Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνο του στομάχου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις ασθένειες σε όλο τον κόσμο. Αναδυόμενες στοιχεία έχουν δείξει ότι τα microRNAs (miRNAs) που συνδέονται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι

H. pylori

μόλυνση ήταν σε θέση να επάγει την αλλαγμένη έκφραση του miR-30b σε γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον πιθανό ρόλο του miR-30b σε καρκίνο του στομάχου.

Μέθοδοι

Αναλύσαμε την έκφραση του miR-30b σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και ανθρώπινου γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Εξετάσαμε την επίδραση της μιμείται miR-30b σχετικά με την απόπτωση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vitro με κυτταρομετρία ροής (FCM) και προσδιορισμούς κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα. Γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν miR-30b εμπλέκεται στην ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου. Ο στόχος του miR-30β ταυτοποιήθηκε με βιοπληροφορική ανάλυση, προσδιορισμός λουσιφεράσης και κηλίδα Western. Τέλος, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση συσχέτισης μεταξύ miR-30b και έκφραση στόχο του στο γαστρικό καρκίνο.

Αποτελέσματα

miR-30β ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα και ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Η αναγκαστική έκφραση του miR-30b προώθησε την απόπτωση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vitro, και miR-30b θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την ογκογονικότητα του γαστρικού καρκίνου με την αύξηση της απόπτωσης ποσοστό των καρκινικών κυττάρων in vivo. Επιπλέον, αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (ΡΑΙ-1) αναγνωρίστηκε ως ο πιθανός στόχος του miR-30b, και το επίπεδο miR-30b ήταν αντιστρόφως ανάλογη με ΡΑΙ-1 σε καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, αποσιώπηση του ΡΑΙ-1 ήταν σε θέση να phenocopy την επίδραση του miR-30b υπερέκφραση σχετικά με τη ρύθμιση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων, και η υπερέκφραση του ΡΑΙ-1 θα μπορούσε κατέστειλε την επίδραση της προώθησης της απόπτωσης των κυττάρων με miR-30b, υποδεικνύοντας ΡΑΙ-1 είναι δυνητικά εμπλέκονται στην miR-30β-απόπτωση που επάγεται σε καρκινικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

miR-30b μπορεί να λειτουργεί ως νέου ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε γαστρικό καρκίνο με στόχευση ΡΑΙ-1 και ρυθμίζει την απόπτωση των τα καρκινικά κύτταρα. miR-30b θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδεικτών και θεραπευτικός στόχος εναντίον καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Zhu Ε-Δ, Li Ν, Li Β-S, Li W, Zhang W-J, ο Μάο X-H, et al. (2014) miR-30b, ρυθμισμένα προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο, προάγει την απόπτωση και καταστέλλει την ανάπτυξη όγκου μέσω στόχευσης Αναστολέας του Ενεργοποιητή Πλασμινογόνου-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049

Επιμέλεια: Gerolama Condorelli, Federico II του Πανεπιστημίου της Νάπολης, στην Ιταλία, στην Ιταλία

Ελήφθη: 7 του Μάη 2014? Αποδεκτές: 28 Ιούλ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Αύγ, 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81202310), Επιστημονικό Ίδρυμα Έρευνας Καινοτομίας Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Νο 2009XQN20). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου προκαλεί περίπου 738.000 θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο, και έχει αναγνωριστεί ως η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [1]. Η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία οδήγησαν σε εξαιρετικές προσδοκίες για τη μακροπρόθεσμη επιβίωση και καλή πρόγνωση, ενώ οι προοπτικές για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου παραμένει φτωχή. Όπως και άλλες μορφές καρκίνου, η ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου θεωρείται ότι είναι πολυπαραγοντική.

Helicobacter pylori (Η. Pylori)

λοίμωξη έχει αναγνωριστεί ότι είναι μια σημαντική ώθηση του γαστρικού καρκίνου [2]. Αν και πολλές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές έχουν αναφερθεί σε γαστρικό καρκίνο, ο μοριακός μηχανισμός που καθορίζουν την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου παραμένει ασαφής.

microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά. Ώριμη miRNAs μπορούν να δεσμεύονται ειδικά με 3 ‘UTRs του στόχου κυτταρικού mRNA με τη σειρά του ενεργοποιεί αποικοδόμηση mRNA ή αναστολή της μετάφρασης [3], [4]. miRNAs δρουν ως ρυθμιστές κλειδιά σε μια ευρεία ποικιλία των βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης των κυττάρων, την απόπτωση, τον μεταβολισμό, και την μεταγωγή σήματος [5], [6]. Έχει αποδειχθεί ότι το 50% των miRNAs συχνά βρίσκονται σε περιοχές του γονιδιώματος που συνδέονται με τον καρκίνο ή σε εύθραυστα θέσεις [7]. Καλλιέργεια στοιχεία έχουν δείξει ότι η έκφραση παρεκκλίνουσα miRNAs συσχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και υποδεικνύει ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων [8] – [10]. Πρόσφατα, ένας σημαντικός αριθμός απελευθερωμένης miRNAs συμπεριλαμβανομένων miR-106b-25 cluster, miR-21, miR-218, miR-7, και miR-335 έχουν ταυτοποιηθεί ως ρυθμιστές της ανάπτυξης των κυττάρων, την απόπτωση, μετανάστευση, ή εισβολή στο γαστρικό καρκίνο ανάπτυξη [11] – [15]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν τα miRNAs μπορούν να παίξουν καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια του καρκίνου του στομάχου.

προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι

H. pylori

μόλυνση ήταν σε θέση να προκαλέσει την αλλοιωμένη έκφραση των miRNAs σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα συμπεριλαμβανομένων των miR-155, miR-146a και miR-30b, miRNAs μπορεί να λειτουργήσει ως νέα αρνητική ρυθμιστικές αρχές να τελειοποιήσουν

H. pylori

επαγόμενη φλεγμονή [16], [17]. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι miR-146a μπορεί να παίζει δυναμικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου με ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των κυττάρων γαστρικού καρκίνου [18]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, βρήκαμε επίσης miR-30b θα μπορούσε να ρυθμίσει τη διαδικασία αυτοφαγία κατά τη διάρκεια

H. pylori

επιμένουν λοίμωξη, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση του

H. pylori

λοιμώξεις [19]. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-30b σε γαστρικό καρκίνο είναι ακόμα σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (ΡΑΙ-1) είναι η κύρια αναστολέας πρωτεάσης σερίνης της τύπου ιστού (ί-ΡΑ) και τύπου ουροκινάσης ( υ-ΡΑ) ενεργοποιητή πλασμινογόνου και επομένως παίζει σημαντικό ρόλο στο σύστημα του πλασμινογόνου-πλασμίνης [20]. Προηγούμενες μελέτες κατέδειξαν ΡΑΙ-1 είναι ένας φτωχός προγνωστικός παράγοντας σε διάφορες κοινές όγκους, και σχετίζεται με την εισβολή καρκίνου και μετάσταση [21]. Πρόσφατα, πολλές ομάδες επίσης έχουν διαπιστώσει ότι ΡΑΙ-1 μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της αναστολής της κυτταρικής απόπτωσης. Για παράδειγμα, η προσθήκη ενός σταθερού άγριου τύπου ΡΑΙ-1 στον ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά PC-3, η ανθρώπινη προμυελοκυτταρική κυτταρική λευχαιμία γραμμή HL-60 και ακόμη και μη των όγκων κυττάρων, είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική αναστολή της απόπτωσης [22] . Όταν ενίεται υποδορίως σε γυμνά ποντίκια με ΡΑΙ-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν ινοσαρκώματος μυοειδούς, οι όγκοι ταχέως αποδειχθεί, ενώ ΡΑΙ-1 ελλειμματικά κύτταρα είχαν κατασταλεί ογκογονικότητα [23]. Μια άλλη έκθεση έδειξε ότι, η γενετική και φαρμακολογική αναστολή του ΡΑΙ-1 σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου (ΗΤ-1080, Α549, HCT-116, και MDA-MB-231) αυξημένη αυτόματη απόπτωση, και έχει ενδιαφέρον, εμφυτεύονται ΡΑΙ-1 knockdown HT- 1080 κυττάρων σε ΡΑΙ-1 ποντίκια knockout οδήγησε σε μειωμένη ογκογένεση και παρατεταμένη επιβίωση σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου [24]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν σημαντικές ενδείξεις ότι η ΡΑΙ-1 ασκεί έναν προστατευτικό ρόλο έναντι των καρκινικών κυττάρων σε απόπτωση.

Στην τρέχουσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miR-30b ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα και ιστούς όγκων. Η έκτοπη έκφραση του miR-30b θα μπορούσε να προωθήσει την απόπτωση των κυττάρων γαστρικού καρκίνου in vitro, και miR-30b θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την ογκογονικότητα των γαστρικών καρκίνων σε γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Επιπλέον, ΡΑΙ-1 αναγνωρίστηκαν ως οι πιθανοί στόχοι του miR-30b, και miR-30β μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου από την καταστολή της έκφρασης του ΡΑΙ-1. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι miR-30b μπορεί να λειτουργεί ως νέου ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε γαστρικό καρκίνο και μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Animal Ethical και Πειραματική επιτροπή του τρίτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις ζώο εκτελέστηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Η μελέτη περιλαμβάνει δείγματα ιστών εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας κριτική στην Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη συμμετοχή.

