Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Αρκετές μεταβολές στο μεταβολισμό του RNA έχουν βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα? Αυτό υποδηλώνει ότι τα μόρια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του RNA που εμπλέκονται στην ανάπτυξη αυτής της παθολογίας. Σε αυτή τη μελέτη, ψάξαμε για τα γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του RNA που εμφανίζουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του πνεύμονα. Εμείς εντοπίστηκαν οκτώ γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Από αυτές, επτά ήταν πάνω ρυθμισμένα ενώ ένας ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια δεν είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με τον καρκίνο του πνεύμονα. Αυτά τα γονίδια παίζουν διαφορετικούς ρόλους στο μεταβολισμό mRNA: τρεις συνδέονται με την σωμάτια συναρμογής (ASCL3L1, SNRPB και SNRPE), ενώ άλλοι συμμετέχουν στις διαδικασίες RNA που σχετίζονται, όπως η μετάφραση (MARS και MRPL3), mRNA σταθερότητα (PCBPC1), mRNA μεταφορών (ΡΑΕ ), ή επεξεργασία mRNA (ADAR2, επίσης γνωστή ως ADARB1). Επιπλέον, βρήκαμε μια υψηλή συχνότητα της απώλειας της ετεροζυγωτίας στο χρωμόσωμα 21q22.3, όπου ο τόπος ADAR2 βρίσκεται, σε κυτταρικές σειρές NSCLC και πρωτογενείς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του ADAR2 στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με συγκεκριμένες γενετικές απώλειες. Τέλος, σε μια σειρά ασθενών αδενοκαρκίνωμα, η έκφραση των πέντε της απελευθερωμένης γονίδια (ADAR2, MARS, ΡΑΕ, SNRPB και SNRPE) συσχετίζεται με την πρόγνωση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι αλλαγές στο μεταβολισμό του RNA εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα, και ταυτοποίηση νέων πιθανών στόχων για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας

Παράθεση:. Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga Ε, Γκόμεζ-Ρωμαϊκή J, Blanco D, et al. (2012) Προσδιορισμός των Μυθιστόρημα Απελευθερωμένης RNA Μεταβολισμού-γονιδίων που σχετίζονται με το μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10.1371 /journal.pone.0042086

Συντάκτης: Stefan Maas, Πανεπιστήμιο Lehigh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8, Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης Αυγούστου του 2012

Copyright: © Valles et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από «έργο UTE CIMA»? Ισπανική Κυβέρνηση (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 και PI10 /00166), το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης (ΕΤΠΑ) «Una manera de Hacer Europa». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους στον άνθρωπο και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως [1], [2]. Περιλαμβάνει δύο κύριες ιστολογικές υποτύπους, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), και τα τελευταία αντιπροσωπεύει το 80-85% όλων των περιπτώσεων. Ο καρκίνος του πνεύμονα συχνά ανιχνεύεται σε προχωρημένο στάδιο, στο οποίο σημείο η ασθένεια είναι σχεδόν ανίατη. Περαιτέρω χαρακτηρισμός των βιολογικών αλλαγών που συνδέονται με την παθογένεια της θα μπορούσε ενδεχομένως να βοηθήσει στον εντοπισμό νέων βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση και νέους στόχους για πιο αποτελεσματικές θεραπείες.

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι μια βιολογική διαδικασία απαραίτητη για την πολυμορφία της πρωτεΐνης. Μέσω εναλλακτικό μάτισμα, οι πολλαπλές μεταγραφές που παράγονται από ένα μόνο πρόδρομο mRNA. Μεταβολές σε εναλλακτικό μάτισμα αποδειχθεί ότι σχετίζονται με διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Αρκετά εναλλακτικά ματισμένες γονιδιακά προϊόντα έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη της νεοπλασματικής νόσου [3]. παραλλαγές ματίσματος Καρκίνος σχετιζόμενη μπορεί δυνητικά να χρησιμεύσει ως διαγνωστικά και προγνωστικά εργαλεία, καθώς και ως θεραπευτικοί στόχοι στον καρκίνο [4]. Στον καρκίνο του πνεύμονα, πολλές τροποποιήσεις ματίσματος έχουν περιγραφεί προηγουμένως σε διεργασίες σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως ανάπτυξη κυττάρου, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, ή αγγειογένεση [5] – [9]. Για παράδειγμα, έχουν υψηλά επίπεδα του αντι-αποπτωτική παραλλαγή Bcl-xL έχουν αναφερθεί να συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου σε τόσο SCLC και NSCLC [10], [11]. Πρόσφατα, οι αλλαγές μάτισμα που επηρεάζονται μεταγραφές των VEGFA, MACF1, APP, και μουδιασμένο καταδείχθηκαν σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [9]. Επιπλέον, η έκφραση ενός συγκεκριμένου ισόμορφου του ναρκωμένος σε δείγματα όγκων δείχθηκε ότι προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [9]. Επιπλέον, η διαμόρφωση της κασπάσης 9 εναλλακτικό μάτισμα αποδείχθηκε ότι επηρεάζουν την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC σε ορισμένες χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [12].

Οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω παρεκκλίνουσα εναλλακτικό μάτισμα στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μεταλλάξεις σε ρυθμιστικά στοιχεία ματίσματος μέσα στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων του γονιδίου σε αποτέλεσμα τροποποιήσεις στην επιλογή θέση ματίσματος, με τη σειρά του οδηγεί σε εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές [13]. Σε άλλες περιπτώσεις, οι αλλαγές στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με mRNA-μεταβολισμός είναι υπεύθυνα για τις μη κανονικά πρότυπα ματίσματος. Μερικές μελέτες έχουν αναφέρει αλλαγές στην συγκέντρωση, τον εντοπισμό, τη σύνθεση ή τη δραστηριότητα αρκετών πρωτεϊνών RNA δέσμευσης στον καρκίνο του πνεύμονα [14] – [19], υποδηλώνοντας ότι αυτή η οδός συχνά μεταβάλλεται και είναι σημαντικό για τον κακοήθη μετασχηματισμό. Το RNA πρωτεΐνη δέσμευσης SF2 /ASF υπερεκφράζεται σε όγκους NSCLC και προωθεί την επιβίωση με την ενίσχυση της έκφρασης της survivin [18]. Μελέτες σε ζωικά μοντέλα δείχνουν ότι η μεταβολή της ισορροπίας μεταξύ των διαφόρων πρωτεϊνών RNA-δεσμευτικές συμβάλλει στην καρκινογένεση του πνεύμονα [20], [21]. Ωστόσο, ο χαρακτηρισμός του ρεπερτορίου των μορίων του μεταβολισμού που σχετίζονται με το RNA που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα είναι σήμερα ελλιπής και χρειάζονται περαιτέρω μελέτες δικαιολογημένη.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει νέες RNA γονίδια του μεταβολισμού που σχετίζονται με αλλοιωμένη έκφραση σε πρωτοπαθείς όγκους του πνεύμονα. Χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχίας αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, ψάξαμε για γονίδια που εμφάνισαν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του πνεύμονα. Έχουμε εντοπίσει επτά mRNA πρωτεΐνες του μεταβολισμού που σχετίζονται με τα πάνω ρυθμισμένα σε ιστούς όγκων και μία κάτω ρυθμισμένα. Ορισμένα από τα υπερ-εκφρασμένα γονίδια ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών συρραφής, εμπλέκοντας αυτήν κυτταρικός μηχανισμός για την ανάπτυξη του NSCLC. Η κατιούσα ρύθμιση γονίδιο ADAR2 βρισκόταν σε μια περιοχή με υψηλή συχνότητα των διαγραφών σε NSCLC. Επιπλέον, η έκφραση των πέντε από αυτά τα γονίδια συνδέθηκε με την πρόγνωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, υποστηρίζοντας τη σημασία του μεταβολισμού του RNA στη βιολογία του καρκίνου του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

γονίδιο επιλογής με ανάλυση βιοπληροφορικής

γονίδια που ανήκουν στις κατηγορίες RNA μεταβολισμό σχετίζονται επιλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων Gene Ontology (www.godatabase.org). Τρεις μεγάλες κατηγορίες RNA μεταβολισμό σχετίζονται επιλέχθηκαν: «δεσμευτικό RNA», «μάτισμα RNA», και «σωμάτια συναρμογής συγκρότημα». Η πολλαπλή μεταβολή (FC) των επιπέδων έκφρασης γονιδίου μεταξύ φυσιολογικού και του αδενοκαρκινώματος πνευμονικό ιστό υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα από τρία πειράματα μικροσυστοιχιών [22] – [24]. Ένα σύνολο γονιδίων με τα επίπεδα έκφρασης του mRNA σημαντικά διαφορετική μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ιστών ελήφθη από κάθε ένα από τα τρία πειράματα μικροσυστοιχιών (Πίνακας S1). Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα δείχνεται στο Σχήμα 1Α, και η επικάλυψη μεταξύ των διαφόρων πινάκων παρουσιάζεται στην Εικόνα 1Β. Επιπλέον, βρήκαμε ότι αυτά τα γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, καρκίνωμα των πνευμόνων μικρών κυττάρων, και καρκινοειδές περιπτώσεις που υπάρχουν στα σύνολα δεδομένων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Να επιβεβαιώσει την εγκυρότητα αυτής της επιλογής, πρόσθετη

in silico

επικύρωση έγινε με μια τέταρτη ανεξάρτητη ομάδα ασθενών αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [25], καθώς και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα ευρήματα του αρχικού πειράματος (Πίνακας S2).

) γονίδια RNA που σχετίζονται με τα επίπεδα έκφρασης σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,01) μεταξύ των δειγμάτων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και τα δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα (10 τελευταίες στήλες) σε μία από τις βάσεις δεδομένων μικροσυστοιχίας που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη [23]. Κόκκινο χρώμα σημαίνει υψηλότερα επίπεδα έκφρασης, ενώ το πράσινο χρώμα υποδηλώνει χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης. Β) διάγραμμα Venn που αντιστοιχούν σε γονίδια με σημαντικές διαφορές έκφρασης μεταξύ φυσιολογικών και αδενοκαρκίνωμα δείγματα.

