Τ, EGP2-ΤΚ-4Τ, EGP2-ΤΚ 2C, EGP2-ΤΚ-4C και επωάζονται για 48 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (1, 10, 50100 μΜ) του GCV για 24 ώρες. Η ευαισθησία για GCV αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ χρωματομετρική. Ένας σαρωτής πολλαπλών φρεατίων (BioTek, VT, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η απορρόφηση σε μήκος κύματος 570 nm. Τα μη επιμολυσμένα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής αποδόθηκαν μία τιμή 100%. Η επιβίωση των κυττάρων υπολογίστηκε από την εξίσωση:. Δοκιμή OD /Ελέγχου OD Χ 100%

Immunofluorscence

Οι ακόλουθες επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών MIO-M1, Nthy-ori-3-1, weri-Rb1 , τα κύτταρα Υ79 πλύθηκαν με 1 χ PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια περατά με 0,25% Triton Χ-100 για 5 λεπτά. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν με 5% ορό εμβρύου μόσχου για 30 λεπτά, επωάστηκαν με αντι-διασπασμένης κασπάσης 3 (κυτταρική σηματοδότηση) και αντι-Bcl2 αντίσωμα (σηματοδότηση κυττάρου) για 3 ώρες, στη συνέχεια με FITC (πράσινο) και TRITC (κόκκινο) συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα (Jackson Immunoresearch, ΡΑ, USA) για 2 ώρες. Τα κύτταρα χρώση έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα Zesis Axio vison μικροσκόπιο ανεστραμμένου σύστημα με αντικειμενικό φακό 10Χ. Για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα της χρώσης, οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις κατά τις οποίες δεν φθορισμός ήταν ανιχνεύσιμος σε αρνητικούς ελέγχους μόνο με δευτερεύοντα αντισώματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SD 3 πειραμάτων με κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με δοκιμασία t του Student και την αξία AP ≤ 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Restricted TK έκφραση από EGP2 υποστηρικτής

Αναλύσαμε την επιλεκτική έκφραση του διαγονιδίου από EGP2 υποκινητή σε Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1 κυτταρικές σειρές. Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε έκφραση της πρωτεΐνης EpCAM σε Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1 κυττάρων και η έκφραση της δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρική σειρά MIO-ΜΙ (Figure1A). Ως εκ τούτου, η Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1cells θεωρήθηκαν ως EpCAM θετικό (EpCAM

+ ve) και το MIO-MI ως EpCAM αρνητικό (EpCAM

κη) για την έκφραση της πρωτεΐνης EpCAM. Για την αξιολόγηση της προαγωγό EGP-2 για την ικανότητά του να ρυθμίζει την έκφραση του HSV-ΤΚ στο EpCAM κύτταρα που εκφράζουν, εμείς παροδικά επιμολυσμένα των κυττάρων με EGP2 υποκινητή οδηγείται κατασκεύασμα HSV-ΤΚ (EGP2-ΤΚ). Η CMV-κατευθυνόμενο από υποκινητή HSV-ΤΚ (CMV-ΤΚ) το κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος. Σε CMV-TK παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα, ΤΚ πρωτεΐνη εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Nthy-ori 3-1, Υ79, weri-Rb1 και ΜΙΟ-Μ1) (Εικόνα 1Β). Σε EGP2-ΤΚ παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα, η έκφραση ΤΚ παρατηρήθηκε σε Nthy-ori 3-1, Υ79 και weri-Rb1 κύτταρα. Περαιτέρω, η έκφραση της πρωτεΐνης ΤΚ ήταν χαμηλή στα κύτταρα ΜΙΟ-Μ1 (Σχήμα 1 C). Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στην διαρροή του υποκινητή EGP2 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως σε άλλους υποκινητές [34], [35]. Σε πραγματικό χρόνο PCR πειράματα ο CMV προαγωγός οδηγείται γονίδιο ΤΚ έδειξε σταθερή έκφραση σε όλες τις κυτταρικές σειρές 4 (Σχήμα 1 D). EGP2-ΤΚ επιμολυσμένα Nthy-ori 3-1, κυτταρικές σειρές Υ79 και weri-Rb1 έδειξαν σημαντική υψηλότερη έκφραση ΤΚ σε σύγκριση με το CMV-ΤΚ επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, ο υποστηρικτής EpCAM μείωσε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου ΤΚ στην κυτταρική σειρά ΜΙΟ-ΜΙ (Σχήμα 1 D). προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς έδειξαν ότι CMV-luc διαμόλυνση παρουσίασαν σημαντική υψηλότερη έκφραση του γονιδίου σε σύγκριση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα. Η επιμόλυνση EGP2-Luc στα Nthy-ori 3-1, Υ79, και weri-Rb1 κυτταρικές σειρές έδειξαν σημαντική υψηλότερη έκφραση λουσιφεράσης σε σύγκριση με τον CMV-Luc επιμολυσμένα κύτταρα εκτός από MIO-Μ1, όπου η έκφραση της λουσιφεράσης είναι σημαντικά χαμηλότερο σε EGP2- luc διαμόλυνση (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υποκινητής EpCAM επιλεκτικά ενεργοποιείται σε EpCAM θετικές κυτταρικές σειρές Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, και όχι σε EpCAM αρνητική κυτταρική σειρά MIO-M1.

