Αφηρημένο

Εδώ αναφέρουμε ότι 3′-hydroxypterostilbene (HPSB), ένα φυσικό ανάλογο pterostilbene, ήταν πιο ισχυρή από ό, τι pterostilbene κατά την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων (COLO 205, HCT-116, και ΗΤ-29) με μετριέται IC

50 τιμές των 9.0, 40.2, και 70.9 μΜ, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι HPSB ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου με επαγωγή απόπτωσης και αυτοφαγία. Autophagy συνέβη σε πρώιμο στάδιο και δεν παρατηρήθηκε μέσω του σχηματισμού των όξινων φυσαλιδώδους οργανιδίων και σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους παραγωγή πρωτεΐνης 1 ελαφρά αλυσίδα 3-II. Σε μοριακό επίπεδο, τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι HPSB σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (MAPKs) signalings συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης την φωσφορυλίωση στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR). Σημαντικές θεραπευτικές επιδράσεις καταδείχθηκαν

in vivo

με κατεργασία γυμνών ποντικών που φέρουν COLO 205 ξενομοσχεύματα όγκου με HPSB (10 mg /kg

ί.ρ.

). Αυτά τα ανασταλτικά αποτελέσματα συνοδεύονταν από μηχανιστική κάτω-ρύθμιση των επιπέδων πρωτεΐνης της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), μήτρα μεταλλοπεπτιδάση-9 (MMP-9), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), και κυκλίνη D1, καθώς και από η επαγωγή της απόπτωσης σε όγκους του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι HPSB θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα νέο πολλά υποσχόμενο μέσο για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Cheng Τ-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam Ν, Majeed Μ, Χο C-T, et al. (2014) ισχυρή αντι-καρκίνο Επίδραση της 3′-Hydroxypterostilbene Ανθρώπων Colon Ξενομοσχεύματος Όγκων. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10.1371 /journal.pone.0111814

Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνική Cheng Kung University, Ταϊβάν

Ελήφθη: 8, Αύγ 2014? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοέμβρη 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο NSC 101-2628-B-022-001-MY4, 102-2628-B-002-053-my3, και NTU-103R7777 (για το Δρ Pan) και από την υγεία και την καλή διαβίωση επιβάρυνση των προϊόντων καπνού MOHW103-TD-B-111-01 (για ΑΥΧΕΝΑ). Sabinsa Corporation παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους δημιουργούς ΝΚ & amp? MM, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. NK και MM είναι υπάλληλοι της Sabinsa Corporation. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι επιδημιολογικές μελέτες παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι διαιτητικοί παράγοντες μπορούν να τροποποιήσουν τις διαδικασίες της καρκινογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της έναρξης , την προώθηση, και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου στον άνθρωπο [1]. χημειοπρόληψη του καρκίνου είναι η χρήση των φαρμακολογικών ή φυσικών παραγόντων για την αναστολή της ανάπτυξης του διηθητικού καρκίνου ή να αντιστρέψει τη διαδικασία της καρκινογένεσης. Θα μπορούσε να είναι η πιο άμεση μέθοδος για τη μείωση της νοσηρότητας και της θνησιμότητας από καρκινικής νόσου [2] – [4]. Ένας μεγάλος αριθμός χημειοπροληπτική και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, από φυσικά προϊόντα, έχουν χρησιμοποιηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου με την επαγωγή της απόπτωσης σε κακοήθη κύτταρα [5], [6].

Pterostilbene (

trans

-3,5-διμεθοξυ-4′-hydroxystilbene), ένα ανάλογο της διμεθυλαιθέρας ρεσβερατρόλη, έχει βρεθεί να είναι τόσο αποτελεσματική όσο η ρεσβερατρόλη στην πρόληψη καρκινογόνο επαγόμενη προνεοπλαστικών βλαβών σε ένα μοντέλο καλλιέργειας μαστού ποντικού και αναστέλλει την μεταστατική ανάπτυξη των κυττάρων μελανώματος στο ήπαρ [7], [8]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι pterostilbene επιδεικνύει πλειοτροπικές φαρμακολογικές επιδράσεις συμπεριλαμβανομένων αντι-φλεγμονώδη, αντιοξειδωτικό, αντι-πολλαπλασιαστική, αντι-καρκίνου και δραστηριότητες αναλγητικά σε κυτταρική καλλιέργεια και τις ζωικές μελέτες [9] – [14]. Πρόσφατα, 3′-hydroxypterostilbene (Εικ. 1), ένα νέο αναλογικό φυσικό pterostilbene έχει απομονωθεί από το

Sphaerophysa salsula

, είναι πολύ περισσότερο δραστική από pterostilbene στην επαγωγή της απόπτωσης σε ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα λευχαιμίας [15], [ ,,,0],16]. Ωστόσο, η

in vivo

αντικαρκινική επίδραση του HPSB παραμένει ασαφής.

