Αφηρημένο

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (SCCHN) είναι μια επιθετική ασθένεια με κακή επιβίωση και είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση είναι μια κοινή εκδήλωση σε ασθενείς SCCHN. GPR4 είναι ένα πρωτόνιο ανίχνευσης G-πρωτεΐνη υποδοχέα, η οποία μπορεί να ενεργοποιηθεί με οξέωση. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο των GPR4 στην έκθεση οξύ και την αγγειογένεση του όγκου σε SCCHN. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώσαμε ότι υπερεκφράζουν GPR4 σε κύτταρα SCCHN μπορούσε να αυξήσει την έκφραση και την έκκριση του IL6, IL8 και VEGFA σε ρΗ 5.9. Αυτή η επίδραση θα μπορούσε να ανασταλεί με SB203580 (αναστολέας ρ38). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η φωσφορυλίωση της ρ38 αυξήθηκε σε μολυσμένα κύτταρα GPR4 σε ρΗ 5,9, η οποία θα μπορούσε να ανασταλεί από SB203580. Στην δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, τα κύτταρα HMEC-1 επωάστηκαν με ρυθμισμένο μέσο (CM, ρΗ 5.9, 6.5, 7.4) που προέρχεται από τον έλεγχο και την GPR4 μολυσμένα κύτταρα SCCHN. μήκος του σωλήνα ήταν σημαντικά αυξημένη σε HMEC-1 κύτταρα επωάζονται με CM από τα μολυσμένα κύτταρα GPR4 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε pH5.9, η οποία έδειξε την προ-αγγειογενετική δράση της GPR4 σε όξινο ρΗ. Τα αντισώματα εξουδετέρωσης του IL6, IL8 και VEGFA θα μπορούσε να αναστείλει τον σχηματισμό σωλήνα κυττάρων HMEC-1. In vivo, η επίδραση της GPR4 επί της αγγειογένεσης ερευνήθηκε με τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) μοντέλο όρνιθας. Έλεγχος και GPR4 μολυσμένα κύτταρα SCCHN σπάρθηκαν πάνω στην άνω επιφάνεια CAM (η = 5 σε κάθε ομάδα) και 5 μL DMEM /F12 (ρΗ 5.9, 6.5, 7.4) προστέθηκε στην επιφάνεια του κυττάρου, κάθε 24 ώρες. Τέσσερις ημέρες αργότερα, ο άνω CAM συλλέχθηκαν και ο λόγος του αγγειακού περιοχή σε περιοχή CAM ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό. μολυσμένα κύτταρα GPR4 θα μπορούσε να προσλάβει περισσότερα αγγειακά από κύτταρα ελέγχου σε pH5.9. Εν κατακλείδι, προτείναμε ότι GPR4 επάγει την αγγειογένεση μέσω GPR4 που προκαλείται από ρ38 IL6, IL8 και VEGFA έκκριση σε όξινο εξωκυττάριο pH σε SCCHN

Παράθεση:. Jing Ζ, Xu Η, Chen X, Zhong Q, Χουάνγκ J, Zhang Y, et al. (2016) Η Proton-Sensing G-πρωτεΐνη υποδοχέα GPR4 προάγει την αγγειογένεση στον καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10.1371 /journal.pone.0152789

Επιμέλεια: Ramani Ramchandran, Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 29, Σεπτεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 18 Μαρ, 2016? Δημοσιεύθηκε: 14 Απρίλη του 2016

Copyright: © 2016 Jing et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα Yangfan του Πεκίνου Δημοτική Διοίκηση των Νοσοκομείων (δεν XMLX201507.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (SCCHN) είναι μια επιθετική ασθένεια με κακή επιβίωση και είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1]. Η παγκόσμια συχνότητα εμφάνισης είναι περίπου 600.000 περιπτώσεις κάθε χρόνο [2]. Το κάπνισμα και η κατάχρηση αλκοόλ είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για SCCHN. Γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση είναι ένα κοινό συμβάν σε ασθενείς SCCHN [3], πράγμα που δείχνει ότι συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του λάρυγγα και του φάρυγγα του καρκίνου [4]. παρακολούθησης διπλό ανιχνευτή ρΗ Είκοσι τέσσερις ώρες δείχνει το ρΗ του άνω οισοφαγικού σφιγκτήρα ως κάτω του 4 [5]. Οξύ έκθεση μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες ωτολαρυγγολογικές διαταραχές όπως η χρόνια λαρυγγίτιδα, φωνητικά οζίδια, οίδημα του ράινκε, έλκος επαφή και κοκκίωμα, του λάρυγγα στένωση, και παροξυσμική λαρυγγόσπασμο [6]. Σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, έκθεση συνεχής οξύ προάγει την αγγειακή ανάπτυξη [7], η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο κατά την έναρξη του όγκου και κακοήθη πρόοδο [8].

