Αφηρημένο

ιστόνης δεακετυλάσης αναστολείς (HDAC) συλλάβει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και να προκαλέσουν απόπτωση με χαμηλή τοξικότητα αποτελώντας έτσι μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για τον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την αντικαρκινική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα του νέου κυκλικού αμιδίου που φέρουν υδροξαμικό οξύ με βάση αναστολείς HDAC SL142 και SL325. Σε Α549 και Η441 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα τόσο SL142 και SL325 επάγεται περισσότερο αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου από το υδροξαμικό οξύ με βάση αναστολέα HDAC σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA). Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού με χρήση ρετινοειδών φάρμακα ATRA ή

9-cis RA

μαζί με SL142 ή SL325 επάγεται σημαντικά περισσότερο απόπτωση και κατέστειλε το σχηματισμό αποικιών από την απλή χρήση είτε. Η έκφραση των υποδοχέων του ρετινοϊκού οξέος ΚΑΚα, ΚΑΚβ, ΚΧΚα και ΚΧΚβ παρέμειναν αμετάβλητες με τη θεραπεία. Ωστόσο, ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης (pGL4. ΣΠΑΝΙΑ 7x) που περιέχει επτά διαδοχικές επαναλήψεις του υπεύθυνου ρετινοϊκού οξέος στοιχείο (RARE) δημιουργείται σημαντική μεταγραφική δραστηριότητα μετά την θεραπεία συνδυασμού της ρετινοϊκό οξύ και SL142 ή SL325 με Η441 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, απόπτωση προάγουν την έκφραση Bax και δραστικότητα κασπάσης-3 αυξήθηκε μετά τη θεραπεία συνδυασμού. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία συνδυασμού SL142 ή SL325 με ρετινοϊκό οξύ εξασκεί σημαντική κατά του όγκου δραστικότητα και είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική υποψήφιος για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Han S, Fukazawa Τ, Yamatsuji Τ, Matsuoka J, Miyachi Η, Maeda Υ, et al. (2010) Αντι-όγκου Επίδραση στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα από μια συνδυασμένη θεραπεία Αναστολείς Μυθιστόρημα δεακετυλάσης ιστόνης: SL142 ή SL325 και ρετινοϊκό οξέα. PLoS ONE 5 (11): e13834. doi: 10.1371 /journal.pone.0013834

Επιμέλεια: Rory Edward Morty, Πανεπιστήμιο του Giessen πνεύμονα Κέντρο, Γερμανία

Ελήφθη: 10 Ιούν, 2010? Αποδεκτές: 11 Οκτ, 2010? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμ 2010

Copyright: © 2010 Han et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης : Το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού, Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ιστόνης δεακετυλάσης (HDAC) και ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (ΗΑΤ) εμπλέκονται στην από κοινού ρύθμιση της αναδιαμόρφωσης χρωματίνης και τη λειτουργική ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής [1]. HDACs ρυθμίζουν διάφορα είδη βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και απόπτωσης [2]. Υπάρχουν αρκετές αναφορές ότι αλλαγμένη καπέλο ή δραστικότητα HDAC συνδέεται με διάφορους καρκίνους [3], [4], [5], [6]. Ένας αριθμός αναστολέων μικρού μορίου HDAC έχουν αναπτυχθεί ως αντι-καρκινικοί παράγοντες. Στην πραγματικότητα, οι αναστολείς HDAC δείχθηκε ότι επάγουν διακοπή κύκλου κυττάρου, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση σε μια ποικιλία των κακοήθων κυττάρων. HDAC αναστολείς αυξάνουν ακετυλίωση των ιστονών και παραγόντων μεταγραφής, η οποία μπορεί να αντιστρέψει γονιδιακής σίγησης διευκολύνοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου [7]. Οι επιδράσεις αυτές επάγονται εν μέρει από την επιλεκτική μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση, όπως η επαγωγή της έκφρασης Η p21WΑF [8]. Ωστόσο, δεν είναι όλα τα γονίδια είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία με αναστολείς HDAC, και ο λόγος της ανοδικής ρύθμισης προς τα κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια έχει βρεθεί να είναι κοντά στο 1:01 [9].

καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου σε παγκόσμιο επίπεδο [7]. Οι δύο κύριες μορφές του καρκίνου του πνεύμονα είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC). τα αποτελέσματα της θεραπείας για προχωρημένο NSCLC χρήση χημειοθεραπευτικών παραγόντων ήταν απογοητευτικές. Σαφώς, περαιτέρω έρευνα απαιτείται επειγόντως για τη θεραπεία του προχωρημένου NSCLC. Νέες θεραπείες με νέους μηχανισμούς δράσης, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων που στοχεύουν την αγγειογένεση και την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης με ρετινοϊκό οξέα έχουν διερευνηθεί [10], [11], [12], [13]. Χωρίς συνδετήρα, ρετινοϊκό υποδοχείς οξέα δρουν ως καταστολείς μετεγγραφής, λόγω της σύνδεσης του συμπλοκών συνκαταστολέα που περιέχουν αποακετυλάσες ιστόνης (HDAC). Η σύνδεση του συνδέτη απελευθερώνει αυτά τα συν-καταστολείς και στρατολογεί σύμπλοκα συν-ενεργοποιητή, το οποίο θα μπορούσε να δημιουργήσει δραστικότητα ιστόνης Ακετυλάση [13], [14]. Έχει αναφερθεί ότι οι συνδυασμοί του all-trans ρετινοϊκό οξύ και αναστολείς HDAC έχουν επιπτώσεις κατά του όγκου [15], [16]. Ο συνδυασμός των all-

