Αφηρημένο

Ιστορικό

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι μορφολογικά ετερογενείς να χαρακτηριστεί ως ορώδες , ενδομητριοειδές, σαφείς κυττάρων, ή βλεννώδες. Μοριακή γενετική ανάλυση έχει προτείνει ένα ρόλο για ογκοκατασταλτικά γονίδια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 3ρ στο ορώδες παθογένεια του ΕΓΚ. Στόχος μας ήταν να αξιολογηθεί η έκφραση του

ΗγΑΙ 1

, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3p21.3, σε αυτές τις EOC υποτύπους, και να διερευνήσει συσχέτιση της με την έκφραση των υποδοχέων στεροειδών ορμονών.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

Θα προσδιορίζεται η έκφραση του mRNA της

ΗγΑΙ 1

, υποδοχέα οιστρογόνων (ER) -α, ΕΚβ και των υποδοχέων προγεστερόνης (PR) σε δείγματα όγκων EOC και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Επίσης εξετάσαμε την έκφραση αυτών των γονιδίων σε μια διαθέσιμη στο κοινό σύνολο δεδομένων των μικροσυστοιχιών. δραστικότητα ενζύμου ΗΥΑί-1 μετρήθηκε σε κυτταρικές γραμμές EOC και σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς. Βρήκαμε ότι

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA ανυψώθηκε σε σαφή βλεννώδες δείγματα ιστού EOC κυττάρων και, αλλά όχι σε ορώδες και ενδομητριοειδές δείγματα, φυσιολογικές ωοθήκες ή καλοήθεις όγκους. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με δύο διαφορετικές τεχνικές και με ομάδες δείγμα ιστού από δύο ανεξάρτητους φορείς. Να συμπίπτει,

ΗγΑΙ 1

mRNA επίπεδα και ενζυμική δραστηριότητα ήταν αυξημένα μόνο σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ΕΓΚ σαφή κυττάρων και βλεννώδες υποτύπους. Δείξαμε επίσης ότι

ΗγΑΙ 1

mRNA ήταν αντιστρόφως ανάλογη με εκείνη του ΕΡα ειδικά σε σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOCs. Επιπλέον, έκτοπη έκφραση ΕΚα σε μια κυτταρική γραμμή διαυγοκυτταρικό EOC (ER- και PR-αρνητικός) προκάλεσε μείωση κατά 50% των

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA, υποστηρίζοντας ένα ρόλο ΕΚα σε

ΗγΑΙ 1

γονίδιο κανονισμός. Σημαντικά, ΗΥΑί-1 δραστηριότητα ήταν επίσης υψηλά στο πλάσμα των ασθενών με αυτές τις EOC υποτύπους.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει υψηλή ΗΥΑί-1 επίπεδα στο ΕΓΚ και την επίδειξη

ΗγΑΙ 1

γονίδιο καταστολής από Ετα. Τα αποτελέσματά μας εντοπισμό υαλουρονιδάση-1 ως πιθανός στόχος /βιοδείκτη για τη σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOCs και ειδικά σε όγκους με χαμηλά επίπεδα Ετα

Παράθεση:. Yoffou PH, Edjekouane L, Meunier L, Tremblay Α, Provencher DM, Mes-Masson ΑΜ, et al. (2011) ειδικού για τον υπότυπο αυξημένη έκφραση του Υαλουρονιδάσης-1 (ΗΥΑί-1) σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (6): e20705. doi: 10.1371 /journal.pone.0020705

Επιμέλεια: Nai Sum Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 15 Δεκέμβρη 2010? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 10 του Ιούνη 2011

