Αφηρημένο

Η κυτταροσκελετού πρωτεΐνη WAVE3 προωθεί την εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Έχουμε δείξει ότι η WAVE3 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της καρκινικών κυττάρων εισβολής οφείλεται, εν μέρει, στην ρύθμιση της έκφρασης και της δραστηριότητας του κλειδιού μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ9, η οποία βρίσκεται σε κεντρική εμπλέκονται στην invadopodia μεσολάβηση αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας ( ECM). ΜΜΡ9 είναι επίσης ένα σημαντικό γονίδιο στόχος ΝΡκΒ, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σύνδεση των WAVE3 σε αυτό το μονοπάτι, το οποίο επιδιώξαμε να ερευνήσει. Μηχανιστικά, βρήκαμε ότι η απώλεια WAVE3 σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε αναστολή του ΝΡκΒ σηματοδότησης ως αποτέλεσμα μία μείωση της πυρηνικής μετατόπισης του ΝΡκΒ και επομένως απώλεια της ενεργοποίησης των γονιδίων στόχων του ΝΡκΒ. Αντιστρόφως, η υπερέκφραση του WAVE3 ήταν αρκετή για να ενισχύουν την δραστικότητα του ΝΡκΒ. Αμφότερες οι φαρμακολογικές και γενετικούς χειρισμούς των μορίων τελεστών ΝΡκΒ δείχνουν ότι η βιολογική συνέπεια της απώλειας της λειτουργίας WAVE3 στην οδό ΝΡκΒ έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή του σχηματισμού invadopodia και αποικοδόμηση ECM από τα καρκινικά κύτταρα, και αυτές οι αλλαγές είναι συνέπεια της μειωμένης έκφρασης ΜΜΡ9 και δραστηριότητας. Απώλεια WAVE3 ευαισθητοποιημένων επίσης καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση και κυτταρικό θάνατο οδηγείται από TNFa, μέσω της αναστολής της οδού προ-επιβίωσης ΑΚΤ. Τα αποτελέσματά μας προσδιορίσει μια νέα λειτουργία του WAVE3 στη σηματοδότηση ΝΡκΒ, όπου η δραστηριότητα του είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση των invadopodia και την υποβάθμιση της ECM. Ως εκ τούτου, στοχευμένες θεραπευτικές αναστολή της WAVE3 θα ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση και κυτταρικό θάνατο, και να καταστείλει την εισβολή καρκίνου και μετάσταση

Παράθεση:. Davuluri G, Augoff Κ, Schiemann WP, άροτρο EF, Sossey-Alaoui K (2014 ) WAVE3-NFκB αλληλεπίδραση είναι απαραίτητη για την επιβίωση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10.1371 /journal.pone.0110627

Επιμέλεια: Chengfeng Yang, το Michigan State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Ιούλ του 2014? Αποδεκτές: 16 Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Davuluri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο έλαβε στήριξη από επιχορηγήσεις P01 HL073311 και R01 HL096062, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, NIH.gov, EFP? και Ρ30 επιχορήγηση CA43703, υπόθεση Comprehensive Cancer Center, Case.edu, να KS-A και WPS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από την πρωτοβάθμια site τους, να επιβιώσουν στο /λεμφικό σύστημα του αίματος και στη συνέχεια να δημιουργήσει μια νέα θέση σε ένα μακρινό τόπο [1]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, που αναφέρεται επίσης ως καταρράκτη εισβολή-μετάσταση, τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν εξειδικευμένες F-ακτίνης πλούσια προεξοχές ονομάζεται invadopodia, να συγκεντρωθεί την ενζυματική δραστικότητα των ΜΜΡ για την υποβάθμιση της ECM, επιτρέποντας έτσι στα καρκινικά κύτταρα να εισβάλουν και να μεταναστεύσουν μέσω μικροπεριβάλλον τους [2], [3]. Οι πρωτεΐνες WASP /WAVE διαδραματίσουν κεντρικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων του σχήματος κυττάρου, κινητικότητας, κυτοκίνηση καθώς και καρκινικών κυττάρων εισβολή [4] – [6]. WAVE3, ιδιαίτερα, έχει δειχθεί ότι είναι βασική για την κινητικότητα και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [7] – [9], συμβάλλοντας στο σχηματισμό των επεκτάσεων ελασματοπόδια στην αιχμή της επεμβατικής κυττάρων [8], [10]. Η έκφραση του WAVE3 επίσης έντονα εμπλουτισμένο σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού (BC) [11] – [14]. Στην πραγματικότητα, η ενισχυμένη έκφραση και τη δραστηριότητα των WAVE3 έδειξε να συμβάλει η μετάσταση του triple-αρνητικών καρκίνων του μαστού (TNBC), την πιο επιθετική υπότυπος π.Χ. [14] – [16].