trans

ρετινοϊκό οξύ (ATRA) και ορισμένοι αναστολείς HDAC έδειξε μια επίδραση κατά του όγκου σε νευροβλάστωμα [15], [16]. Η θεραπεία συνδυασμού ρετινοϊκού οξέων με αναστολείς HDAC μπορούν να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα ενώ μειώνει τις παρενέργειες Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Επομένως, έχουμε αναλύσει την επίδραση της με το συνδυασμό των νέων, κατηγορίας επιλεκτική κυκλικό αμίδιο που φέρουν οξύ που βασίζεται αναστολείς HDAC SL142 υδροξαμικό ή SL325 [17] σε συνδυασμό με ρετινοϊκό οξύ για τη δοκιμή της αποτελεσματικότητάς τους για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

SL-142 ((Ε) -3- (2- (4-πυριδιν-4-υλο) βενζυλο-1-οξοϊσοϊνδολιν-6-υλ) -Ν- hydroxyacrylamide) και SL-325 ((Ε) -3- (2- (4-κινολιν-3-υλ) βενζυλο-1-οξοϊσοϊνδολιν-6-υλ) -Ν-υδροξυ-ακρυλαμίδιο) είναι νέες ισοϊνδολινόνη-υδροξαμικού ιστόνης βασίζονται οξύ αναστολείς αποακετυλάσης (HDAC) που προέρχονται από δομικές μας μελέτες ανάπτυξης του προτύπου θαλιδομίδης σε πολλαπλά φάρμακα για τη δημιουργία νέων φαρμάκων δομικά (Εικ. 1Α) [18], [19].

A. Χημική δομή του SAHA, SL142 και SL325. B. Ανίχνευση Η4 ακετυλίωση με ανοσοκηλίδα 24 ώρες μετά SAHA, SL142 ή θεραπεία SL325 (0.5 ή 2.0 μΜ) σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. β-ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος. Γ Επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων που προκαλείται από το SAHA, SL142 και SL325. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο 24 ώρες πριν από την αγωγή με SAHA, SL142 ή SL325 (0,1 έως 10 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε στις 96 ώρες μετά την αγωγή με τον προσδιορισμό WST1 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. **, Σημαντική διαφορά από την κυτταρική βιωσιμότητα θεραπεία με 0,1 μΜ SAHA, SL142 και SL325 (p & lt? 0,01).

Η

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνος του πνεύμονα Α549 κύτταρα, Η441 και Η1299 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε F12 (κύτταρα Α549) του Ham, RPMI 1640 (Η1299 κύτταρα) με τροποποιημένο μέσο Eagle υψηλής γλυκόζης Dulbecco συμπληρωμένο με 10% θερμο -inactivated εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 10% CO

2 στους 37 ° C. Τα προϊόντα λύσης του ενήλικα ανθρώπου πνευμονικού ιστού ελήφθησαν από Novas Biologicals (Littleton, CO).

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [1% Triton Χ-100, 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 137 mM NaCl, 10% γλυκερόλη (ν /ν), 2 mM EDTA, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο (ν /ν) 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο]. Τα κυτταρολύματα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση (10 λεπτά στα 15.000 χ g στους 4 ° C) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης DC (BioRad, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα SDS-PAGE. Η γέλη ηλεκτροφορητικά μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη μεταφοράς Hybond PVDF (Amersham, Arlington Heights, IL). Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα σύμφωνα με την SuperSignal

R West Pico χημειοφωταύγειας πρωτόκολλο (Pierce, Rockford, IL) για την ανίχνευση δεσμευτικών δευτερογενές αντίσωμα. Αντίσωμα ειδικό για το αντίσωμα β-ακτίνης ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) και το αντίσωμα ειδικό για την ανθρώπινη ΡΑΡα και ΡΧΡα λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντι ΡΑΡβ, ΚΧΚβ και ιστόνης Η4 ακετύλιο αντίσωμα ελήφθησαν από Abcam (Cambridge, UK). Αντίσωμα ειδικό για την ανθρώπινη Bax, ρ21 και ρ27 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας Δευτερεύουσα ελήφθησαν από Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, ΡΑ).