δείγματα ιστών

Συνολικά, γαστρικό καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου ελήφθησαν από ασθενείς με πρωτογενή καρκίνο του στομάχου υφίστανται ριζικές γαστρεκτομή στο Southwest Νοσοκομείο, Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα, και τα κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του στομάχου συνοψίζονται στον πίνακα 1. Μετά τη χειρουργική αφαίρεση, οι ιστοί καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Η μελέτη εγκρίθηκε από το διοικητικό συμβούλιο επανεξέτασης δεοντολογίας στην Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη συμμετοχή.

Η

κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την Shanghai Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Shanghai, Κίνα), τα ανθρώπινα γαστρικά γραμμές AGS καρκινικό κύτταρο καλλιεργήθηκε σε Ham Ρ12 (Hyclone) μέσο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), άλλα γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45, HGC-27, BGC-823, SGC-7901 και τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά (ΗΕΚ) 293 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Hyclone) με 10% FBS, είχαν όλοι διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen), που ακολουθείται από μια ανάστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan miRNA (Ambion), με U6 μικρό πυρηνικό RNA ως εσωτερική κανονικοποιημένη αναφοράς. Αντιδράσεις qRT-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους: 95 ° C για 2 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s. αναλύσεις qRT-PCR για το mRNA του ΡΑΙ-1 διεξήχθησαν με χρήση κιτ PrimeScript RT-PCR (Takara), με τις ακόλουθες παραμέτρους: 95 ° C για 30 s που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s, 60 ° C για 5 s και 72 ° C για 30 s. Το επίπεδο του mRNA της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα 2.

Η

Northern blot

Μικρού μεγέθους RNAs απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης RNA mirVana (Ambion). Τρία ζεύγη κλινικών δειγμάτων επιλέχθηκαν τυχαία από τις 21 ασθενείς για μεταγενέστερη ανάλυση κηλίδος Northern. Northern blot πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρότυπο διαδικασία όπως descried προηγουμένως [17]. Τα αντιπληροφοριακά ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίου DNA χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση miR-30b και U6 snRNA ήταν ως ακολούθως: miR-30b (5′-AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ‘) και U6 (5′-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3’)

διαμόλυνσης κυττάρων.

μιμείται miR-30b, ομελέτα miR-ελέγχου, χημικώς μετασχηματισμένα miR-30b διπλής όψης (agomir), χημικώς μετασχηματισμένα ομελέτα miR-ελέγχου, ΡΑΙ-1 siRNA, ή siRNA αρνητικού ελέγχου αγοράστηκαν από GenePharma (Σαγκάη GenePharma Co . Ltd., Κίνα). PAI-1 (Serpine1) Ανθρώπινη cDNA ORF Κλώνος αγοράστηκε από ΟηΟεηε (ΟηΟεηε Technologies, Πεκίνο, Κίνα). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης με FCM

SGC-7901 ή HGC-27 κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκα σε μία κατάλληλη πυκνότητα και αναπτύχθηκαν σε 30% συρροή μετά από 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου, και το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM ελεύθερο ορού για 48 ώρες. Για το πείραμα συν-επιμόλυνση με miR-30b και ΡΑΙ-1 που εκφράζει τον φορέα, SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-έλεγχο ή miR-30b μιμείται, και στη συνέχεια με ΡΑΙ-1 Ανθρώπινη cDNA ORF φορέα κλώνος (υποδεικνύεται ως ΡΑΙ-1) ή κενό φορέα 24 ώρες αργότερα. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση φορέα, το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM ελεύθερο ορού για άλλες 24 ώρες. Τέλος, τα κύτταρα εφαρμόσθηκαν σε ανάλυση απόπτωσης. Για την ανάλυση FCM, ένα κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC απόπτωση Ι (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκε, στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD FACSCantoTM II).

κασπάσης-Glo 3/7 Δοκιμασία

Η δραστικότητα της κασπάσης-3/7 ανιχνεύθηκε με τη χρήση της κασπάσης-Glo 3/7 Δοκιμασία (Promega). Προσθέστε 100 μl της κασπάσης-Glo αντιδραστήριο 3/7 σε λευκά τοιχώματα πλάκας 96-φρεατίων, αναμείξτε απαλά περιεχόμενα των πηγαδιών, και στη συνέχεια επωάστε τα βοθρία σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η φωταύγεια ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το GloMax-96 Microplate φωτόμετρο (Promega).

