Αφηρημένο

Καρκίνος στομάχου (GC) έχει ένα υψηλό ποσοστό νοσηρότητας και θνησιμότητας μεταξύ των διαφόρων μορφών καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Η ανάπτυξη των μη επεμβατικών διαγνωστικών μεθόδων ή τεχνολογιών για την παρακολούθηση της εμφάνισης του GC είναι επείγον, και την αναζήτηση αξιόπιστων βιοδεικτών είναι μελέτης considered.This προορίζεται να ανακαλύψουν άμεσα απόκλιση βιοδείκτες από ιστούς GC με ηλεκτροφόρηση σε γέλη δύο-διαστάσεων-διαφορικό (2D-ΨΗΦΟ), και περαιτέρω επικύρωση έκφραση της πρωτεΐνης με κηλίδωση Western (WB) και ανοσοϊστοχημεία (IHC) .Pairs των ιστών GC (ιστούς καρκίνου του στομάχου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών) που λαμβάνεται από τη χειρουργική επέμβαση ερευνήθηκε για 2D-DIEG.Five πρωτεΐνες wereconfirmed από WB και IHC, συμπεριλαμβανομένης της γλυκόζης -regulated πρωτεΐνη 78 (GRP78), πίν γλουταθειόνης s-τρανσφεράσης (GSTpi), της απολιποπρωτεΐνης AI (ΑροΑΙ), άλφα-1 αντιθρυψίνη (Α1ΑΤ) και gastrokine-1 (GKN-1). Μεταξύ των αποτελεσμάτων, GRP78, GSTpi και A1ATwere significantlyup ρυθμιζόμενα και κάτω-ρυθμίζονται αντίστοιχα σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, GRP78 και ΑροΑΙ συσχετίστηκαν με A1AT για τη μελέτη της πρωτεΐνης expressions.This προϋποθέτει οι πρωτεΐνες αυτές θα μπορούσαν να είναι υποψήφιοι αξιόπιστων βιοδεικτών για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Wu JY, Cheng CC, Wang JY, Wu DC, Hsieh JS , Lee SC, et al. (2014) Ανακάλυψη των καρκινικών δεικτών για τον Καρκίνο γαστρική από Πρωτεϊνωματική. PLoS ONE 9 (1): e84158. doi: 10.1371 /journal.pone.0084158

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 του Αύγ 2013? Αποδεκτές: 12, Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NSC96-3111-Ρ-042A-004-Y, NSC100-2314-B-037-040, και από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Δημοκρατίας της Κίνας. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (KMUH97-7R32, KMUH98-8R33). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και theprevalence του γαστρικού καρκίνου μειώνεται και τα ποικίλα γεωγραφικά, παραμένει ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους στις χώρες της Ασίας και είναι η τέταρτη πιο συχνά εμφανιζόμενων καρκίνο (9% όλων των καρκίνων) σε όλο τον κόσμο. Τα ηλικία τυποποιημένα ποσοστά επίπτωσης (ASR) είναι μεγαλύτερη από 20 ανά 100.000 σε χώρες υψηλού κινδύνου, όπως η Κίνα, η Ιαπωνία και η Κορέα [1], [2], [3]. Είναι επίσης η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο και στα δύο φύλα παγκοσμίως (737.000 θάνατοι, 9,7% του συνόλου). Στην Ανατολική Ασία, τα ποσοστά θνησιμότητας έχουν εκτιμηθεί ως περίπου 28,1 ανά 100.000 άνδρες και 13,0 ανά 100.000 στις γυναίκες, whilein Βόρεια Αμερική, είναι περίπου 2,8 και 1,5 αντίστοιχα [4].

ποσοστά πενταετούς επιβίωσης κυμαίνονται από 90% σε λιγότερο από 5 τοις εκατό, κυρίως ανάλογα με το στάδιο της διάγνωσης [5], [6] .Εάν γαστρικού καρκίνου μπορεί να ανιχνευθεί και να αντιμετωπίζονται στα πρώτα στάδια, η πενταετής επιβίωση ποσοστά νεανικής ανεργίας καλύτερη από 90%? Ωστόσο, isno υπάρχει προφανής ή ειδικό σύμπτωμα σε πρώιμα στάδια γαστρικού cancer.Thus, νωρίς detectionof γαστρικού καρκίνου becomesmore difficult.Although πεψινογόνου ορού (PG) testssuch όπως χαμηλή συγκέντρωση ΠΓΕ ή /και χαμηλή αναλογία ΠΓΕ /ΙΙ ήταν ενδεικτικά δοκιμές προσυμπτωματικού ελέγχου υψηλής χώρες κινδύνου, όπως η Ιαπωνία, weregood δείκτες ατροφική γαστρίτιδα και όχι διαγνωστική markersof γαστρικού καρκίνου [7] – [9] .Essentially, ενδοσκόπηση έχει beenthe εργαλείο υπόσχεται με 2.7 έως 4.6 φορές υψηλότερο ποσοστό ανίχνευσης από τις μελέτες του βαρίου [10]. Ωστόσο, η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του στομάχου από endoscopydependson προσόν.

