Αφηρημένο

Σκοπός

Exosomal microRNAs (miRNAs) έχουν προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον ως πιθανές διαγνωστικές βιοδείκτες του καρκίνου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει τα προφίλ miRNA εξωσωμάτων ορού και για τον εντοπισμό εκείνων που έχουν αλλοιωθεί σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Να αξιολογήσουν τη χρήση τους ως διαγνωστικοί βιοδείκτες, η σχέση μεταξύ των ειδικών exosomal επίπεδα των miRNAs και τις παθολογικές μεταβολές των ασθενών, συμπεριλαμβανομένων στάδιο της νόσου και την εκτομή του όγκου, εξετάστηκε.

Πειραματικός Σχεδιασμός

μικροσυστοιχιών αναλύσεις των miRNAs στην διεξήχθησαν κλάσματα εξωσωμάτων εμπλουτισμένα δείγματα ορού από 88 ασθενείς με πρωτογενή CRC και 11 υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα έκφρασης του miRNAs στο μέσο καλλιέργειας των πέντε κυτταρικών σειρών καρκίνου του κόλου συγκρίθηκαν επίσης με εκείνες στο μέσο καλλιέργειας ενός κανονικού κόλον που προέρχεται από κυτταρική γραμμή. Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ CRC και σύνολα δειγμάτων ελέγχου επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας 29 ζεύγη δειγμάτων από ασθενείς εκτομή του όγκου. Οι ευαισθησίες των επιλεγμένων miRNAs ως βιοδείκτες της CRC αξιολογήθηκαν και συγκρίθηκαν με εκείνα των γνωστών καρκινικών δεικτών (CA19-9 και CEA) χρησιμοποιώντας ένα χαρακτηριστικό λειτουργίας λήπτη ανάλυση. Τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων miRNAs επίσης επικυρωθεί από ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση ενός ανεξάρτητου συνόλου 13 ασθενών CRC.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα exosomal ορού επτά miRNAs (γράμ- 7α, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 και miR-23a) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε CRC ασθενείς με πρωτοπαθή, ακόμη και εκείνοι με τη νόσο πρώιμο στάδιο, σε σχέση με υγιείς μάρτυρες και ήταν σημαντικά ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά από χειρουργική εκτομή των όγκων. Αυτά τα miRNAs επίσης εκκρίνονται σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές παρά με ένα φυσιολογικό κόλον κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται. Οι υψηλές ευαισθησίες των επτά επιλεγμένα miRNAs exosomal επιβεβαιώθηκαν από έναν δέκτη που λειτουργεί χαρακτηριστική ανάλυση.

Συμπέρασμα

Exosomal miRNA υπογραφές φαίνεται να αντανακλά παθολογικές μεταβολές των ασθενών CRC και αρκετές miRNAs υπόσχονται βιοδείκτες για τη μη -invasive διάγνωση της νόσου

Παράθεση:. Ogata-Kawata η, Izumiya Μ, Kurioka D, Honma Υ, Yamada Υ, Furuta K, et al. (2014) Κυκλοφορούν Exosomal microRNAs ως βιοδείκτες του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10.1371 /journal.pone.0092921

Επιμέλεια: Tadayuki Akagi, Πανεπιστήμιο Καναζάβα, Ιαπωνία

Ελήφθη: 13 Νοέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 26 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η, Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Ogata-Kawata et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από το The Advanced Research για Ιατρικά Προϊόντα Εξόρυξη Πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Καινοτομίας (NIBIO) (08-02), https://www.nibio.go.jp? Grant-in-Ενισχύσεις από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας (13802015), https://www.mhlw.go.jp/? Grant-in-Ενισχύσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού & amp? Τεχνολογία της Ιαπωνίας (13314780), https://www.jsps.go.jp/? Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Έρευνας και Ανάπτυξης (23-Β-08), https://www.ncc.go.jp. Εθνικό Κέντρο Βιοτράπεζας Καρκίνου υποστηρίζεται από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου του Ταμείου Έρευνας και Ανάπτυξης. . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto και Hikaru Sonoda, είναι υπάλληλοι της Shionogi & amp? Co., Ltd. Shionogi & amp? Co., Ltd έχει την αποκλειστική άδεια για αρκετές miRNAs που παρουσιάζονται σε αυτό το έργο. Shionogi & amp? Co., Ltd έχει υποβάλει αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (WO2011 /040.525) για την ανάπτυξη αυτών των miRNAs ως διαγνωστικοί δείκτες. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Συστηματικές μεθόδους για τη διάγνωση παθολογικών καταστάσεων μπορεί να συμβάλει σε ένα υψηλό ποσοστό ανίχνευσης των ασθενών στα αρχικά στάδια του CRC, που οδηγεί σε μείωση των ποσοστών θνησιμότητας. Εφαρμογή του Τεστ Κρυφού Αίματος και ευέλικτη σιγμοειδοσκόπηση οι μέθοδοι ανίχνευσης έχει τη μείωση της θνησιμότητας CRC [2], [3]. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές έχουν εγγενείς περιορισμούς? η ευαισθησία της ανίχνευσης της κοπράνων εξέταση κρυφού αίματος είναι αρκετά χαμηλή και σιγμοειδοσκόπηση είναι επεμβατική και δυσάρεστη για τους ασθενείς. Υδατάνθρακες αντιγόνο 19-9 (CA19-9) και καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σαν δείκτες όγκου για ανίχνευση πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του ήπατος, του παγκρέατος, και του στομάχου. Ωστόσο, η ευαισθησία αυτών των δεικτών για την ανίχνευση του CRC είναι χαμηλή, ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια της νόσου [4]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ανάγκη για την ανάπτυξη CRC-ειδικών διαγνωστικών δεικτών για την ταχεία, μη επεμβατική και εξαιρετικά ευαίσθητο διαλογή των ασθενών.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς, μικρά, μη-κωδικοποιητικές RNA και τους ιστο-ειδική έκφραση συνεισφέρει στην ακριβή έλεγχο των διαφόρων βιολογικών διεργασιών [5], [6]. Δυσλειτουργία του miRNAs βρίσκεται σε διάφορους καρκίνους και τα ενδογενή προφίλ έκφρασης του miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταξινόμηση τύπων καρκίνου [7], [8]. Αρκετές miRNAs δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης σε ιστούς του καρκίνου έχει αναφερθεί ως κατάλληλο διαγνωστικό ή προγνωστικοί δείκτες [9]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι miRNAs εκκρίνονται από διάφορα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων, σε σωματικά υγρά όπως αίμα, ούρα, μητρικό γάλα, και σάλιο,