ΝΡκΒ ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα είναι γνωστή για να εμπλακεί στην επιβίωση, εισβολή, και μετάσταση διαφόρων τύπων καρκίνου [17], [18]. Η ενεργοποίηση της οδού ΝΡκΒ είναι αναγκαία για διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές αποκρίσεις που κυμαίνονται από την τοποθέτηση μιας επιτυχημένης ανοσολογική απάντηση και για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [19] – [21]. Η οικογένεια NFκB των μεταγραφικών παραγόντων αποτελείται από πέντε μέλη, p50, ρ52, ΚεΙΑ (p65), RelB και c-συνδεδεμένη, τα οποία αποτελούν ομομερείς ή ετερομερικά διμερή να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [22]. Σε κύτταρα σε ηρεμία, ΝΡκΒ διατηρείται σε μεταγραφικά κατάσταση ηρεμίας με το να απορροφάται στο κυτταρόπλασμα σε σύμπλοκα πρωτεΐνης με μέλη των αναστολέων της ΙκάππαΒ οικογένειας (ΙκΒ), συμπεριλαμβανομένων των ΙκΒα, IκBβ, IκBε. Στην κλασική οδό, TNFa μπορεί να προκαλέσει ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ) μεσολάβηση φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση του πρωτεασώματος ΙκΒα, ακολουθούμενη από φωσφορυλίωση και πυρηνική μετατόπιση του ετεροδιμερούς ρ50-ρ65 να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων ΝΡκΒ [23]. Ο ΝΡκΒ έχει δειχθεί ότι διεγείρουν την παραγωγή των MMPs, συμπεριλαμβανομένων ΜΜΡ1, ΜΜΡ3, και ΜΜΡ9 [24] – [26]. Είναι ενδιαφέρον, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι WAVE3 μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση και την δραστηριότητα αυτών των MMPs, υποδηλώνοντας εν δυνάμει ρόλο WAVE3 /ΝΡκΒ αλληλεπίδραση στη ρύθμιση της ΜΜΡ9 και δραστηριότητα invadopodia σε καρκινικά κύτταρα [8], [10].

Εδώ παρουσιάζουμε ενδείξεις ότι η προώθηση της μετάστασης δραστηριότητα WAVE3 επιτυγχάνεται εν μέρει μέσω της ρύθμισης της NFκB σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι η απώλεια του WAVE3 στο μεταστατικό BC MDA-MB-231 κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα αναστολή της δραστικότητας του ΝΡκΒ. Αντιστρόφως, η υπερέκφραση του WAVE3 ενισχύει σηματοδότηση ΝΡκΒ. Δείχνουμε ότι WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση του ΝΡκΒ απαιτείται για το σχηματισμό invadopodia καθώς έκφραση ΜΜΡ9 και η δραστικότητα που απαιτούνται για τα καρκινικά κύτταρα να υποβαθμίσει το ECM. Τέλος, δείχνουμε ότι στοχευμένη-αναστολή της WAVE3 ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση και κυτταρικό θάνατο μέσω της αναστολής της ΑΚΤ και την επιβίωση κασπάσης οδών κατάντη του ΝΡκΒ. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας δημιουργήσει μια νέα λειτουργία για WAVE3 που είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση των ΝΡκΒ σηματοδότησης και υποστηρίζουν τη χρήση των αναστολέων WAVE3 σε συνδυασμό θεραπειών για να στοχεύουν συγκεκριμένα μετάσταση του καρκίνου.

Πειραματικές Διαδικασίες

Αντισώματα

Rabbit anti-WAVE3 (1:1000), αντι-ΜΜΡ9 (1:1000), αντι-ΜΜΡ2 (1:1000), αντι-p38 (1:1000), αντι φωσφο ρ38 κουνελιού (1:1000), ΕΚΚ φωσφο κουνέλι (1:1000), ΕΚΚ κουνέλι (1:1000), κουνελιού αντι φωσφο ΑΚΤ (Ser473? 1:1000), αντι panAKT κουνέλι (1:1000), αντι φωσφο JNK κουνελιού (1 :1000), κουνελιού αντι-ΙΝΚ (1:1000), αντι-φωσφο ρ65 ποντικού (Ser536) (1:1000), κουνελιού αντι-Cortatcin είναι από τη Cell Signaling Technologies. (Danvers, ΜΑ)? ποντικού αντι-ΟΡΡ, ποντικού αντι-WAVE2 (1:3000), ποντικού αντι-WAVE1 (1:3000) είναι από την Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA)? αντι-κουνελιού ΝΡκΒ ρ65 (1:5000) από Biolegend (San Diego, CA), κουνελιού αντι ΕΣΚΔΕ1 (1:2000), κουνελιού αντι ABI1 (1:5000), αντι CYFIP2 κουνελιού (1:3000), ποντικού αντι-ακτίνης (1:5000), κουνελιού αντι-Μγο (1:1000) είναι από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ)? κατσίκα συζευγμένη με ραφανιδική υπεροξειδάση αντι-ποντικού IgG (1:5000) και κατσίκας συζευγμένη με ραφανιδική υπεροξειδάση IgG αντι-κουνελιού (1:5000) από την Calbiochem? και Alexa 488-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού και Alexa 568-συζευγμένη αντι-ποντικού IgG, Alexa 568-συζευγμένη φαλλοειδίνη είναι από την Invitrogen. Vecta-ασπίδα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη ήταν από τα Vector Laboratories (Burlingame, CA). αντιδραστήρια ηλεκτροφόρηση γέλης ήταν από την Bio-Rad (Hercules, CA).

siRNA και shRNA έκφραση του γονιδίου νοκ ντάουν

Χρησιμοποιήσαμε το On-Targetplus SMARTpool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), και SignalSilence ΙκΒα siRNA (Cell Signaling Technology) για παροδική knockdown έκφρασης WAVE2, WAVE3, CYFIP2 και ABI1, αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (14). Σταθερό knockdown του WAVE3 επιτεύχθηκε μέσω διαμόλυνση των κυττάρων MDA-MB-231 και ΒΤ549 BC είτε με τον έλεγχο μη-στόχευση shRNA ή των κλώνων WAVE3 MISSION shRNA (Sigma) που ακολουθείται από επιλογή πουρομυκίνης των θετικών κλώνων όπως περιγράφηκε προηγουμένως (12).