Η

Η έκφραση των επιλεγμένων RNA του μεταβολισμού που σχετίζονται με γονίδια στις γραμμές κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και της Πρωτοβάθμιας Πολιτισμών φυσιολογικού πνεύμονα

τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων εκτιμήθηκαν με συμβατική PCR σε SCLC και κυτταρικές γραμμές NSCLC και σε πρωτογενή κύτταρα ΝΗΒΕ. Για τα περισσότερα γονίδια, τα επίπεδα mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ήταν υψηλότερες από ό, τι στα κύτταρα ΝΗΒΕ (Σχήμα 2). Επιπλέον, τα επίπεδα mRNA ήταν γενικά υψηλότερες σε SCLC κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές NSCLC. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις στις οποίες τα επίπεδα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών δέσμευσης RNA προσδιορίστηκαν επίσης να είναι υψηλότερη σε σύγκριση με SCLC NSCLC [15]. Σε ADAR2, αρκετές καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα mRNA σε σύγκριση με κύτταρα ΝΗΒΕ. Αποκλείσαμε RNPS1 και SNRPC σε επακόλουθες αναλύσεις επειδή τα επίπεδα έκφρασης ήταν ομοιογενής μεταξύ όλων των τύπων κυττάρων.

Τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και τα φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά (ΝΗΒΕ). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου. SCLC: μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα? ADC: αδενοκαρκίνωμα? SCC: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC: μεγάλο καρκίνωμα? CT: καρκινοειδή όγκο? NC:. Αρνητικός έλεγχος (νερό)

Η

Για την ποσοτικοποίηση διαφορών στα επίπεδα έκφρασης, σε πραγματικό χρόνο PCR για κάθε μία από τις οκτώ επιλεγμένων γονιδίων πραγματοποιήθηκε στον πίνακα των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα, καθώς επίσης και σε ΝΗΒΕ κύτταρα και φυσιολογικά πρωτογενή SAECs. Αυτή η ανάλυση επιβεβαίωσε τα προηγούμενα αποτελέσματα μας: έκφραση των up-ρυθμιζόμενα γονίδια ήταν υψηλότερη σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε σύγκριση με κύτταρα ΝΗΒΕ ή SAECs. Αντίθετα, η έκφραση ADAR2 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα ήταν χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα ΝΗΒΕ ή SAECs (Σχήμα 3).

Τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και μη κακοήθεις καλλιέργειες πνεύμονα πρωτογενούς (ΝΗΒΕ και SAEC). HPRT χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν ομαλοποιήθηκαν αναλογίες έκφρασης σε σχέση με τα επίπεδα του γονιδίου σε κύτταρα ΝΗΒΕ. Αναλογίες & gt? 1 δείχνουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης από ό, τι στα κύτταρα ΝΗΒΕ, ενώ οι αναλογίες & lt? 1 δηλώνουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης

Η

γενετικές μεταβολές στο ADAR2 Locus

Εμείς χαρακτηρίζονται οι γενετικές μεταβολές που συνδέονται. με ADAR2 κάτω ρύθμιση στον καρκίνο του πνεύμονα. Έτσι, αξιολογήσαμε την παρουσία LOH στο 21q22.3, την τοποθεσία του τόπου ADAR2. Χρησιμοποιήσαμε ένα πάνελ οκτώ ετερόζυγο μικροδορυφόρων. Οι μικροδορυφόροι ενισχύθηκαν με PCR και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Μικροδορυφόρων ετεροζυγωτίας που είχε εκτιμηθεί αρχικά στον πίνακα των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4. Σε έξι κυτταρικές γραμμές (Η23, HCC827, Α549, H322, H1385, και Η1299), όλες οι μικροδορυφόροι ήταν ομοζυγώτες. Αν και η παρουσία της απώλειας της ετεροζυγωτίας (ΑΕ), δεν είναι οριστικά πειστικές οφείλεται στην έλλειψη του συμφωνημένα κανονική γονιδιωματική DNA, αυτό ομοζυγωτία είναι εξαιρετικά απίθανη και υποδηλώνει έντονα απώλεια γενετικού υλικού. Σε άλλες κυτταρικές γραμμές τα αποτελέσματα ήταν μεταβλητή, και σε ορισμένες περιπτώσεις, πρότεινε εντοπισμένες περιοχές του LOH (π.χ., στην πιο κεντρομερική περιοχή στα κύτταρα Η157). Στη συνέχεια, συγκρίναμε την ομοζυγωτία σε 21q22.3 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ADAR2 (που συγκεντρώθηκαν προηγουμένως). Όλες οι κυτταρικές σειρές ομόζυγα για το μικροδορυφόρων εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα ADAR2 mRNA. Στην πραγματικότητα, δύο από τις τρεις κυτταρικές γραμμές με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ADAR2 mRNA (Α549 και H1385) ανήκουν σε αυτήν την ομάδα. Σε αντίθεση, οι πέντε κυτταρικές σειρές με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ADAR2 (H82, H187, Η157, Η226 και Η460) ήταν ως επί το πλείστον ετερόζυγο για τις μικροδορυφόρων πλαισιώνουν τον τόπο ADAR2 (D21S171 και D21S1574).

ομοζυγωτισμός (πράσινο) ή ετεροζυγωτία (κόκκινο) προσδιορίστηκε σε κάθε κυτταρική σειρά. Οι μικροδορυφόρων παραγγείλει από την πιο κεντρομερική στην πιο τελομερικού. ADAR2 τόπος βρίσκεται σε D21S171 και D21S1574.