EpCAM έκφραση αξιολογήθηκε από τη δυτική ανάλυση κηλίδας και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (Α). Η έκφραση διαγονιδίου οδηγείται από EGP2 και CMV προαγωγού αξιολογήθηκε με παροδική επιμόλυνση του CMV-ΤΚ, EGP2-ΤΚ, ΟΜν-Luc, και EGP2-Luc. Μετά από 2 ημέρες έκφρασης πρωτεΐνης διαμόλυνσης ΤΚ οδηγείται από CMV προαγωγό αξιολογήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν έναντι της β-ακτίνης (Β). έκφραση πρωτεΐνης ΤΚ οδηγείται από EGP2 προαγωγό αξιολογήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν έναντι της β-ακτίνης (C). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση ποσοτικοποιήθηκε με χρήση του λογισμικού και η πρωτεΐνη έκφρασης ImageJ εκφράστηκε σε σχετικές τιμές έντασης σήματος. επίπεδα ΤΚ mRNA ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν ενάντια στην GAPDH και εκφράστηκαν σε σχετικές μονάδες αλλαγή δίπλωσης (D). Λουσιφεράσης ανάλυση έκφρασης πραγματοποιήθηκε με την ποσοτικοποίηση του εκκρίνονται λουσιφεράσης Gaussia. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι των κυττάρων un-επιμολυσμένα και εκφράσθηκαν σε σχετικές μονάδες φωτός (Ε). Κανονικοποιημένη επίπεδα έκφρασης λουσιφεράσης ως ποσοστό παρουσιάζεται ως μέση ± Τ.Α (n = 3). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου, + p & lt? 0,05, ++ p & lt? 0,01, +++ p & lt?. 0.001 έναντι CMV-Luc

Η

ΕΟΡ-2 προαγωγέα ελέγχει επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων με περιορισμένη έκφραση του ΤΚ

προκειμένου να αξιολογηθούν οι λειτουργικές πτυχές της έκφρασης γονιδίου ΤΚ, διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 10, 50, 100 μΜ) της θεραπείας GCV έγινε για 24 ώρες σε CMV-ΤΚ ή EGP2-ΤΚ παροδικά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών όπως Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, ΜΙΟ-Μ1. Η συγκέντρωση 10 μΜ της θεραπείας GCV έδειξε σχεδόν 50-60% βιωσιμότητα των κυττάρων στην όλη την CMV-ΤΚ διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας μειώθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης του GCV σε Nthy-ori 3-1, Υ79, και weri-Rb1 κύτταρα (Σχήμα 2Α, 2C, 2D). Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, η κυτταρική βιωσιμότητα μειώθηκε κάτω από τον προαγωγό EpCAM ρυθμίζεται ΤΚ σε σύγκριση με εκείνη του CMV προαγωγού ρυθμίζεται ΤΚ EpCAM

+ ve κυττάρων. Σε κύτταρα ΜΙΟ-ΜΙ, το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων είναι περίπου 60% κάτω από την ρύθμιση του υποκινητή CMV ΤΚ /GCV (Σχήμα 2Β) και 90% κάτω από τη ρύθμιση EpCAM υποκινητή του γονιδίου. Επιπλέον, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά στο πλαίσιο του EpCAM υποκινητής ρυθμίζεται ΤΚ στο Υ79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1 κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν υποστηρικτής EGP2 εκφράζει το γονίδιο ΤΚ στο EpCAM

+ ve και όχι στα EpCAM

κη κυτταρικές σειρές.

δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων με ΜΤΤ αξιολογήθηκε από την επιμόλυνση του EGP2-ΤΚ και CMV -TK πλασμιδίων σε κυτταρικές γραμμές. Nthy-ori-3-1 (Α), MIO-M1 (Β), Υ79 (C), weri-Rb1 (D). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, ακολουθούμενη από επεξεργασία με GCV σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 10, 50, 100 μΜ) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι των κυττάρων un-επιμολυσμένα και εκφράστηκαν σε ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων. βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζονται ως ποσοστό μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

Παρουσία ας-7 οικογένεια miRNA σε ρετινοβλάστωμα με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Έχει αναφερθεί ότι ας-7 οικογένεια miRNAs είναι αποπτωτικά, και πολύ συντηρημένες μεταξύ των ειδών στη σειρά και τη λειτουργία και την απορρύθμιση των αφήνω-7 οικογένειας οδηγεί σε καρκίνο [25]. Αναλύσαμε το προφίλ έκφρασης του ας-7 οικογένεια στο (n = 10) πρωτοπαθείς όγκους ρετινοβλάστωμα και Υ79, WER-Rb1, MIO-M1, Nthy-ori 3-1 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3). Η οικογένεια let-7 κάτω ρυθμίζονται σε πρωτογενείς όγκους σε σύγκριση με εκείνη του φυσιολογικού ενήλικα αμφιβληστροειδή. ας-7α ήταν ιδιαίτερα κάτω ρυθμίζονται μεταξύ των μελών της οικογένειας γράμ- 7 σε πρωτογενείς όγκους (Σχήμα 3Α, Β). ας-7c και αφήστε-7η ήταν πολύ κάτω ρυθμίζονται Υ79 και weri-Rb1 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τη γραμμή MIO-M1cell (Σχήμα 3C). Σε Nthy-ori 3-1 κυτταρική σειρά, όλα τα miRNA ήταν μέχρι ρυθμίζονται σε σύγκριση με το MIO-M1 (Σχήμα 3C). Επιπλέον, ας-7b έδειξαν συνεπή ρύθμιση προς τα κάτω και στις δύο κυτταρικές σειρές ρετινοβλάστωμα, σε σύγκριση με τα άλλα μέλη αφήνω-7 οικογένεια και έδειξε ψηλά ρύθμιση σε Nthy-ori 3-1. Ως εκ τούτου, αυτή η (ας-7b) επιλέχθηκε για να κλωνοποιήσουν αλληλουχίες στόχους των miRNAs σε πλασμίδιο κατασκευές μας.

Η έκφραση ας-7 miRNAs ήταν ποσοτικά με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR. Η ανάλυση της έκφρασης του ας-7 οικογένεια miRNAs αξιολογήθηκε σε ρετινοβλάστωμα πρωτογενείς όγκους. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι φυσιολογικά ενήλικα αμφιβληστροειδή και εκφράστηκαν σε τιμές φορές μεταβολή σε σχέση με φυσιολογικούς ενήλικες αμφιβληστροειδούς (Α, Β). Η ανάλυση της έκφρασης του ας-7 οικογένεια miRNAs αξιολογήθηκε σε κυτταρικές σειρές ρετινοβλάστωμα. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι ΜΙΟ-M1 και εκφράστηκαν σε τιμές φορές μεταβολή σε σχέση με ΜΙΟ-Μ1 (C). miRNA φορές αλλαγή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 2

-▵▵CT μέθοδο.

Η

In vitro

δοκιμασία λουσιφεράσης που προκαλείται από pCMV /EGP2-

Luc

διανύσματα

Η επιμόλυνση των EGP2-ΤΚ και EGP2-Luc κατασκευές σε EpCAM αρνητική κυτταρική σειρά έδειξαν σημαντική έκφραση της ΤΚ και τα γονίδια λουσιφεράσης (Σχήμα 1 C, E). Μια σημαντική κυτταροτοξικότητα κατά την κατεργασία GCV παρατηρήθηκε σε EpCAM αρνητική κυτταρική σειρά ΜΙΟ-Μ1 κατά EGP2-ΤΚ επιμόλυνση με θεραπεία GCV (Σχήμα. 2Β) μπορεί να οφείλεται σε διαρροή έκφρασης EGP2 υποκινητή σε αρνητικές κυτταρικές γραμμές EpCAM. Μια παρόμοια διαρροή έκφραση του υποκινητή GFAP παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά αστροκύτταρα [34]. Για τη ρύθμιση της μη ειδική έκφραση του διαγονιδίου καθοδηγείται από EGP2 υποκινητή, κλωνοποιήσαμε στόχους ας-7b στην περιοχή 3’UTR του EGP2-Luc κατασκεύασμα (Σχήμα 4Α). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το EGP2-Ιυο, EGP2-Luc-2Τ EGP2-luc-4Τ, EGP2-luc-2C, EGP2-luc-4C κατασκευάσματα πλασμιδίου και η έκφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης αναλύθηκε μετά από 24 ώρες. Μια σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης παρατηρήθηκε με EGP2-Luc-2Τ και EGP2-Luc-4T σε σύγκριση με EGP2-Luc στο MIO-M1 (EpCAM