Cell Culture

Ανθρώπινο MDA-MB-231 ΒΤ549 και MCF7 BC κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειου ορού (FBS), 100 μονάδες πενικιλίνης /ml, 100 μg στρεπτομυκίνης /ml. Για διέγερση με TNFa, τα κύτταρα πρώτα υποβλήθηκαν σε ορό λιμοκτονία για την ολονύκτια σε DMEM χωρίς εμβρυϊκό ορό βοοειδούς, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 ng /ml ΤΝΡα ή το DMSO αραιωτικό (βασικές συνθήκες) ως ο αρνητικός έλεγχος θεραπείας για 15 λεπτά. Για την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης, κύτταρο υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυκλοεξιμίδιο (CHX? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στα 50 μg /ml και επωάστηκαν για 24 ώρες. Για την αναστολή πρωτεασώματος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε συγκέντρωση 20 μΜ και επωάστηκαν για 24 ώρες. Η Akt αναστολέα ΜΚ-2206 (Select Chemicals, Yorktown, ΤΧ) χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ για τη θεραπεία κυττάρων για 16 ώρες, ενώ η ΙΚΚβ-αναστολέα (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε στην τελική συγκέντρωση του 10 μΜ για τη θεραπεία κυττάρων για 24 ώρες.

η κυτταρομετρία ροής

MDA-MB-231 ή ΒΤ549 κύτταρα, επιμολυσμένα με είτε τον έλεγχο μη-στόχευση shRNA ή την shWAVE3, υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡα για 3 ώρες και πολλαπλασιάζονται σε τροποποιημένο μέσο καλλιέργειας ϋυΐββοοο μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% FBS και πουρομυκίνης (5 μg /mL). Υποσυρρέουσες κυτταρικές καλλιέργειες αποσπάστηκαν με τρυψινοποίηση και πλύθηκε με ισορροπημένο διάλυμα αλάτων Hank με Ca2 +, Mg2 +, και 0,1% BSA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Roche In-Situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Φλουορεσκεΐνη). Ιωδιούχου προπιδίου έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των νεκρών κυττάρων. Όλα τα δεδομένα που αποκτήθηκαν σε ένα όργανο BD LSRII και αναλύονται με FlowJo 7.6.3 (Treestar) λογισμικού. Η μη ειδική πρόσδεση του δευτερογενούς αντισώματος και μόνο στα κύτταρα αφαιρέθηκε από όλα κυτταρομετρίας ροής δεδομένων για να δώσει τις προκύπτουσες τιμές έντασης φθορισμού που εμφανίζονται.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

ολόκληρου κυτταρολύματα που περιέχουν παρόμοιες ποσότητες των συνολικών πρωτεΐνη (~ 50 μg) διαχωρίστηκαν σε 10% δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου, ακολουθούμενη από μεταφορά σε νιτροκυτταρίνη (Bio-Rad, Hercules, CA) ή Immobilon-Ρ (Millipore, Billerica, μΑ) μεμβράνες με τη χρήση της Bio-Rad τζελ και συσκευές μεταφοράς. Οι μεμβράνες επωάστηκαν σε 5% πλήρους γάλακτος ή αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), που ακολουθείται από επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα (όπως προσδιορίζεται) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν στο κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, και ανοσοσυμπλέγματα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας Western φώτα από την Perkin-Elmer (Boston, ΜΑ). Σήματα ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ σύμφωνα με τις παραμέτρους που περιγράφονται στο εγχειρίδιο ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Οι μέσες τιμές από 3 διαφορετικές κηλίδες παρουσιάζονται.

NFκB Λουσιφεράσης Reporter

Cignal NFκB κιτ δοκιμασίας ρεπόρτερ από Qiagen Inc (Valencia, CA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, MDA-ΜΒ 231 ή ΒΤ549 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με siWAVE3 ή siWAVE2 με ΝΡκΒ ρεπόρτερ, θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, μαζί με ένα ρεπόρτερ λουσιφεράσης Renilla κατασκεύασμα για εσωτερική ομαλοποίηση. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ng /ml ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ΤΝΡα για 30 λεπτά εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) διεξήχθησαν σε πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας Veritas Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), και οι τιμές δραστηριότητα υποκινητή που εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες μετά από κανονικοποίηση για λουσιφεράσης δραστικότητα του ανταποκριτή Renilla. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και οι τυπικές αποκλίσεις των τιμών που υποδεικνύεται.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου και πλένονται με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε 0.2% Triton Χ-100 σε PBS για 15 λεπτά, πλύθηκαν και πάλι με PBS και επωάζονται εντός του διαλύματος αποκλεισμού που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma) σε PBS για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτογενής και δευτερογενής αντισώματα αραιώθηκαν στη συνιστώμενη συγκέντρωση σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα για 1 ώρα, πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα. νημάτια ακτίνης (F-ακτίνη) βάφτηκαν με ροδαμίνη-συζευγμένα phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) σε PBS. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλακίδια αντικείμενο χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης Vectashield που περιέχει 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Vector Laboratories, Burlingame, CA). εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon TE2000-Ε ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Σήματα ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ σύμφωνα με τις παραμέτρους που περιγράφονται στο εγχειρίδιο ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Μέσες τιμές από 5 διαφορετικές εικόνες χαράχθηκαν.