μέσω

εξωσώματα [10] – [12]. Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια μεμβράνης περίπου 100 nm που ενσωματώνουν πρωτεΐνη, λιπίδια, mRNAs, και miRNAs, ανάλογα με την προέλευση των κυττάρων που εκκρίνουν [13], [14]. Ως εκ τούτου, exosomal miRNAs στα υγρά του σώματος μπορεί να είναι χρήσιμα διαγνωστικά βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου [10], [15]. Ωστόσο, αυτή τη στιγμή υπάρχει έλλειψη πληροφοριών σχετικά με τη σχέση μεταξύ exosomal προφίλ miRNA στο αίμα και την παθολογική κατάσταση των ασθενών με καρκίνο.

Εδώ, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών με βάση το προφίλ των miRNAs exosomal σε ορούς από υγιείς μάρτυρες (ΚΘ ) και οι ασθενείς πρωτογενούς CRC. Τα προφίλ miRNA σε εξωσώματα από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου εξετάσθηκαν επίσης για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών που εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Οι exosomal miRNA υπογραφές διέφεραν μεταξύ των ασθενών CRC και τους ελέγχους. Με τη σύγκριση των προφίλ miRNA των κλινικών δειγμάτων και κυτταρικών σειρών, οκτώ miRNAs (ας-7α, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 και miR-23a) που ήταν σημαντικά αυξημένα σε εξωσώματα ορό από πρωτογενή ασθενείς CRC και ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά ταυτοποιήθηκαν χειρουργική επέμβαση. CRC-σχετίζεται ανύψωση επτά από αυτά τα miRNAs exosomal ελέγχθηκε σε ένα ανεξάρτητο σύνολο του δείγματος χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι exosomal miRNA υπογραφές αντανακλούν παθολογικές αλλαγές σε ασθενείς CRC και ισχύουν για την ανάπτυξη διαγνωστικών στρατηγικές για την ανίχνευση των πρωτογενών CRCs.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

τα δείγματα ορού από 88 ασθενείς με CRC (ηλικίας 35-65 ετών) με πρωτοπαθή όγκο δόθηκαν από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Νοσοκομείο Βιοτράπεζα, Ιαπωνία (Τόκιο, Ιαπωνία) από το 2003 έως το 2004. τα δείγματα ορού συλλέχθηκαν επίσης από 29 από τους ασθενείς μετά από χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου από το 2003 έως το 2004. για την επικύρωση από qRT-PCR, τα δείγματα ορού από 13 διαφορετικές CRC ασθενείς (ηλικίας 45-70 ετών) με πρωτοπαθή όγκο δόθηκαν από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Νοσοκομείο Βιοτράπεζας της Ιαπωνίας το 2009. Χειρουργικά δείγματα πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου και περιβάλλει μη-καρκινικές περιοχές ελήφθησαν από ασθενείς που έλαβαν τα Teikyo Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Tokyo, Japan) [16]. Οροί από 19 άτομα (ηλικίας 35 έως 65 ετών) που υποβλήθηκε σε πλήρη φυσική διαλογή στην NTT Ιατρικό Κέντρο του Τόκιο (Ιαπωνία) το 2011 χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα HC. Τα δείγματα ορού αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Ηθική Δήλωση

εγκρίσεις Institutional Review Board για τη χρήση των δειγμάτων λήφθηκαν σε NTT Ιατρικό Κέντρο, το Πανεπιστήμιο του Τόκιο, και National Cancer Κέντρο. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται στη μελέτη.