Αναστολή και μέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης

Caspase-3 δραστικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ApoAlert κασπάσης κιτ δοκιμασίας ελήφθη χρωματομετρική από Clontech (Mountain View, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η πλάσια αύξηση στην δραστικότητα προσδιορίστηκε με σύγκριση των επιπέδων της δραστηριότητας κασπάσης σε κατεργασμένα κύτταρα με αυτές στα κύτταρα ελέγχου (DMSO). Για την αναστολή της κασπάσης, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΜ-ίτηκ λαμβάνεται από BioVision (Mountain View, CA).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για απόπτωση

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε μια πυκνότητα 0,5-1,0 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο 1 ημέρα πριν τις θεραπείες. Μετά από 72 ή 96 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 0,2% Triton Χ-100 και 1 mg /ml RNase για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο στα 50 μg /ml για τον προσδιορισμό υπο-G

0 /G

1 DNA περιεχόμενο χρησιμοποιώντας ένα ΡΑΟδοαη. Ζεύγη, τα κυτταρικά θραύσματα και αντικείμενα καθήλωση περιορίστηκαν, και υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Cell Quest Ver. 3.3 λογισμικό.

κλωνογονιδιακή επιβίωση

Η441 κύτταρα πρώτα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων 24 ώρες πριν από τη θεραπεία. Μετά τη θεραπεία με αναστολείς HDAC (0,5 μΜ) και /ή ρετινοϊκό οξύ (2,5 μΜ) για 36 ώρες, τα κύτταρα απελευθερώνονται από το πιάτο με επώαση με θρυψίνη /ΕϋΤΑ, μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα σε τρυβλία των 100 mm για 16 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα. Τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες (ομάδες των συγκεντρωτικών κυττάρων αριθμεί τουλάχιστον 50) μετά μετρήθηκαν. Ο μέσος αριθμός του PBS αγωγή κυττάρων αυθαίρετα οριστεί σε 100%, και όλοι οι άλλοι αριθμοί ομαλοποιήθηκαν αναλόγως.

πλασμίδια και παροδικές δοκιμασίες δημοσιογράφος επιμόλυνσης

Το δίκλωνο DNA που περιέχει επτά επαναλήψεις του RARE αλληλουχία [20], [21] συντέθηκε και συνδέθηκε στις θέσεις NheI και HindIII του κατασκευάσματος ανταποκριτή λουσιφεράσης pGL.4.24 (pGL4 RARE 7x?. Promega, Madison, WI). Το κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης pGL4 Βαχ δημιουργήθηκε με υποκλωνοποίηση την περιοχή προαγωγού του Βαχ -1570 /+ 68 από γενωμικό DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές PCR: 5′-tttctcgag

XhoIgaagtccaagagatcttcctgacaccctagtctga και 5′- tttaagctt

HindIII caccgccgctcccgccgccgcctctcgccgggtcc. Το PCR-δημιουργημένο θραύσμα χωνεύθηκε με Xhol και Hindlll και υποκλωνοποιήθηκε άμεσα στο pGL.4.24 – λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή (Promega). Όλες οι επιμολύνσεις διεξήχθησαν σε πλάκες έξι φρεατίων. κύτταρα πνεύμονος Η441 σπάρθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση σε πυκνότητα 0,3 × 10

6 /φρεάτιο. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. κύτταρα πνεύμονος Η441 σπάρθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση σε πυκνότητα 0,3 χ 106 /φρεάτιο. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 4 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς HDAC ή /και το ρετινοϊκό οξύ. 24 ώρες μετά την HDAC αναστολείς και /ή θεραπεία ρετινοϊκού οξέα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν. Τα αποτελέσματα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος παρουσιάζονται ως πλάσια επαγωγή σχετικές μονάδες φωτός ομαλοποιήθηκε με β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα σε σχέση με εκείνη που παρατηρείται για τους φορείς ελέγχου. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από το μέσο όρο των εις τριπλούν δειγμάτων σε ένα πείραμα.

Στατιστική ανάλυση

στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ μέσων και διαμέσους του μελέτησαν ομάδες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας έλεγχος τ ή η μη παραμετρική Mann-Whitney U-test. Μια ανάλυση της διακύμανσης δοκιμής (ANOVA), ανάλογα με την περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει στατιστική σημασία για πολλαπλές συγκρίσεις. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p & lt? 0,05 (*, #), σ & lt?. 0.01 (**)

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις της SL142 και SL325 για Η4 ακετυλίωση

Για να αναλύουν την δραστηριότητα απακετυλάσης ιστόνης της SL142 και SL325, διεξήχθη ανάλυση ανοσοκηλίδος. Η επώαση των κυττάρων Η441 επί 24 ώρες με SAHA, SL142 και SL325 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην ιστόνης Η4 ακετυλίωση. Τόσο SL142 και SL325 αποδειχθεί ισχυρότερη Η4 ακετυλίωση από SAHA σε συγκεντρώσεις 0,5 μΜ και 2,0 μΜ. SL142 προκάλεσε πολύ μεγαλύτερη αύξηση της ιστόνης Η4 ακετυλίωση από SL325 σε συγκέντρωση 2,0 μΜ (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο SL142 και SL325 αύξηση της ιστόνης Η4 ακετυλίωση περισσότερο από SAHA [22] σε Η441 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