κη /ας-7b

μέχρι ρυθμιζόμενη) και Nthy -ori 3-1 (EpCAM

+ ve /ας-7b

up-ρύθμιση) κύτταρα (Σχήμα 4Β). Μια περαιτέρω σημαντική μείωση της δραστικότητας λουσιφεράσης στις EGP2-Luc-2Τ σε σύγκριση με EGP2-Luc-4Τ παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΜΙΟ-Μ1. Ωστόσο, το Υ79 και weri-Rb1 (EpCAM

+ ve /let7

κάτω-ρυθμιζόμενες) κύτταρα, δεν παρατηρήσαμε σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της EGP2-Luc-2Τ και EGP2-Luc-4T σε σύγκριση με το ο EGP2-Luc (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα τονίζει την ανάγκη για τη ρύθμιση miRNA της έκφρασης διαγονιδίου μαζί με τον προωθητή ιστού για τη στοχευμένη έκφραση του διαγονιδίου.

στόχος miRNA αλληλουχίες δύο αντίγραφα ή τέσσερα αντίγραφα, όπως αναφέρεται λεπτομερώς στον Πίνακα 1. Το γονίδιο λουσιφεράσης υπό CMV υποκινητή κλωνοποιήθηκε σε κατασκεύασμα EpCAM-ΤΚ αφαιρώντας γονίδιο ΤΚ και την εισαγωγή του γονιδίου λουσιφεράσης. miRNA στόχοι κλωνοποιήθηκαν σε 3 ‘UTR περιοχή του φορέα έκφρασης που περιέχει γονίδιο Gluc υπό EpCAM υποκινητή (Α). Η έκφραση της λουσιφεράσης ποσοτικοποιήθηκε με εκκρίνεται λουσιφεράση Gaussia. Το πλασμίδιο κατασκευάζει EGP2-Luc, EGP2-Luc-2Τ, EGP2-Luc-4Τ, EGP2-Luc-2C, και EGP2-Luc-4C μετήχθησαν σε MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Υ79, weri-Rb1 κυτταρικές γραμμές. Μετά από επώαση για 48 ώρες τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε κύτταρα un-επιμολυσμένα και εκφράσθηκαν σε σχετικές μονάδες φωτός (Β). Η λουσιφεράση επίπεδα εκφράζονται ως ποσοστό σημαίνουν ± Τ.Α (n = 3). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0,001 vs EGP-2-Luc-2T

Η

Κυττάρου ειδική κυτταροτοξικότητα με διπλή επιμόλυνση φορέα ελέγχου με τη θεραπεία με GCV ήταν υψηλότερη από ό, τι ETK μόνος

Αξιολογήσαμε η στοχευμένη κυτταροτοξικότητα που επάγεται με αγωγή με GCV επί EGP2-TK-2Τ και EGP2-ΤΚ-4Τ διαμόλυνση σε σύγκριση με τους μάρτυρες EGP2-ΤΚ, EGP2-ΤΚ-2C και EGP2-ΤΚ-4C σε όλα τα 4 κυτταρικές σειρές. Οι φυσιολογικές κυτταρικές σειρές Nthy-ori 3-1 (Σχήμα 5Α) και ΜΙΟ-Μ1 (Σχήμα 5Β) επιμολυσμένα με EGP2-TK-2Τ και EGP2-ΤΚ-4Τ κατασκευάσματα με θεραπεία GCV είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά χαμηλότερο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με την EGP2- ΤΚ. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές έδειξαν σημαντικές λιγότερο κυτταροτοξικότητα διαμεσολαβείται από EGP2-ΤΚ-2Τ σε σύγκριση με κατασκεύασμα EGP2-ΤΚ-4Τ. Σε κυτταρικές σειρές ρετινοβλαστώματος Υ79 (Σχήμα 5C), weri-Rb-1 (Σχήμα 5D) επιμολυσμένα με EGP2-ΤΚ, EGP2-ΤΚ-2Τ, EGP2-ΤΚ-4Τ, EGP2-ΤΚ-2C και EGP2-ΤΚ-4C κατασκευάσματα, ακολουθούμενη από αγωγή με GCV δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε κυτταρικό θάνατο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ειδική κυτταρική κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από HSV-ΤΚ κατά την κατεργασία με GCV φαρμάκου ρυθμίζεται με στόχους miRNA ας-7b στις κανονικές κυτταρικές γραμμές.