δοκιμασίες ογκογονικότητας σε γυμνούς ποντικούς

Οι ποντικοί που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα διατηρήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Βιώσιμα mimics- miR-30b και miR-ελέγχου-επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα (1 χ 10

6) αιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και στη συνέχεια ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές της πτέρυγας οπίσθιο τμήμα του ίδιο θηλυκό BALB /c αθυμικά γυμνού ποντικού στους 4 έως 6 εβδομάδων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η ανάπτυξη του όγκου και η κατάσταση, συμπεριλαμβανομένης της συνολικής υγείας και τη συμπεριφορά των ποντικών εξετάστηκαν κάθε τρεις ημέρες για 4 εβδομάδες. Τα ποντίκια καρκινικά beared δεν εμφάνισαν σημάδια πόνου ή δυσφορίας όπως απώλεια βάρους ή αλλαγές της συμπεριφοράς, έτσι όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία κατά την 28η ημέρα μετά την ένεση. Ο όγκος του όγκου (V) παρακολουθήθηκε με μέτρηση του μήκους (L) και το πλάτος (W) με παχύμετρο και υπολογίστηκαν με τον τύπο (L χ W

2) × 0.5.

χρώσης TUNEL

Οι όγκοι συλλέχθηκαν στις 26 ημέρες, και μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10%, τότε ενσωματωμένο σε παραφίνη. Τμήματα (πάχους 5 μm) που είχε αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. καρκινικά κύτταρα αποπτωτικών βάφτηκαν με το μέθοδο situ τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (ΤΟΥΝΕΛ) χρησιμοποιώντας ένα in situ κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (POD? Roche Diagnostics Co.). Αρνητικός έλεγχος υποβλήθηκε στην ίδια χρώση για TUNEL χωρίς TdT. Εικόνες συλλέχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου με μεγέθυνση × 200.

Κατασκευή των πλασμιδίων

Η κατασκευή των διαφόρων φορέων λουσιφεράσης έκθεση για στόχο miR-30b πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], [26] , και το κατασκεύασμα που περιέχει μεταλλαγμένο περιοχή σπόρος παρήχθη ως έλεγχος. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα 2.

πειράματα

δοκιμασία Λουσιφεράσης και GFP καταστολή

κύτταρα ΗΕΚ-293 σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο μία ημέρα πριν την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με κάθε λουσιφεράση πυγολαμπίδας φορέα αναφοράς, Renilla φορέα ελέγχου λουσιφεράσης, ρΡΙ_-ΤΚ (Promega), και μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου (GenePharma). Η δοκιμασία λουσιφεράσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega).

Για πειράματα GFP καταστολή, τα κύτταρα ΗΕΚ-293 σπάρθηκαν σε πλάκα 12-φρεατίων σε 1 × 10

5 ανά φρεάτιο του ημέρα πριν την επιμόλυνση και έπειτα διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με τις μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου με διάφορους φορείς αναφοράς GFP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, και τα δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση λογισμικού CellQuest Pro.

κηλίδος Western

Τα επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και στη συνέχεια λύθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (Διατρυπώ). Μετά από φυγοκέντρηση στις 12000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C, η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Pierce). Προϊόντα λύσης κυτταρικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 12% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου μετουσιωθεί και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Τπδ αλατούχο διάλυμα, ρΗ 7,4, που περιέχει 0,05% Tween 20, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για ΡΑΙ-1 (1:1000, Abcam) και β-ακτίνη (1:1000 , Santa Cruz) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, αντίστοιχα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα (1:5000, Santa Cruz) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος έγινε ορατή χρησιμοποιώντας υπόστρωμα ECL Western blotting (Pierce) και του Συστήματος Chemidoc XRS Gel (BioRad).

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. t δοκιμή Student εφαρμόστηκε για την ανάλυση των διαφορών μεταξύ των ομάδων. Η σχέση μεταξύ του επιπέδου miR-30b και ΡΑΙ-1expression αναλύθηκε χρησιμοποιώντας συσχέτισης του Pearson. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το λογισμικό SPSS (έκδοση 17). Στατιστικές διαφορές δηλώθηκαν σημαντική σε

P

& lt? 0,05 επίπεδο. Τα στατιστικά σημαντική δεδομένα σημειώνονται με αστερίσκο (

P

& lt? 0,05 (*),

P

& lt?. 0.01 (**)

Αποτελέσματα

Μειωμένη έκφραση miR-30b σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και δείγματα ιστών GC