Η

Autophagy, επίσης γνωστή ως τύπος II προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό ενός διπλού μεμβράνη ή απομόνωση μεμβράνη που προέρχεται από ένα μέρος του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) [17] ή από την cytolplasmic πισίνα λιπίδιο [18]. Η διπλή μεμβράνη μορφές autophagosome από τμήματα συμπλεκτικό κυτταρόπλασμα και οργανίδια [11], [12], [19], [20].

Η αυτοφαγία είναι η απάντηση των ευκαρυωτικών κυττάρων σε διάφορα μικρο-εντάσεις, συμπεριλαμβανομένων πείνα, μόλυνση από παθογόνο και χημειοθεραπεία. Επιπλέον, υπάρχουν επίσης αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι η επαγωγή αυτοφαγία φαίνεται να διευκολύνει επιτυχή θεραπεία επαγόμενης θανάτωση των καρκινικών κυττάρων [21], και προ-αυτοφαγικά φάρμακα όπως η τεμοζολομίδη είναι υποψήφιοι που υπόσχονται πολλά για επιλεκτική θανάτωση απόπτωσης ανθεκτικών γλοιοβλαστώματα [22].

Η έναρξη του σήματος για το σχηματισμό αυτοφαγία είναι ελάχιστα κατανοητή, ενώ έχει διαπιστωθεί ότι πολλά μόρια και μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στη ρύθμιση αυτοφαγία, όπως PI3K-AKT-mTOR (φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάση /πρωτεϊνική κινάση Β /στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά), MAPKs, Raf-1-ΜΕΚ1 /2-ERK1 οδών /2 και ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο) [10], [23]. PTEN και AKT είναι ανάντη ρυθμιστές του μονοπατιού mTOR που δρουν ως επαγωγέας ή αναστολέας των autophage, αντίστοιχα. ΑΚΤ αναστέλλει autophage από τη ρύθμιση προς τα κάτω μοριακής 4E-BP1 (4 επιμήκυνση-δεσμεύουν πρωτεΐνη 1), p70S6K που έχουν ως αποτέλεσμα την προώθηση της μετάφρασης του mRNA.

Σε αυτήν την τρέχουσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των pterostilbene και των φυσικών 3 του «υδροξυ παράγωγο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σαφώς ότι HPSB ήταν πιο ισχυρό από pterostilbene στην επαγωγή της απόπτωσης σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε COLO 205 κύτταρα.

Αξιολογήσαμε περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών των αποπτωτικών και αυτοφαγικά αποτελεσμάτων που προκαλούνται από HPSB. Για τη διαλεύκανση της αντικαρκινικής μηχανισμό HPSB, ερευνήσαμε τα μονοπάτια σηματοδότησης που σχετίζονται με HPSB που προκαλείται από αυτοφαγία στο ανθρώπινο COLO 205 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

In vivo

θεραπευτική αποτελεσματικότητα εξετάστηκε περαιτέρω με επεξεργασία γυμνών ποντικών που φέρουν COLO 205 ξενομοσχεύματα όγκου με 10 mg /kg

ip

HPSB. Αυτή η μελέτη παρέχει νέα στοιχεία ότι το υδροξύλιο παράγωγο της pterostilbene θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα νέο και πολλά υποσχόμενο μέσο εναντίον ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Αντιδραστήρια

ιωδιούχο προπίδιο ( PI), πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) και χλωροκίνη (CQ) αγοράστηκε από την Sigma Chemical (St. Louis, ΜΟ, USA). 2 ‘, 7′-Dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFH-DA) και 3,3’-dihexyloxacarbocyanine ιωδίδιο (DiOC6) αγοράστηκαν από την Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Η PARP, DFF-45, LC-3 Ι /ΙΙ, σ-mTOR (Ser

2448), mTOR, π-p70S6K (Thr

398), π-p70S6K (Ser

371), σ -Akt (Ser473), Akt, ΡΙ3Κ, ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, π-p38 (Thr180 /Tyr182), ρ38 και ΜΜΡ-9 αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Η p85α π-PI3K (Tyr508), ERK1 /2, VEGF και D1 αντισώματα κυκλίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Οι κασπάσης 3, 8 και 9 τα αντισώματα αγοράστηκαν από Imgenex (San Diego, CA, USA). Το αντίσωμα COX-2 αγοράστηκε από την Transduction Laboratories (BD Biosciences, Lexington, ΚΥ). Το αντίσωμα β-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Pterostilbene και HPSB ελήφθησαν από Sabinsa Corp. (East Windsor, NJ). Η καθαρότητα των pterostilbene και HPSB προσδιορίστηκε με HPLC όπως υψηλότερα από 99,2%.

2.2 Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές Colo 205, HCT-116 και ΗΤ-29 αγοράστηκαν από την την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO BRL, Grand Island, ΝΥ), 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλίνης, 100 μg /mL στρεπτομυκίνης), 2 mM L-γλουταμίνη (GIBCO BRL, Grand Island, ΝΥ), και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Pterostilbene και HPSB διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, ως τελική συγκέντρωση 0,05%). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05% DMSO ως έλεγχο του οχήματος.