Οι κυτταρικές σειρές

Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection. Κανονικό ανθρώπινο εμβρυϊκό κόλον προερχόμενα κύτταρα FHC καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 που περιέχει 25 mM HEPES, 10 ng /ml τοξίνης χολέρας, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 μg /ml τρανσφερίνη, 100 ng /ml υδροκορτιζόνη, και 10% ορό εμβρύου βοός [17]. Η HCT116, ΗΤ-29, ανθρώπινου κόλου καρκινικές κυτταρικές σειρές RKO, SW48, SW480 και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου [18] – [20]. Το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε μετά από ανάπτυξη των κυττάρων για 48 ώρες.

Παρασκευή κλασμάτων εξωσωμάτων εμπλουτισμένου

κλάσματα εξωσωμάτων παρασκευάστηκαν με μια μέθοδο φυγοκέντρησης-υπερφυγοκεντρίσεως βαθμηδόν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [13]. Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 500 χ g για 5 λεπτά για να απομακρυνθεί το απόρριμμα κυττάρου και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 16.500 χ g για 20 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα ρότορα JA-30.50 (Beckmann). Το διαυγασθέν υπερκείμενο διήλθε μέσα από ένα φίλτρο 0.20 μm και στη συνέχεια υπερφυγοκεντρήθηκε σε 120.000 χ g για 70 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα ρότορα TLA-110 (Beckmann). Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και μετά επαναιωρήθηκαν σε 250 μΐ PBS ως κλάσματα εμπλουτισμένα εξωσωμάτων. Δείγματα ορού (750 μl) από ασθενείς CRC και HCs αραιώθηκαν οκτώ φορές με PBS και τα κλάσματα εξωσωμάτων εμπλουτισμένα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Εμπλουτισμός του CD81 δείκτη εξωσωμάτων στα έτοιμα κλάσματα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης (βλέπε Μέθοδοι S1 και Σχήμα S1).

Παρασκευή ολικού RNA exosomal

Το κλάσμα εξωσωμάτων παρασκευάζονται από ορό αναμίχθηκε με 750 μΙ αντιδραστηρίου ΤπζοΙ-LS (Invitrogen) και η υδατική φάση συλλέχθηκε με προσθήκη χλωροφορμίου. Μετά την προσθήκη αιθανόλης στην υδατική φάση, το συνολικό RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας στήλες RNeasy Mini Spin (Qiagen). Το δείγμα RNA στέγνωσε χρησιμοποιώντας ένα Speed-Vac φυγοκεντρικού συμπυκνωτή (Savant) και στη συνέχεια διαλύθηκε σε 10 μΙ ύδατος άνευ νουκλεάσης. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Scientific) και το ποσοτικοί-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Invitrogen). Η ποιότητα του RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Agilent 2100 Bioanalyzer και μικρών RNA τσιπ (Agilent Technologies).

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών

Ολικά RNAs από τα κλάσματα εξωσωμάτων σημάνθηκαν με PCP-Cy3 χρησιμοποιώντας την Agilent αντιδραστήριο επισήμανσης miRNA, και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν σε έναν άνθρωπο miRNA ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών (8 × 15 K, έκδοση 3.0? Agilent Technologies), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την υβριδοποίηση, η συστοιχία πλύθηκε με γονιδιακή έκφραση Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης kit (Agilent Technologies) και σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή μικροσυστοιχιών Agilent DNA. Μετά την αριθμητική μετατροπή των πρώτων δεδομένων χρησιμοποιώντας Feature Extraction λογισμικού (έκδοση 10.7? Agilent Technologies), τα μετασχηματισμένα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GeneSpring GX (έκδοση 12.5? Digital Βιολογία). Οι εντάσεις σήματος των κηλίδων στη μικροσυστοιχία κανονικοποιήθηκαν προς τη συνολική ένταση του σήματος του πίνακα και εμφανίζονται ως ποσοστά. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA έχουν κατατεθεί στο NCBI Gene Expression Omnibus βάση δεδομένων με κωδικό ένταξη GSE40247.

qRT-PCR

Exosomal miRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας MultiScribe αντίστροφης μεταγραφάσης (Life Technologies) και miRNA- ειδικούς εκκινητές. Τα miRNAs ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan microRNA (Life Technologies) και το 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο [21]. Η συγκριτική κατώφλι κύκλου (Ct) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του σχετικού επιπέδου ανίχνευση του κάθε miRNA στο δείγμα, το οποίο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο -ΔΔCT 2

[22]. Σε πειράματα qRT-PCR, miR-451 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο, επειδή ήταν ανιχνεύσιμο σε όλα τα δείγματα και κανονικοποιημένη ένταση του δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των HC και CRC εξωσώματα ορού (

P

& gt? 0,05).