SL142 και SL325 σημαντικά κατέστειλε βιωσιμότητα των κυττάρων σε Η441 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

προκειμένου να αναλυθεί η επίδραση κατά του όγκου των αναστολέων HDAC, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη δοκιμασία MTS μετά από θεραπεία με SAHA, SL142 και SL325 σε Η441, Α549 και Η1299 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας αποκάλυψε ότι όλοι οι αναστολείς HDAC (SAHA, SL142 και SL325) κατέστειλε έντονα κυτταρική βιωσιμότητα του Η441, Α549 και Η1299 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σε συγκέντρωση 10 μΜ. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (0,5-5,0 μΜ), και οι δύο SL142 και SL325 κατέστειλε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των Η441 και Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SL142 και SL325 είναι πιο αποτελεσματικά στην καταστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας του Η441 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα από SAHA και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις.

SL142 και SL325 αυξήθηκε σημαντικά κασπάσης-3 δραστικότητα επαγόμενη απόπτωση σε Η441 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

Αναλύσαμε δράση της κασπάσης-3 και την απόπτωση σε Η441, Α549 και ο καρκίνος του πνεύμονα Η1299 κυττάρων μετά από θεραπεία με αναστολείς HDAC. SAHA, SL142 και SL325 αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης-3 σε όλους τους τύπους κυττάρων. Σημαντικά, SL142 και SL325 επάγεται μεγαλύτερη δραστικότητα κασπάσης-3 (2.25- 2.48 έως φορές) από SAHA (1,42- έως 1.66 φορές) σε Η441 και Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Εικ. 2Α). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την απόπτωση που επάγεται από τους αναστολείς HDAC σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, SL142 και SL325 που προκαλείται περισσότερες υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο του DNA (51,36 με 55,81% και 35,07 έως 43,80% αντίστοιχα) από ό, τι SAHA (10,47 – 12,12%) σε Η441 και Α549 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μετά από μια θεραπεία 72 ώρα. Ωστόσο, αυτοί οι αναστολείς HDAC που επάγεται λιγότερο απόπτωση σε Η1299 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SL142 και SL325 αυξήσει πιο αποτελεσματικά δράση της κασπάσης-3 και θα οδηγήσει σε απόπτωση σε Η441 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα από SAHA.

Α. Ανάλυση της δραστικότητας κασπάσης-3 σε Α549, Η441 και Η1299 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα μετά SAHA, SL142 και SL325 θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA, SL142 ή SL325 σε συγκέντρωση 2,5 μΜ για 36 ώρες. Τριπλούν πειράματα διεξήχθησαν? δεδομένων αντιπροσωπεύουν την μέση αύξηση φορές ± Τ.Α. Σημαντική διαφορά από κύτταρα επεξεργασμένα με PBS και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς HDAC υποδεικνύεται δείχθηκε (* ρ & lt? 0,05, ** & lt? 0,01). B. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης που επάγεται από SAHA, SL142 ή SL325. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με SAHA, SL142 ή SL325 σε συγκέντρωση 2,5 μΜ για 72 ώρες και υπο-G

0 /G

περιεχόμενο DNA 1 μετρήθηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

ATRA ή

9-cis RA

ενισχυμένη κασπάσης-3 δραστηριότητα που προκαλείται από SL142 ή SL325 και αυξημένη απόπτωση σε Η441 κύτταρα πνευμονικού αδενοκαρκινώματος

Για να αναλύσουμε το αποτέλεσμα συνδυασμού ρετινοϊκό οξύ με SL142 ή SL325, εξετάσαμε τη δράση της κασπάσης-3 και υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο του DNA χρησιμοποιώντας βαφή ιωδιούχου προπιδίου με κυτταρομετρία ροής και τη δράση της κασπάσης-3 μετά από εφάπαξ ή συνδυασμού θεραπείας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, αμφότερα ATRA και

9-cis RA

επαγόμενη δραστικότητα κασπάσης-3, ενώ μία μόνο θεραπεία του SAHA, SL142 ή SL325 σημαντικά αυξημένη κασπάσης-3 δραστικότητα (1.38- 2.13 έως φορές) σε Η441 κύτταρα πνευμονικού αδενοκαρκινώματος . Είναι σημαντικό ότι, το ρετινοϊκό οξύ ενισχυμένη δραστικότητα κασπάσης-3 που προκαλείται από το SAHA, SL142 ή SL325 και ο συνδυασμός του ATRA ή

9-cis RA

, και SL142 ή SL325 αυξημένη κασπάσης-3 δραστικότητα (2.47- 2.91 έως φορές) περισσότερο από ATRA ή

9-cis RA

και SAHA μόνο (1.90- 2.04 έως φορές). 100 μΜ-ίτηκ ανέστειλε αποτελεσματικά τη δράση της κασπάσης-3 σε όλα τα πειράματα. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ποσότητα της απόπτωσης που επάγεται από τους αναστολείς HDAC σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA αυξήθηκε σε 5,98% έως 8,58% μετά από μία μόνο θεραπεία του ρετινοϊκού οξέων ή αναστολείς HDAC. Ωστόσο, ο συνδυασμός της θεραπείας του SAHA και ATRA ή