2.3 κυτταροτοξικότητας

δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζολίου (ΜΤΤ). Εν συντομία, COLO 205, HCT-116 και ΗΤ-29 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /mL σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια ανάπτυξη, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες. Οι τελικές συγκεντρώσεις DMSO στο μέσο καλλιέργειας ήταν & lt? 0,05%. Στο τέλος της θεραπείας, 0,2% ΜΤΤ προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για περαιτέρω 4 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με σάρωση με μια συσκευή ανάγνωσης ELISA με ένα φίλτρο 570-nm.

2,4 ανάλυση κυτταρομετρίας ροής κυτταρικού πληθυσμού υπο-G1, μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και ROS

παραγωγή

Για υπο-G1 ανάλυση πληθυσμού κυττάρων, COLO 205 κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /mL) καλλιεργήθηκαν σε 12 καλά και θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 200 μL PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 800 μΙ παγωμένου αιθανόλης 100% στους -20 ° C. Αφού αφέθηκε σε ηρεμία όλη τη νύκτα, τα σφαιρίδια του κυττάρου συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε 1 mL υποτονικού ρυθμιστικού διαλύματος (0.5% Triton Χ-100 σε PBS και 0.5 μg /mL RNase) με ΡΙ (50 μg /mL) και επωάστηκαν στους 37 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από το σύμπλοκο ΡΙ-DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά μετά από διέγερση της φθορίζουσας χρωστικής με FACScan κυτταρομετρία (Becton Dickinson, San Jose, CA). Στη μελέτη αναστολέα αυτοφαγία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία 25 μΜ CQ για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επώαση με pterostilbene ή HPSB.

Για μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και της παραγωγής ROS, κύτταρο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται ανωτέρω για 15 λεπτά, και στη συνέχεια DiOC6 (40 ηΜ) ή DCFH-DA (20 μΜ) προστέθηκαν στο μέσο για περαιτέρω 30 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από πλύση με PBS, η ένταση του φθορισμού προσδιορίσθηκε με FACScan κυτταρομετρία.

2.5 Ανίχνευση autophagy

επαγωγή

Autophagy ανιχνεύθηκε με χρώση ΑΟ. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, τα κύτταρα ΟοΙο205 πλύθηκαν με PBS, αιωρήθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με 1 μg /mL AO 20 λεπτών. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, ΝΥ) εξοπλισμένο με ένα υδραργύρου 100 W λάμπα, 490-nm ζωνοπερατού μπλε φίλτρα διέγερσης, ένας 500 nm διχρωματικού κατόπτρου και ένα 515-nm μακράς-pass φίλτρο φραγμού. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των Avós με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται και βάφτηκαν με ΑΟ για 15 λεπτά και αναλύθηκαν με FACScan λέιζερ κυτταρόμετρο ροής και το λογισμικό CellQuest.

2.6 Western Blotting

Οι συνολικές πρωτεΐνες του COLO 205 κύτταρα εκχυλίστηκαν μέσω προσθήκης ρυθμιστικού χρυσού λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4? 1 mM NaF? 150 mM NaCl? 1 mM EGTA? 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλο φθορίδιο? 1% ΝΡ-40? και 10 μg /mL λευπεπτίνη) στα κυτταρικά σφαιρίδια σε πάγο για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 10.000 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C. Οι συνολικές πρωτεΐνες μετρήθηκαν με Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Μόναχο, Γερμανία). Τα δείγματα (50 μα πρωτεΐνης) αναμίχθηκαν με 5 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος που περιέχει 0,3 Μ Tris-HCl (ρΗ 6.8), 25% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 12% δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS), 25 mM EDTA, 20% γλυκερόλη, και 0,1% μπλε βρωμοφαινόλης. Τα μίγματα έβρασαν στους 100 ° C για 5 λεπτά και υποβλήθηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου μινιπηκτές σε σταθερό ρεύμα 20 mA. Η ηλεκτροφόρηση συνέχεια διεξάγεται σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές. Πρωτεΐνες επί της γέλης ηλεκτρομεταφέρθηκαν επάνω σε ένα ακίνητο μεμβράνη (PVDF? Millipore Corp., Bedford, ΜΑ) με ρυθμιστικό μεταφοράς που αποτελείται από 25 mM Tris-HCl (ρΗ8,9), 192 mM γλυκίνη και 20% μεθανόλη. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 20 mM Tris-HCl, και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με διαφορετικά πρωτεύοντα αντισώματα και β-ακτίνης. Οι κηλίδες ξεπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό PBST (0,2% Tween 20 σε 1 × PBS ρυθμιστικό διάλυμα) για 10 λεπτά η κάθε μία. Στη συνέχεια, τα στυπώματα επωάστηκαν με 1:5000 αραίωση του υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) και στη συνέχεια πλύθηκε πάλι τρεις φορές με ρυθμιστικό PBST. Οι μεταφερθείσες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη ανίχνευση χημειοφωταύγειας κιτ (ECL? Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Οι πυκνότητες των ζωνών ήταν ποσοτικά με πυκνόμετρο υπολογιστή (AlphaImagerTM 2200 Σύστημα της Alpha πυκνόμετρο. Innotech Corporation, San Leandro, CA).