η στατιστική ανάλυση

Ένα διπλής όψης αντιστοιχισμένο Φοιτητών

t-test

ή του Welch

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας των διαφορών στην μικροσυστοιχιών εντάσεις σήματος. Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης του συνόλου δεδομένων όλων των προφίλ miRNA έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του Ward. Ο δέκτης καμπύλης (ROC) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη αναλύθηκαν για να αξιολογηθεί η δυνατότητα χρήσης ενός επιλεγμένου αναλογία miRNA ως διαγνωστικός δείκτης για CRC. συντελεστές συσχέτισης των exosomal προφίλ miRNA μεταξύ των κυτταρικών σειρών και των επιπέδων της CA19-9, CEA, και exosomal miRNAs στον ορό του ασθενούς ως υποψήφιος δείκτες CRC προσδιορίστηκαν από πολυπαραγοντική ανάλυση. Αυτές οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού JMP9. Η δοκιμή Jonckheere-Terpstra (SPSS λογισμικού, έκδοση 18) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ CRC όγκου /node /μετάσταση (TNM) τα στάδια και τα επίπεδα των miRNAs.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των miRNAs exosomal που είναι αυξημένα σε CRC από microarray ανάλυση

διαλογής που βασίζεται σε μικροδιάταξη χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει επίπεδα miRNA σε κλάσματα exosomal δειγμάτων ορού από CRC και HC ασθενείς, καθώς επίσης και μέσα καλλιέργειας από φυσιολογικό κόλον κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται και πέντε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον. Το σχήμα 1 δείχνει μια γενική επισκόπηση της στρατηγικής διαλογής που χρησιμοποιείται. Τα κλάσματα εξωσωμάτων εμπλουτισμένα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μία μέθοδο φυγοκέντρησης-υπερφυγοκεντρίσεως βαθμηδόν, όπως φαίνεται στο Σχήμα S1 Α. Εμπλουτισμός των μικρών RNA και CD81 στα κλάσματα εξωσωμάτων επιβεβαιώθηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση και ανάλυση ανοσοστυπώματος, αντίστοιχα (Σχήματα S1B-D). Μια πολυπαραγοντική ανάλυση και συσχέτιση οικόπεδα των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έδειξε επαναλήψιμη ανίχνευση miRNAs exosomal σε ανεξάρτητα πειράματα και οι συσχετίσεις μεταξύ των προφίλ miRNA των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών (Σχήμα S1E και τον πίνακα S1). Τα προφίλ exosomal miRNA από τις πέντε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και την κυτταρική γραμμή FHC ήταν διαφορετικές από τις ενδογενείς προφίλ κυτταρική miRNA (Σχήμα S1F).

Η

Τα προφίλ miRNA των κλασμάτων εξωσωμάτων δειγμάτων ορού από 88 ασθενείς με πρωτοπαθή CRC (συμπεριλαμβανομένων ΤΝΜ κλινικά στάδια I, II, IIIa, IIIb, και IV) και 11 HCs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και των miRNAs exosomal ανιχνεύονται σε κάθε ομάδα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Ένα σύνολο 164 miRNAs ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα ορού που εξετάστηκαν (Σχήμα S2A) και 69 miRNAs εκφράστηκαν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ασθενείς CRC από HCS (

P

& lt? 0,05) (Σχήματα S2B και S2C, Πίνακας S2). Ανάλυση των προφίλ exosomal miRNA του μέσου καλλιέργειας από πέντε διαφορετικές κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου FHC αποκάλυψε ότι 52 miRNAs εκκρίνονται σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από τις πέντε κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές από από τα κύτταρα FHC (Σχήματα S3A και S3b, Πίνακας S3).

η

Μια σύγκριση των 69 up-ρυθμίζονται miRNAs από ασθενείς CRC και τα 52 up-ρυθμίζεται miRNAs από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου αποκάλυψε ότι το 16 miRNAs ήταν παρόντες και στις δύο σειρές (Σχήμα 2 ): ας-7α, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-1268, miR-1290, miR-1308, miR-150, miR-181β, miR-181δ, miR-1915, ΜΙΚ 21, miR-223, miR-23a, miR-483-5p, και miR-638. Τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης αυτών των miRNAs μετρήθηκαν στη συνέχεια στις κυτταρικές γραμμές FHC και καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και τον καρκίνο του παχέος εντέρου και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς από τέσσερις επιπλέον ασθενείς. Με την εξαίρεση του miR-181δ, η οποία ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη τόσο τα καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς κανένα από αυτά τα miRNAs εκφράστηκαν στους ιστούς καρκίνου (Σχήμα S3C) ή κυτταρικές σειρές καρκίνου (

P

& gt? 0,05 ) (Σχήμα S3D) σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι τα συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς ή την FHC κυτταρική γραμμή, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκκριση του miRNAs δεν εξαρτάται από κυτταρικά επίπεδα έκφρασης τους και προτείνουν ότι πάνω ρυθμισμένα ενδογενούς miRNAs σε καρκινικά κύτταρα δεν είναι απαραίτητα υποστρώματα για την έκκριση εξωσωμάτων μεσολάβηση. καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα φαίνεται να εκκρίνουν ένα υποσύνολο των miRNAs σε εξωκυττάρια χώρους μέσω εξωσώματα.