Τα πρωτόνιο ανίχνευσης συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs) που περιλαμβάνει GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), και GPR132 (G2A) έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως μυθιστόρημα αισθητήρες pH που προτείνεται να ενεργοποιείται από όξινο εξωκυττάριο pH [9]. Έχει αποδειχθεί ότι GPR4 υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους κακοηθειών [10, 11]. Σε επιθηλιακό καρκίνωμα ωοθηκών, πυκνότητα έκφραση GPR4 συνοδεύεται από μία πυκνότητα υψηλότερη μικροαγγειακή (MVD) [10], και αυτό συσχετίζεται με την ιδιότητα του λεμφαδένα μετάστασης και κλινικό στάδιο. Αυτό δείχνει ότι GPR4 μπορεί να εμπλέκεται σε σχετίζονται με τον καρκίνο αγγειογένεση. Σε SCCHN, η συσχέτιση μεταξύ της έκθεσης οξύ, αγγειογένεση των όγκων και GPR4 δεν έχει μελετηθεί επαρκώς. Σε προηγούμενη μελέτη, επιβεβαίωσε ότι GPR4 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει ΑΡ1 και ERK μονοπάτια σηματοδότησης σε όξινο εξωκυττάριο pH [12]. ΑΡ1 είναι μία από τις ρυθμιστικές θέσεις του IL6, IL8 και VEGFA [13-15]. GPR4 ως αισθητήρας ρΗ συσχετίζεται θετικά με υψηλότερη πυκνότητα μικροαγγειακή, έτσι υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της IL6, IL8 και VEGFA και επάγουν αγγειογένεση σε όξινο εξωκυτταρικό ρΗ. Σε αυτή τη μελέτη, προτείναμε ότι GPR4 αγγειογένεση που επάγεται μέσω GPR4 επαγόμενη έκκριση IL6, IL-8 και VEGFA σε όξινο εξωκυττάριο pH σε SCCHN.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

ηθικές άδεια για τη μελέτη αυτή έγινε δεκτή από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας της Πεκίνο Tongren Νοσοκομείο (Πεκίνο, Κίνα).

Cell Culture

Οι κυτταρικές σειρές SCCHN κύτταρα FaDu και κύτταρα Tca8113, ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMEC-1) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. κύτταρα FaDu ελήφθησαν από μέλος Βασικά Εργαστήριο των νόσων του στόματος, του Πανεπιστημίου Σιτσουάν [16]. Tca8113 κύτταρα ελήφθησαν από την Κίνα υποδομής των πόρων κυτταρική γραμμή. κύτταρα HMEC-1, που λαμβάνεται από Thermo Fisher, δημιουργήθηκε με Ades κ.ά. [17]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, Hyclone, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco) και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Παραγωγή ανασυνδυαστικού αδενοϊού μεταφοράς GPR4 Gene

Το ανασυνδυασμένο αδενοϊό που εκφράζει GPR4 (Ad-GPR4) δημιουργήθηκε σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [18]. Εν συντομία, GPR4 ήταν υπο-κλωνοποιήθηκε στο φορέα αδενοϊού pAdxsi (Sinogenomax, Κίνα). Το ανασυνδυασμένο αδενοϊικός κατασκεύασμα διαμολύνθηκε σε συσκευασία ΗΕΚ293 κύτταρα και στη συνέχεια, αυτά τα κύτταρα με κατάψυξη αποψύχθηκαν αρκετές φορές για να απελευθερώσει ενδοκυτταρική ιικών σωματιδίων. Οι τίτλοι του ιού ελέγχθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293 και λήφθηκε ο αριθμός των μονάδων σχηματισμού πλακών (pfu) χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό σχηματισμού πλάκας.

Κυττάρων Infection and Acid Διέγερση

FaDu κύτταρα και κύτταρα Tca8113 ήταν σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, φθάνοντας το 80% συρροή από την επόμενη ημέρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-GPR4 ή Ad-null (ένα κενό ανασυνδυασμένο αδενοϊό ως έλεγχος). Δεκαοκτώ ώρες αργότερα, διέγερση οξύ διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, 18 ώρες μετά τη μόλυνση, τα μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν από ελεύθερο από ορό ΟΜΕΜ /Ρ12 (ρΗ 5.9, 6.5 και 7.4). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από διέγερση για 6 ώρες. SB203580 (αναστολέας ρ38, 1 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί αν η ρ38 μεσολαβεί την έκκριση των προ-αγγειογενετική κυτοκίνες. Για την εκτέλεση της αναστολής ρ38, GPR4 μολυσμένα κύτταρα σε παντελή στέρηση ορού για 4 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μΜ SB203580 για 1 ώρα πριν από τη διέγερση οξύ και στη συνέχεια τα μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν από ϋΜΕΜ ελεύθερο ορού /Ρ12 (ρΗ 5.9). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 6 ώρες αργότερα.

προσαρμοσμένο μέσο

Για την προετοιμασία προσαρμοσμένο μέσο (CM), τα κύτταρα FaDu και τα κύτταρα Tca8113 μολύνθηκαν με Ad-GPR4 ή Ad-null για 18h, τον πολιτισμό media αντικαταστάθηκαν από ελεύθερο από ορό ΟΜΕΜ /Ρ12 (ρΗ 5.9, 6.5 και 7.4), και κύτταρα χωρίς μόλυνση ενήργησε σαν ένας έλεγχος. Έξι ώρες αργότερα, το μέσο φυγοκεντρήθηκε (4 ° C, 1500 rpm) και το υπερκείμενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Real Time PCR (qPCR) και ποσοτικαί PCR

Ολικά RNA από FaDu και κυττάρων και ιστών Tca8113 SCCHN απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies, USA). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα RT FastQuant Kit (TIANGEN, Κίνα). qPCR διεξήχθη όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για qPCR: IL6 νόημα 5′-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 ‘, αντινόημα 5′-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3′? IL8 αίσθηση 5’-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 ‘, αντινόημα 5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3′? VEGFA αίσθηση 5’-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 ‘, αντινόημα 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3’. Οι εκκινητές για PCR του GPR4 είχαν ως εξής: 5′-νόημα AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 ‘, αντινόημα 5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3’. GAPDH ενισχύθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Το σχετικό επίπεδο RNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο 2 (-Delta Delta C (T)).