Η

Μελετήσαμε την παρουσία ομοζυγωτίας σε 21q22.3 στο γονιδιακό DNA από 48 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Η αξιολόγηση των οκτώ μικροδορυφόρων σε ιστούς όγκων και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς μας επέτρεψε να προσδιορίσει με ακρίβεια τη συχνότητα της ΑΕ σε αυτή τη χρωμοσωμική περιοχή. Το σχήμα 5Α απεικονίζει τα τρία εναλλακτικά σχήματα ηλεκτροφορητικής λαμβάνεται: μη πληροφοριακές περίπτωση, η διατήρηση της ετεροζυγωτίας, και LOH. Μετά μικροδορυφορικών ανάλυση, LOH ταυτοποιήθηκε σε περίπου 30-40% των περιπτώσεων (Σχήμα 5Β). LOH στο 21q22.3 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινώματα πλακωδών κυττάρων σε σχέση με αδενοκαρκινώματα (25 ± 6% έναντι 49 ± 7%, ρ = 0,003). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη συχνότητα της ΑΕ βρέθηκαν μεταξύ των σταδίων (στάδιο Ι: 37 ± 2% έναντι στάδια ΙΙ-ΙΙΙ: 34 ± 7%, p = 0.279). Για να αξιολογηθεί η θέση ADAR2 πιο συγκεκριμένα, ένας SNP που βρίσκεται μέσα στο γονίδιο ADAR2 (rs1051367) αναλύθηκε. Από τις είκοσι κατατοπιστική περιπτώσεις (δηλ περιπτώσεις ετερόζυγο για SNP rs1051367 σε κανονικό ιστό), δεκαπέντε (75%) ήταν ομόζυγοι στο αντίστοιχο συμφωνημένα ιστό του όγκου. Μια σύγκριση μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση μικροδορυφορικού και αλληλούχιση SNP απέδειξαν αντιστοιχία μεταξύ των αντίστοιχων τεχνικών, αν και ο αριθμός των ασθενών με LOH στο ADAR2 SNP ήταν υψηλότερη (30-40% έναντι 75%).

χρησιμοποιήθηκαν Γονιδιωματικό DNA από καρκίνους του πνεύμονα και πρωτογενή αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί των πνευμόνων τους. Α) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των ηλεκτροφορητικά πρότυπα που λαμβάνονται με ανάλυση μικροδορυφόρων: μη κατατοπιστική περίπτωση, με μόνο μία κορυφή ενίσχυση? κατακράτηση ετεροζυγωτίας, με δύο κορυφές και σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα? και LOH, με δύο κορυφές στο φυσιολογικό δείγμα, αλλά μόνο μία κορυφή στο αντίστοιχο δείγμα όγκου. Τα βέλη δείχνουν μικροδορυφόρων αλληλόμορφα. Β) ΑΕ των ενδεικνυόμενων μικροδορυφόρων αναλύθηκε σε 48 ασθενείς με NSCLC. Οι μικροδορυφόρων παραγγείλει από την πιο κεντρομερική στην πιο τελομερικού. LOH εις την θέσιν ADAR2 αναλύθηκε με άμεση αλληλούχιση των rs1051367 πολυμορφισμού (A /G). Πράσινα κουτιά αντιπροσωπεύουν ΑΕ, κόκκινα κουτιά δείχνουν διατήρηση της ετεροζυγωτίας και κίτρινα κουτιά είναι μη-πληροφοριακές θέσεις.

Η

Η έκφραση του RNA του μεταβολισμού που σχετίζονται με Γονίδια και καρκίνος του πνεύμονα Κλινική Αποτέλεσμα

Ερευνήσαμε αν έκφραση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων του μεταβολισμού που σχετίζονται με το RNA που σχετίζονται με τις κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα χρησιμοποιεί διαθέσιμη στο κοινό δεδομένων των μικροσυστοιχιών [26]. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σύμφωνα με υψηλά και χαμηλά επίπεδα έκφρασης του mRNA χρησιμοποιώντας την διάμεση τιμή ως το σημείο αποκοπής (Σχήμα 6). Στην περίπτωση των ASCC3L1, MRPL3, και PABPC1, δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του mRNA και τον ασθενή κλινική έκβαση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υψηλή έκφραση του Άρη, RAE1, SNRPB και SNRPE συσχετίστηκε με μειωμένη συνολική επιβίωση. Υψηλά επίπεδα ADAR2 mRNA ήταν σημαντικά σχετίζεται με καλύτερα αποτελέσματα. Για μια συνδυασμένη ανάλυση των πέντε προγνωστικών γονιδίων, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: οι ασθενείς χωρίς απορύθμιση εκδηλώσεις, οι ασθενείς με ένα έως τρία γεγονότα, και οι ασθενείς με τέσσερα ή πέντε γεγονότα. Η συνδυασμένη βαθμολογία των πέντε γονιδίων ήταν ένα ισχυρό προγνωστικό δείκτη (Σχήμα 6). Έτσι, οι ασθενείς χωρίς απορρύθμιση γεγονότα παρουσίασαν πολύ καλή επιβίωση. Σε αντίθεση, οι ασθενείς με απορρύθμιση σε τέσσερις ή πέντε από τα γονίδια που παρουσίασαν τη χειρότερη επιβίωση. Η Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της προγνωστική βαθμολογία για τη συνολική επιβίωση, τόσο στην μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση (Πίνακας 1). Η βαθμολογία RNA-μεταβολισμό ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