Copyright: © 2011 Yoffou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών Συμβούλιο Έρευνας Φυσικών του Καναδά (επιχορήγηση # 262142 έως ΕΚ). Όγκου τραπεζικών υποστηρίχθηκε από την Banque de ιστούς et de données του Réseau de recherche sur le καρκίνο του Fonds de la recherche en Santé du Québec συνδεδεμένες με το αποθετήριο δικτύου καναδική όγκου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό καρκίνο στις περισσότερες δυτικές χώρες [1]. Λόγω της ασυμπτωματικής ανάπτυξή της και την έλλειψη αποτελεσματικών μεθόδων ελέγχου, περίπου το 70% όλων των περιπτώσεων διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο, με μόνο μέτριες βελτιώσεις στην επιβίωση κατά τη διάρκεια των τελευταίων 40 ετών [1]. Αν και οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται σε χημειοθεραπεία αρχικά, τα ποσοστά υποτροπής είναι πολύ υψηλή με αποτέλεσμα την γενική κακή πρόγνωση φαίνεται στο [2] αυτούς τους ασθενείς. Επιπλέον, EOCs είναι μορφολογικά ετερογενείς, και διαφορετικές ιστοπαθολογικές υποτύπων έχουν διακριτά μοριακά χαρακτηριστικά και ποικίλες ανταπόκρισης στη θεραπεία [3]. EOC μπορούν να ταξινομηθούν ως ορώδες, ενδομητριοειδές, σαφής κύτταρο ή βλεννώδες οι οποίες αντιστοιχούν στα διάφορα είδη επιθηλίων που υπάρχουν στο γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα [4]. Οι διαφορές στην απόκριση σε χημειοθεραπεία και την έκβαση του ασθενούς πιθανώς να προκύψει από τη μοριακή ετερογένεια αυτών των μορφολογικά διακριτών [3] EOCs. Για παράδειγμα,

TP53

μεταλλάξεις παρατηρούνται συχνά σε ορώδες και ενδομητριοειδές καρκίνους, αλλά μόλις και μετά βίας ανιχνεύθηκε σε σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOCs [3]. Είναι επίσης γνωστό ότι η συχνότητα των χρωμοσωμικής αστάθειας είναι υψηλότερη σε ορώδης EOC σε σύγκριση με άλλους υπότυπους [3].

ορώδες EOC, μοριακή γενετική ανάλυση έχει προτείνει έναν ρόλο για ογκοκατασταλτικά γονίδια που βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 3 (3ρ) στην παθογένεση αυτής της ασθένειας [5]. ανάλυση μεταγραφικό του χρωμοσώματος 3 γονιδίων που ταυτοποιούνται αρκετά διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε κυτταρικές σειρές EOC και των ωοθηκών, σε σύγκριση με την κανονική επιφάνεια επιθηλιακών ωοθηκών (μύτη) κυττάρων [6], [7]. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε 3p21.3 ανευρίσκονται συχνά στον πνεύμονα, των νεφρών και των καρκίνων του μαστού, γεγονός που υποδηλώνει ότι φιλοξενούν γονίδια καταστολής όγκων [8]. Που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3p21.3 είναι ένα σύμπλεγμα των γονιδίων, που ονομάζεται υαλουρονιδασών (

ΗγΑΙ 1

,

HYAL2

και

HYAL3

), που είναι η πιο συχνή στόχος της ομόζυγη διαγραφές στο καρκίνο του πνεύμονα [8].

θηλαστικών υαλουρονιδασών (ΕΚ 3.2.1.35) είναι ενδο-

Ν

-acetylhexosaminidases που υδρολύουν την γλυκοζαμινογλυκάνη υαλουρονάνη. Περιλαμβάνουν μια οικογένεια 6-7 γονιδίων με περίπου 40% ταυτότητα μεταξύ τους [9], [10]. Στους ανθρώπους, που είναι συγκεντρωμένα σε ομάδες των τριών στα χρωμοσώματα 3p21.3 (