Δοκιμασία ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές (ELISA)

Τα κύτταρα ελέγχου και GPR4 μολυσμένα κύτταρα διεγέρθηκαν για 6 ώρες χρησιμοποιώντας ελεύθερο ορού DMEM /F12 (ρΗ 5.9). Στη συνέχεια, το μέσο φυγοκεντρήθηκε (4 ° C, 1500 rpm) και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η συγκέντρωση του IL6, IL8 και VEGFA στο μέσο καλλιέργειας ποσοτικοποιήθηκε με ένα κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Abcam).

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA ( Beyotime, Κίνα) συμπληρωμένο με 1 mM PMSF. Ένα σύνολο 100 μα πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πηκτώματα SDS-PAGE, και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Invitrogen, USA). κηλίδα Western διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. GPR4 αντίσωμα αγοράστηκε από τη διάρκεια ζωής BioSciences (διάρκεια ζωής, USA). Φωσφο-ρ38 (ρ-p38), η συνολική ρ38 (p38) φωσφογλυκόζης VEGF υποδοχέα 2 (Tyr1175) και VEGF υποδοχέα αντίσωμα 2 αγοράσθηκαν από την Cell Signaling Technology (Cell Signaling, USA). GAPDH (Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας λύμα φόρτωσης.

Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα της GPR4 στο σχηματισμό σωλήνα σε HMEC-1, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση της αγγειογένεσης στο αυξητικού παράγοντα-μειωμένες Matrigel (BD Biosciences). Μία ημέρα πριν από τον προσδιορισμό του σχηματισμού σωλήνα, HMEC-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα δίσκο των 10 cm. Μετά την επικάλυψη του πλακιδίου των 96 φρεάτων με Matrigel ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα κύτταρα HMEC-1 συλλέχθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε 1 χ 10

5 /mL χρησιμοποιώντας CM συμπληρωμένο με 2% FBS. Στη συνέχεια 0,1 mL από το κυτταρικό εναιώρημα προσετέθη στο πλακίδιο των 96 φρεατίων. VEGFA (1 ng /ml) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και DMEM χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C,

2 για 12 ώρες 5% CO να επιτραπεί ο σχηματισμός τριχοειδών-όπως δομές. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο και το μήκος του σωλήνα (pixels) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 του λογισμικού.

χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη όρνιθας (CAM) Μοντέλο

Τα γονιμοποιημένα ελεύθεροι ειδικών παθογόνων (SPF) αυγά ελήφθησαν από το Πεκίνο Εργαστήριο Κέντρου Ερευνών των ζώων. Αυγά εκκολάφθηκαν σε υγρό επωαστήρα στους 37,0 ° C με 60% υγρασία. Την ημέρα 10, τα μεγάλα αιμοφόρα αγγεία και σάκο είχαν επισημανθεί στο ωάριο με τη χρήση ψυχρού φωτισμού Κρήνη (STORZ, Γερμανία). Μετά την απολύμανση χρησιμοποιώντας 75% αλκοόλη, ένα στρογγυλό παράθυρο ανοίχθηκε στην κορυφή του κελύφους, διατηρώντας την εξωτερική κελυφών μεμβράνη. Μία οπή ακριβούς ήταν διάτρητοι στη θέση του αεροσάκου. Στη συνέχεια, 20 μλ φυσιολογικού ορού προστέθηκαν στο χόριο μεμβράνη. Η κελυφών μεμβράνη τρυπήσει χρησιμοποιώντας μια λεπτή βελόνα και τη μικρή οπή εντοπίσουμε στο σάκο αέρα με ηλεκτρική σκούπα χρησιμοποιώντας μια λάμπα πιπέτα καουτσούκ, έτσι ώστε το κανονικό αλατόνερο διαχωριστεί το εξωτερικό κελύφους μεμβράνης από το CAM. Η μεμβράνη κελυφών είχε αποκολληθεί χωρίς να διαταραχθεί το CAM. Το παράθυρο καλύφθηκε με parafilm και το αυγό τοποθετήθηκε στον επωαστήρα για μια άλλη ημέρα. Στη συνέχεια, 1 × 10

6control και GPR4 μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν επί της άνω επιφάνειας CAM (η = 5 σε κάθε ομάδα). Το τετράγωνο παράθυρο στο αυγό σφραγίστηκε. Στη συνέχεια, 5 μL DMEM /F12 (ρΗ 5.9, 6.5, 7.4) προστέθηκε στην επιφάνεια του κυττάρου, κάθε 24 ώρες. Τέσσερις ημέρες αργότερα, ο άνω CAM συλλέχθηκαν και ο λόγος του αγγειακού περιοχή σε περιοχή CAM ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό.