ζυμογραφία ζελατίνης

πηκτώματα ακρυλαμιδίου Ζελατίνη ζυμογραφία (10%) παρασκευάσθηκαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες [8]. Η ζελατίνη προστέθηκε στο διάλυμα γέλης σε μία τελική συγκέντρωση ζελατίνης 1 mg /ml. Το υπερκείμενο χωρίς κύτταρο αναμίχθηκε με 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος, επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, και 25 μΐ του μίγματος φορτώθηκαν σε πηκτώματα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή επωάστηκε σε ρυθμιστικό αναδιάταξης Ζυμόγραμμα με ήπια ανάδευση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση στον αναπτυσσόμενο ρυθμιστικό Ζυμόγραμμα στους 37 ° C για τουλάχιστον τέσσερις ώρες. δραστικότητα ζελατινάσης οπτικοποιήθηκε με χρώση των πηκτωμάτων με Coomassie Brilliant Blue G250 και αποχρωματίζονται σε οξικό οξύ-μεθανόλη-DH

2O (1:03:06). Τομείς δραστηριότητας της πρωτεάσης φωτογραφήθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή SLR.

Δοκιμασία σχηματισμού Invadopodia

δοκιμασίες υποβάθμιση FITC-ζελατίνη πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή (Invitrogen). Εν συντομία, καλυπτρίδες (διαμέτρου 18 mm) επικαλύφθηκαν με 50 μg /ml πολυ-L-λυσίνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 0,5% γλουταραλδεΰδη για 15 λεπτά και πλύθηκαν με PBS για 3 φορές. Μετά την πλύση, οι καλυπτρίδες αναστράφηκαν σε μία σταγόνα 0,2% FITC συζευγμένο ζελατίνη σε PBS που περιέχει 2% σακχαρόζη, επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS 3 φορές, σβήστηκε με βοροϋδρίδιο νατρίου (5 mg /ml) για 3 λεπτά και τελικά επωάζεται σε 2 ml πλήρους μέσου για 2 ώρες. Τα κύτταρα (2 χ 10

5 κάθε φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε FITC επικαλυμμένα με ζελατίνη καλυπτρίδες και επωάστηκαν στους 37 ° C για 12 ώρες. Invadopodia και ECM υποβάθμιση τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού όπως περιγράφεται [27], [28]. ανάλυση του σήματος και ανακατασκευή των εικόνων 3D πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα ελέγχθηκαν για τη σημασία χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή ενός αταίριαστο του Student. Ένα

σ

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

WAVE3 απαιτείται για τη δράση του ΝΡκΒ

Για να τεκμηριώσει την αλληλεπίδραση μεταξύ WAVE3 και ΝΡκΒ σηματοδότησης , χρησιμοποιήσαμε έναν προσδιορισμό ΝΡκΒ ανταποκριτή λουσιφεράσης που βασίζονται στην εκτίμηση των αλλαγών στην δραστικότητα του ΝΡκΒ με την παρουσία και απουσία του WAVE3. Ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση ΝΡκΒ, χρησιμοποιήσαμε TNFa, μια γνωστή διεγέρτη ΝΡκΒ σηματοδότησης. Βρήκαμε ότι η θεραπεία ΤΝΡα του MDA-MB-231 ή ΒΤ549 κύτταρα αυξημένη δραστηριότητα του ΝΡκΒ κατά τουλάχιστον 3-φορές στις δύο κυτταρικές σειρές συγκριτικά με μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ. S1 σε S1 File). Ωστόσο, στην WAVE3-knockdown κυττάρων (sh-W3) (Εικ. 1Α ένθετο), η δραστηριότητα της λουσιφεράσης, και επομένως η δράση του ΝΡκΒ, μειώθηκε κατά τουλάχιστον 4-φορές σε σύγκριση με MDA-MB-231 επιμολυσμένα με τον έλεγχο μη-στόχευσης shRNA (Ctrl-sh) (Εικ. 1Α). Έτσι, WAVE3 ήταν απαραίτητη για τη δραστηριότητα του ΝΡκΒ. Αυτή η αναστολή της δραστικότητας του ΝΡκΒ ήταν ειδικά για την απώλεια του WAVE3 αφού knockdown έκφρασης WAVE2, ένα άλλο κύμα ισομορφή, δεν είχε επίδραση επί της δραστικότητας του ΝΡκΒ (Εικ. S2 σε S1 File).

(Α) με βάση Luciferase δοκιμασίας ρεπόρτερ ΝΡκΒ σε MDA-MB-231 κυττάρων με σταθερή επιμόλυνση ενός μη-στόχευσης shRNA (Ctrl-sh) ή το WAVE3-trageting shRNA (sh-W3). (Ένθετο) ανάλυση κηλίδας Western των πρωτεϊνικών προϊόντων λύσης από κύτταρα που περιγράφονται στο (Α) με αντι-WAVE3 αντίσωμα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (*, P & lt? 0,05). (Β) ανάλυση κηλίδας Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα των προϊόντων λύσης πρωτείνης από Ctrl-sh MDA-MB-231 και δύο διαφορετικά shWAVE3 προερχόμενο κλώνοι (sh-W3-1 και SH-W3-2), πριν και μετά τη θεραπεία ΤΝΡα (50 ng /μl για 15 λεπτά). Οι αριθμοί κάτω από το ρ-ρ65 και τα πάνελ WAVE3 δείχνουν την πολλαπλή μεταβολή του ρ-p65 και τα επίπεδα WAVE3, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Ctrl-sh. (Γ) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων ρ-ρ65 στις ενδεικνυόμενες συνθήκες. (D) ανάλυση κηλίδας Western με αντίσωμα p65 των κυτταρολυμάτων πυρηνικό κλάσμα από το Ctrl-sh και τα κύτταρα SH-W3 MDA-MB-231, με ή χωρίς θεραπεία TNFa. H2b χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για το πυρηνικό κλάσμα. Οι αριθμοί κάτω από τον πίνακα H2b δείχνουν τις φορές επίπεδα αλλαγή p65 σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Ctrl-sh. (Ε) Ανοσο-χρώση για πυρηνικής μετατόπισης (λευκά βέλη) της πρωτεΐνης ρ65 (Κόκκινο) σε Ctrl-sh και shWAVE3 κύτταρα MDA-MB-231. Κύτταρα πυρήνες είναι αντι-χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε). (F) Ποσοτικοποίηση των p65 πυρηνική χρώση. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, ή είναι ο μέσος όρος ± SD (η = 3? *, Ρ & lt? 0,05? T-test του Student)