9-cis RA

αυξημένη υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο του DNA σε 22,37% και 23,36% αντίστοιχα. Επιπλέον, SL142 και ATRA ή

9-cis RA

αυξημένη υπο-G

0 /G

1 DNA περιεχόμενο στο 32.82% και 56.92% και SL325 και ATRA ή

9-cis

RA αύξησε την περιεκτικότητα σε 26,18% και 49,33%, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Η υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA που επάγεται από την ενιαία ή θεραπείας συνδυασμού σε φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα ινοβλαστών (NHLF) ήταν μικρότερο από Η441 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μορφολογική ανάλυση έδειξε ότι περισσότερο κυτταρικό θάνατο προκλήθηκε μετά από τη θεραπεία συνδυασμού SL142 και ATRA ή

9-cis RA

από εκείνα μιας χρήσης (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATRA ή

9-cis

αύξηση RA δράση της κασπάσης-3 και την απόπτωση που προκαλείται από το SAHA, SL142 και SL325.

Α. Ανάλυση της κασπάσης-3 δραστικότητα που επάγεται από ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) και /ή SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA, SL142 ή SL325 σε συγκέντρωση 2,5 μΜ για 36 ώρες. Μετά από 36 ώρες επεξεργασίας, υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA μετρήθηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τριπλούν πειράματα διεξήχθησαν? δεδομένων αντιπροσωπεύουν την μέση αύξηση φορές ± Τ.Α. *, Σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου (κύτταρα χωρίς αγωγές) (ρ & lt? 0,05). B. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που προκαλείται από ATRA απόπτωση ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) και /ή SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Μετά από 96 ώρες επεξεργασίας, υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA μετρήθηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Γ Μορφολογική ανάλυση των κυττάρων Η441 μετά ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) και /ή SL142 (0,5 μΜ) θεραπεία.

Η

Επιδράσεις της θεραπείας συνδυασμού του ρετινοϊκού οξέων και SL142 ή SL325 για καταστολή του σχηματισμού αποικίας του Η441 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

για να αναλυθεί η αντικαρκινική δράση της θεραπείας συνδυασμού ATRA ή

9-cis RA

και SL142 ή SL325, ένα κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και 4Β, ATRA ή

9-cis RA

ασθενώς καταστέλλουν τον σχηματισμό αποικίας του καρκίνου του πνεύμονα Η441 κύτταρα (69,1 – 78,0%), ενώ καταστέλλουν SAHA, SL142 ή SL325 εντονότερα σχηματισμό αποικίας (40,2 έως 69,4%). Σημαντικά, ATRA ή

9-cis RA

ενίσχυσε την αντικαρκινική δράση του SAHA, SL142 ή SL325 ειδικά όταν συνδυάζεται με SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-cis RA

δραστικά κατέστειλαν σχηματισμού αποικίας (2,52 έως 13,22%). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο συνδυασμός θεραπεία SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-cis RA

συνεργικά αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών των Η441 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Α. σχηματισμός αποικίας των κυττάρων Η441 που έλαβαν θεραπεία με ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) ή /και SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) για 36 ώρες. Η δοκιμασία άρχισε με επίστρωση 2 × 10

3 κύτταρα ανά δίσκους 100-mm. Μετά από 16 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν φαίνεται. αριθμοί αποικιών Β Mean προήλθαν από ποσοτικοποίηση του τριπλούν πιάτα για κάθε επεξεργασία και το ποσοστό-ειδική κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με το σχηματισμό αποικιών στην ομάδα DMSO (έλεγχος) υπολογίστηκε. *, P & lt?. 0,05 έναντι μόνο μέσα

Η

Η θεραπεία συνδυασμού της SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-cis RA

αυξάνει συνεργικά την μεταγραφική δραστηριότητα του σπάνια, αλλά δεν μεταβάλλει την έκφραση των RAR και RXR

Για να αναλυθεί η μεταγραφική δραστηριότητα της αποκριτικού στοιχείου ρετινοϊκού οξέος (RARE) μετά την επεξεργασία του SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-cis RA

, δημιουργήσαμε ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης οδηγείται από επτά διαδοχικές επαναλήψεις του σπάνιου στοιχείου: pGL4. ΣΠΑΝΙΑ 7x [20], [21]. pGL4. RARE 7x δημιουργείται σημαντική δραστηριότητα προαγωγέα (5.26- να 17,11 φορές) μετά τη χορήγηση του 2,5 μΜ ATRA ή

9-cis RA

θεραπείες σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, το κατασκεύασμα έδειξε μικρή δραστικότητα μεταγραφικής μετά από 0.5 μΜ SAHA, SL142 ή θεραπεία SL325 στα κύτταρα (1.26- 1.43- να φορές). Σημαντικά, SL142 και SL325 ενισχυμένης περισσότερο σημαντικά την δραστικότητα προωθητή των σπάνιων μετά τη θεραπεία του ATRA ή