Τα στοιχεία ελήφθησαν από μια μελέτη μικροσυστοιχιών [26]. Τα στοιχεία δείχνουν καμπύλες Kaplan-Meier και συνδεθείτε στατιστικές κατάταξη για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς χωρίζονται σε έκφραση υψηλής και χαμηλής mRNA (χρησιμοποιώντας τη μέση ως σημείο cut-off). Τελευταίο ψηφίο αντιστοιχεί σε ασθενείς διαιρείται με τον αριθμό των απορρύθμιση εκδηλώσεις (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Η

Συζήτηση

Εμείς εντοπίστηκαν οκτώ γονίδια RNA που σχετίζονται με διαφορικά εκφρασμένο σε καρκίνο του πνεύμονα , ένα εύρημα που υποστηρίζει την υπόθεση ότι το RNA του μεταβολισμού είναι σημαντική στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Επτά από τις προσδιοριζόμενες γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω, ενώ μόνο ο ένας ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια δεν είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι σχετίζεται με τον καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, η έκφραση της πλειοψηφίας αυτών των γονιδίων εμφάνισε μια ένωση με τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει μια σύνδεση μεταξύ του μεταβολισμού RNA και παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα.

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι τα γονίδια RNA-μεταβολισμός απορυθμισμένη και εμπλέκεται σε κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων του πνεύμονα [14], [16], [18]. Τα ευρήματα της μελέτης μας προσδιορίσει ένα νέο σύνολο των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που σχετίζονται με το RNA του μεταβολισμού. Είναι σαφές ότι η έκφραση πολλών άλλων γονιδίων που σχετίζονται με το RNA είναι αλλαγμένη σε καρκίνο του πνεύμονα. Η ομάδα των γονιδίων που προσδιορίζονται στη μελέτη μας επηρεάστηκε έντονα από την αυστηρή στρατηγική της επιλογή. Στατιστικές αναλύσεις ήταν περιοριστικές? Έτσι, μόνο οι πιο σημαντικές γονίδια επιλέχθηκαν. Επιπλέον, οι αλλαγές στο μάτισμα, οι οποίες έχουν αναφερθεί για μερικά γονίδια RNA που σχετίζονται με [17], [27], [28], δεν μπορεί να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας αυτή αναλυτική προσέγγιση.

Τα περισσότερα από τα γονίδια RNA που σχετίζονται με προσδιορίζονται στη μελέτη μας ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκινικό ιστό. Ο λόγος για αυτό είναι ασαφής? αυτό μπορεί να οφείλεται στο αυξημένο μεταβολικό ρυθμό που σχετίζονται με πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η συντριπτική πλειοψηφία των γονιδίων που σχετίζονται με το RNA δεν εμφάνισαν διαφορές μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα. Επιπλέον, ένας σχετικός γονίδιο που ταυτοποιείται στην παρούσα μελέτη ήταν μειωτικά (ADAR2), και η έκφραση του mRNA των πέντε από τα επιλεγμένα γονίδια που σχετίζονται με την κλινική έκβαση σε μια σειρά ασθενών αδενοκαρκίνωμα. Πιο συγκεκριμένα, η υψηλή έκφραση του up-ρυθμιζόμενων γονιδίων (MARS, RAE1, SNRPB και SNRPE) σχετίστηκε με χειρότερη πρόγνωση, ενώ υψηλή έκφραση του γονιδίου ρυθμίζεται προς τα κάτω (ADAR2) συσχετίστηκαν με βελτιωμένη επιβίωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ομάδα των ασθενών χωρίς απορρύθμιση σε οποιοδήποτε από αυτά τα γονίδια παρουσίασαν πολύ καλή επιβίωση. Από την άλλη πλευρά, ένας υψηλός αριθμός απορρύθμιση εκδηλώσεων συσχετίστηκε με κακή επιβίωση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δραστικότητα της RNA-μεταβολικό μηχανήματα θα μπορούσαν δυνητικά να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Οι πρωτεΐνες μεταφράζονται από τρία από τα οκτώ up-ρυθμιζόμενα γονίδια ανήκουν στην οικογένεια των συρραφής μικρών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεΐνες ( snRNPs): ASCC3L1, SNRPB και SNRPE. Το σωμάτια συναρμογής είναι ένα συγκρότημα snRNPs συν ένα πλήθος σχετίζεται πρωτεϊνών. Αυτό το σύμπλοκο αναγνωρίζει θέσεις ματίσματος και αφαιρεί εσώνια από την προ-mRNA μόρια. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο που διαδραματίζει η σωμάτια συναρμογής στον καρκίνο. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ανάλυση προσδιορισμού αλληλουχίας ολόκληρου exome, μερικές μελέτες έχουν εντοπίσει μια υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων σε διακριτές συνιστώσες του σωμάτια συναρμογής σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και μυελοδυσπλασία [29] – [33], εμπλέκοντας αυτήν κυτταρικός μηχανισμός για την ανάπτυξη του καρκίνου [34] . Έτσι, ορισμένοι αναστολείς συρραφής έχουν δοκιμαστεί σε καρκινικά κύτταρα και το σωμάτια συναρμογής έχει προταθεί ως στόχος αντικαρκινικό [35]. Ο προσδιορισμός των τριών συρραφής πρωτεΐνες εκφράζονται διαφορικά στον καρκίνο του πνεύμονα υποδηλώνει ότι ένας ρόλος παίζεται από το σωμάτια συναρμογής σε αυτή την κακοήθεια. Δυστυχώς, υπάρχει μικρή δημοσιευμένες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο αυτών των συγκεκριμένων πρωτεϊνών στον καρκίνο. ASCC3L1 (SNRNP200) κωδικοποιεί ελικάση Brr2, ένα σημαντικό συστατικό της U5 συρραφής snRNP. Για τις γνώσεις μας, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αποδεικνύει ό, τι ASCC3L1 συνδέεται με κακοήθεια. Μικρές πυρηνική ριβονουκλεοτιδίου πρωτεΐνης που συνδέεται Β (SNRPB) αποτελεί μέρος του snRNP U1. SNRPB έχει αναφερθεί ότι είναι ένας καταστολέας μετάσταση σε ένα μοντέλο αλλομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του προστάτη [36]. Ένα σπάνιο πολυμορφισμό στο γονίδιο SNRPB έχει συσχετιστεί με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του μαστού σε φορείς μετάλλαξης BRCA1 [37]. Η υπερέκφραση των μικρών πυρηνικών ριβονουκλεοτιδίου πρωτεΐνης που συνδέεται με E (SNRPE) έχει σύμφωνα με πληροφορίες που σχετίζονται με τη διακοπή της ανάπτυξης στη φάση G2 τόσο σε κακοήθη και μη κακοήθη κύτταρα [38]. Ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, SNRPE ενισχύεται και υπερεκφράζεται σε κακοήθη γλοιώματα και τα καρκινώματα του στόματος πλακωδών κυττάρων [39], [40]. SNRPE ενισχύεται επίσης και πάνω ρυθμισμένα σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο ενισχύοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [41].