Η

Η φωσφορυλίωση της υπομονάδας ΝΡκΒ ρ65 στη σερίνη 536 και πυρηνική μετατόπιση του είναι απαιτούμενα βήματα για την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ. Βρήκαμε απώλεια WAVE3 σε MDA-MB-231 να αναστέλλει σημαντικά (3- έως 8-φορές μείωση) των επιπέδων φωσφορυλίωσης ρ65 (Εικ. 1Β και 1Γ). Ακόμα και μετά από διέγερση με TNFa, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ρ65 σε WAVE3-knockdown κυττάρων δεν μπορεί να αποκατασταθεί σε αυτά τα επίπεδα που βρίσκονται σε μη-στόχευση shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 1Β και 1Γ). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε κύτταρα ΒΤ549 (Σχ. S3 σε File S1). Επιπλέον, πυρηνική μετατόπιση του p65, το οποίο είναι το τελευταίο βήμα στον καταρράκτη ενεργοποίησης του ΝΡκΒ σηματοδότησης, επίσης ανέστειλε σημαντικά σε WAVE3-knockdown κυττάρων MDA-MB-231, όπως μετράται από τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ65 στον πυρήνα (10-πλάσια μείωση) τόσο από ανοσοκηλίδωση του πυρηνικού κλάσματος των προϊόντων λύσης κυττάρου (Εικ. 1 D) και ανοσοχρώση αναλύσεις (5-πλάσια μείωση) ολόκληρων κυττάρων (Εικ. 1 Ε, 1 F και το Σχ. S4 στο S1 File). Και πάλι, η διέγερση του WAVE3-knockdown κυττάρων με ΤΝΡα απέτυχε να αυξήσει ρ65 εντός του πυρηνικού κλάσματος σε επίπεδα που βρίσκονται στα κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο μη-στόχευσης shRNA (Εικ. S4 στο S1 File). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω τη συμμετοχή των WAVE3 στην ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης του ΝΡκΒ.

WAVE3 υπερέκφραση ενεργοποιεί δραστηριότητα σηματοδότησης ΝΡκΒ

Για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς WAVE3 διαμορφώνει τη σηματοδότηση ΝΡκΒ, εφαρμόσαμε ένα συνδυασμό γενετικών και φαρμακολογικών μέσων να χειριστούν μόρια τελεστές στην οδό ΝΡκΒ. Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε αν η υπερέκφραση εξωγενούς WAVE3 μπορεί να επηρεάσει NFκB δραστηριότητα. Για να γίνει αυτό, μπορούμε είτε υπερεκφράζεται GFP μόνη ή πρωτεΐνη σύντηξης GFP-WAVE3 σε MDA-MB-231 κύτταρα και αξιολογήθηκαν για δραστηριότητα του ΝΡκΒ. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης ΝΡκΒ που βασίζεται περιγράφεται στο Σχήμα 1Α, βρήκαμε υπερέκφραση WAVE3 (Εικ. 2Α) διεγείρεται δραστικότητα του ΝΡκΒ από 3-πλάσια αύξηση (Εικ. 2Β). Συνεπής με αυτή την παρατήρηση, WAVE3-overexpresion διεγείρονται και (& gt? 3πλάσια αύξηση) p65 φωσφορυλίωση χωρίς να επηρεάζει τα συνολικά επίπεδα έκφρασης p65 (Σχήμα 2C.). Αντιστρόφως, η θεραπεία με ένα συγκεκριμένο αναστολέα της ΙΚΚβ (ΙΚΚβ-I), στο ανάντη ενεργοποιητή του ΝΡκΒ σηματοδότησης, αμβλύνθηκε το ΤΝΡα διαμεσολαβούμενη διέγερση του φωσφο-ρ65 στα WAVE3 υπερεκφράζουν MDA-MB-231 κύτταρα (0.9-φορές μεταβολή στην TNFa και ΙΚΚβ-Ι-κατεργασμένων κυττάρων έναντι 3,2 φορές αλλαγή στα επίπεδα του TNFα μόνο επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2D)). Έτσι, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω το ρόλο του WAVE3 στη ρύθμιση της ΝΡκΒ σηματοδότησης. Στη συνέχεια, θα παρακολουθείται η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης p65 και ο κύκλος εργασιών στο GFP και WAVE3-υπερεκφράζουν MDA-MB-231 κυττάρων μετά από θεραπεία με κυκλοεξαμίδιο (CHX), ένας ισχυρός αναστολέας της