2.7 Δραστηριότητα των κασπασών

Η κασπάσης 3, 8 και 9 δραστηριότητα σε πρωτεΐνη εκχυλίσεις των COLO 205 κυττάρων προσδιορίστηκε με ένα φθορισμογόνο δοκιμασία (σύστημα προσδιορισμού CaspACE της Promega, Madison, WI). Εν συντομία, 50 μg ολικής πρωτεΐνης, όπως καθορίζεται από το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories), επωάστηκε με υπόστρωμα 50 μΜ Ac-Asp-Glu-Val-Asp-μεθυλκουμαρυλ-7-αμίνη (κασπάσης-3 ειδικό υπόστρωμα), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (κασπάση-8 ειδικό υπόστρωμα), ή Ac-Leu-Glu-His- Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( κασπάση-9 ειδικό υπόστρωμα) στους 30 ° C για 1 ώρα. Η απελευθέρωση του μεθυλκουμαρυλ-7-αμίνη μετρήθηκε με διέγερση στα 360 nm και εκπομπή στα 460 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο φθορισμού (έκλειψη, Varian, ΡβΙο Alto, CA).

2.8 COLO μοντέλο 205 ξενομοσχεύματος

Άντρας Balb /c γυμνά ποντίκια 3-4 εβδομάδων (βάρους 16-18 g) ελήφθησαν από την BioLASCO Πειραματικό Κέντρο ζώων (BioLASCO, Ταϊπέι, Ταϊβάν). Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε ελεύθερα παθογόνων στείρα απομονωτές και σε ελεγχόμενη ατμόσφαιρα (25 ± 1 ° C σε 50% σχετική υγρασία) και με ένα ελαφρύ 12-σκότους 12 h ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Τα ζώα τρέφονται με το πρότυπο δίαιτα ΑΙΝ-76 και όλα τα τρόφιμα, το νερό, τον εγκλωβισμό και κλινοσκεπάσματα ήταν αποστειρώνονται πριν από τη χρήση. Τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό ανά πάσα στιγμή. φλιτζάνια φαγητό ήταν αναπληρώνονται με φρέσκο ​​διατροφή κάθε μέρα. Όλα τα ζωικά πειραματικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής του Εθνικού Θαλάσσιου Kaohsiung Πανεπιστήμιο (IACUC, NKMU, # 099-AAA9-02, ημερομηνίες ισχύος 08/01 /2009-07 /31/2012) . Μετά από 1 εβδομάδα εγκλιματισμού, καρκίνου του παχέος εντέρου COLO 205 κύτταρα (5 × 10

6) σε 0,2 ml PBS εγχύθηκαν υποδορίως μεταξύ των ωμοπλατών εκάστου γυμνού ποντικού. Μετά τη μεταμόσχευση, το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας καλίμπρες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = L χ W2 /2, όπου L είναι το μήκος και το W είναι το πλάτος. Μόλις οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο μέγεθος της τάξης των 100-200 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (6 ζώα /ομάδα). Τα ποντίκια ήταν

ε.π.

. ένεση με pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, αντίστοιχα) για 15 ημέρες, ενώ τα ζώα ελέγχου υποβλήθηκαν ένεση αραβοσιτέλαιο. Η πρόσληψη δίαιτα και το σωματικό βάρος του κάθε ζώου παρακολουθήθηκε κάθε μέρα. Ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε και καταγράφηκε κάθε 5 ημέρες χρησιμοποιώντας μετρήσεις καλίμπρας. Μετά από 15 ημέρες, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία και το ήπαρ, τα νεφρά, η σπλήνα και συμπαγείς όγκους αποκόπηκαν αμέσως και ζυγίστηκαν. Μέσος όγκος του όγκου και του βάρους του όγκου της κάθε ομάδας ήταν αντιπροσωπεύουν την μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Οι ιστοί όγκου κόπηκαν σε αρκετές τμήμα για ανάλυση δυτικής μπουλόνι ή αποθηκεύονται στους -80 ° C.