Ορός exosomal επίπεδα miRNA σε 11 HCs (μπλε) και 88 ασθενείς CRC (κόκκινο) σε διαφορετικά στάδια ΤΝΜ (Ι έως IV). Οι εντάσεις σήματος κανονικοποιήθηκαν προς τη συνολική ένταση του σήματος της μικροσυστοιχίας. Οι οριζόντιες γραμμές υποδεικνύουν τη μέση κανονικοποιημένη ένταση σήματος για κάθε ομάδα. Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν από την Welch του

t-test

.

Η

Σχέση μεταξύ των επιπέδων exosomal ορό 16 miRNAs και τα κλινικά στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την σχέση μεταξύ των 16 συνήθως επάνω ρυθμισμένη miRNAs και κλινικά στάδια του CRC με διαχωρισμό των ασθενών CRC με βάση στάδιο TNM τους. Για κάθε miRNA, καμία σημαντική συσχέτιση (

P

& gt? 0,05) μεταξύ του επιπέδου exosomal και το κλινικό στάδιο της νόσου ταυτίστηκε με δοκιμή Jonckheere-Terpstra (Σχήμα S4)

Down. -Κανονισμός οκτώ miRNAs μετά την αφαίρεση των πρωτοπαθών όγκων

για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι 16 miRNAs κοινώς up-ρυθμίζονται προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα, αναλύσεις μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των επιπέδων αυτών των miRNAs σε κλάσματα εξωσωμάτων εμπλουτισμένο με σύμπτωση ορού δείγματα που συλλέχθηκαν μετά από χειρουργική εκτομή των πρωτογενών όγκων (n = 29 ασθενείς). τα επίπεδα έκφρασης των οκτώ από τα miRNAs μειώθηκαν σημαντικά (

P

& lt? 0,05) μετά την αφαίρεση των πρωτοπαθών όγκων (Σχήμα 3 και Πίνακας S4): ας-7α, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 και miR-23a. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα οκτώ miRNAs μπορεί να προέρχονται από εξωσώματα που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα και ότι τα επίπεδά τους μπορεί να αντανακλούν την κατάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου των ασθενών.

(Α) Διάγραμμα διασποράς του 16 συνήθως πάνω ρυθμισμένα miRNAs exosomal ορού σε CRC ασθενείς (n = 29) πριν (Pre) και μετά (Post) χειρουργική αφαίρεση των όγκων. Το σύνολο του δείγματος περιλαμβάνεται το στάδιο Ι (n = 6), το στάδιο ΙΙ (n = 6), το στάδιο IIIa (n = 5), Σταδίου ΙΙΙ (n = 9), και το στάδιο IV (n = 4) ασθενείς. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες κανονικοποιημένες εντάσεις σήματος (%). Οι κόκκινες κουκίδες υποδεικνύουν τις οκτώ miRNAs που ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται μετά την εκτομή του όγκου: ας-7α, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, και ΜΙΚ 23α. (Β) μεμονωμένες αλλαγές στα επίπεδα εξωσωμάτων ορό των οκτώ κάτω-ρυθμίζονται miRNAs σε ασθενείς CRC (n = 29) πριν (Pre) και μετά (Post) χειρουργική αφαίρεση των όγκων. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων προ αξίες και τις μέσες τιμές Δημοσίευση προσδιορίστηκαν από ζεύγη Φοιτητών

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ.

Η

Πιθανές miRNAs εξωσωμάτων ορού για εφαρμογή ως διαγνωστικοί βιοδείκτες

Για την εκτίμηση δύναμη τους ως πιθανών διαγνωστικοί δείκτες, οι τιμές cut-off από τους οκτώ miRNAs που ήταν πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά την εκτομή του όγκου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια καμπύλη ROC (Σχήμα 4). Οι αληθινοί θετικούς ρυθμούς miR-1246 και miR-23a για τον εντοπισμό των 88 ασθενών CRC ήταν 95,5% και 92,0%, αντίστοιχα? Αυτά τα miRNAs είχαν επίσης χαμηλές ψευδώς θετικά ποσοστά για την ταυτοποίηση των 11 HCs (9% και 0%, αντίστοιχα). Οι αληθινοί θετικούς ρυθμούς miR-21, miR-150, αφήστε-7α, miR-223, miR-1224-5p, και miR-1229 για την αναγνώριση του CRC ήταν 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% και 22,7%, αντίστοιχα? οι ψευδώς θετικά ποσοστά αυτών των miRNAs κυμαίνονταν από 0% έως 9% (Σχήμα 4). Σημειώνεται ότι μία συνδυασμένη χρήση των 8 miRNAs δεν έδειξε περισσότερο διαγνωστικό δύναμη από εκείνες στις Mirs-1246 και -23a (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συγκριτικά, οι ευαισθησίες του CEA και CA19-9, τα οποία είναι γνωστά βιοδείκτες του CRC, ήταν 30,7% και 16,0%, αντίστοιχα. Μια πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των οκτώ επιλεγμένων miRNAs σε εξωσώματα ορού και τα επίπεδα του CEA και CA19-9 (Πίνακας S5) στον ορό. Ως εκ τούτου, έχουμε εκ νέου αξιολογηθούν τα επίπεδα έκφρασης των οκτώ miRNAs σε εξωσώματα ορό από qRT-PCR αναλύσεις ένα πρόσθετο σύνολο του δείγματος που περιλάμβανε οκτώ ΚΘ, επτά σταδίου Ι ασθενείς CRC, και έξι σταδίου ΙΙ ασθενείς CRC (Πίνακας S6). Τα επίπεδα των επτά από τα miRNAs, δηλαδή ας-7α, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 και miR-23a, ήταν σημαντικά υψηλότερα σε εξωσώματα ορό από ασθενείς CRC από εκείνα HCS (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 5). Στατιστικά σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα έκφρασης αυτών των miRNAs καν παρατηρείται για το αρχικό στάδιο (ΤΝΜ στάδιο Ι) δείγματα CRC (Σχήμα S5). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miRNAs exosomal ορού μπορεί να είναι χρήσιμη για την έγκαιρη ανίχνευση του πρωτογενούς CRCs.