Βιοπληροφορική

μέθοδος Βιοπληροφορική χρησιμοποιήθηκε ως Li [ ,,,0],19] περιγράφεται, εν συντομία, τα δεδομένα σειρά που σχετίζονται με καρκίνους από την Affymetrixhuman U133 γονιδίωμα συν 2,0 πλατφόρμα ήταν κάτω φορτωθεί από τη βάση δεδομένων GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), και διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε όγκοι αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας βάση δεδομένων TumourProfile (https://tumour.bjmu.edu.cn/, αδημοσίευτο) ως Wang et al προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους ανάλυσης επεξεργασίας δεδομένων και μικροσυστοιχιών [20, 21]. Το προφίλ έκφρασης του GPR4 σε μια ποικιλία καρκίνων και το αντίστοιχο χειριστήριο (κανονική ή μη-όγκου) σε ιστούς ερευνήθηκε σε αυτή τη βάση δεδομένων, και τα επίπεδα έκφρασης αντιπροσωπεύθηκαν ως μέσες βαθμολογίες rank (ARS).

Ανοσοϊστοχημεία ( IHC)

παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα του λάρυγγα ή δειγμάτων υποφάρυγγα πλακώδες καρκίνωμα σε συνδυασμό με περι-καρκίνωμα δείγματα φυσιολογικού ιστού ελήφθησαν από το κεφάλι και το λαιμό του όγκου του δείγματος όχθη του Πεκίνου Tongren Νοσοκομείο [12]. slides παραφίνης ιστού αποκηρώθηκαν, επανυδατώθηκαν και τοποθετήθηκε σε 10 mmol /L ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (ρΗ 6.0), και θερμαίνεται δύο φορές σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 5 λεπτά η κάθε μία. Τα πλακίδια επωάστηκαν με 3% Η2Ο2 επί 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, αποκλείστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-GPR4 (αραιωμένο 1: 100? Τελική συγκέντρωση, 2 μg /mL, διάρκεια ζωής, USA ) ή κανονικό IgG κουνελιού ως μάρτυρα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση, τα πλακίδια χρωματίστηκαν με το κιτ που καταλύεται υπογραφεί σύστημα ενίσχυσης (κωδικός ϋΑΚΟ k5007) και οι εικόνες φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Olympus IX70. Ημιποσοτική έκφραση GPR4 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό.

Δεδομένα

Ανάλυση

Η ανάλυση βιοπληροφορικής των διαφορών στην έκφραση GPR4 μεταξύ των καρκίνων και των ιστών ελέγχου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την βαθμολογικά Wilcoxon sumtest στο περιβάλλον του λογισμικού R (https://www.r-project.org/). διόρθωση Bonferroni της συνάρτησης R «p.adjust» χρησιμοποιήθηκε για την προσαρμογή των τιμών-Ρ. Τα πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student με λογισμικό SPSS19.0. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GPR4 Διεγείρει Pro-αγγειογενετική έκκριση κυτοκίνης σε όξινα Εξωκυττάρια ρΗ

Για να διερευνηθεί αν GPR4 θα μπορούσε να προκαλέσει. η έκφραση των προ-αγγειογενετική κυτοκινών σε όξινο εξωκυττάριο pH, ανιχνεύσαμε την έκφραση της IL6, IL8 και VEGFA σε διαφορετικές τιμές ρΗ (ρΗ 7,4, 6,5 και 5,9). Η υπερέκφραση του GPR4 σε μολυσμένα κύτταρα GPR4 επικυρώθηκε από qPCR και κηλίδα western (Σχήμα 1Α). Τα επίπεδα του mRNA της IL-6, IL-8, και VEGFA στα κύτταρα Ad-GPR4 αυξήθηκαν στατιστικά σημαντικά σε σύγκριση με τα Ad-null κύτταρα μόνο σε pH 5,9 (Σχήμα 1Β). Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, δεν υπήρχε 67.8-, 118- και 12,5-πλάσια επαγωγή για IL6, IL8 και VEGFA, αντίστοιχα, στα κύτταρα Ad-GPR4. Αυτό έδειξε ότι όξινα εξωκυτταρικό ρΗ ενισχυμένη έκφραση pro-αγγειογενετική κυτοκίνη μέσω GPR4, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Οι συγκεντρώσεις του IL6, IL8 και VEGFA αυξήθηκαν σημαντικά στο υπερκείμενο των GPR4 υπερεκφράζεται κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε ρΗ 5.9 (Σχ 1C). Ο αναστολέας, SB203580, θα μπορούσαν να μειώσουν την έκφραση και την έκκριση του IL6, IL8 και VEGFA (Σχήμα 2Α και 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ρ38 μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή κυτοκίνης από GPR4. κηλίδα Western διεξήχθη για να διερευνηθεί αν GPR4 θα μπορούσε να αυξήσει την φωσφορυλίωση ρ38 σε διαφορετικά ρΗ. Η φωσφορυλίωση της ρ38 αυξάνεται σε GPR4 υπερεκφράζεται κύτταρα σε ρΗ 5.9 (Σχ 2C), η οποία θα μπορούσε να ανασταλεί με SB203580 (Σχήμα 2D). Τα αποτελέσματά μας ήταν ανταποκρίτρια ότι, σε SCCHN, ρ38 είναι συστατικά ενεργοποιείται και οδηγεί σε αύξηση της έκκρισης των κυτοκινών IL-6 και IL-8 [22].