2.9 Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± SE για τον προβλεπόμενο αριθμό ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν . Συγκρίσεις στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των ομάδων έγιναν με t-test ή μονόδρομη ανάλυση ένας τρόπος του Student διακύμανσης (ANOVA). Ένα

P

-τιμή & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

3.1 Αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε HPSB επεξεργασμένο ανθρώπινο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα

Συγκρίναμε πρώτα τις επιδράσεις της pterostilbene και HPSB (Σχήμα 1) σχετικά με την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου με τη χρήση της κυανού τρυπανίου δοκιμασία αποκλεισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, HPSB μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων σε καλλιεργημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (COLO 205, HCT-116, και ΗΤ-29) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με IC

50 τιμές των 9.0, 40.2, και 70.9 μΜ, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Η ανασταλτική δράση κυτταρικής ανάπτυξης σε COLO 205 και HCT-116 κύτταρα (ρ53 άγριου τύπου) ήταν ευαίσθητη σε HPSB σε σύγκριση με ΗΤ-29 (ρ53 μεταλλαγμένη). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ρ53 μπορεί να είναι ένας ρυθμιστής κλειδί σε COLO 205 κύτταρα. Σε σύγκριση με πτεροστιλβένης HPSB ήταν ένα ισχυρότερο αναστολέα της ανάπτυξης των κυττάρων COLO 205. Ως αποτέλεσμα, εξετάσαμε περαιτέρω τις κυτταροτοξικές επιδράσεις HPSB σε COLO 205 κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (5, 10, 25 και 50 μΜ) του pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες. (Α) Προσδιορισμός των κυττάρων υπο-G1 σε COLO 205 κύτταρα με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση ΡΙ όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (B, C) Μετά την αγωγή, η συνολική κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα COLO 205 και τη διάσπαση της PARP, DFF-45, προ-κασπάσης 8 και προ-κασπάσης 9 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (D) Κινητική ενεργοποίηση της κασπάσης σε COLO 205 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 και 50 μΜ pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες. δραστηριότητες Κασπάση αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (Ε) Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 50 μΜ pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 15 λεπτά. δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και παραγωγή ROS βάφτηκαν με DiOC6 (40 ηΜ) και DCFH-DA (20 μΜ) και μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± SE των δοκιμών εις τριπλούν. *

P

& lt?. 0.05 δείχνει στατιστικά σημαντική διαφορά από την ομάδα pterostilbene επεξεργασμένο

Η

3.2 HPSB επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος

Ροή κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η επαγωγή του κυτταρικού πληθυσμού υπο-G1, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης. Για να διερευνηθεί αν οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της HPSB παρατηρούνται σε κύτταρα COLO 205 οφείλονταν σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με pterostilbene και HPSB (5-100 μΜ) για 24 ώρες και το περιεχόμενο DNA των κυττάρων COLO 205 έγιναν με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων COLO 205 ήταν 6,2, 8,4, 10,2, 14,8, και 7.2 και 9.3, 20.1, και 36.3% μετά από επώαση με 5, 10, 25, και 50 μΜ pterostilbene και HPSB, αντίστοιχα. Σχήμα 2Β σε σύγκριση με πτεροστιλβένης HPSB προκαλέσει σημαντικά την υποβάθμιση των 116 kDa PARP σε τεμάχια 85 kDa και επάγουν DFF-45 πρωτεϊνικής αποδόμησης. Αυτές οι διασπάσεις πρωτεΐνης που σχετίζεται με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, HPSB προκάλεσε μια δραματική αύξηση στην διάσπαση της κασπάσης-9 από pterostilbene. Ωστόσο, μόνο μικρότερη επίδραση στην κασπάση-8 δραστικότητα σε HPSB επεξεργασμένα κύτταρα. Για την παρακολούθηση της ενζυματικής δραστηριότητας της κασπάσης-3, -8, -9 και, δραστικότητα κασπάσης μετρήθηκε μετά από θεραπεία COLO 205 κύτταρα με 10 και 50 μΜ HPSB. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, HPSB προκάλεσε μια δραματική αύξηση της κασπάσης-3 ενεργότητα κατά προσέγγιση 2,4-φορές μετά από 24 ώρες θεραπείας. Έχει γίνει πρόσφατα σαφές ότι η απόπτωση συνεπάγεται διάρρηξη της ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης που είναι αποφασιστικό για τη διαδικασία κυτταρικού θανάτου. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τα αποτελέσματα του HPSB στην μιτοχονδριακή μεμβράνη trans-δυναμικό (ΔΨ

m). Τα αποτελέσματα της μέτρησης της έντασης φθορισμού σε COLO 205 κύτταρα που εκτίθενται σε pterostilbene και HPSB σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου συνοψίζονται στο Σχ. 2Ε. Η DiOC6 (3) ένταση φθορισμού μετατοπιστεί προς τα αριστερά 224 έως 117 και 75 στη pterostilbene και HPSB που προκαλείται από αποπτωτικό 205cells COLO, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι HPSB προκάλεσε μείωση στη μιτοχονδριακή δυναμικό trans-μεμβράνης σε COLO 205 κύτταρα. Ο ρόλος των ROS στην επαγωγή της απόπτωσης είναι καλά αναγνωρισμένη. Είναι ενδιαφέρον, HPSB μειώθηκε σημαντικά την μέση ένταση φθορισμού DCFH-DA 114-38, ενώ pterostilbene αυξημένη DCFH-DA ένταση φθορισμού 114-141 σε 15 λεπτά. Η ανισορροπία των συγκεντρώσεων ROS θα μπορούσε να παίζει σημαντικό ρόλο ως ένα πρώιμο μεσολαβητή σε HPSB απόπτωση.