Μερικές μη επεμβατική βιοδεικτών για τη διάγνωση ή την παρακολούθηση στο γαστρεντερικό και ηπατική tumorshave έχουν αναφερθεί. Για παράδειγμα, α-εμβρυϊκής πρωτεΐνης (AFP) είναι μία από τις κλινικά χρήσιμες βιοδείκτες για τη διάγνωση και την παρακολούθηση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) .AFP ανυψώθηκε πάνω από 20 ng /mL σε μία μελέτη σε περισσότερες από 70% των ασθενών με HCC [11]. Σύμφωνα με τα συμπεράσματα του Ευρωπαϊκού Συνδέσμου της Βαρκελώνης του 2000 για τη Μελέτη του συνεδρίου Ήπατος (EASL), το HCC θα μπορούσε να διαγνωστεί χωρίς περιπτώσεις biopsyin όπου AFP είναι μεγαλύτερη από 400 ng /ml με ένα οζίδιο μεγαλύτερη από 2 cm, με ενδείξεις αρτηριακής υπεραγγείωση σε ασθενείς με κίρρωση [12] .Incolorectal καρκίνωμα (CRC), προεγχειρητική καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) επίπεδο είναι ένα εξαιρετικά σημαντικό προγνωστικό συμμεταβλητή και συνιστάται από την αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας (ASCO) ότι θα πρέπει να δοκιμαστεί προ-εγχειρητικά για να παρέχουν προγνωστικές πληροφορίες [13]. Serial αυξήσεις του CEA δείχνουν μεγαλύτερη πιθανότητα επανάληψης της CRC. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αξιόπιστη βιοδεικτών για καρκίνο του στομάχου.

Ως εκ τούτου, η αναζήτηση για αξιόπιστη βιοδεικτών για καρκίνο του στομάχου είναι πολύ σημαντικό για την κλινική πρακτική. Αυτή η μελέτη είχε σκοπό να ανακαλύψουν αξιόπιστες πρωτεΐνη βιοδείκτες από συμφωνημένα ιστούς (όγκος και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών) με ηλεκτροφόρηση γέλης δύο-διαστάσεων-διαφορά (2D-ΨΗΦΟ), και τον εντοπισμό των πρωτεϊνών με υποβοηθούμενη από τη μήτρα εκρόφηση λέιζερ /ιονισμού-απεικόνισης φασματομετρίας μάζας (MALDI -IMS).

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

τα δείγματα ιστού ελήφθησαν μετά ενημερώσει συναινεί είχαν υπογραφεί. Αξιόπιστες όγκου samplesincluding και δίπλα ασθενείς κανονική tissuesfrom προήλθαν από ενδοσκοπική βιοψία ή βαθμούς surgery.The όγκου προσδιορίστηκαν σύμφωνα με το αμερικανικό Κοινή Επιτροπή για τον Καρκίνο Σταδιοποίηση σύστημα (AJCCS) από παθολόγους κάτω μπλε του μεθυλενίου staining.Clinical πληροφορίες των ασθενών καταγράφηκε, συμπεριλαμβανομένων την ηλικία, το φύλο, τον τύπο του όγκου, την εισβολή και την επιβίωση. Επιπλέον, η συγκέντρωση του CEA στον ορό μετρήθηκε επίσης με ραδιενεργό ανοσοπροσδιορισμό στη ρουτίνα ιατρικές diagnosis.The individualsenrolled στην παρούσα μελέτη έχουν δώσει γραπτή συγκατάθεση για τη δημοσίευση αυτών μελέτη περίπτωσης details.This εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστήμιο Chung- Memorial Hospital Ho (KMUH-IRB-980382).