Οι εντάσεις σήματος των miRNAs εμφανίζονται ως ποσοστά της συνολικής έντασης του σήματος. Οι τιμές αποκοπής των οκτώ miRNAs που ήταν πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά την εκτομή του όγκου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια καμπύλη ROC. Μαύρα κουτιά δείχνουν ασθενείς άνω τιμή αποκοπής των βιοδεικτών ή τα επίπεδα των miRNAs. Οι κανονικοποιημένες εντάσεις των μη ανιχνεύσιμα miRNAs σε εξωσώματα ορού υπολογίστηκαν ως 0.

Η

Box-and-μουστακιού οικόπεδα των επιπέδων έκφρασης των οκτώ επιλεγμένων miRNAs σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των υδρογονανθράκων (n = 8) και ασθενείς CRC με πρωτογενή όγκο (n = 13). Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των συνόλων δεδομένων HC και CRC προσδιορίστηκαν από την Welch του

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ. Η μέθοδος συγκριτικής κατώφλι κύκλου (Ct) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων των miRNAs exosomal στο HC και CRC ασθενείς. Η σχετική αναλογία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Η τιμή Ct του miR-451 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Κάθε σημείο δεδομένων ομαλοποιήθηκε σε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα HC.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα, miRNAs έχουν προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον ως μέσο για την ανάλυση των μοριακών οδών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Εκτός από σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες τους, είναι πιθανό ότι εκκρινόμενη miRNAs ενσωματωμένα σε εξωσώματα μπορούν να είναι διαγνωστικά βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου. Εδώ, συνολικές αναλύσεις των exosomal προφίλ miRNA εντοπίζονται 16 miRNAs που εκφράστηκαν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου και δείγματα ορού από ασθενείς CRC από φυσιολογικό κόλον προερχόμενα κύτταρα και δείγματα ορού από HCs, αντίστοιχα. Ενδογενή επίπεδα έκφρασης των περισσοτέρων από αυτούς miRNAs δεν ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και καρκινικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι exosomal έκκριση miRNAs δεν εξαρτάται από κυτταρικά επίπεδα έκφρασης. Από την άλλη πλευρά, miR-181, ένα πλαίσιο που εξαρτάται από καρκίνο που σχετίζεται miRNA [23], [24], μόνο υποδεικνύεται επάνω ρυθμισμένη κυτταρικό και exosomal επίπεδα έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου και κλινικά δείγματα, υποδηλώνοντας μια ενδιαφέρουσα υπόθεση ότι η συνάρτηση της exosomal miR-181 μπορεί να εμπλέκεται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Τα επίπεδα exosomal ορό των οκτώ αυτών των 16 miRNAs ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται μετά από χειρουργική εκτομή των πρωτοπαθών όγκων, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα miRNAs εκκρίνονται από κύτταρα όγκου. Ωστόσο, δεν αποκλείουμε την πιθανότητα ότι αυτές οι miRNAs εκκρίνονται από άλλα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των άνοσων και φλεγμονωδών κυττάρων, τα οποία εμφανίζονται συμπτωματικά στην πρωτοβάθμια βλάβες του ιστού. Τέλος, CRC-συνδέονται αυξήσεις των επιπέδων exosomal επτά επίπεδα miRNA (ας-7α, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 και miR-23a) επικυρώθηκαν από qRT-PCR , υποδεικνύοντας ότι αυτά τα miRNAs μπορεί να είναι κατάλληλα βιοδείκτες για την ανίχνευση καρκίνων του παχέος εντέρου. Οι υψηλές ευαισθησίες και ιδιαιτερότητες αυτών των miRNAs exosomal προσδιορίζεται από την ανάλυση ROC (Σχήμα 4) υποστηρίζουν τη χρήση τους ως διαγνωστικοί βιοδείκτες.