Για να καθοριστεί ο ρόλος του miR-30b στην παθογένεση του καρκίνου του στομάχου, αναλύσαμε τα επίπεδα miR-30b σε διάφορα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων HGC-27, AGS, BGC-823 και SGC-7901. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η έκφραση του miR-30b ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε τέσσερις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με μια δεξαμενή πέντε μη-όγκου γαστρικών ιστών (

P

& lt?. 0.01)

(Α) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης των miR-30β μεταξύ της κανονικής δείγματα γαστρικό βλεννογόνο ιστό και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου HGC-27, ΓΓΕ-7901, BGC-823 και AGS . **

P

& lt?.. 0.01, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (Β) Σχετική έκφραση του miR-30b σε 21 γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα γειτονικά μη-όγκου γαστρικών ιστών (C) σύγκριση του μέσου όρου της έκφραση του miR-30b σε δύο ομάδες Β Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD **

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο. (Δ) Ανάλυση της έκφρασης miR-30b χρησιμοποιώντας κηλίδωση Northern. Ολικό RNA εξήχθη από τρία ζεύγη γαστρικού καρκίνου (Τ) και των παρακείμενων μη-καρκινικές γαστρικού ιστούς (Ν), που επιλέχθηκαν τυχαία από όλους τους ασθενείς. RNAs υβριδίστηκαν διαδοχικά με miR-30b και ο ανιχνευτής U6, και U6 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για RNA φόρτωση.

Η

Η έκφραση του miR-30β εξετάστηκε περαιτέρω σε 21 ζεύγη GC και τις παρακείμενες μη-όγκου γαστρικό ιστούς μέσω TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β, η μείωση του miR-30b βρέθηκε σε 18 από 21 ασθενείς (85,7%) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, το διάγραμμα διασποράς έδειξε ότι miR-30b σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκίνο δείγματα έναντι κανονικών γαστρικό βλεννογόνο, με μέσο όρο 6,28 φορές μείωση (

P

= 0.002) (Σχήμα 1 C). Για την επικύρωση των δεδομένων έκφρασης που αποκτήθηκαν από qRT-PCR, 3 όλων των 21 ζεύγη δειγμάτων ήταν τυχαία επέλεξε να καθορίσει το επίπεδο των miR-30b χρησιμοποιώντας Βόρεια μπουλόνι. Βρήκαμε επίσης συνεπής μειωμένη έκφραση του miR-30b σε γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με μη-όγκου γαστρικών ιστούς (Σχήμα 1 D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση miR-30b είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκίνο και ίσως εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου.

Η υπερέκφραση του miR-30b αυξάνει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων γαστρικού

Ένα από τα σήμα κατατεθέν του καρκίνου είναι η ικανότητά του να αποφύγει την απόπτωση [27], έτσι εξετάσαμε την επίδραση του miR-30b στην γαστρική καρκινικά κύτταρα απόπτωσης. SGC-7901 ή HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-30b ή ομελέτα miR-ελέγχου, και η ισχύς του miR-30β έκτοπη έκφραση επιβεβαιώθηκε από qRT-PCR (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια, η επίδραση των miR-30b στην απόπτωση των SGC-7901 ή HGC-27 κυττάρων εκτιμήθηκε από δοκιμασίες ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FCM) και κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β και 2C, βρήκαμε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε SGC-7901 ή κύτταρα HGC-27 επιμολυσμένα με μιμείται miR-30b σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα miR (16,08%

έναντι

8,25% έως SGC-7901 κύτταρα, και 17,83%

έναντι

10,87% σε HGC-27 κύτταρα). Επιπλέον, σημαντική αύξηση της κασπάσης-3/7 δραστηριότητα βρέθηκε στο SGC-7901 ή HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-30b σε σύγκριση με επιμολύνσεων miR-ελέγχου (

P

& lt? 0.01, Σχήμα 2D). Παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερέκφραση του miR-30b μπορεί να προωθήσει την απόπτωση του γαστρικού καρκίνου in vitro.