Δύο ηλεκτροφόρηση γέλης διάσταση-διαφορά

Ένα (Πίνακας 1) ζεύγος των δειγμάτων ιστού washomogenized (PRO 200, Bertec, Ταϊβάν) σε μέτρια ένταση ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris-HCl, 8Μ ουρία, 4% (β /ο) 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλ) διμεθυλαμμωνιο] -1-προπανοσουλφονικό, και ρΗ 8,5). Η ατομική 50 μα δείγματος πρωτεΐνης σημάνθηκε με 400 pmol του Cy3 ή Cy5 ξεχωριστά για 30 λεπτά (Σχ. 1Β). Επιπλέον, τα κοινά μείγμα δείγματος (100 μg) επισημάνθηκε με 800 pmol από CY2 ως εσωτερικό πρότυπο συγχρόνως. Στη συνέχεια, η επισήμανση reactionswere σταμάτησε με επώαση 1 μι 10 mM ρυθμιστικού λυσίνης για 30 λεπτά, στη συνέχεια το ένα-πλάσιο όγκο ρυθμιστικού δείγματος (8 Μ ουρίας, 20 mM διθειοθρεϊτόλης, 4% (β /ο) 3 – [(3 -Cholamidopropyl) διμεθυλαμμωνιο] -1-προπανοσουλφονικό, 0,5% (ν /ν) ρυθμιστικό IPG και λίγοι βρωμοφαινόλη μπλε) ήταν προσέθετε πρώτο διαχωρισμό, ισοηλεκτρική εστίαση, διεξήχθη χρησιμοποιώντας καπάκι φόρτωσης στο λωρίδων γέλης (7 cm, ρΐ 4- 7) στους 20 ° C τήρηση κάτω 15000voltage-ώρες (σύστημα IPGphor, GE Healthcare). Μετά την εξισορρόπηση με δωδεκυλοθειικό νάτριο, το δεύτερο separationwas εκτελείται using4-12% δωδεκύλο θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. Οι εικόνες τζελ αποκτήθηκαν (Typhoon TRIO Imager Variable Mode, GE Healthcare) με τη χρήση 488, 532, και 633 nm λέιζερ με ένα φίλτρο εκπομπής 520, 532, και 670 nm αντίστοιχα. Όλες οι εικόνες αναλύθηκαν με DeCyder 6,5 λογισμικό (GE Healthcare) για να επιλέξετε τις διαφορικό πρωτεΐνες που wereselected ανάλογα γιαΤΟ τοποθέτηση κάτω από μια σημαντική αξία των 0,05 σύμφωνα με Student

t-test

.

Τα διαφορικά πρωτεΐνες παρουσιάζονται σε πήγματα. (Αριστερά): κανονικό? (Δεξιά): ο καρκίνος. Τριάντα-έξι πρωτεΐνες συλλέγονται από DeCyder στατιστικό λογισμικό, αλλά μόνο δεκαπέντε πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με PMF ή τεχνική PFF. Οι συνθήκες gel: PI: 4-7? gel: 4-12% .Οι αναλυτική περιοχή τιμών ήταν από ρΙ 4 έως 7 forisoelectric εστίαση και από 4% έως 12% βαθμιαίας πηκτής για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλο νάτριο θειικό άλας

Η

In-gel. τρυπτική πέψη

Τα πήγματα βάφτηκαν με Sybro Ruby (Sigma) στην συνέχεια αποχρωματίζονται με 10% μεθανόλη και 7% οξικό οξύ σε απιονισμένο νερό για ακριβώς 30 min.The ορατές κηλίδες πηκτές κάτω από μια συσκευή υπεριώδους (Spectroline) ήσαν χρησιμοποιείται για να σκάψουν για τις ενδιαφέρουσες πρωτεΐνες χειροκίνητα. Αυτά τα σωματίδια γέλης πλύθηκαν σε 100 μL 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου σε 50% ακετονιτρίλιο για 15 λεπτά, και κατόπιν πλύθηκαν σε 200 μΐ 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου σε απιονισμένο νερό για 15 λεπτά δύο φορές, και στη συνέχεια, αρκετά ακετονιτριλίου προστέθηκαν για να συρρικνωθεί το σωματίδια γέλης. Μετά από ξήρανση κάτω, το άτομο γέλη particleswereincubated με 3 μί 20 ng /μΙ τρυψίνης σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου σε 4 ° C για 1 ώρα και στη συνέχεια 3 μι 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου προστέθηκε για να αφομοιώσει τις πρωτεΐνες στους 56 ° C για 1 ώρα. Μετά την πέψη In-gel, 2 μί 100% ακετονιτρίλιο με 1% τριφθοροοξικό οξύ προστέθηκαν στα διαλύματα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ηχητική επεξεργασία δειγμάτων για 10 λεπτά για να απελευθερώσει τα πεπτίδια από σωματίδια πήγματος.