Οι άλλες πρωτεΐνες που ήταν πάνω ρυθμισμένα στη μελέτη μας ήταν MARS, MRPL3, PABPC1 και ΡΑΕ . συνθετάση της μεθειονίνης-tRNA (MARS ή αλκαλική ισορροπία του νερού) ενεργεί ως καταλύτης στη σύνδεση της μεθειονίνης σε αντίστοιχες tRNA της. Αυξημένη δραστικότητα αυτού του ενζύμου έχει αναφερθεί σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου [42]. Πιο πρόσφατα, μια επαγωγή της έκφρασης MARS δείχθηκε σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού που διεγείρεται με ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας [43]. Οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε MARS έχουν περιγραφεί στα γαστρικά και ορθοκολικά καρκινώματα με αστάθεια μικροδορυφόρου [44]. Μιτοχονδριακή ριβοσωμικής L3 πρωτεΐνη (MRPL3) είναι ένα συστατικό της υπομονάδας 39s της μιτοχονδριακής ριβοσώματος. Υψηλή έκφραση αυτής της πρωτεΐνης έχει αναφερθεί σε ηπατοκαρκινώματος, καρκίνωμα του κόλου, και λέμφωμα, γεγονός που υποδηλώνει μια ένωση αυτής της πρωτεΐνης με υψηλά ποσοστά κυτταρική διαίρεση [45]. Πολυ-Α πρωτεΐνης δέσμευσης κυτταροπλασματική 1 (PABPC1) συμμετέχει στην πολυ-Α βράχυνση στο 3 ‘άκρο των ευκαρυωτικών mRNAs. έχουν αντιφατικά αποτελέσματα σχετικά με το ρόλο αυτής της πρωτεΐνης στον καρκίνο έχουν αναφερθεί. Μια μελέτη κατέληξε στο συμπέρασμα ότι τα χαμηλά επίπεδα της PABPC1 συσχετίζονται με πιο επεμβατικές όγκους και χειρότερα ποσοστά επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου [46]. Ωστόσο, σε άλλες μελέτες, PABPC1 υπερέκφραση περιγράφηκε σε όγκους του προστάτη [47], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [48], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης επιφανειακή [49], και του καρκίνου του πνεύμονα [50]? στην τελευταία έκθεση οι συγγραφείς πρότειναν ότι η συμμετοχή του συμπλόκου έναρξης μετάφρασης στην ογκογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. PABPC1 ρυθμίζει επίσης τη δράση της τελομεράσης, που οδηγεί σε ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης σε κερατινοκύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινο είδος ιού του θηλώματος 16 Ε6 [51]. εξαγωγή RNA 1 ομόλογο (RAE1) είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη εξαγωγή εμπλέκονται στη μεταφορά mRNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. RAE1 παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ατράκτου διπολικότητας κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης [52], [53]. RAE1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης μειώνονται κατά αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων νευροβλαστώματος, και η υπερέκφραση της εμποδίζει ρετινοϊκό οξύ προκαλούμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου και τη διαφοροποίηση [54]? Ωστόσο, σε προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι RAE1 /NUP98 μεταλλαγμένα ποντίκια είναι πιο επιρρεπή σε επαγόμενη από DMBA όγκοι του πνεύμονα σε σύγκριση με ποντικούς άγριου τύπου, υποδεικνύοντας ότι οι συνδυασμένες RAE1 /NUP98 ΗΑΡΙΌ-ανεπάρκεια δυνητικά προάγει την ογκογένεση [55].