9-cis RA

. (29.94- 37.42 έως φορές, 55.58- 60.14 έως φορές αντιστοίχως) σε σύγκριση με SAHA (14.99- 24.65 έως φορές) (Εικ. 5Α). Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, ανάλυση ανοσο blot έδειξε ότι μικρή αλλαγή παρατηρήθηκε στην έκφραση της ΒΑΒα RARβ, RXRα και ΚΧΚβ έκφραση μετά την εφάπαξ ή θεραπείας συνδυασμού σε Η441 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Α. δοκιμασίες δημοσιογράφος παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα Η441 με pGL4. ή pGL4.RARE 7x (2 μg), συν pCMV. β-γαλακτοσιδάση (2 μg) μετά από ρετινοϊκό οξύ (2,5 μΜ) και /ή SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) ρετινοϊκό θεραπεία οξέων. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια επαγωγή σχετικές μονάδες φωτός ομαλοποιήθηκε με β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα σε σχέση με εκείνη που παρατηρείται για κατασκευάσματα ελέγχου.

#, σημαντική διαφορά από τη δράση του υποκινητή που παράγεται από pGL4.RARE 7x μετά ATRA και SAHA θεραπεία (p & lt? 0,05). *, Σημαντική διαφορά από την δραστηριότητα προαγωγέα που παράγεται από pGL4.RARE 7x μετά

9-cis RA

και SAHA κατεργασμένων κυττάρων (ρ & lt? 0,05). B. ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση του ΚΑΚα, ΚΑΚβ, ΚΧΚα και ΚΧΚβ εκφράσεις μετά ρετινοϊκό οξύ ή /και SL142 ή θεραπεία SL325 σε καρκινικά κύτταρα Η441 πνεύμονα. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την θεραπεία με ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) ή /και SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ). β-ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος.

Η

Η συνδυασμένη θεραπεία με SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-cis RA

αυξάνει την έκφραση Bax σε Η441 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων

προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός της επίδρασης κατά του όγκου που προκαλείται από τη θεραπεία συνδυασμού ATRA ή

9-cis RA

και SL142 ή SL325, αναλύσαμε την έκφραση της ρ21, ρ27 και Bax σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, έκφραση ρ21 αυξήθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία SL142 (Σχ. 6Α, λωρίδα 7-9). Μετά από 9-cisRA, θεραπεία SAHA ή θεραπεία συνδυασμού με SAHA και ρετινοειδή αυξημένη έκφραση p27 (Εικ. 6Α, λωρίδα 1-6), όπως αναφέρθηκε από τους άλλους [16], ωστόσο, καμία σημαντική μεταβολή παρατηρήθηκε στην έκφραση p27 μετά SL142 ή SL325 θεραπεία ή η θεραπεία συνδυασμού της SL142 ή SL325 και ρετινοειδή (Εικ. 6Α, λωρίδα 7-12). Σημαντικά, η έκφραση Bax αυξήθηκε 24 ώρες μετά SL142 ή θεραπεία SL325 (Εικ. 6Α, λωρίδα 7, 10) και ATRA ή

9-cis RA

ενίσχυσε την έκφραση (λωρίδα 8, 9, 11,12) σε Η441 κύτταρα. Η θεραπεία συνδυασμού του

9-cis RA

και SL325 αύξησε επίσης την έκφραση Bax (λωρίδα 6). Στη συνέχεια, αναλύσαμε δραστηριότητα υποκινητή Βαχ μετά τη θεραπεία συνδυασμού χρησιμοποιώντας το κατασκεύασμα λουσιφεράσης που περιέχει την περιοχή υποκινητή Bax: pGL4. Bax. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η ενεργοποίηση του υποκινητή Bax παρέμεινε (3.58- 6.07 έως φορές) μετά από μία μόνο θεραπεία των αναστολέων HDAC ή ρετινοϊκό οξύ σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Σημαντικά, SAHA ενισχυμένη δραστικότητα προαγωγού Βαχ επάγεται από ATRA ή

9-cis RA

(6.27- 8.74 έως φορές) και SL142 και SL325 ενισχυθεί ακόμη περισσότερο (10.14- 18.44 έως φορές). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία συνδυασμού SL142 ή SL325 και ATRA ή

9-κις-RA

μπορεί να ενισχύσει τη μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού Βαχ και επάγει την έκφραση Bax σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα.

Α . ανάλυση ανοσοστυπώματος του ΚΑΚα, ΚΑΚβ, ΚΧΚα και ΚΧΚβ εκφράσεις μετά ρετινοϊκό οξύ ή /και SL142 ή θεραπεία SL325 σε καρκινικά κύτταρα Η441 πνεύμονα. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την θεραπεία με ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) ή /και SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ). β-ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος. Β Παροδική επιμόλυνση δημοσιογράφος σε κύτταρα Η441 με pGL4. ή pGL4.Bax (2 μg), συν pCMV. β-γαλακτοσιδάση (2 μg) μετά από ρετινοϊκό οξύ (2,5 μΜ) και /ή SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) ρετινοϊκό θεραπεία οξέων. Τα αποτελέσματα υποδεικνύονται ως Σχ. 6Α. *, Σημαντική διαφορά από την δραστηριότητα προαγωγέα που παράγεται από pGL4.Bax μετά ATRA ή

9-cis RA

(2,5 μΜ) ή SAHA, SL142 ή SL325 (0,5 μΜ) (ρ & lt? 0,05).