Τα επίπεδα exosomal των επτά επιλεγμένα miRNAs δεν εξαρτάται από το κλινικό στάδιο της CRC (Σχήμα S4 ). Πράγματι, miR-23a και miR-1246 έδειξαν υψηλές ευαισθησίες για τα δείγματα σταδίου Ι του 95% και 90%, αντίστοιχα. Συγκριτικά, οι ευαισθησίες της CA19-9 και CEA για το στάδιο Ι ΣΔΠ είναι μόνο 10 και 15%, αντίστοιχα. Επιπλέον, qRT-PCR αποδειχθεί αναπαραγώγιμη ανίχνευση αυτών των miRNAs σε υψηλά επίπεδα σε ένα ανεξάρτητο σύνολο εξωσωμάτων ορού από το στάδιο Ι CRC ασθενείς (Σχήμα S5). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι αυτά τα miRNAs είναι κατάλληλοι βιοδείκτες για την ανίχνευση των πρώιμων CRC στάδιο. Ωστόσο, περαιτέρω επικύρωση απαιτείται για να υποστηρίξει αυτή την πρόταση.

Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι αφήνω-7α εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε εξωσώματα εκκρίνονται στο ορό από κύτταρα γλοιοβλαστώματος όγκου [15]. Επιπλέον, miR-1246 είναι ανιχνεύσιμο σε δείγματα ολικού ορού, παρά εξωσωμάτων κλάσματα, από ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου [25]. Μετρήσαμε επίσης ας-7α, miR-1224-5p, και miR-150 επίπεδα στο μέσο καλλιέργειας των παγκρεατικών κυτταρικών σειρών και βρέθηκε ότι τα επίπεδα ήταν παρόμοια με εκείνα που εκκρίνονται από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου πέντε (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα miRNAs συνήθως εκκρίνονται από διάφορα καρκινικά κύτταρα. Αρκετές αναφορές έχουν προτείνει τη χρήση των κυκλοφορούντων miRNAs στο σύνολό του πλάσματος ή ορού, συμπεριλαμβανομένων των miR-141, miR-21, miR-221, miR-29, και miR-92a, ως διαγνωστικοί βιοδείκτες της CRC [26] – [30]. Αυτά τα miRNAs δείχθηκε να εμφανίζει ευαισθησίες και εξειδικεύσεις συγκρίσιμες με εκείνες των δεικτών καρκίνου του παχέος εντέρου που χρησιμοποιούνται σήμερα. Αξιοσημείωτα, miR-141, miR-221, και miR-21 αναφέρθηκε ότι είναι επάνω ρυθμισμένη σε καρκινικούς ιστούς [31] – [33]? η συνολική miRNA που από όλο το πλάσμα ή τον ορό μπορεί να περιλαμβάνει ενδογενές κυτταρικό miRNAs προέρχονται από σπασμένα ή κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων [34], [35], η οποία μπορεί να εξηγήσει γιατί miR-141, miR-221 και miR-21 είναι παρόντα σε υψηλά επίπεδα σε ολόκληρο δείγματα ορού ή πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο. Επιπλέον, miRNAs ορού /πλάσματος, τα οποία δεν συνδέονται με κυστίδια, αναφέρθηκαν να δείξει απόκλιση σταθερότητα σε θεραπεία με RNase Α [36], υποδηλώνοντας ότι miRNAs exosomal προτιμώνται περισσότερο ως βιολογικών δειγμάτων για την ανάπτυξη διαγνωστικών βιοδείκτες, λόγω της σταθερότητας τους στον ορό /πλάσμα αίματος. Στην πραγματικότητα, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι τα επίπεδα exosomal miRNA αντανακλούν επίσης την ιδιότητα του καρκίνου που φέρουν και τις παθολογικές μεταβολές των ασθενών. Τα εξωσώματα απελευθερώνονται ενεργά από τα καρκινικά κύτταρα και ειδικά συστατικά τους εξαρτάται από το κύτταρο από το οποίο προέρχονται. Πράγματι, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να χρησιμοποιήσει μια ακόμη άγνωστος μηχανισμός να ενσωματώσετε ένα υποσύνολο των miRNAs σε εξωσωμάτων.