ΗγΑΙ 1

,

HYAL2

και

HYAL3

) και 7q31.3 (

HYAL4

,

PH20

/

SPAM1

και

HYALP1

), με το

HYALP1

είναι ένα ψευδογονίδιο και

HYAL4

κωδικοποίησης για ένα chondroitinase ενζύμου [9], [11]. Ως εκ τούτου, στον άνθρωπο, υπάρχουν τέσσερις υαλουρονιδάσες, ΗΥΑί-1, -2, -3 και PH20 /Spam1, όπου η τελευταία εκφράζεται κυρίως στο αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα και που έχει ένα σημαντικό ρόλο στην γονιμοποίηση [12]. Από την άλλη πλευρά, οι υαλουρονιδάσες βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3 εκφράζονται παντού. ΗΥΑί-1 και ΗΥΑί-2 είναι τα κύρια σωματικά υαλουρονιδάσες υπεύθυνος για τον κύκλο εργασιών υαλουρονάνη και είναι γνωστό ότι έχουν διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές ρόλους [9], [13], όπως επούλωση τραύματος, φλεγμονή και οστεοαρθρίτιδα. Σε αντίθεση, Hyal-3 έχει περιγραφεί ότι είναι άνευ υαλουρονάνης ενζυματικής δραστικότητας [14] και φυσιολογικό ρόλο του παραμένει να προσδιοριστεί.

στον καρκίνο των ωοθηκών, αλληλικές ανισορροπία αυτών των τριών γονιδίων (

ΗγΑΙ 1

,

HYAL2

και

HYAL3

) έχει αποδειχθεί σε όγκο και το στρώμα των ιστών [15]. Ειδικότερα,

ΗΥΑί-1

έκφραση του mRNA βρέθηκε να μειώνεται σημαντικά το ορώδες EOC σε σύγκριση με φυσιολογικές ωοθήκες [16], ενώ αμετάβλητες ή μια τάση για μειωμένη δραστικότητα ΗΥΑί-1 έχει αναφερθεί σε εκχυλίσματα ιστών EOC [ ,,,0],16], [17]. Σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, εξωκυτταρική συσσώρευση υαλουρονάνης συχνά παρατηρείται σε στρώμα ωοθηκών όγκου και περικυτταρική μήτρα, και συνδέεται με την κακή έκβαση της νόσου [17], [18]. Επιπλέον, αρκετές αναφορές έχουν καταδείξει αλληλεπιδράσεις μεταξύ υαλουρονάνη και μεμβράνη υποδοχείς, όπως CD44, η οποία προωθεί τη σύνδεση του CD44 με ορισμένες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού (π.χ. ανκυρίνης, RhoGTPases, Cdc42) παραγωγή συγκεκριμένων γεγονότων σηματοδότησης προώθηση των ωοθηκών προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και η επιβίωση [ ,,,0],19]

σε αντίθεση, τα επίπεδα τόσο υαλουρονάνη και ΗΥΑί-1 έχουν αναφερθεί ότι αυξάνονται στην κύστη, προστάτη και καρκίνους της κεφαλής και του αυχένα, και ότι εμπλέκεται στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση [20] -. [ ,,,0],22]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αυξημένη εξωκυττάρια υαλουρονάνη βρίσκεται κυρίως στα στρώματος του όγκου, ενώ τα αυξημένα επίπεδα ΗΥΑί-1 ανιχνεύεται σε ιστούς όγκων, προτείνοντας ένα σταυρό-talk μεταξύ αυτών των δύο τύπων ιστών. Τα υψηλά επίπεδα ΗΥΑί-1 έκφραση βρέθηκε επίσης στον καρκίνο του μαστού και γλοιοβλαστώματα, και συσχετίζονται με μεταστατικούς όγκους [22], [23]. Είναι ενδιαφέρον, υποδοχέα οιστρογόνου (ER) αρνητικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού, οι οποίες τείνουν να είναι πιο επιθετικοί, έχουν αυξημένη δραστηριότητα υαλουρονιδάσης σε σύγκριση με ER θετικές κυτταρικές σειρές [24]. Με ένα μηχανισμό ακόμη άγνωστο, ΗΥΑί-1 επάγει τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου και up-ρυθμίζει τα επίπεδα των θετικών ρυθμιστών της G2-M μετάπτωσης (π.χ. cdc25C, κυκλίνη Β1, cdk10) στην κύστη, προστάτη και του στόματος πλακωδών καρκινικές κυτταρικές γραμμές [25] – [27]. ΗΥΑί-1 ενισχύει επίσης την αγγειογένεση, πιθανώς μέσω της παραγωγής θραυσμάτων υαλουρονάνη διακριτών μεγεθών τα οποία διαθέτουν την ικανότητα να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό τριχοειδών [28].