Συζήτηση

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους παγκοσμίως [23]. Θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα με χημειοθεραπεία έχει παρατεταμένη επιβίωση, ωστόσο, κλινικά οφέλη με αυτούς τους παράγοντες είναι περιορισμένη σε ασθενείς σε άλλα καλή υγεία και εκείνων στα πρώτα της στάδια. Αλλά όλοι οι χημειοθεραπείες έχουν επίσης ανεπιθύμητες παρενέργειες για τον ασθενή [24]. Πρόσφατα, μικρά μόρια έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα σε ασθενείς που φέρουν τέτοια μεταλλαγμένα γονίδια όπως τα γονίδια σύντηξης EGFR και EML4-ALK. Αυτά τα μικρά μόρια έχουν σχεδιαστεί να στοχεύουν τα πεδία κινάσης των μεταλλαγμένων γονιδίων και αναστέλλουν τη δράση τους [25], [26]. Ωστόσο, τέτοιες μικρό μόριο θεραπεία δεν είναι κατάλληλη για τα περισσότερα γεγονότα καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου που προκαλείται από ένα μεταλλαγμένο γονίδιο KRAS [27]. Σαφώς, η περαιτέρω διερεύνηση των νεότερων, ανεκτή παράγοντες με νέους μηχανισμούς δράσης είναι επειγόντως αναγκαία, προκειμένου να βελτιωθεί η διάρκεια και η ποιότητα της ζωής γι ‘αυτό το μεγάλο πληθυσμό ασθενών.

Οι μη εκλεκτικοί αναστολείς της ανθρώπινης αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) είναι αναφέρθηκε ότι έχει αντικαρκινική δραστικότητα

in vivo

, και αρκετές από αυτές είναι κάτω από κλινικές μελέτες [9], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]. Το πρώτο από αυτά, SAHA έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του δερματικού λεμφώματος Τ-κυττάρων και έχει επίσης αναφερθεί ότι SAHA έχει μια επίδραση κατά του όγκου έναντι του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων [37], [38]. Προηγουμένως, έχουμε αναπτύξει νέες αμιδίου που φέρουν παράγωγα του υδροξαμικού οξέος ως αναστολείς HDAC κατηγορίας επιλεκτικών ονομαζόμενα SL142 και SL325 (Εικ. 1Α) και ανέφερε ότι αυτά τα μικρά μόρια εμφανίζονται πιο σημαντική HDAC1, HDAC4 και HDAC6 ανασταλτική δραστικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP από SAHA [17]. Οι μέγιστες συγκεντρώσεις αναστολής μισό (IC50s) του SL-142 κατά HDAC1, HDAC4 και HDAC6 είναι 69 ± 5 nM, 53 ± 2 nM και 260 ± 70 nM. Οι IC50s του SL-325 κατά HDAC1, HDAC4 και HDAC6 είναι 120 ± 4 nM, 65 ± 4 nM και 310 ± 50 nM. Σε αντίθεση οι IC50s της κλινικά χρησιμοποιείται αναστολέα HDAC σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ ZolinzaTM κατά HDAC1 και HDAC4 είναι πολύ υψηλότερα στα 290 ± 50 ηΜ, 340 ± 30 ηΜ, και συγκρίσιμη με HDAC6 στα 200 ± 10 ηΜ. Ως εκ τούτου, οι ενώσεις αυτές εμφανίζουν περισσότερο ισχυρή ανασταλτική δραστικότητα επί HDAC1 και HDAC4 και συγκρίσιμες ανασταλτική δράση HDAC6 σε σύγκριση με το κλινικά χρησιμοποιείται αναστολέα HDAC σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (ZolinzaTM) [18], [19].

Στην παρούσα μελέτη , SL142 και SL325 έδειξαν περισσότερο σημαντική ανασταλτική δραστικότητα HADC (δραστικότητα ΗΑΤ) σε Η441 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Εικ. 1Β) και κατέστειλε βιωσιμότητα όγκου σε Η441 και τον καρκίνο πνεύμονα Α549 κύτταρα από SAHA (Εικ. 1C), δείχνοντας ότι SL142 και SL325 είναι πιο αποτελεσματικοί αναστολείς HDAC από το SAHA. Στην προηγούμενη έκθεσή μας, SL142 και SL325 έδειξαν σημαντική δραστικότητα ρ21 υποκινητή και κυτταροστατική δραστικότητα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP [17]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, αυτά τα μικρά μόρια που επάγεται επίσης σημαντική δραστικότητα κασπάσης-3 και subG

0 /G

1 πληθυσμού Η441 και Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SL142 και SL325 θα μπορούσε να επάγει απόπτωση στον καρκίνο του πνεύμονα.