Το συνολικό RNA και πρωτεΐνες των κυττάρων Ad-GPR4-FaDu, Ad-τευθείαν κύτταρα FaDu απομονώθηκαν μετά από διέγερση οξύ για 6 ώρες. qPCR και στύπωμα western πραγματοποιήθηκαν. (Α) Η υπερέκφραση του GPR4 στα κύτταρα Ad-GPR4-FaDu ήταν comfirmed από qPCR και κηλίδα western. (Β) Η έκφραση του IL6, IL8 και VEGFA αυξήθηκε σημαντικά σε μολυσμένα κύτταρα GPR4 σε ρΗ 5.9. (Γ) Τα υπερκείμενα των κυττάρων συλλέχθηκαν και οι συγκεντρώσεις των IL6, IL8 και VEGFA ανιχνεύθηκαν με ELISA. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε Tca8113 κύτταρα (S1 Σχήμα).

Η

(Α) Σε κύτταρα Ad-GPR4-FaDu, SB203580 μείωσε την έκφραση της IL-6, IL-8 και VEGFA σε pH 5,9. (Β) SB203580 μειωμένη έκκριση της IL-6, IL-8 και VEGFA. (C) GPR4 αυξημένη φωσφορυλίωση της p38 σε pH5.9. (D) SB203580 αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του p38 σε GPR4 υπερεκφράζεται κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε Tca8113 κύτταρα (S2 σχήμα).

Η

GPR4 προάγει την αγγειογένεση In Vitro

Για να ελέγξετε αν GPR4 θα μπορούσε να προωθήσει το σχηματισμό σωλήνα, τα κύτταρα HMEC-1 επωάστηκαν με CM που προέρχεται από κύτταρα ελέγχου και GPR4 υπερεκφράζεται κύτταρα. Τα μήκη των σωλήνων (βέλη) ήταν σημαντικά αυξημένα σε HMEC-1 κύτταρα επωάζονται με CM από τα μολυσμένα κύτταρα GPR4 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε ρΗ 5,9 (σχήμα 3Α). Αυτό έδειξε ότι η υπερέκφραση του GPR4 σε SCCHN θα μπορούσε να προκαλέσει αγγειογένεση in vitro σε όξινο ρΗ. Σε SCCHN, η αγγειογένεση προκαλείται από IL-8, IL-6 και VEGF [23, 24]. Για να ελεγχθεί αν η επίδραση της GPR4 αγγειογένεση που επάγεται άμεσα τη μεσολάβηση IL6, IL8 και VEGFA έκκριση, αντισώματα μονοκλωνικά εξουδετέρωσης (R &? D Systems) του IL6, IL8 και VEGFA προστέθηκαν στο CM των κυττάρων Ad-GPR4-FaDu, αντίστοιχα , ισότυπος IgG αντισώματος χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Εικόνα 3Β). Αυτά τα αντισώματα εξουδετέρωσης μείωσε το μήκος του σωλήνα του HMEC-1, και επιπλέον, τα αποτελέσματα εξουδετέρωσης αντισώματος θα μπορούσε να αναστραφεί με την προσθήκη περίσσειας ποσότητας αυτών των παραγόντων (S3 Εικ). Αυτό πρότεινε ότι GPR4 αγγειογένεση που επάγεται μέσω της IL-6, IL-8 και την έκκριση VEGFA. Αγγειακή υποδοχέα ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα 2 (VEGFR2) είναι ο κύριος υποδοχέας του VEGF και ο κύριος μεσολαβητής της επαγόμενης από VEGF σηματοδότηση προ-αγγειογένεση σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για να ελεγχθεί αν GPR4 αυξημένη φωσφορυλίωση VEGFR2 σε κύτταρα HMEC-1, στύπωμα Western διεξήχθη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση VEGFR2 αυξάνεται σε HMEC-1 κύτταρα επωάζονται με CM (ρΗ 5,9) που προέρχεται από GPR4 υπερεκφράζεται κύτταρα (Σχ 3D).

(α) το μήκος του σωλήνα (βέλη) του HMEC-1 κύτταρα ήταν αυξήθηκε το CM που προέρχεται από τα κύτταρα Ad-GPR4-FaDu σε σύγκριση με το Ad-null-FaDu κύτταρα σε pH 5,9. (Β) Οι αντισώματα εξουδετέρωσης του IL6, IL8 και VEGFA ανέστειλε το σχηματισμό σωλήνων σε κύτταρα HMEC-1. Ισοτύπου IgG αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας στην εξουδετέρωση τεστ αντισωμάτων. (Γ) VEGFA (1 ng /ml) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και DMEM χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος σε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα. μήκη Tube (pixels) ποσοτικοποιήθηκαν από 6 αντιπροσωπευτικά πεδία χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό. (D) GPR4 αυξημένη φωσφορυλίωση VEGFR2 σε κύτταρα HMEC-1 σε ρΗ 5.9. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε Tca8113 κύτταρα (S4 σχήμα).