Ανάλυση φασματογράφου μάζας για ταυτοποίηση πρωτεϊνών

Κάθε διάλυμα πρωτεΐνης χωνεύεται με θρυψίνη αναμίχθηκε 1:01 με 10 mg /mlof α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως διαλύθηκαν σε 50% ακετονιτρίλιο /0,1% τριφθοροοξικό οξύ, και στίγματα στο στόχο MALDI AnchorChip (Bruker Daltonics GmbH , Βρέμη, Γερμανία) μέχρι να στεγνώσει. Τα πεπτίδια αναλύθηκαν με MALDI-TOF /TOF UltraflexIII (Bruker Daltonics) κάτω των 20 KV με θετικό πρότυπο, και τα δεδομένα αιχμής μεταφέρθηκαν σε FlexAnalysis ™ 3.0 λογισμικό (Bruker Daltonics) για προηγμένη υπολογισμό και τη βαθμονόμηση. MASCOT 2.2 (Matrix Science) χρησιμοποιήθηκε για να ταιριάζει με τα πεπτίδια με NCBI ή Swiss-Prot βάση δεδομένων για ταυτοποίηση πρωτεϊνών. Η ρύθμιση περιορίστηκε σε ανθρώπινο ταξινομίας parameters.Meanwhile, carbamidomethyl κυστεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως σταθερή τροποποίηση, και οξειδωμένη μεθειονίνη ως μεταβλητή τροποποίηση. Η πιθανότητα (P) βασίστηκε σε Mowse βαθμολογία υπολογίζεται από -10 × Log (Ρ). Πρωτεΐνη score μεγαλύτερο από 56 ήταν σημαντική (

σ

& lt? 0,05). Επιπλέον, ένας από τους σημαντικότερους πεπτιδίου κορυφές που εμφανίζονται στο φάσμα χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την πανομοιότυπο αποτέλεσμα με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας αμινοξέων, η οποία ονομάζεται πεπτίδιο μέθοδος θραύσμα αποτυπωμάτων.

κηλίδωση Western

τα ζεύγη δειγμάτων ιστού ομογενοποιήθηκαν (Pro 200, Bertec) στο ρυθμιστικό λύσης (10 mM φωσφορικό νάτριο, 0.9% χλωριούχο νάτριο, 1% Τπίοη-Χ100, ρΗ 7,4) και επωάστηκαν σε ανακίνηση στους 4 ° C για 1 ώρα. Μετά να απαλλαγούμε από τα καταβυθισμένου σφαιριδίων με φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας (10,000 rpm, 5 λεπτά), οι πιπέτα υπερκείμενα προστέθηκαν σε δείγμα ρυθμιστικού διαλύματος (10 mM φωσφορικό νάτριο, 0.9% χλωριούχο νάτριο, 8 Μ ουρία, 30% γλυκερόλη, 2 % δωδεκυλοθειικό νάτριο, 0.1% β-μερκαπτοαιθανόλη και 0,1% βρωμοφαινόλη μπλε) με 1: 1 αναλογία και βράζεται στους 100 ° C για 5 λεπτά για πρωτεΐνη denature.Approximately 20 μg εκάστου δείγματος πρωτεΐνης φορτώθηκαν στο ξεχωριστό πλέγμα 4- 12% νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE, Invitrogen). Το iblot σύστημα ξηράς κηλίδωσης (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή των πρωτεϊνών σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) με βάση ιόν ρέει μαζί με ένα ηλεκτρόδιο χαλκού. Μετά τη χρήση 0,5% γάλα για να καθαρίσει τη μεμβράνη PVDF για 30 λεπτά, theindividual πρωτογενές αντίσωμα (2 μg /ml) προστέθηκε για επώαση για 2 ώρες σε ανακίνηση. Οι συνεπείς δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (HRP) (2 μg /ml) επωάστηκαν για 1 ώρα σε ανακίνηση διαδοχικά. Μεταξύ των διεργασιών επώαση, repeatedlywashings με ρυθμιστικό διάλυμα PBS (10 mM φωσφορικό νάτριο, ρΗ7,4 και 0,9% χλωριούχο νάτριο) weredone. Το σύστημα ανίχνευσης ECL (Millipore) εκτελέστηκε, και οι εικόνες αποκτήθηκαν από το Σύστημα Απεικόνισης (Gel Doc XR συστήματος, Bio-Rad), ανάλογα με το μέτριο χρόνο για να εξερευνήσετε.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία ήταν performedusing μια τυποποιημένη μέθοδο χρώσης υπεροξειδάσης που βασίζεται. Τα δείγματα ιστού κόπηκαν με κρυοστάτη (HM525, Microm) τομές ιστού .Fresh (10 um) στις διαφάνειες λυσίνης επικαλυμμένων ήταν driedon ένα θερμαντήρα στους 37 ° C και διαδοχικά εμβαπτίζονται με διαδοχική 75%, 95% και 100% αιθανόλη για 1 λεπτό για σταθεροποίηση της πρωτεΐνης. Εν συντομία, η ενδογενής δραστηριότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Το επεισόδιο αντιγόνο εκτέθηκε με εμβάπτιση του slide ιστού σε 10 mM κιτρικού οξέος εντός βραστό νερό για 25 λεπτά. Διαδοχικές επωάσεις με τα μεμονωμένα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με HRP πρωτογενούς antibodyandthe διεξήχθησαν για μεμονωμένες 1 ώρα σε ανάδευση. Το κιτ AEC (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των ιστών, και η λειτουργία ακολούθησε το συνημμένο εγχειρίδιο. Εν συντομία, μεικτές διαλύματος 2,5 Μ οξικού ρυθμιστικού διαλύματος, AEC χρωμογόνο (3-αμινο-9ethylcarbazole) και 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου wasperformed άμεσα και διαδοχικά επωάζονται με τον ιστό slides.The διαφάνειες χρώση εικόνα παρατηρήθηκαν και αποκτήθηκαν στο πλαίσιο μιας μικροσκόπιο (BX51, Όλυμπος) .