(A) Σχετική έκφραση του miR-30b στην AGS, HGC-27, και SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με ΜΙΚ 30β μιμείται ή miR-ελέγχου για 48 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, ***

P

& lt? 0.001. (Β) Η επίδραση του miR-30β επί της απόπτωσης εξετάστηκε με ανάλυση FCM. SGC-7901 ή HGC-27 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου, και στη συνέχεια το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM ελεύθερο ορού για 48 ώρες, τα κύτταρα αναλύθηκαν για αποπτωτική ρυθμό μετά από χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ . Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01. (Γ) ένας εκπρόσωπος ανάλυση FCM στην Β παρουσιάζεται. (D) SGC-7901 ή HGC-27 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου για 48 ώρες. Η δραστικότητα της κασπάσης-3 και κασπάσης-7 ανιχνεύθηκε με τη χρήση της κασπάσης-Glo 3/7 Assay. Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. 6 επαναλήψεις από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt?. 0.01

Η

miR-30β καταστέλλει ογκογενετικότητας και προωθεί την κυτταρική απόπτωση in vivo

Για να προσδιορίσετε περαιτέρω αν miR-30b εμπλέκεται στην ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου, χρησιμοποιήθηκε γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Επειδή διαπιστώσαμε ότι το miR-30b έπαιξε πιο σημαντικό ρόλο στην προώθηση της ΓΓΕ-7901 κύτταρα απόπτωσης από HGC-27 κύτταρα in vitro, θα διερευνήσει το ρόλο του miR-30b στην ογκογένεση του γαστρικού καρκίνου με τη βοήθεια SGC-7901 κύτταρα. miR-μάρτυρα και miR-30b-διαμολυσμένους SGC-7901 κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως σε πλευρό είτε οπίσθιο των ίδιων γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για παρατήρηση της ανάπτυξης ξενομοσχεύματος για 4 εβδομάδες. Βρέθηκε ότι η εισαγωγή του miR-30b σε SGC-7901 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου του όγκου (Σχήμα 3Α και 3Β), και οι όγκοι που προέρχονται από miR-30b αγωγή SGC-7901 κύτταρα αναπτύχθηκαν πιο αργά σε σύγκριση με τον έλεγχο ομάδα κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου ανάπτυξης του όγκου (Σχήμα 3C, αριστερό πάνελ). Όταν συλλέχθηκαν οι όγκοι, ο μέσος όγκος των όγκων που προέρχονται από την ομάδα μιμείται miR-30b ήταν μόνο 27,87% του ότι στην ομάδα miR-ελέγχου (Σχήμα 3C, δεξιό πλαίσιο,

P

& lt? 0,01). Οι όγκοι συλλέχθηκαν σε 26 ημέρες από την δύο πλευρές του πλευρού οπίσθιο τμήμα του ίδιου ποντικού, η απόπτωση in situ μετρήθηκαν με TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, τομές όγκου από μιμείται miR-30b αγωγή ξενομοσχευμάτων εμφάνισαν αυξηθούν σημαντικά σε TUNEL-θετικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι η εισαγωγή του miR-30b θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του καρκίνου του γαστρικού προωθώντας την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων.

(Α) Επίδραση ofmiR-30β επί του σχηματισμού όγκου σε λειτουργία vivo ξενομοσχεύματος. miR-μάρτυρα και miR-30b-επιμολυσμένα SGC-7901 (1 × 10

6) αιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και στη συνέχεια ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές της πτέρυγας οπίσθιο τμήμα του ίδιο θηλυκό BALB /c αθυμικά γυμνά ποντικού. Δύο αντιπροσωπευτικά ποντίκια που φέρουν όγκο μετά από 4 εβδομάδες εμβολιασμό έδειξαν. (Β) Οι σημαντικές διαφορές του μεγέθους του όγκου μεταξύ της ομάδας miR-ελέγχου και την ομάδα του miR-30b από 6 ποντίκια. (Γ) Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε τρεις ημέρες μετά την ένεση του SGC-7901 κυττάρων με κατεργασία όπως περιγράφηκε στο Α, και η καμπύλη ανάπτυξης όγκου φάνηκε. Η διαφορά του μεγέθους του όγκου μεταξύ της ομάδας miR-ελέγχου και την ομάδα του miR-30β ήταν στατιστικά σημαντική, ** P & lt? 0,01. (Δ) Οι όγκοι συλλέχθηκαν σε 26 ημέρες από την δύο πλευρές του πλευρού οπίσθιο τμήμα του ίδιου ποντικού, η απόπτωση in situ μετρήθηκαν με TUNEL. Όλα τα παραπάνω στοιχεία είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

ΡΑΙ-1 είναι ένα γονίδιο στόχος υποψήφιος του miR-30β

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η λειτουργία των miR-30b, είναι σημαντικό να καθοριστεί ποια mRNAs υποδοχής που ρυθμίζεται από miR-30b. Σε προηγούμενη μελέτη μας, εξετάσαμε το προφίλ έκφρασης mRNA σε πέντε ζεύγη των πρωτογενών καρκινικών ιστών του ασθενείς με γαστρικό καρκίνο και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς με τη χρήση μικροσυστοιχιών. Απόλυτα, βρήκαμε 303 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια (fold αλλαγή & gt? 2,