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας με ΜΤΤ αξιολογήθηκε με επιμόλυνση του EGP2-ΤΚ , EGP2-ΤΚ-2Τ, EGP2-ΤΚ-4Τ, EGP2-ΤΚ-2C, EGP2-ΤΚ-4C πλασμιδίων σε κυτταρικές γραμμές, Nthy-ori-3-1 (Α), ΜΙΟ-Μ1 (Β), Υ79 ( C), weri-Rb1 (D). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, ακολουθούμενη από επεξεργασία με GCV σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 10, 50, 100 μΜ) για 24 ώρες, οι μετρήσεις μετρήθηκαν στα 570 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε μη επιμολυσμένα κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζεται σαν ποσοστό σημαίνουν ± Τ.Α (n = 3). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0,001 έναντι του ελέγχου

Η

EpCAM υποκινητή και αλληλουχίας στόχου ας-7b μεσολαβεί η έκφραση των αποπτωτικών δεικτών σε ρετινοβλάστωμα κύτταρα

Για τον έλεγχο της αναφερόμενη διαρρέοντος έκφραση του γονιδίου ΤΚ στις μη στοχευμένες φυσιολογικά κύτταρα (Εικόνα 1 & amp? 2), επιμολύναμε EGP2-ΤΚ, EGP2-ΤΚ-2Τ, EGP2-ΤΚ-2C κατασκευάσματα στα ακόλουθα κυτταρικές γραμμές : Ν-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Υ79 και weri-Rb-1. Δεδομένου ότι, παρατηρήσαμε EGP2-ΤΚ-2Τ έδειξαν σημαντική επίδραση στον έλεγχο της διαγονιδιακής έκφρασης, επιλέγουμε μόνο EGP2-ΤΚ-2Τ για την ανάλυση των δεικτών απόπτωσης μετά τη θεραπεία με GCV. Το κατασκεύασμα EGP2-ΤΚ εντόνως εκφρασμένο σε EpCAM

+ ve κυτταρικές σειρές, Nthy-ori 3-1 (Σχήμα 6Α, λωρίδα 1), Υ79 (Σχήμα 6Α, λωρίδα 3), weri-Rb-1 (Σχήμα 6Α, λωρίδα 4), σε σύγκριση με το EpCAM

κη MIO-M1cell γραμμή (Σχήμα 6Α, λωρίδα 2). Η επιμόλυνση κατασκευάσματος EGP2-ΤΚ-2Τ περιορίζεται η έκφραση ΤΚ μόνο σε κυτταρικές σειρές ρετινοβλαστώματος (Σχήμα 6Β, γραμμή 3, 4) και όχι σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές όπως ΜΙΟ-M1 και Nthy-ori 3-1 ακόμη και με την παρουσία του πρωτεΐνη EpCAM. Οι EGP2-TK-2Τ επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές ρετινοβλαστώματος σε επεξεργασία με GCV φάρμακο έδειξε το αποπτωτικό δείκτη, ενεργοποιείται Caspase3 και PARP-1 έκφραση νεκρωτική δείκτη (Σχήμα 6C, λωρίδες 3, 4), αλλά όχι σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 6C, λωρίδες 1, 2). Για την επικύρωση περαιτέρω το αποπτωτικό έκφραση δεικτών, εκτελέσαμε πειράματα immunofluroscence όπου παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα, το οποίο υποστηρίζει την έκφραση αποπτωτικών δείκτη στο κηλίδα western (Σχήμα S1). Αντί της PARP χρησιμοποιήσαμε Bcl-2, η οποία είναι ένα αντι αποπτωτικό δείκτη.

ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για την παρουσία του ΤΚ πρωτεΐνης, EGP2-ΤΚ επιμολύνθηκε σε Nthy-ori-3-1, ΜΙΟ-M1 κυτταρικές σειρές weri-Rb-1, Υ79 και (Α).