Στατιστικά ανάλυση

το στατιστικό λογισμικό SPSS διεξήχθη για να υπολογίσει τη σημασία σύμφωνα με Student

t-test

και συσχέτιση μεταξύ GRP78, GSTpi, A1AT, ΑροΑΙ και GKN- 1. Η significantdifference (

σ

αξία) ήταν αποδεκτή ως λιγότερο από 0.5.

Biomarkers ανακάλυψη βασίζεται σε 2D-ΨΗΦΟ

Η γαστρική καρκινικούς ιστούς αναλύθηκαν

Αποτελέσματα

από 2D-ΨΗΦΟ και σε σύγκριση με το αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς για να αναζητήσετε τις υποθετικές βιοδείκτες του καρκίνου του στομάχου. Οι διαφορές των proteinexpressions μεγαλύτερη από 1,2 φορές ήταν υποθετική υποψηφίων. Η εικόνα γέλη ήταν παρουσίαση του επισημασμένου με CY-βαφές πρωτεΐνες θέση (Εικ. 1). Δεκαπέντε πρωτεΐνες μπορούσαν να αναγνωριστούν, συμπεριλαμβανομένης της γλυκόζης ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη 78 (GRP78), θερμικό σοκ συγγενούς 71 kDa πρωτεΐνη (HSC70), πρωτεΐνη δισουλφίδιο ισομεράση Α3 (PDIA3), μιτοχονδριακή ΑΤΡ συνθάσης υπομονάδα βήτα (ATPB), πρωτεΐνη δισουλφίδιο ισομεράση πρωτεΐνη που σχετίζεται 5 (PDIRP5), gastricsin, s-τρανσφεράση γλουταθειόνης pi (GSTpi), απολιποπρωτεΐνη ΑΙ (ΑροΑΙ), άλφα-1 αντιθρυψίνη (Α1ΑΤ) και gastrokine-1 (GKN-1) .Στην 3 διπλές επαναλήψεις, κάποιες ταυτόσημες πρωτεΐνες βρέθηκαν στο διαφορετικές θέσεις του gel και εξαιρούνται σύμφωνα με την υποψία της μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Τέλος, πέντε πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων GRP78, GSTpi, ΑροΑΙ, Α1ΑΤ και GKN-1 επιβεβαιώθηκαν και περαιτέρω επικυρώνονται ως υποθετικό δείκτες του καρκίνου του στομάχου. Οι λεπτομερείς συγκρίσεις με stereopicture και διευρυμένη imageswere τζελ που φαίνεται στο Σχήμα 2.

Τα επιλεγμένα υποθετικές πρωτεΐνες παρουσιάστηκαν ως stereopictures και διευρυμένη κλίμακες εικόνες gel. Αυτές οι πρωτεΐνες επιλέγεται σύμφωνα με τη σημαντική διαφορά κάτω του 0,05 (

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, ο διπλές ταυτοποίηση των ATPB, PDIRP5, ΑροΑΙ και GSTpi σε γειτονικά σημεία δήλωσαν ότι είχαν μια διαφορετική τροποποίηση.

Η

Western και στατιστική ανάλυση

Twelvepairs των ιστών από γαστρικό καρκινοπαθείς χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα επικύρωσης. Τέσσερις ασθενείς ήταν σταδίου Ι, 3 ασθενείς ήταν σταδίου ΙΙ, 2 ασθενείς ήταν σταδίου ΙΙΙ, και 3 ασθενείς ήταν σταδίου IV. Η κλινική πληροφορίες που παρατίθενται στον πίνακα 1.Five των πρωτεϊνών (GRP78, GSTpi, ΑροΑΙ, Α1ΑΤ και GKN-1) επιβεβαιώθηκαν από τα αποτελέσματα της Δυτικής blotting.Amongthe, GRP78 και GSTpiwere significantlyup ρυθμιζόμενων ενώ A1AT ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρική καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (Εικ. 3) .Για GSTpi, nineout από τους 12 ασθενείς (75%) είχαν πάνω ρυθμισμένα εκφράσεις πρωτεΐνης σε tumortissues? Από την άλλη πλευρά, 10 από τους 12 ασθενείς (83%) έχουν κάτω ρυθμισμένα πρωτεΐνη Α1ΑΤ expression.Regarding τη σχέση μεταξύ εκφράσεων πρωτεΐνης και κλινικά στάδια, GRP78 έχει μια τάση να αυξηθεί από το στάδιο Ι έως το στάδιο IValthough καμία στατιστική σημασία θα μπορούσε να βρεθεί. Η έκφραση του GSTpi και Α1ΑΤ δεν συσχετίστηκαν με κλινικά στάδια (Σχήμα 4).