3.3 HPSB έδειξαν ισχυρότερες επιπτώσεις που προκαλεί στην αυτοφαγία από pterostilbene σε COLO 205 κύτταρα

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν σαφώς ότι pterostilbene έχει την ικανότητα αντι-ογκογένεση μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και αυτοφαγία. Είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσο pterostilbene και HPSB επίσης προκαλείται από αυτοφαγία στην COLO 205 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η θεραπεία HPSB οδήγησε σε αξιοσημείωτη εμφάνιση AVO από pterostilbene όταν τα κύτταρα βάφτηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης μετά τη θεραπεία 24 ώρες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της συχνότητας εμφάνισης της HPSB επαγόμενης αυτοφαγία, κύτταρα με Avos έδειξαν αυξημένη κόκκινου φθορισμού αναλύθηκε με ροής που αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με HPSB με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Β και 3C). Για να επιβεβαιωθεί η εμφάνιση autophagy επάγεται από pterostilbene και HPSB, εξετάσαμε την διαδικασία του LC3I /II, χαρακτηριστικά της αυτοφαγία, χρησιμοποιώντας για την ανίχνευση ανοσοκηλίδος κυτταρολύματα-εξάγεται από COLO 205 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, HPSB περισσότερο ισχυρότερη αύξησε τα ποσά των LC3B I /II πρωτεΐνες από pterostilbene.

Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 50 μΜ pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης. (Α) Πράσινο και κόκκινο φθορισμό σε πορτοκαλί ακριδίνης-χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. (B, C) Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός των αυτοφαγία σε COLO 205 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 και 50 μΜ pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης. Η μέτρηση του πράσινου και κόκκινου φθορισμού σε ακριδίνη κύτταρα πορτοκαλί χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. (D) Προϊόντα κυτταρικής λύσης παρασκευάσθηκαν μετά από 24 ώρες θεραπείας και η πρωτεΐνη έκφραση του LC3 Ι /ΙΙ αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD πειραμάτων εις τριπλούν. *

P

& lt? 0.05 υποδεικνύει στατιστικά σημαντική διαφορά από την ομάδα pterostilbene επεξεργασμένο

Η

3.4 HPSB ανέστειλε την mTOR /p70S6K, PI3K /Akt και ΜΑΡΚ μονοπατιών σηματοδότησης στην COLO 205 κύτταρα.

Για την περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της HPSB προκαλείται από αυτοφαγία στην COLO 205 κύτταρα, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση της mTOR /p70S6K, PI3K /Akt, και MPAKs σε HPSB επεξεργασμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του mTOR και p70S6K (Thr389) ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα κατεργασμένα με HPSB (Σχήμα 4Α). Συσσώρευση αποδείξεις υποστηρίζουν ότι οι PI3K /Akt και οι ΜΑΡΚ μονοπάτια που εμπλέκονται στη ρύθμιση αυτοφαγία, ωστόσο, η JNK1 /2 σε αυτό το μονοπάτι μένει να διευκρινιστεί. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε το πώς αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης λειτουργούσαν στην πρόκληση αυτοφαγία από HPSB σε COLO 205 κύτταρα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β και 4C, η φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ, Akt, και ρ38 ΜΑΡΚ μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με HPSB σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Αντίθετα, η θεραπεία με HPSB αυξήθηκε η φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 και JNK1 /2 αποτελεσματικά για 1 ώρα και στη συνέχεια μειώθηκε σταδιακά τη φωσφορυλίωση της ERK1 /2 και JNK1 /2 από 3 ώρες έως 9 ώρες σε σύγκριση με το σύνολο των ERK1 /2 και JNK1 /2 πρωτεΐνης σε COLO 205 κύτταρα. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι HPSB αναστέλλει την PI3K /Akt /mTOR /p70S6K, και μονοπάτια p38MAPK και ενεργοποιεί τους, JNK1 2 μονοπάτια ERK1 /2 /ΜΑΡΚ και προτείνει ότι οι αλλαγές αυτές μεσολαβούν HPSB που προκαλείται από αυτοφαγία στην COLO 205 κύτταρα.

COLO 205 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ 3′-hydroxypterostilbene σε διαφορετικούς χρόνους. lyates κυττάρων παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα της πρωτεΐνης από (Α) ρ-mTOR, ρ-p70S6K, (Β) π-ΡΙ3Κ, ρ-Akt και (C) p-ERK1 /2, π-JNK1 /2, π-p38 ήταν αναλύθηκε με ανάλυση Western blotting. Όλες οι αναλύσεις ήταν αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές κάτω από κάθε λωρίδα δείχνουν σχετική πυκνότητα της μπάντας ομαλοποιηθεί σε β-ακτίνη χρησιμοποιώντας ένα πυκνόμετρο.