novo

σύνθεση de πρωτεΐνης. Ενώ τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ρ65 αυξήθηκαν (~3- έως 4-πλάσια αύξηση) στις WAVE3 υπερεκφράζουν κύτταρα, η θεραπεία με CHX δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης του συνολικού ρ65 (Εικ. 2Ε). Παρομοίως, η αγωγή με το MG-132, μια ένωση που αναστέλλει την πρωτεασώματος μεσολάβηση πρωτεϊνικής αποδόμησης, δεν επηρέασε την WAVE3 μεσολάβηση αύξησης του φωσφορυλιωμένου p65 στην WAVE3 υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχ. 2F), ενώ τα επίπεδα της ολικής ρ65 παρέμειναν αμετάβλητες ( Σχ. 2F). Έτσι, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση του ΝΡκΒ σηματοδότηση δεν απαιτεί την συμμετοχή των WAVE3 σε πρωτεΐνες νεο-σύνθεση (τα δεδομένα CHX, Εικ. 2Ε) ή t πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμησης πρωτεΐνης (τα MG-132 δεδομένα, το σχ . 2F).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης WAVE3-GFP σε GFP και GFP-W3-εκφράζοντα κύτταρα. (Β) λουσιφεράσης με βάση δοκιμασία ανταποκριτή ΝΡκΒ σε GFP και GFP-WAVE3 κύτταρα που εκφράζουν (*, ρ & lt? 0,05). (C & amp? D) ανάλυση κηλίδας Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα κυτταρολυμάτων από το GFP και WAVE3-GFP κύτταρα που εκφράζουν. Οι αριθμοί κάτω από τον πίνακα GFP δείχνουν τις φορές μεταβολής επιπέδων p-p65 σε σχέση με τα κύτταρα GFP. (Ε & amp? F) ανάλυση κηλίδας Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα κυτταρολυμάτων από το GFP και WAVE3-GFP που εκφράζουν κύτταρα μετά από αγωγή με κυκλοεξαμίδιο (CHX, E) και το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (F). Οι αριθμοί κάτω από τον πίνακα GFP δείχνουν τις φορές μεταβολής επιπέδων p-p65 σε σχέση με τα κύτταρα GFP. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε έλεγχος φόρτωσης. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, ή είναι ο μέσος όρος ± SD (η = 3? *, Ρ & lt? 0,05? T-test του Student)

Η

WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση του ΝΡκΒ σηματοδότησης δεν απαιτούν άλλα μέλη του WAVE ρυθμιστικών συγκρότημα

WAVE3, όπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας WASP /WAVE, είναι γνωστό ότι λειτουργεί σαν ένας ενεργοποιητής του συμπλέγματος ARP2 /3 για την προώθηση του πολυμερισμού της ακτίνης και κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση. Για WAVE πρωτεΐνες για να εκτελέσετε αυτή κυτταροσκελετού λειτουργία αναδιοργάνωση, πρέπει να ενσωματωθεί σε μια πενταμερή σύμπλοκο πρωτεΐνης, που αναφέρεται επίσης ως το ρυθμιστικό συγκρότημα WAVE (WRC) ότι, εκτός από την WAVE πρωτεΐνες, περιέχει επίσης ΕΣΚΔΕ1, ABI1 /2, CYFIP2 και HSPC300 [29]. Κατά συνέπεια, απευθύνεται το ερώτημα κατά πόσον η WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση NFκB σηματοδότησης απαιτεί τη συμμετοχή των άλλων μελών του WRC. Πρώτον, δείξαμε ότι ενώ siRNA μεσολάβηση knockdown του WAVE3 οδήγησε σε σημαντική αναστολή (& gt? 8-φορές μείωση) της έκφρασης WAVE3, αυτό δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης των άλλων τεσσάρων μελών της WRC (Σχήμα 3Α).. Αντιστρόφως, siRNAs που κατευθύνονται έναντι είτε ABI1 ή CYFIP2, η οποία είχε ως αποτέλεσμα επιλεκτική απώλεια της έκφρασης των αντίστοιχων στόχων τους, δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης των άλλων μελών του WRC (Εικ. 3Α). Λειτουργικά, και όπως αναμενόταν, WAVE3-knockdown ανέστειλε ΝΡκΒ σηματοδότησης (5-φορές μείωση), όπως μετράται με την φωσφορυλίωση του ρ65 απώλειας (Σχ. 3Β). Παρ ‘όλα αυτά, μειωμένη έκφραση οποιουδήποτε από τα άλλα μέλη του WRC (ABI1 και CYFIP2) δεν επηρέασε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ρ65 (Σχ. 3Β). Επιπλέον, ενώ η διέγερση με TNF αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης ρ65 τόσο τον έλεγχο και την knockdown κυττάρων, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης στα WAVE3-knockdown κυττάρων ήταν περισσότερο από δύο φορές μικρότερη από ό, τι στα κύτταρα siRNA ελέγχου ή ΑΒΙ ή CYFIP2 siRNA κύτταρα (Σχ. 3Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση NFκB σηματοδότησης δεν απαιτεί τη συμμετοχή των μελών του WRC, και ως εκ τούτου, αντιπροσωπεύει μια δραστηριότητα της WAVE3 εξαρτάται από την παραδοσιακή ιδιοκτησία πολυμερισμού της ακτίνης του στο WRC.