P

& lt? 0,05) σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με το μη καρκινικούς ιστούς (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβάνοντας υπόψη την κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης του miR-30β στο γαστρικό καρκίνο, εστιάσαμε στον κατάλογο των γονιδίων που δείχνουν αυξημένη εκφράσεις και επέλεξε τα top 30 αυξήθηκε γονίδια σε καρκίνο του στομάχου, τότε προσδιορίζεται αν αυτά τα γονίδια ήταν πιθανοί στόχοι του miR-30b, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο πρόβλεψης , TargetScan. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ΡΑΙ-1 γονιδίου το οποίο ρυθμίζεται αυξητικά σε μικροσυστοιχία (3,83 φορές,

P

= 0.04) μπορεί να είναι μια πιθανή γονίδιο στόχος του miR-30b (Σχήμα 4Α). Για την αντιμετώπιση άμεσα είτε miR-30b συνδέεται με το 3′-UTR των mRNA στόχου, κατασκευάσαμε τις λουσιφεράσης φορείς έκθεση που περιέχουν το υποθετικές θέσεις εντός 3′-UTR δέσμευσης miR-30b. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης (

P

& lt? 0,01) μετά contransfection λουσιφεράσης φορέων έκθεσης και μιμείται miR-30b. Αντίθετα, καμία μεταβολή της λουσιφεράσης παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με το μεταλλαγμένο κατασκευάσματα 3′-UTR. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια από τα πειράματα GFP καταστολή. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C και 4D, ο φθορισμός GFP ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς έκθεση GFP που περιέχει θέσεις δέσμευσης και μιμείται miR-30b, ενώ δεν υπήρξε μεταβολή του φθορισμού GFP σε κύτταρα επιμολυσμένα με μεταλλαγμένο φορέα και miR-30b μιμείται. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-30b σε AGS και HGC-27 κύτταρα σαν αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων πρωτεΐνης του ΡΑΙ-1 (Σχήμα 4Ε). Στο σύνολό τους, παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι η PAI-1 είναι ένας πιθανός στόχος του miR-30b, και miR-30b θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την πρωτεΐνη-στόχο.

ευθυγράμμιση Ακολουθία του miR-30b και θέσεις στόχου (Α) του σε 3′-UTRs του ΡΑΙ-1. (Β) κύτταρα ΗΕΚ293 συνδιαμολύνθηκαν παροδικά με λουσιφεράσης φορείς έκθεση, και είτε miR-30b μιμείται ή miR-ελέγχου. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκαν με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα κύτταρα ΗΕΚ-293 (C και D) διαμολύνθηκαν με τον φορέα έκθεση GFP ή μεταλλαγμένο φορέα, και είτε miR-30b μιμείται ή miR-ελέγχου. φθορισμός GFP παρακολουθήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού και ανάλυση FCM. (Ε) ανάλυση Western blots για ΡΑΙ-1 του AGS και κυττάρων HGC-27 επιμολυσμένα με μιμείται miR-30b ή miR-ελέγχου. Όλα τα παραπάνω στοιχεία είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, **

P

& lt?. 0.01

Η

αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ mir-30β και ΡΑΙ-1 έκφρασης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και καρκινικές κυτταρικές γραμμές

Θεωρώντας ότι miR-30b ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο, και έχει αναφερθεί ότι ΡΑΙ-1 πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς είναι δραματικά υψηλότερο από εκείνο των μη καρκινικούς ιστούς [28], πραγματοποιήσαμε την ανάλυση συσχέτισης μεταξύ miR-30b και ΡΑΙ-1 έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και του γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α κορυφή, επίπεδο πρωτεΐνης ΡΑΙ-1 ήταν η χαμηλότερη στην AGS κυψέλη μεταξύ των πέντε γαστρικού κυτταρικές γραμμές. Αντίθετα, το επίπεδο miR-30b ήταν η υψηλότερη στην AGS, σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 5Α κάτω). Στη συνέχεια, εξετάσαμε ΡΑΙ-1 και miR-30b έκφραση σε 21 σετ γαστρικού καρκίνου και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου. Βρήκαμε ότι το 81% (17/21) των γαστρικών καρκίνων που εμφανίζονται υψηλότερα mRNA ΡΑΙ-1 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς. Σε αντίθεση, miR-30b ήταν συνήθως κάτω-ρυθμίζονται σε 18 από 21 όγκων. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης του Pearson, παρατηρήσαμε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-30b και ΡΑΙ-1 mRNA (Σχήμα 5Β,

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). Παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση miR-30b συσχετίζεται αντίστροφα με ΡΑΙ-1 σε καρκίνο του στομάχου, και την ενίσχυση της ΡΑΙ-1 σε καρκίνο του στομάχου θα μπορούσε να είναι ένα αποτέλεσμα της μειωμένης έκφρασης miR-30b.