Η

GPR4 προάγει την αγγειογένεση In Vivo

In vivo, η αγγειογενετική δυναμικό της GPR4 σε SCCHN επαληθεύτηκε στο μοντέλο CAM. GPR4 κύτταρα μολυσμένα σπέρνονται στην CAM προσληφθεί περισσότερα αγγειακά από κύτταρα ελέγχου σε pH 5,9. Το αγγειακό πυκνότητα ποσοτικοποιήθηκε με υπολογισμό της αναλογίας του αγγειακού περιοχή σε περιοχή CAM. Στα κύτταρα Ad-null και Ad-GPR4-FaDu, οι αγγειακές πυκνότητες που περιβάλλει τον όγκο ήταν 8,46%, και 16%, αντίστοιχα (Σχήμα 4). Αυτό έδειξε ότι η υπερέκφραση του GPR4 σε SCCHN θα μπορούσε να προωθήσει την αγγειογένεση in vivo σε όξινο ρΗ. Η in-vivo και in-vitro μελέτες έδειξαν ότι GPR4 επάγει την αγγειογένεση σε όξινο pH, ένα σήμα κατατεθέν της εξέλιξης του όγκου.

Τα κύτταρα Ad-GPR4-FaDu προσληφθεί περισσότερα αγγειακά από τα κύτταρα Ad-null-FaDu μόνο σε pH 5.9. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των κυττάρων του Ad-GPR4-FaDu και τα κύτταρα Ad-GPR4-FaDu σε pH 7,4 και 6,5. Οι αναλογίες των αγγειακών περιοχή σε περιοχή CAM ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Tca8113 (S5 Σχήμα).

Η

GPR4 υπερεκφράζεται σε SCCHN

GPR4 υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους κακοηθειών που περιλαμβάνουν καρκίνους του μαστού, των ωοθηκών, καρκίνους του παχέος εντέρου, καρκίνων του ήπατος και του νεφρού [11]. Για να εκτιμηθεί η διαφορική έκφραση του GPR4 σε πολλαπλές καρκίνων και αντίστοιχο έλεγχο τους (κανονική ή μη-όγκου) ιστούς στο επίπεδο του mRNA, μια ολοκληρωμένη ανάλυση βιοπληροφορικής διεξήχθησαν βάσει των δεδομένων μική όγκου που από τη βάση δεδομένων GEO. Οι μέσες βαθμολογίες rank (ARS), διόρθωση Bonferroni ρυθμίστηκε Ρ-τιμές (πίνακας 1) συντέθηκαν και GPR4 ρυθμίζεται αυξητικά στο νεφρό σαφές καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, SCCHN και ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα. Η υπερέκφραση του GPR4 σε SCCHN υποστηρίζεται περαιτέρω από την BioXpress (https://hive.biochemistry.gwu.edu/tools/bioxpress) [25]. Η βάση δεδομένων BioXpress δείχνει ότι GPR4 υπερεκφράζεται στο 85,37% των δειγμάτων SCCHN σε σύγκριση με ζευγαρωμένα δείγματα κανονικού τους με βάση αλληλουχίας RNA (RNA-seq)? το σύνολο δεδομένων που κατατέθηκαν στον Καρκίνο Γονιδιώματος Atlas (TCGA) από το σύνολο των 72 ασθενών που έχουν συλλεχθεί και να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση [25].

Η

Εμείς συγκεντρώθηκαν 12 δείγματα SCCHN (Πίνακας 2) και εκτελείται RT-PCR (Σχήμα 5Α και 5Β) και ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση (Σχήμα 5C και 5D). Όλοι οι ασθενείς υπέφεραν από γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, GPR4 ενισχύθηκε σε 9/12 δείγματα και ρυθμίζεται αυξητικά στους ιστούς του όγκου (Σχήμα 5Α) σε σύγκριση με τα περι-όγκου φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 5Β). Η πρωτεΐνη που εκφράζεται GPR4 σε υψηλότερα επίπεδα (κόκκινα βέλη) στα κύτταρα όγκου σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου περι-φυσιολογικούς ιστούς. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στα δύο του λάρυγγα και υποφάρυγγα καρκίνων.

(Α) RT-PCR του GPR4 σε καρκινικούς ιστούς. (Β) RT-PCR του GPR4 σε περι-καρκινικούς φυσιολογικούς ιστούς. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. (C) αντιπροσωπευτική εικόνα της IHC μετρίως διαφοροποιημένο καρκίνο του υποφάρυγγα. (D) Peri-καρκινικό φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή ως C. (Ε) Ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) θετικών κυττάρων έκφρασης (βέλη) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό. Συνολικά, περιελήφθησαν 12 περιπτώσεις SCCHN. Το επίπεδο της ανοσοδραστικότητας βαθμολογήθηκε από τον υπολογισμό της ολοκληρωμένης οπτικής πυκνότητας (IOD) των θετικών κυττάρων έκφρασης.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προτείνει ότι, όταν εκτεθεί σε ένα όξινο περιβάλλον, GPR4, ένας από τους GPCRs πρωτονίου ανίχνευσης, μπορεί να επάγει την αγγειογένεση μέσω προ-αγγειογενετική έκκριση κυτοκίνης σε SCCHN. Οι κυτοκίνες περιλαμβάνονται IL6, IL8 και VEGFA, και αυτό επιβεβαιώθηκε από qPCR και ELISA. Η προ-αγγειογενετική δράση της GPR4 παρατηρήθηκε από την δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα και το μοντέλο CAM.