(α) ανάλυση κηλίδας Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης siRNA (Ctrl-σι) ή siRNA που στοχεύει είτε WAVE3 (si-W3), ABI1 si-ABI1), ή CYFIP2 (si-CYFIP2). (Β) ανάλυση κηλίδας Western με ρ-p65 και των συνολικών αντισωμάτων ρ65 από τα προϊόντα λύσης των κυττάρων που περιγράφονται στο (Α). Οι αριθμοί κάτω από τον πίνακα β-ακτίνης δείχνουν τις φορές αλλαγή επιπέδων p-p65 σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Ctrl-σι. Σε αμφότερα τα (Α) και (Β), β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Έκφραση και τη δραστηριότητα των ΜΜΡ9, ένα σημαντικό γονίδιο στόχο ΝΡκΒ, αναστέλλονται από την απώλεια του WAVE3

Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι τα σταθερά knockdown των αποτελεσμάτων WAVE3 στην απώλεια της έκφρασης και της δραστηριότητας αρκετών MMPs, συμπεριλαμβανομένων ΜΜΡ1, 3 και 9 [8]. Μεταξύ αυτών των MMPs, ΜΜΡ9 είναι ένας σημαντικός στόχος της οδού ΝΡκΒ, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι WAVE3 μπορεί να εμπλέκεται στη μεσολάβηση ΝΡκΒ ρύθμιση της ΜΜΡ9. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε κηλίδωση Western να διαπιστωθεί ότι η έκφραση ΜΜΡ9 αναστάλθηκε ως αποτέλεσμα της σταθερής knockdown του WAVE3? η μείωση στην πρωτεΐνη ΜΜΡ9 ήταν ~ 5-φορές σε MDA-MB-231 (Σχ. 4Α) και ~ 4-φορές σε κύτταρα ΒΤ549 (Εικ. S5 σε S1 File). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του WAVE1 και WAVE2 δεν επηρεάστηκαν από την απώλεια της WAVE3, και ως εκ τούτου δεν έχουν καμία σχέση με τις αλλαγές των επιπέδων MMP9 προκαλείται από WAVE3-νοκ ντάουν (Σχ. 4Α). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία ζυμογραφία ζελατινάσης να δείξει δραστικότητα ΜΜΡ9 ανεστάλη επίσης (5-φορές μείωση) στις WAVE3-knockdown κυττάρων (Εικ. 4Β). Επιπλέον, η διέγερση με TNFa, το οποίο είναι ένα σημαντικό ενεργοποιητής της οδού σηματοδότησης ΝΡκΒ, ενισχυμένη (αύξηση -3.5 φορές) δραστικότητα ΜΜΡ9 στα κύτταρα ελέγχου (Ctrl-sh). Ωστόσο, σε WAVE3-knockdown κυττάρων, διέγερση με ΤΝΡα δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει ΜΜΡ9 στα επίπεδα που παρατηρήθηκαν στα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4C). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η WAVE3 μεσολάβηση ρύθμιση της ΜΜΡ9 μπορεί να ασκηθεί μέσω διαμόρφωσης του ΝΡκΒ σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, τα επίπεδα έκφρασης και η δραστικότητα του ΜΜΡ9 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένδειξη για WAVE3 μεσολάβηση διαμόρφωση των επιπέδων ενεργοποίησης ΝΡκΒ.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα των κυτταρολυμάτων των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα μορφομετατραπέντα με μη-στόχευση shRNA (Ctrl-sh), και δύο διαφορετικών κλώνων sh-WAVE3 (SH-W3-1 και SH-W3-2). Οι αριθμοί κάτω από το WAVE3 και πίνακες ΜΜΡ9 δείχνουν τις φορές επίπεδα αλλαγής WAVE3 και ΜΜΡ9 σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα Ctrl-sh κύτταρα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) ζελατίνη zymography ενεργοποιημένου ΜΜΡ9 και ΜΜΡ2 σε ρυθμισμένα μέσα από τα Ctrl-sh δύο κλώνους sh-W3. Γ) Ζελατίνη ζυμογραφία ενεργοποιημένου ΜΜΡ9 πριν και μετά τη θεραπεία με ΤΝΡα στο ρυθμισμένο μέσο της Ctrl-sh και δύο κλώνοι SH-W3. Σε αμφότερα τα (Β) και (Γ), οι Red-Ponceau-βάφτηκαν πήγματα εμφανίζονται ως μάρτυρες φόρτωσης. Οι αριθμοί κάτω από τα πάνελ zymography δείχνουν την πολλαπλή μεταβολή των επιπέδων MMP9 σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Ctrl-sh.

Η

WAVE3 απαιτείται για το σχηματισμό invadopodia και την υποβάθμιση ECM μέσω NFκB σηματοδότησης

Η βιολογική σημασία της απώλειας WAVE3 και η επίδρασή του στην σηματοδότηση ΝΡκΒ διερευνήθηκαν μέσω της ικανότητας των καρκινικών κυττάρων για να σχηματίσουν invadopodia και υποβαθμίζουν την ECM, και τα δύο εκ των οποίων απαιτούν ενεργοποίηση ΜΜΡ9 οδηγείται από ΝΡκΒ σηματοδότηση. MDA-MB-231, όπως και πιο ιδιαίτερα επεμβατική καρκινικές κυτταρικές σειρές, σχηματίζουν invadopodia