η κατιούσα ρύθμιση απαμινάση γονίδιο αδενοσίνης ενεργούν για RNA 2 (ADAR2 ή ADARB1) είναι ένα editase RNA που καταλύει αδενοσίνης σε ινοσίνη απαμίνωση σε διπλής έλικας περιοχές. Δυσλειτουργία της αδενοσίνης σε ινοσίνη επεξεργασία σε ανθρώπινους καρκίνους δυνητικά συνεισφέρει στην μεταβληθεί μεταγραφικό πρόγραμμα αναγκαίες για να διατηρηθεί καρκινογένεση [56]. ADAR2 εκφράζεται παντού σε πολλούς ιστούς, ιδίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα [57]. Πρόωρη επιληψία έναρξη και πρόωρου θανάτου έχουν αναφερθεί σε ADAR2 knock out ποντίκια [58]. Στον καρκίνο, μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε υπερέκφραση του ADAR2 σε ποσοστό

in vitro

μετασχηματισμένα ενήλικα άνθρωπο μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, μετασχηματισμένα ινοβλάστες, και σε μερικές κυτταρικές σειρές από άλλους ιστούς [59]. Υψηλότερα επίπεδα ADAR2 mRNA παρατηρήθηκαν επίσης σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών σε σχέση με κυτταρικές σειρές που αποκρίνονται στο ανδρογόνο [60]. Ωστόσο, οι περισσότερες αναφορές συνδέουν τον καρκίνο με μειωμένη έκφραση ADAR2 ή δραστηριότητα. Έτσι, μια μείωση στην ενζυμική δραστικότητα της ADAR2 σε ασθενείς με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (MGB) συνδέθηκε με υψηλότερες Ca

2+ διαπερατότητα και ενεργοποίηση της οδού Akt, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη του όγκου και επιθετικότητα [61], [62]. Paz et al. βρήκε επίσης μια μείωση των επιπέδων mRNA ADAR2 στους όγκους του εγκεφάλου και απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του σε κυτταρική σειρά MGB οδήγησε σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων [63]. Μία μείωση της δραστηριότητας επεξεργασίας ADAR2, η οποία συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθειας, βρέθηκε επίσης σε παιδιατρικούς αστροκυτώματα [64]. Όταν η κατάσταση επεξεργασίας επανήλθε σε τρία αστροκύτωμα κυτταρικές γραμμές, μια σημαντική μείωση στην κυτταρική κακοήθη συμπεριφορά βρέθηκε [64]. Πιο πρόσφατα, Γκαλεάνο et al. παρατηρείται μια γενική μείωση στην ADAR2 μεσολάβηση γεγονότα επεξεργασίας στην ουροδόχο κύστη και του παχέος εντέρου [65]. Στην περίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα, μια μείωση της έκφρασης ADAR2 περιγράφηκε προηγουμένως σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα [66].

Η ελαττωμένη ADAR2 στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται δυνητικά με γενετικές αλλοιώσεις στο 21q22, όπου το γονίδιο είναι ADAR2 που βρίσκεται. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει την απώλεια γενετικού υλικού στο μακρύ βραχίονα του χρωμοσώματος 21 σε ασθενείς με διάφορους συμπαγείς όγκους [67] – [71], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [72] – [76]. Lee et al. αναλύονται εννέα δείκτες μικροδορυφόρων, που τοποθετείται μεταξύ 21q21.1 και 21q22.3 σε ασθενείς με NSCLC. LOH ανιχνεύθηκε για τουλάχιστον ένα από αυτά σε πάνω από το 55% των όγκων, με 26% ποσοστό επίπτωση της ΑΕ -48% σε επιμέρους μικροδορυφόρων [74]. Sato et al. περιγράφεται LOH στο 21q22.3 στο 28% των δειγμάτων από αδενοκαρκίνωμα και οι ασθενείς πλακώδες καρκίνωμα [72]. Είμαστε επικεντρώθηκε στην ανάλυση των 21q22.3 μεταβολές στην περιοχή της ADAR2. Βρήκαμε 30-40% επίπτωση της ΑΕ μεταξύ των ασθενών με NSCLC, με σχεδόν το ήμισυ των όγκων (23 από 48) εμφανίζουν ΑΕ σε τουλάχιστον μία από τις μικροδορυφόρων αναλύθηκαν. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, καρκινώματα πλακωδών κυττάρων έδειξαν υψηλότερες συχνότητες της ΑΕ στο 21q22 από αδενοκαρκινώματα. Επιπλέον, μια πολύ υψηλή συχνότητα εμφάνισης LOH (75%) παρατηρήθηκε μετά από ανάλυση ενός SNP που βρίσκεται εντός του γονιδίου ADAR2. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να εξηγηθούν από την ύπαρξη εναλλασσόμενες περιοχές με και χωρίς LOH, και δείχνουν ότι η ADAR2 γενετική θέση είναι μία από τις πιο συχνά μεταβάλλονται περιοχές στον πνεύμονα καρκινογένεση. Στο σύνολό τους, οι συχνές γενετικές απώλειες στον τόπο ADAR2 και μειωμένη έκφραση του υποδηλώνουν ότι ADAR2 δυνητικά λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του πνεύμονα. Λειτουργική δεδομένα υποστηρίζουν επίσης αυτή η υπόθεση, διότι η υπερέκφραση του ADAR2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση [63], [64]. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι τα χαμηλά επίπεδα ADAR2 mRNA σχετίζονται σημαντικά με τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Μια προγνωστική βαθμολογία με βάση την έκφραση του ADAR2 και τέσσερα επιπλέον γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του RNA (MARS, RAE1, SNRPB και SNRPE) μπορεί διαστρωμάτωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα σε ομάδες υψηλού και χαμηλού κινδύνου για το θάνατο του καρκίνου. Πρόσθετη έρευνα είναι εντάλματος να εξεταστεί αν αυτή η πληροφορία μπορεί να είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό αυτών των ασθενών με χειρουργήσιμο ΜΜΚΠ οι οποίοι βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο υποτροπής και θα επωφεληθούν από την επικουρική θεραπεία.