Το ρετινοϊκό οξύ ρυθμίζουν την κανονική, προκακοήθων και κακοήθων κυττάρων φαινοτύπων από τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που προκαλούνται μέσω σύνδεσης προς δύο κατηγορίες υποδοχέων πυρηνικής ορμόνης, η RARs και RXRs οι. ATRA δεσμεύεται RAR με υψηλή συγγένεια αλλά δεν δεσμεύεται με RXR, ενώ

9-cis RA

είναι ένας συνδέτης που δεσμεύεται και μετενεργοποιεί αμφότερα RARs και RXRs [39], [40]. Ρετινοϊκό οξέα ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση σε επιθήλιο των αεραγωγών και την καταστολή της καρκινογένεσης για τον καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνο κεφαλής και λαιμού [41], [42], [43]. Σημαντικά, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία συνδυασμού των αναστολέων HDAC και το ρετινοϊκό οξύ αυξημένη δραστικότητα κατά του όγκου σε κακοήθη κύτταρα [44], [45], [46], [47]. Επιπλέον, Epping et al. ανέφεραν ότι η οδός υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος (RAR) στοχεύεται με αναστολέα HDAC και ότι η αντικαρκινική δράση του αναστολέα HDAC σε νεοπλασματικά κύτταρα είναι, εν μέρει, μέσω της αποκαταστολή του ρετινοϊκού οξέος [48]. Στη μελέτη μας, η θεραπεία συνδυασμού SL142 ή SL325 με αυτά ρετινοϊκό οξέα συνεργικά αυξημένη απόπτωση και τον σχηματισμό αποικίας καταστέλλεται στα κύτταρα (Σχ. 3Α, 3Β, 4Α και 4Β). Επιπλέον, η μεταγραφική δραστηριότητα που δημιουργείται από σπάνιες μετά τη θεραπεία συνδυασμού ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη μιας ενιαίας θεραπείας (Εικ. 5Α). RAR είναι γνωστό ότι σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με RXR και δεσμεύεται σε ένα στοιχείο απόκρισης ρετινοϊκού οξέος (RARE) [49], [50]. Ωστόσο, η έκφραση αυτών των υποδοχέων δεν αυξήθηκε μετά τη θεραπεία σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Εικ. 5Β) [45], [51]. Οι δύο ρετινοϊκό οξύ και αναστολείς HDAC έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν τον κυτταρικό κύκλο ή γονίδια που σχετίζονται απόπτωση και επάγει κυτταρική διαφοροποίηση ή απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Στην έκθεσή μας, η έκφραση του ρ21 αυξήθηκε σαφώς μετά τη θεραπεία SL142 σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα και το πιο σημαντικό, η έκφραση Bax αυξήθηκε μετά τη θεραπεία συνδυασμού αναστολέων HDAC και το ρετινοϊκό οξύ. Η έκφραση της ρ27 δεν άλλαξε μετά SL142 ή SL325 και /ή θεραπεία ρετινοειδών [16]. Ο υποκινητής του γονιδίου p21 περιέχει ένα λειτουργικό σπάνια [62] και αυτό είναι συνεπές με τα αποτελέσματα μας (εικ. 5Α). Ωστόσο, ρ21 ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα μόριο που ρυθμίζει τη μετάβαση από την G1 φάση στην φάση S του κυτταρικού κύκλου και η υπερέκφραση του ρ21 έχει δειχθεί ότι επάγει διαφοροποίηση σε διάφορα κύτταρα και όχι επάγουν κασπάσης-3 δραστικότητα και την απόπτωση [63] , [64], [65], [66]. Από την άλλη πλευρά πάνω από την έκφραση Bax επάγει κασπάσης-3 δραστικότητα και την απόπτωση σε πολλά είδη κυττάρων [67], [68], [69]. Σε αυτή τη μελέτη η θεραπεία συνδυασμού SL325 και το ρετινοϊκό οξύ που επάγεται σημαντικά θάνατο των κυττάρων σε καρκίνο του πνεύμονα Η441 κύτταρα. Παρόλα αυτά, η θεραπεία συνδυασμού δύσκολα αυξημένη έκφραση ρ21 (Σχ. 6Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η έκφραση της ρ53 δεν αλλοιώθηκε μετά τη θεραπεία και Η441 μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα φέρουν μεταλλαγμένο ρ53. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μέχρι ρύθμιση του Βαχ μπορεί να έχει ένα κρίσιμο ρόλο στην αντικαρκινική δράση της θεραπείας συνδυασμού SL142 ή SL325 και ATRA ή

καρκινικά κύτταρα 9-cis RA

σε Η441 πνεύμονα [54] και Βαχ ήταν ρυθμίζεται σε p53 ανεξάρτητη πορεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η έκφραση της ρ53 δεν αλλοιώθηκε μετά τη θεραπεία και Η441 μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα φέρουν μεταλλαγμένο ρ53. Από την άλλη πλευρά, όπως φαίνεται στο Σχ. 1C και Εικ.