in vitro

όταν εμβολιάζονται σε συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας. Για την παρακολούθηση της δραστηριότητας ΜΜΡ9 εντός invadopodia, MDA-MB-231 κύτταρα επικαλύπτεται πάνω φθορισμού καλυπτρίδες επικαλυμμένες με ζελατίνη. Μετά από χρώση για Ρ-ακτίνη, invadopodia παρατηρήθηκαν ως dot-όπως συστάδες των F-ακτίνης στην κοιλιακή επιφάνεια των κυττάρων που είναι σε άμεση επαφή με το υπόστρωμα ζελατίνης (Εικ. 5Α πάνελ Α). Αυτές οι δομές invadopodia επικαλύπτουν θέσεις αποικοδόμηση της μήτρας ζελατίνης (Εικ. 5Α, πάνελ Β και C) και μπορεί να απεικονιστεί σε 3-διαστάσεων (3-D) ανακατασκευάστηκε εικόνες ως εγκολπώσεις στην κλίνη ζελατίνης (Σχ. Πίνακα 5Α δ) . Cortactin είναι ένα πολύ γνωστό δείκτη για invadopodia (Σχ. S6 σε File S1). Βρήκαμε ότι η θεραπεία TNFα του MDA-MB-231 οδήγησε σε συν-εντοπισμό των WAVE3 με Cortactin σε δομές invadopodia (Εικ. 5Β), συνάδει με τη συμμετοχή των WAVE3 στο σχηματισμό invadopodia.

(Α) Ομοεστιακή μικροσκοπική μικροφωτογραφίες των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε FITC-επισημασμένο ζελατίνη και χρωματίστηκαν για (α) F-ακτίνης νημάτια (κόκκινο). Τα λευκά αιχμές βελών δείχνουν δομές invadopodia (λευκές κηλίδες). (Β) Οι περιοχές της υποβάθμισης ECM (μαύρο βέλος κεφαλής) εμφανίζονται ως μαύρα στίγματα. Οι δομές invadopodia συμπίπτουν με τις περιοχές της υποβάθμισης ECM στη συγχωνευμένη εικόνα (γ). (Δ) Σε 3-διαστάσεων ανακατασκευασμένη εικόνα τα μαύρα βέλη δείχνουν προς invadopodia (κόκκινο) διεισδύοντας το κρεβάτι ζελατίνη (πράσινο). (Β) Ομοεστιακή μικροσκοπική μικρογραφήματα των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε επικαλυμμένες με κολλαγόνο καλυπτρίδες, κατεργάζεται με TNFa (50 ng /μl) για 15 λεπτά, και χρωματίστηκαν για WAVE3 (αριστερό πάνελ) και Cortactin (μεσαίο πλαίσιο). Οι αιχμές βελών δείχνουν σε περιοχές με invadopodia όπου τόσο Cortactin και WAVE3 συνεντοπίζονται στη συγχωνευμένη εικόνα στο δεξί πλαίσιο (κίτρινες κηλίδες).

Η

Χρησιμοποιήσαμε αυτή τη δοκιμασία invadopodia ζελατίνη με βάση την εκτίμηση της επίδρασης της WAVE3 σχετικά με το σχηματισμό της invadopodia και στη συνέχεια την υποβάθμιση της ECM από MDA-MB-231 κύτταρα. Βρήκαμε μια σημαντική μείωση τόσο του αριθμού των invadopodia (Σχ. 6Α, αριστερό πάνελ και Σχ. 6Β), καθώς και το συνολικό εμβαδόν των invadopodia μεσολάβηση αποικοδόμηση της ζελατίνης σε WAVE3-knockdown κυττάρων σε σύγκριση με το μη-στόχευσης ελέγχου shRNA (Ctrl-sh) MDA-MB-231 κύτταρα (Σχήμα 6Α, μεσαίο πάνελ και το Σχ. 6C). Υπήρξε περισσότερο από 3-φορές μείωση (ρ & lt? 0,05) στον αριθμό των invadopodia (Σχήμα 6Β.) και πάνω από 10 φορές μείωση (ρ & lt? 0,05) στην περιοχή της αποικοδόμησης ECM στα WAVE3-knockdown κυττάρων σε σύγκριση με το κύτταρα ελέγχου (Σχ. 6C). Ενώ τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η απώλεια του WAVE3 αναστέλλει τόσο τον σχηματισμό invadopodia και την υποβάθμιση του ECM, το φαινόμενο αυτό φαίνεται να επηρεάζει την πλειονότητα των κυττάρων που παρατηρούνται κάτω από το μικροσκόπιο, και προσεκτική ανάλυση των δεδομένων μας δεν κατάφερε να βρει μια μείωση στον αριθμό των κυττάρων που σχηματίζουν invadopodia και υποβαθμίζουν την ECM, μάλλον, απώλεια WAVE3 φαίνεται να έχουν παγκόσμια επίδραση. Η θεραπεία με TNFa, η οποία οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των invadopodia στα κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0,01), δεν ήταν σε θέση να σώσει την αναστολή της invadopodia που προκαλείται από έλλειψη WAVE3 (Εικ 6D & amp?. 6Ε). Αντιστρόφως, η υπερβολική έκφραση των WAVE3 στις μη επεμβατικές κύτταρα MCF7 BC (Εικ S7A σε File S1), το οποίο είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι διεγείρει διεισδυτικότητα τους [30], οδήγησε σε σαφή αύξηση τόσο σχηματισμό invadopodia και αποικοδόμηση ζελατίνης με ΤΝΡα κυττάρων διεγερμένων (Σχ. S7B σε File S1).

(Α) Ομοεστιακή μικρογραφήματα μικροσκοπία ελέγχου shRNA- ή SH-WAVE3 εκφράζουν MDA ΜΒ-231-κύτταρα αναπτύχθηκαν σε FITC-επισημασμένο ζελατίνη και χρωματίστηκαν για F ακτίνη νημάτια (αριστερά πάνελ). Τα λευκά αιχμές βελών δείχνουν δομές invadopodia (λευκές κηλίδες). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.