Εν κατακλείδι, στην παρούσα μελέτη εντοπίστηκαν νέες μεταβολισμό RNA -σχετικών γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο του πνεύμονα και σχετίζεται με την κλινική έκβαση. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το ρόλο του μεταβολισμού RNA στην παθογένεση αυτής της ασθένειας. Περαιτέρω χαρακτηρισμός των μηχανισμών που ρυθμίζουν τη διαδικασία αυτή μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη βελτιωμένων στρατηγικών για τη διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές δεοντολογίας της Clínica Universidad de Navarra (Παμπλόνα, Ισπανία) και το Νοσοκομείο Marques de Valdecilla (Santander, Ισπανία). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή

Πειράματα μικροσυστοιχιών

Τέσσερις διαθέσιμες στο κοινό πειράματα μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό γονιδίων που σχετίζονται με το RNA του μεταβολισμού που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και του ιστού φυσιολογικού πνεύμονα [22]. – [25]. Μερικά από αυτά τα πειράματα περιλάμβαναν στοιχεία από άλλες ιστολογικές υποτύπους. Ένα πέμπτο πείραμα μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης και την πρόγνωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [26]. Πίνακας S3 περιέχει πληροφορίες σχετικά με τον αριθμό των δειγμάτων και των ιστολογικών υποτύπων παρούσα σε κάθε μελέτη.

Καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων και σε πρωτογενή Πολιτισμών

πνεύμονα κυτταρικές σειρές καρκίνου ελήφθησαν από την American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA). επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών Small (SAEC) αγοράστηκαν από την Lonza (Walkersville, MD) και καλλιεργήθηκαν σε μικρές αεραγωγών μέσο ανάπτυξης επιθηλιακών (SAGM, Lonza) συμπληρωμένο με SAGM SingleQuots (Lonza). Τα φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά (ΝΗΒΕ) (Clonetics, San Diego, CA) αναπτύχθηκαν σε βρογχικά επιθηλιακά μέσο κυτταρικής ανάπτυξης (BEGM, Clonetics) συμπληρώνεται με τα συμπληρώματα ανάπτυξης του BulletKit (Clonetics). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. Πριν από RNA ή DNA εκχύλιση, τα κύτταρα ελέγχθηκαν ως προς την

Mycoplasma

μόλυνση, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Cambrex, Rockland, ΜΕ).

Κλινικά Δείγματα

πρωτοπαθείς όγκους και τις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων τους ελήφθησαν από ασθενείς με ΜΜΚΠ αντιμετωπίζεται με θεραπευτική resectional χειρουργική επέμβαση στο Clínica Universidad de Navarra (Παμπλόνα, Ισπανία) ή στο Νοσοκομείο Marques de Valdecilla (Santander, Ισπανία). Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Αφαιρεθεί χειρουργικά δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Χρησιμοποιήθηκαν μόνο δείγματα που περιέχουν κύτταρα όγκου περισσότερο από 70%. Οι ιστολογικές και τα στάδια των όγκων που περιλαμβάνονται στη μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα S4. Οι όγκοι ταξινομούνται σύμφωνα με τον ΠΟΥ το 2004 ταξινόμηση [77].

RNA Extraction

εκχύλιση RNA έγινε με τη χρήση RNA Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, TX). Για πρωτογενείς ιστούς, εκχύλιση RNA έγινε μετά από μηχανικό θρυμματισμό των κατεψυγμένων δειγμάτων, χρησιμοποιώντας β-μερκαπτοαιθανόλη και RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα RNA αραιώθηκαν σε νερό με DEPC και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Αντίστροφη Μεταγραφή (RT)

Δύο μικρογραμμάρια του RNA επωάστηκαν με 1 mM dNTPs και 50 ng /μL ολιγο -dTs στους 65 ° C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 4 μΙ ρυθμιστικού 5 χ RT, 1 μΐ 0.1 Μ DTT, 40 U ΚΝάσης Out και 200 ​​U αντίστροφης μεταγραφάσης του Super Script III (όλα από την Invitrogen). Οι σωλήνες επωάστηκαν 50 λεπτά στους 50 ° C και 15 λεπτά στους 70 ° C, και στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε πάγο. Τέλος, 2 υ RNase Η (Invitrogen) προστέθηκαν, και οι σωλήνες επωάστηκαν 20 λεπτά στους 37 ° C.