(Α) με κηλίδωση Western, 12 ζεύγη του γαστρικού καρκίνου και των φυσιολογικών ιστών χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση των υποθετικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων GRP78, GSTpi, A1AT, ΑροΑΙ και GKN-1. (Β) Η GSTpi και GRP78 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του στομάχου tissues.Down-εκφράσεις της Α1ΑΤ, ΑροΑΙ και GKN-1 παρατηρήθηκαν. **

σ

& lt? 0,01. *

σ

& lt?. 0.05

Η

Αν και GRP78 και GSTpi αυξήθηκαν σε διαφορετικά στάδια του καρκίνου του στομάχου, καμία στατιστική σημασία θα μπορούσε να βρεθεί. Μια τάση αύξησης με κλινικό στάδιο βρέθηκε σε GRP78

Η

Είναι ενδιαφέρον, οι πρωτεΐνες εκφράσεις GRP78 σε αυτά τα ζεύγη των ιστών αντιστοιχεί με εκείνη του ΑροΑΙ (r

2:. -0,61,

σ

& lt? 0,01) και A1AT (r

2: -0,49,

σ

& lt? 0,05) (Σχήμα 5).. Εν τω μεταξύ, η έκφραση της πρωτεΐνης του ΑροΑΙ συσχετίστηκε με εκείνη του A1AT (r

2: 0,62,

σ

& lt? 0.01, Εικ. 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτές οι τρεις υποθετικές βιοδείκτες, GRP78, ΑροΑΙ και Α1ΑΤ, συνδέθηκαν μεταξύ τους στην έκφραση της πρωτεΐνης. Σε αντίθεση, GSTpi και GKN-1 φαίνεται να είναι ανεξάρτητη για την έκφραση της πρωτεΐνης

Η GRP78 σε αυτά τα 12 ζεύγη των ιστών εκφράστηκε συνακόλουθα με εκείνη του ΑροΑΙ (R2: -0,61) και A1AT (R2:. – 0.49) ξεχωριστά. Εν τω μεταξύ, ΑροΑΙ εκφράστηκε συνακόλουθα με εκείνη της Α1ΑΤ (R2: 0,62). Ωστόσο, GSTpi και GKN-1 φαίνεται να είναι ανεξάρτητη. ** P & lt? 0,01. * P & lt?. 0.05

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

DespiteGRP78, GSTpi και Α1ΑΤ είναι statisticallydifferent σημαντικά, η εκφραστική τάση των άλλων πρωτεϊνών ήταν η ίδια με την παρατήρηση στο πείραμα 2D-ΨΗΦΟ. Ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση των κεκτημένων αποτελέσματα από το πείραμα western αποτύπωση. GRP78, GSTpi, ΑροΑΙ, GKN-1, και Α1ΑΤ επικυρώθηκαν σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και μη-καρκινικούς ιστούς, όπως φαίνεται στο Σχήμα εκφράσεις πρωτεΐνης 6.Η σε ζεύγη ιστών ήταν σύμφωνα με την παρατήρηση σε κηλίδωση Western. Ιδιαίτερα, οι up-ρυθμίζονται πρωτεΐνες, GRP78 και GSTpi, ήταν συγκεκριμένα βρίσκεται στα γαστρικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Από την άλλη πλευρά, οι κάτω-ρυθμίζονται πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων ΑροΑΙ και Α1ΑΤ ήταν παρούσες στις κανονικές γαστρικού αδένες. Ένα άλλο κάτω-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη, GKN-1, φάνηκε σαν αυτό που εμφανίστηκε στο βλεννογόνο του γαστρικού ιστού.

Οι up-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες, GRP78 και GSTpi, ήταν συγκεκριμένα βρίσκεται στα γαστρικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Αντίθετα, οι κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων ΑροΑΙ και A1AT ήταν παρόντες στις κανονικές γαστρικού αδένες. Ένα άλλο κάτω-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη, GKN-1, φάνηκε να εμφανίζεται στο βλεννογόνο του γαστρικού ιστού.