Η αγγειογένεση είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου [26]. Όγκοι δεν μπορούν να αναπτυχθούν πέρα ​​από ένα κρίσιμο μέγεθος ή μετάσταση σε άλλο όργανο χωρίς αιμοφόρα αγγεία [27], έτσι ώστε να πρέπει να στρατολογήσουν νέα αιμοφόρα αγγεία από αγγειογένεση. Η «αγγειογόνος διακόπτης» εξισορροπείται από προ-αγγειογενετική και αντι-αγγειογόνων μορίων [27]. Ένα από τα σήματα που ενεργοποιούν αυτό το διακόπτη είναι χαμηλό pH. Σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος, όξινο ρΗ αυξάνει την έκφραση των προ-αγγειογόνος παράγοντες VEGFA και IL8 [28]. GPR4 κυρίως λειτουργεί ως αισθητήρας πρωτόνιο και εκφράζεται ενδογενής σε HMEC-1 και HUVEC. Εξωκυττάρια οξέωση μπορεί να ενεργοποιήσει GPR4 και να οδηγήσει στην παραγωγή cAMP [29]. Υπερκαπνικά οξέωση μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει GPR4 για την τόνωση της πρόσφυσης HUVEC μόριο έκφρασης και κολλητικότητα [30]. Σε μια άλλη μελέτη, δείχθηκε ότι GPR4 έπαιξαν καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη μετανάστευση, και το σχηματισμό σωλήνα με ενδοθηλιακών κυττάρων, αλλά οι αλλαγές του ρΗ δεν μπορούσαν να ρυθμίσει την παραγωγή cAMP σε HMEC-1 και HUVEC [31]. Στο HUVEC, οξέωση ενεργοποιεί GPR4 και αυξάνει την έκφραση του IL1, IL2, IL6 και IL8 [32]. GPR4, ως αισθητήρας ρΗ, είναι πλήρως ενεργοποιημένο σε όξινο ρΗ 6.8 και μερικώς ενεργοποιημένο στο φυσιολογικό εύρος (ρΗ 7.4 έως 6.8) [33, 34]. Γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση είναι ένα κοινό συμβάν στο κεφάλι και το λαιμό ασθενών με καρκίνο [3], το οποίο σημαίνει ότι το βλεννογόνο και καρκίνωμα εκτίθενται συχνά σε χαμηλό ρΗ. Η σχέση μεταξύ χαμηλό ρΗ και την αγγειογένεση του όγκου σε SCCHN δεν έχει μελετηθεί καλά. Σε αυτή τη μελέτη, προτείναμε ότι, στα κύτταρα Ad-null-FaDu και Ad-null-Tca8113, χαμηλό pH δεν θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της IL-6, IL-8, και VEGFA. Σε κύτταρα Ad-GPR4, η έκφραση του IL6, IL8 και VEGFA αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τον έλεγχο σε ρΗ 5.9, αλλά όχι σε ρΗ 6,8 και ρΗ 7,4, που μπορεί να δείχνουν ότι GPR4 ενεργοποιηθεί πλήρως σε ρΗ 5.9 SCCHN και αυτό είναι συνεπές με προηγούμενη μελέτη μας [12].

Η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα και το μοντέλο CAM επαλήθευσε την προ-αγγειογενετική δράση της GPR4. CM που προέρχεται από κύτταρα Ad-GPR4-FaDu επάγεται πλέον σωλήνες σε HMEC-1 κύτταρα και περισσότερο αγγειακή πυκνότητα σε CAM σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες σε ρΗ 5,9. Τα αντισώματα εξουδετέρωσης του IL6, IL8 και VEGFA μείωσε τα μήκη σωλήνα κυττάρων HMEC-1, το οποίο δείχνει ότι GPR4 αγγειογένεση που επάγεται μέσω IL6, IL8 και έκκριση VEGF. VEGFA και IL6 αναγνωρίζονται ως οι κύριες προ-αγγειογενετικών μορίων σε SCCHN και έχουν συνδεθεί με την επιθετικότητα της νόσου και την κακή έκβαση των ασθενών [35-40]. IL8, ένα τελικό προϊόν της οδού VEGF, παρατηρήθηκε επίσης σε υψηλά επίπεδα σε SCCHN [40]. Λόγω του σημαντικού ρόλου της αγγειογένεσης στην πρόοδο του όγκου, έχουν αντιαγγειογενετικές παράγοντες έχουν αναπτυχθεί. Σε FaDu SCCHN ξενομοσχεύματα, μακροχρόνια χορήγηση της bevacizumab, ένα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα αντίσωμα, διαμορφωμένο αποτελεσματικά χημειοθεραπευτικό αποτελεσματικότητα [41]. Στη φάση ΙΙ των κλινικών δοκιμών σε ασθενείς SCCHN, bevacizumab συν cetuximab ή χημειοθεραπεία έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα αποτελεσματικότητας [42, 43]. Η υπερέκφραση του IL8 οδήγησε στην αντίσταση στην bevacizumab σε SCCHN, έτσι συν-στόχευση του VEGF και IL8 μπορεί να βοηθήσει να ξεπεραστεί η αντίσταση και την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας.