(Α) Η έκφραση του mir-30b και ΡΑΙ-1 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ45, MGC-823, SGC-7901, AGS και HGC-27. Επάνω, ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης ΡΑΙ-1? κάτω, ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων miR-30b. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. επίπεδα (Β) miR-30β και ΡΑΙ-1 mRNA σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς αναλύθηκαν με qRT-PCR. Το γράφημα ένθετο έδειξε μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). U6 και β-ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερική κανονικοποιημένες αναφορές για miR-30b και ΡΑΙ-1 mRNA, αντίστοιχα.

Η

ΡΑΙ-1 είναι δυνητικά εμπλέκονται στην miR-30β-επαγόμενη απόπτωση

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η ΡΑΙ-1 εμπλέκεται στην miR-30β-προωθείται απόπτωση, που δοκιμάστηκε για πρώτη φορά, αν η αποσιώπηση του ΡΑΙ-1 μπορεί να έχει την παρόμοια απόπτωση προάγουν την ισχύ miR-30β υπερέκφραση. SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΡΑΙ-1 siRNA ή RNA αρνητικό έλεγχο (NC) για 48 ώρες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, τα επίπεδα mRNA του ΡΑΙ-1 μπορεί να μειωθεί σημαντικά με siRNA της. Στη συνέχεια, ΡΑΙ-1 siRNA εμφανίζονται προφανείς αυξήσεις στην αποπτωτική συντελεστή SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 6Β, 6C), σε σύγκριση με miR-ελέγχου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ΡΑΙ-1 siRNA ήταν σε θέση να phenocopy την επίδραση του miR-30β υπερέκφραση σχετικά με τη ρύθμιση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων (Εικόνα 6Β, 6C). Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα του dot οικόπεδο φαίνεται στο Σχήμα 6D. Στη συνέχεια, εξετάσαμε επίσης αν ΡΑΙ-1 θα μπορούσε να καταργήσει την επίδραση της προώθησης απόπτωσης με miR-30b. SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-έλεγχο ή miR-30b μιμείται για 24 ώρες, και ακολούθησε επιμόλυνση με ΡΑΙ-1 Ανθρώπινη cDNA ORF φορέα κλώνος (υποδεικνύεται ως ΡΑΙ-1) ή με κενό φορέα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Ε-G, το υπερεκφράζουν του ΡΑΙ-1 οδήγησε σε εμφανή καταστολή για την επίδραση της miR-30β-επαγόμενη απόπτωση. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΡΑΙ-1 δυνητικά εμπλέκονται στην miR-30β-προωθείται απόπτωσης.

(Α) ΡΑΙ-1 siRNA αναστέλλει την έκφραση του ΡΑΙ-1 αποτελεσματικά σε mRNA επίπεδα. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της έκφρασης του ΡΑΙ-1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA για ΡΑΙ-1 ή αρνητικό RNA ελέγχου, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01. (Β) SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-ελέγχου, miR-30b ή ΡΑΙ-1 siRNA, και το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM ελεύθερο ορού για 48 ώρες, στη δραστηριότητα της κασπάσης-3 και κασπάσης-7 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας η κασπάση-Glo 3/7 Δοκιμασία. Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. 6 επαναλήψεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01. (C) SGC-7901 κύτταρα επεξεργάστηκαν ως (Β), και στη συνέχεια τα κύτταρα αναλύθηκαν για αποπτωτική ρυθμό μετά από χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01. (Δ) ένας εκπρόσωπος FCM ανάλυση (C) εμφανίζεται. (Ε) SGC-7901 κύτταρα πρώτα διαμολύνονται με miR-έλεγχο ή miR-30b μιμείται, και στη συνέχεια με ΡΑΙ-1 Ανθρώπινη cDNA ORF φορέα κλώνος (υποδεικνύεται ως ΡΑΙ-1) ή με κενό φορέα 24 ώρες αργότερα. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση φορέα, το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM ελεύθερο ορού για άλλες 24 ώρες, τελικά τη δραστικότητα της κασπάσης-3 και κασπάσης-7 ανιχνεύθηκε με τη χρήση της κασπάσης-Glo 3/7 Assay. Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. 6 επαναλήψεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01. (F) SGC-7901 κύτταρα επεξεργάστηκαν ως (Ε), τέλος τα κύτταρα αναλύθηκαν για αποπτωτική ρυθμό μετά από χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, **

P

& lt? 0,01.