Η

Συζήτηση

Είναι σημαντικό να έχουμε βιοδείκτες για τη διάγνωση και την παρακολούθηση γαστρικών cancer.However, καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA), το αντιγόνο υδατάνθρακα (CA19-9) και CA72-4 δεν χρησιμοποιούνται συνήθως στην κλινική πρακτικών.Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να αποκαλύψει υποθετικό βιοδείκτες με σύγκριση των διαφορικών πρωτεΐνες μεταξύ συμφωνημένα καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς .Afterward, αυτές οι υποθετικές βιοδείκτες εξετάστηκαν στην επικύρωση υποθετικές πρωτεΐνες group.Five, συμπεριλαμβανομένων GRP78, GSTpi, ΑροΑΙ, Α1ΑΤ και GKN-1, ταυτοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δύο dimensiondifference (2D-ΨΗΦΟ), andmatrix υποβοηθούμενη λέιζερ εκρόφηση /ιονισμό -imaging φασματομετρία μάζας (MALDI-IMS) και fatherlyvalidated σε 12 κλινικές patients.Among πέντε υποθετικές πρωτεΐνες, GRP78 και GSTpi ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα και ειδικά ενισχυμένη σε καρκινικά κύτταρα με western αποτύπωση και την αντίθεση immunohistochemistry.In, A1AT wassignificantlydown ρυθμιζόμενα και είχε θετική και αρνητική συσχέτιση με την έκφραση της ΑροΑΙ και GRP78.

Πολλές υποθετικές βιοδείκτες του καρκίνου του στομάχου έχουν προταθεί σε προηγούμενα επίπεδα studies.High του GSTpi σε καρκινώματα στομάχου αποδείχθηκε [14] .Οι εκφράσεις GSTpi ήταν επίσης συσχετίζεται με γαστρικό καρκίνο stagewhere αυξημένα GSTpi werefound σε 50% στα στάδια Ι ή ΙΙ, και 80% στα στάδια ΙΙΙ ή IV ασθενείς με γαστρικό καρκίνο [15] προηγούμενη μελέτη .A έδειξε ότι GSTpi-θετικούς ασθενείς είχαν λιγότερο πενταετής επιβίωση ελεύθερη νόσου ποσοστά (49,0%) σε σύγκριση με GSTpi-αρνητικών ασθενών (75,0%), που υποδεικνύεται GSTpi ήταν ένας δείκτης της προγνωστικής σημασίας [16] .Στην παρούσα μελέτη, υπερ-έκφραση του GSTpi σε 75% των ασθενών με γαστρικό καρκίνο ήταν επίσης demonstrated.However , η έκταση της υπερ-έκφραση GSTpi δεν συσχετιζόταν με κλινικά στάδια (σχ. 4).

Πάνω-expressionof πρωτεΐνη GRP78 αναφέρθηκε επίσης ως ένα υποθετικό βιοδείκτη του γαστρεντερικού cancers.GRP78 υπερ-εκφράσεις μπορούν να ανιχνευθούν και να σχετίζονται με το στάδιο και την πρόγνωση του αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου [17], και του παχέος εντέρου [ ,,,0],18]. Είναι ένα από τα κυψελοειδή πρωτεΐνες απόκρισης στρες που παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιολογία των όγκων όπως η ρύθμιση της απόπτωσης και τη διατήρηση της ενδοκυτταρικής ισορροπία ασβεστίου [19], [20]. Αναφέρθηκε επίσης ότι η υπερ-έκφραση της GRP78 με ανοσοϊστοχημεία σε γαστρικό δείγματα καρκίνου και μεταστατικούς λεμφαδένες συσχετίζονταν αντίστροφα με την επιβίωση των ασθενών [21]. Ωστόσο, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν διαφορετική από την έκθεση του Zhang. Ερευνήσαμε υποψήφιος πρωτεϊνών με 2D-ΨΗΦΟ να διαχωρίσει απόκλιση πρωτεΐνες και MALDI-TOF /TOF για την αναγνώριση πεπτιδίων σε συμφωνημένα καρκίνο και φυσιολογικό tissues.In μελέτη μας, η υπερέκφραση GRP78 αυξήθηκε και είχε μια τάση συσχέτισης με κλινικά στάδια, αν και δεν στατιστική σημασία λόγω του περιορισμού του αριθμού περίπτωση.

τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών μπορεί να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Στην παρούσα μελέτη, τρεις πρωτεΐνες, ΑροΑΙ, Α1ΑΤ, και GKN-1, ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στους φυσιολογικούς ιστούς γαστρικό σύγκριση με γαστρικό καρκίνο tissues.The σχέση του ΑροΑΙ και γαστρικού καρκίνου δεν έχει αναφερθεί. ΑροΑΙ είναι ένα από τα κύρια συστατικά πρωτεΐνης του υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης χοληστερόλης (HDL-C) και παίζει πρωταρχικό ρόλο στη διατήρηση μεταφορά της χοληστερόλης και την αθηροσκλήρωση επίδραση της HDL-C [22] .Apolipoproteins όπως ΑροΑΙ μπορεί να ρυθμίζουν λιποπολυσακχαρίτη inducedinflammatory απόκριση σε σηψαιμία [23]. Στην παρούσα μελέτη, είναι πιθανό ότι μειώθηκε ΑροΑΙ είναι μια αντανάκλαση της χρόνιας φλεγμονής, η οποία είναι μια αιτία της καρκινογένεσης. Η περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να αποδειχθεί η σχέση μεταξύ μείωσης των ΑροΑΙ και δυσλειτουργίες-ρύθμιση της φλεγμονής.

Παρά το γεγονός ότι αυξήθηκε A1AT στα αρχικά της στάδια και συσχέτιση με την πορεία του γαστρικού στάδια καρκίνου παρατηρήθηκε από Bernacka Κ et al. [ ,,,0],24], περιορισμένα δεδομένα θα μπορούσε να διαφωτίσει αυξημένη Α1ΑΤ ως δείκτης όγκου του γαστρικού καρκίνου. Αντ ‘αυτού, μειωμένη Α1ΑΤ σε γαστρικό καρκίνο βρέθηκε στη μελέτη μας. Α1ΑΤ διαθέτει αντι-φλεγμονώδη δράση in vitro και συμβάλλει στην καταστολή της σύνθεσης προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως η ιντερλευκίνη-8, TNF-α, ιντερλευκίνη-1 βήτα [25]. Έχει αναφερθεί ότι οι γενετικοί παράγοντες ξενιστή που επηρεάζουν την ιντερλευκίνη-1-β μπορεί να καθορίζει το φαινότυπο της νόσου λοίμωξης από H. pylori [26]. Είναι πιθανό ότι μειώθηκε Α1ΑΤ αναστέλλει προφλεγμονωδών επίδραση καταστολής κυτοκίνης. [25]. Στη μελέτη μας, η συσχέτιση μεταξύ μειώθηκε A1AT και ΑροΑ1 θεωρήθηκε ότι ένας δείκτης χρόνιας φλεγμονής.

Gastrokine-1 (GKN-1), που διαθέτουν κάποιες μιτογονικά αποτελέσματα για εντερικά επιθηλιακά κύτταρα (IEC-6), ήταν κάτω -regulated σε γαστρικό καρκινικό ιστό σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα γαστρικό βλεννογόνο στη μελέτη μας. Γαστρικό βλεννογόνο αποκατάσταση μετά από τραυματισμό μπορεί να παρεμποδιστεί εάν GKN-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω [27], [28] .είναι έχει αναφερθεί ότι GKN1 σχετίζεται με αποπτωτικά σήματα τα οποία είναι σημαντικά για την επισκευή των ιστών κατά τη διάρκεια νεοπλασματικό μετασχηματισμό [29]. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης δείχνουν επίσης μειωμένη GKN-1 μπορεί να βρεθεί στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς.

Πρωτεομική με βάση τη μέθοδο για να εντοπίσει την απόπτωση πρωτεϊνών που σχετίζονται με το γαστρικό καρκίνο είχε αναφερθεί στο παρελθόν από Bai Ζ et al [ ,,,0],30] .Nevertheless, πρωτεΐνες διαφορικής έκφρασης της παρούσας μελέτης δεν ήταν όμοια με την έκθεση Μπάι προτείνοντας ΕΝΟ1, GRP78, GRP94, PPIA, PRDX1 και ΡΤΕΝ ως πιθανοί γαστρικό καρκίνο biomarkers.Regarding την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, είναι μια περίπλοκη διαδικασία, και εκθέματα αλληλεπιδράσεις μεταξύ υποδοχής, το περιβάλλον, και βακτήρια όπως

Helicobacter pylori

.A μόνο παράγοντα ή πρωτεΐνη δεν θα μπορούσε να είναι σε θέση να προβλέψει την εμφάνιση και εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου. Στην παρούσα μελέτη, πέντε υποθετικές πρωτεΐνες βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε συμφωνημένα ιστούς (όγκος και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό). Δύο από αυτούς (GRP78 και GSTpi) ήταν up-ρυθμίζονται και οι άλλοι (ΑροΑΙ, A1AT και GKN-1) ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Περαιτέρω μελέτες θα είναι αναγκαίο να διευκρινίσει theseproteins asbiomarkers για την ανίχνευση του καρκίνου του στομάχου.