Εν ολίγοις, οι προσπάθειες έχουν γίνει πρόσφατα για να χρησιμοποιήσετε miRNAs σε ορό ή πλάσμα ως διαγνωστικοί βιοδείκτες των διαφόρων μορφών καρκίνου [37] ? Ωστόσο, δεν υπάρχει σήμερα συλλογική άποψη της οποίας miRNAs θα πρέπει να επιλέγεται ως δείκτες. Οι μοναδικές ιδιότητες του εξωσωμάτων, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητάς τους να ενσωματώσετε συγκεκριμένες miRNAs, η σταθερότητά τους σε κυκλοφορία, αναπαραγώγιμη ανίχνευση τους και, το σημαντικότερο, το γεγονός ότι αντικατοπτρίζουν τις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, μπορεί να τις καθιστά χρήσιμες για την ανάπτυξη εξαιρετικά ευαίσθητο διαγνωστικό στρατηγικές για την ταχεία και μη επεμβατική παρακολούθηση της παθολογικής κατάστασης των ασθενών με καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Παρασκευή των κλασμάτων εξωσωμάτων εμπλουτισμένο από ορό ή καλλιέργεια κυττάρων μέσο. (Α) Επισκόπηση της διαδικασίας εξωσωμάτων-εμπλουτισμού. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των επιπέδων CD81 σε ανθρώπινους ορούς προ-εξωσωμάτων εμπλουτισμού και πριν (διαδρομή 2) ή μετά overnsight αποθήκευση στους 4 ° C (διαδρομές 5 και 6), -20 ° C (διαδρομές 7 και 8), ή – 80 ° C (διαδρομές 9 και 10). Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS) πριν (διαδρομή 1) και μετά από ολονύκτια αποθήκευση στους 4 ° C (διαδρομές 3 και 4) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Το κλάσμα εμπλουτισμένο σε εξωσώματα ακολούθως παρασκευάζεται από 1 ml ορού χρησιμοποιώντας τη μέθοδο υπερφυγοκέντρησης που περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι (λωρίδα 11). Πέντε μικρολίτρα από κάθε δείγμα ορού, ή 300 ng του εμπλουτισμένου κλάσματος φορτώθηκε σε 10-20% κλίση γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου. CD81, ένα εξωσωμάτων δείκτη, ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα. (C) Ανίχνευση του μικρού RNA κλάσμα κυτταρικής συνολικής RNAs (ενδογενείς) και RNAs exosomal (exosomal) από κύτταρα HCT116 (30 ng έκαστο). Τα RNA φορτώθηκαν 5-150 nt μικρά RNA μάρκες (Agilent) και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας έναν Agilent 2100 Bioanalyzer. Ένα μικρό κλάσμα RNA που περιέχουν miRNAs ήταν ανιχνεύσιμη σε περίπου 10-40 nt. Η κορυφή στους 4 αντιπροσωπεύει nt ένα δείκτη μεγέθους. Τα γεμισμένα και ανοικτά βέλη δείχνουν 5S tRNA και μικρό rRNAs, αντίστοιχα. FU, μονάδες φθορισμού. (Δ) Ανάλυση ανοσοκηλίδας της έκφρασης CD81 σε μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό των κυττάρων HCT116 πριν και μετά εξωσωμάτων-εμπλουτισμό. Οι συγκεκριμένες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης από το κυτταρικό ίζημα, το μέσο καλλιέργειας, και τα κλάσματα εξωσωμάτων εμπλουτισμένα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση αντισωμάτων που στοχεύουν CD81 ή αντι-γ-τουμπουλίνης, ένα αντιπροσωπευτικό ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης. Λωρίδες 1-4, σφαιρίδιο κυττάρου? λωρίδες 5-7, μέσο καλλιέργειας ελεύθερο ορού? λωρίδες 8-10, εξωσωμάτων εμπλουτισμένο κλάσμα. (Ε) οικόπεδα διασπορά του κανονικοποιημένου εντάσεων σήματος (%) των miRNAs exosomal (αριστερά πάνελ) και ενδογενούς κυτταρικού miRNAs (δεξιά πάνελ) στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. (F) Ιεραρχική συσταδοποίηση των ενδογενών και exosomal miRNAs στην κανονική FHC κυτταρική γραμμή και πέντε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές των κανονικοποιημένων εντάσεων σήματος (%) του η = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Συνολικά 489 miRNAs ήταν ανιχνεύσιμα σε όλα τα δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

μικροσυστοιχιών ανάλυση του προφίλ των miRNA σε δείγματα ορού εξωσωμάτων εμπλουτισμένο από ασθενείς CRC και των HC. (Α) Ιεραρχική ομαδοποίηση των miRNAs exosomal σε δείγματα από 11 HCs και 88 ασθενείς CRC (ΤΝΜ: στάδιο Ι, n = 20? Σταδίου ΙΙ, n = 20? Stage IIIA, n = 20? Σταδίου IIIb, n = 16? Σταδίου IV , n = 12). Το μπλε και το κόκκινο σκίαση υποδεικνύει τις ασθενείς HC και CRC, αντίστοιχα. Οι εντάσεις σήματος κάθε miRNA εμφανίζεται ως ποσοστό της συνολικής έντασης σήματος στη συστοιχία. Ένα σύνολο 64 miRNAs ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα ορού εξετάστηκαν. (Β) Ιεραρχική ομαδοποίηση των 69 miRNAs που εκφράστηκαν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ασθενείς CRC από ΚΘ (

P

& lt? 0,05 από την Welch του

t

-τεστ). οικόπεδο (Γ) διασπορά των κανονικοποιημένων εντάσεων σήματος των 69 miRNAs exosomal που ήταν πάνω ρυθμισμένα σε ασθενείς CRC (γ-άξονας) σε σύγκριση με HCs (χ-άξονας). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες κανονικοποιημένες εντάσεις σήματος κάθε miRNA από τους ασθενείς CRC και HC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

μικροσυστοιχιών ανάλυση exosomal miRNAs από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και ενδογενή επίπεδα έκφρασης των miRNAs. (Α, Β) Τα επίπεδα έκφρασης των 52 miRNAs που εκκρίνονται από πέντε κύτταρα καρκίνου κόλου σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι από κύτταρα FHC (

P

& lt? 0,05). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες κανονικοποιημένες εντάσεις σήματος του η = 3 ανεξάρτητα πειράματα μικροσυστοιχιών.