αντιόξινα φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων ανταγωνιστής ισταμίνης 2 υποδοχέα (H2RA) και αναστολείς της αντλίας πρωτονίων (PPI ) χρησιμοποιούνται πάντοτε στη θεραπεία των ασθενών SCCHN. Μερικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η χρήση αντιόξινων φαρμάκων μπορεί να έχει σημαντικά θεραπευτικά οφέλη για τους ασθενείς SCCHN [44, 45]. Ένας από τους μηχανισμούς μπορεί να είναι επειδή αντιόξινο τα φάρμακα μπορούν να ρυθμίσουν την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο [44]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι GPR4 προωθεί προ-αγγειογόνοι παράγοντες έκκριση σε όξινο ρΗ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της GPR4 ή όξινο ρΗ μπορεί να οδηγήσει σε αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου. Έτσι εικάζουν ότι ένας άλλος πιθανός μηχανισμός είναι ότι αντιόξινο φάρμακα μπορούν να αναστείλουν την έκκριση προ-αγγειογόνοι παράγοντες αυξάνοντας το ρΗ, και στη συνέχεια να μειώσει την αγγειογένεση, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου. Προηγουμένως, δείξαμε ότι όξινο εξωκυττάριο pH ενισχύει μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) έκφραση μέσω της οδού σηματοδότησης ERK σε GPR4 υπερεκφράζεται κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι GPR4 θα μπορούσε να αυξήσει την φωσφορυλίωση της ρ38 σε ρΗ 5,9, η οποία θα μπορούσε να ανασταλεί από SB203580. SB203580 μπορούσε να μειώσει την έκφραση των προ-αγγειογενετική κυτοκίνες, που μπορεί να δείχνουν p38 παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της έκφρασης των κυτταροκινών.

Εν κατακλείδι, προτείναμε ότι GPR4 επάγει την αγγειογένεση μέσω GPR4 επαγόμενη ρ38 IL6, IL8 και VEGFA έκκριση σε όξινο εξωκυττάριο pH σε SCCHN.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. GPR4 διεγείρει την έκκριση κυτοκίνης σε όξινο ρΗ σε κύτταρα Tca8113.

Ολικό RNA και πρωτεϊνών των κυττάρων Ad-GPR4-Tca8113, κύτταρα Ad-null-Tca8113 απομονώθηκαν μετά οξύ διέγερση για 6 ώρες. qPCR και στύπωμα western πραγματοποιήθηκαν. (Α) Η υπερέκφραση του GPR4 στα κύτταρα Ad-GPR4-Tca8113 ήταν comfirmed από qPCR και κηλίδα western. (Β) Η έκφραση του IL6, IL8 και VEGFA αυξήθηκε σημαντικά σε μολυσμένα κύτταρα GPR4 σε ρΗ 5.9. (Γ) Τα υπερκείμενα των κυττάρων συλλέχθηκαν και οι συγκεντρώσεις των IL6, IL8 και VEGFA ανιχνεύθηκαν με ELISA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s001

(TIF)

S2 Σχ. SB203580 μειώνει την έκκριση κυτοκινών με αναστολή της φωσφορυλίωσης ρ38 σε κύτταρα Tca8113.

(Α) σε κύτταρα Ad-GPR4-Tca8113, SB203580 μείωσε την έκφραση της IL6, IL8 και VEGFA σε ρΗ 5.9. (Β) SB203580 μειωμένη έκκριση της IL-6, IL-8 και VEGFA. (C) GPR4 αυξημένη φωσφορυλίωση της p38 σε pH5.9. (D) SB203580 αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του p38 σε μολυσμένα κύτταρα GPR4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Οι εξουδετέρωσης αποτελέσματα αντισωμάτων μπορεί να αναστραφεί με την προσθήκη του επιπλέον ποσό του IL6, IL8 ή VEGFA σε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ . σωλήνα προσδιορισμού σχηματισμό των κυττάρων Tca8113.

(Α) Το μήκος του σωλήνα (βέλη) των κυττάρων HMEC-1 αυξήθηκε σε CM που προέρχεται από τα κύτταρα Ad-GPR4-Tca8113 σε σύγκριση με το Ad-τευθείαν κύτταρα Tca8113 σε pH 5,9. (Β) Οι αντισώματα εξουδετέρωσης του IL6, IL8 και VEGFA ανέστειλε το σχηματισμό σωλήνων σε κύτταρα HMEC-1. Ισοτόπου IgG αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας στην εξουδετέρωση τεστ αντισωμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s004

(ΔΕΘ)

S5 Εικ. Τα κύτταρα Ad-GPR4-Tca8113 προσληφθεί περισσότερα αγγειακά από τα κύτταρα Ad-null-Tca8113 μόνο σε ρΗ 5.9 στο μοντέλο CAM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s005

(ΔΕΘ)

S1 αρχείου . αρχείο Excel που περιέχει δεδομένα υποστήριξης πληροφοριών αυτής της μελέτης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s006

(XLSX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Pingzhang Wang ( Τμήμα Ανοσολογίας, Τμήμα Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας? Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο για τα Ανθρώπινα Νοσημάτων Genomics) για την ανάλυση βιοπληροφορικής

.