Η

Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε χλωροκίνη (CQ), έναν αναστολέα της αυτοφαγία, για να διαπιστωθεί αν η αναστολή της αυτοφαγία κατέστειλε HPSB επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CQ αποκάλυψε σημαντική αύξηση κυτταροτοξικότητα (Εικ. 5Α) με ενισχυμένη HPSB-ενεργοποιείται απόπτωση (Σχ. 5Β και 5C). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν με την παρατήρηση ότι θεραπεία HPSB επάγει κυτταρικό θάνατο αυτοφαγικά σε COLO 205 κύτταρα.

Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 25 μΜ CQ για 1 ώρα πριν από την αγωγή με 50 μΜ του pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 24 ώρες. (Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (B, C) πληθυσμός Υπο-G1 κυττάρων (%) αναλύθηκε και ποσοτικοποίηση μετά από χρώση ΡΙ που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD πειραμάτων εις τριπλούν.

*

P

& lt? 0,05 και

**

P

& lt?. 0.01 δείχνει στατιστικά σημαντική διαφορά από την ομάδα pterostilbene επεξεργασμένο

Η

3.5 HPSB έντονα ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

η

Εξετάσαμε περαιτέρω την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των HPSB

in vivo

με κατεργασία γυμνούς ποντικούς που φέρουν ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου COLO 205 ξενομοσχεύματα όγκου, χρησιμοποιώντας pterostilbene και HPSB σε συγκέντρωση 10 mg /kg. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, όλοι οι ποντικοί παρακολουθούνται για να διερευνήσει κατά πόσον pterostilbene και θεραπεία HPSB προκάλεσε τις δυσμενείς επιπτώσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, το σώμα και το όργανο βάρη σε κάθε ομάδα δεν έδειξαν καμία ανθυγιεινών συμπτώματα καθ ‘όλη τη διάρκεια της μελέτης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν υπάρχουν αξιοσημείωτες παρενέργειες ή τοξικότητα προκλήθηκαν από το

ε.π..

Ένεση pterostilbene και HPSB. Περαιτέρω, σε ποντικούς που λαμβάνουν αυτά τα θεραπευτικά σχήματα, δεν ακαθάριστο σημάδια τοξικότητας παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια ορατά επιθεωρήσεις γενικής εμφάνισης και μικροσκοπικές εξετάσεις των επιμέρους οργάνων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). After15 ημέρες, ο όγκος του όγκου σε HPSB ανεστάλη σημαντικά σε σύγκριση με τα ποντίκια που pterostilbene αγωγή (Σχ. 6Α και 6Β). Το βάρος του όγκου αναστάλθηκε ισχυρώς στα HPSB αγωγή ποντίκια (Σχ. 6C). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D, τα επίπεδα της πρωτεΐνης COX-2, ΜΜΡ-9, VEGF, κυκλίνη D1, και προ-κασπάσης-3 αξιοσημείωτα μειωμένη σε COLO 205 όγκους ξενομοσχεύματος από την ομάδα /kg HPSB αγωγή 10 mg σε σύγκριση με το ομάδα pterostilbene. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HPSB θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα νέο ελπιδοφόρο παράγοντα για τον καρκίνο χημειοθεραπευτικών σκοπούς.

πρωτόκολλο Πειραματική θεραπεία όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα ποντίκια που φέρουν COLO 205 ξενομοσχεύματα ήταν

ε.π..

Ένεση με pterostilbene ή 3′-hydroxypterostilbene για 15 ημέρες όπου ομάδα ελέγχου έλαβε αραβοσιτέλαιο. (Α) Φωτογραφία όγκων ξενομοσχεύματος αναπτυχθεί σε κάθε ομάδα παρουσιάζεται στο τέλος της day15. (Β) Μέσο όγκων του όγκου καταγράφηκαν κατά την διάρκεια μετρήθηκαν την θεραπευτική αγωγή και (C) μέσα βάρη των όγκων στο τέλος του πειράματος. Έξι δείγματα αναλύθηκαν σε κάθε ομάδα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD.

*

P

& lt? 0,05 και

**

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

#

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα pterostilbene-θεραπεία. (Δ) Συνολική πρωτεΐνες του ξενομοσχεύματος όγκων σε κάθε ομάδα εκχυλίζονται για την ανάλυση κηλίδος western. COX-2, ΜΜΡ-9, VEGF, PCNA, κυκλίνη D1 έκφρασης πρωτεΐνης και διασπασμένη κασπάση 3 ανιχνεύθηκαν με χρήση ειδικών αντισωμάτων. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, για πρώτη φορά, συγκρίνουμε με την ανασταλτική της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων επίδραση της pterostilbene και HPSB (Σχήμα 1) σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι HPSB ισχυρότερα επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία από pterostilbene σε COLO 205 κύτταρα. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η διαφορά σε βιοδραστικότητα HPSB συγκρίνουν με pterostilbene σχετίζεται με την παρουσία και τη θέση των ομάδων υδροξυλίου επί του βασικού pterostilbene χημική δομή. Ανθρώπινου ορθοκολικού COLO 205 καρκινικά κύτταρα υπέστησαν απόπτωση μετά τη θεραπεία με HPSB, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόπτωση είναι η κύρια αιτία για την ανάπτυξη-ανασταλτική δράση της HPSB. Αυτά τα δεδομένα θα πρέπει να παρέχει φαρμακευτικά χημικοί με νέες πληροφορίες για το σχεδιασμό παραγόντων κατά του όγκου, και επίσης πληροφορίες για την περαιτέρω στήριξη βιολογικές μελέτες αυτών των τροποποιημένων και μη τροποποιημένων λειτουργικών ομάδων στο μέλλον. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, HPSB είναι ένας ισχυρός αναστολέας της κυτταρικής βιωσιμότητας και προκαλεί την ισχυρή και ταχεία επαγωγή της απόπτωσης σε COLO 205 κύτταρα. Πράγματι, η θεραπεία με HPSB προκαλεί μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και επαγωγή της κασπάσης-3 και caspage-9, η οποία συνδέεται με την αποικοδόμηση DFF-45 και PARP, προηγήθηκε της έναρξης της απόπτωσης. Ο ρόλος των ROS στην επαγωγή της απόπτωσης είναι καλά αναγνωρισμένη. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια αύξηση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού υπεροξειδίου του υδρογόνου σε πτεροστιλβένης ενώ αξιοσημείωτα μειώνουν τα επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε HPSB επεξεργασμένα COLO 205 κύτταρα (Σχ. 2Ε). Έχουμε σκεφτεί ότι pterostilbene διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα και επηρεάζει τα μιτοχόνδρια ποδηλασία δι-οξυγόνου μέσα από το συγκρότημα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Ωστόσο, HPSB θα μπορούσε να σαρώνουν απευθείας ROS στα κύτταρα και την περαιτέρω διαταράξει ενδοκυτταρική ισορροπία οξειδοαναγωγής.

ανάπτυξη του καρκίνου, μια δυναμική και μακροπρόθεσμη διαδικασία, περιλαμβάνει πολλούς πολύπλοκους παράγοντες με σταδιακή εξέλιξη οδηγώντας τελικά σε μια ανεξέλεγκτη εξάπλωση και ανάπτυξη των καρκινικών κύτταρα σε όλο το σώμα που ονομάζεται μετάσταση. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν παράσχει πειστικές αποδείξεις ότι διαιτητικοί παράγοντες μπορούν να τροποποιήσουν αυτή τη διαδικασία [1]. Η σχέση μεταξύ της απόπτωσης και αυτοφαγία είναι πολύπλοκη και ποικίλλει μεταξύ των διαφόρων τύπων κυττάρων και διαφορετικές τάσεις. Αυτοφαγία είναι επίσης γενετικά προγραμματισμένο, υποστηρικτές της αυτοφαγία έχουν τη δυνατότητα για κλινικό όφελος στη ρύθμιση της πρόληψης του καρκίνου [24]. Όπως αυτοφαγία απαιτείται για την αποτελεσματική διαχείριση του μεταβολικού στρες, την προώθηση αυτοφαγία μέσω mTOR αναστολή της οδού θα μπορούσε να αναμένεται να περιορίσουν την εξέλιξη του όγκου [25]. Διαιτητικά φυσικές ενώσεις προσφέρουν μεγάλες δυνατότητες για την καταπολέμηση του καρκίνου στον άνθρωπο μέσω της αναστολής της διαδικασίας καρκινογένεσης μέσω των κυτταρικών αμυντική και αποπτωτικών μηχανήματα [10]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν σαφώς ότι η επαγωγή της απόπτωσης και αυτοφαγία ως μηχανισμός πρόληψης του καρκίνου από διαιτητικές φυσικών ενώσεων [24]. Έχουμε αποδείξει ότι οι αντικαρκινικές επιδράσεις των HPSB ρυθμίζονται από την απόπτωση και την αυτοφαγία, και εντοπίστηκαν τα μονοπάτια σηματοδότησης που μεσολαβούν HPSB που προκαλείται από αυτοφαγία. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά από επώαση με HPSB, οι εκφράσεις LC3I /II ήταν αξιόλογα αυξημένη σε COLO 205 κύτταρα (Σχ. 3D). Η PI3K /Akt και mTOR /p70S6K οδοί είναι οι κύριες οδοί σηματοδότησης που ρυθμίζουν αρνητικά την αυτοφαγία [26]. mTOR ενεργοποιεί το κατάντη p70S6 Ser /Thr κινάση που φωσφορυλιώνει ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6, που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση της μεταγραφικής συσκευής του κυττάρου, ένα κρίσιμο συστατικό της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού [27].