Ως εκ τούτου, τα επίπεδα της έκφρασης υαλουρονιδάση ενδέχεται να διαφέρουν ανάλογα με τον τύπο του όγκου και της επιθετικής συμπεριφοράς του. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήσαμε μια λεπτομερή μελέτη σχετικά με την έκφραση της ΗΥΑί-1 σε δείγματα καρκινικού ιστού των ωοθηκών που εκπροσωπούν τέσσερις διαφορετικές ιστοπαθολογικές υποτύπους και έδειξε αυξημένα επίπεδα του ενζύμου αυτού, με σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOCs, αλλά όχι σε ορώδες ή ενδομητριοειδές. Δείξαμε επίσης ότι τα επίπεδα του

ΗγΑΙ 1

mRNA σε σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOCs ήταν αντιστρόφως ανάλογη με εκείνες της Ετα. Αξίζει να σημειωθεί, δείξαμε ότι η έκτοπη έκφραση του ΕΚα προκάλεσε μια μείωση κατά 50% σε

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA σε μια σαφή γραμμή κυττάρων κύτταρο EOC. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση: i) η οποία αποδεικνύει την αυξημένη έκφραση ΗΥΑί-1 σε συγκεκριμένα μορφολογικά υποτύπους EOC, ii) δείχνει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ

ΗγΑΙ 1

και στεροειδών ορμονών σε δείγματα ιστών, και iii) εμπλέκουν

ΗγΑΙ 1

γονιδίου ως στόχο ΕΡα για γονιδιακή καταστολή. Τέλος, δείξαμε ένα 2.1 έως 2.8 φορές αύξηση στα επίπεδα αυτού του ενζύμου σε ασθενείς με σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOC πλάσματος, αλλά όχι σε εκείνους με ορώδες ή ενδομητριοειδές όγκων, σε σύγκριση με τους ασθενείς με καλοήθεις κύστεις. παρόντα αποτελέσματα μας προσδιορίσει ΗΥΑί-1 ως μια πιθανή βιοδείκτη για την ανίχνευση αυτών των δύο διακριτών EOC υποτύπους.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Δείγματα ιστού όγκου και EDTA- συλλέγονται πλάσμα ελήφθησαν, με ενημερωμένη συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες που υποβάλλονται σε χειρουργικές επεμβάσεις που εκτελούνται στο νοσοκομειακό κέντρο de l’Université de Montréal (CHUM) Hôpital Notre-Dame. Οι πολιτικές για τη συλλογή και τη χρήση των δειγμάτων ιστού και αίματος εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας του CHUM. χρησιμοποιήθηκαν μόνο οι όγκοι από ασθενείς χωρίς προηγούμενη χημειοθεραπεία. Ιστοπαθολογική εξέταση, ο βαθμός και το στάδιο των όγκων είχαν ανατεθεί σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και τα κριτήρια (FIGO) Μαιευτική. Όπως κανονική ωοθήκη έχει μικρή περιεκτικότητα επιθηλιακά, καλοήθεις όγκοι των ωοθηκών ορώδες χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Πληροφορίες σχετικά με τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

τηλέφωνα Γραμμές

Οι πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών κύτταρα (μύτη) προήλθαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],29], από τις ωοθήκες των τριών συμμετεχόντων χωρίς προηγούμενο ιστορικό καρκίνου των ωοθηκών, μετά από profilactic ωοθηκεκτομή στο CHUM Hôpital Notre-Dame και εν επιγνώσει συναίνεση. κυτταρικές γραμμές EOC καθιερώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] – [31], και προήλθαν από ορώδεις επιθηλιακών όγκων των ωοθηκών (TOV81D, TOV2223, TOV1946) ή υγρό ασκίτη (OV1946, OV866), από ένα ενδομητριοειδές όγκου ωοθηκών (TOV112D), ένα σαφής καρκίνωμα (TOV21G), και ένα βλεννώδες επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (TOV2444). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΟΣΕ (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) που περιέχει 2,5 μg /ml αμφοτερικίνη Β και 50 μg /ml γενταμυκίνη (και τα δύο από την Invitrogen, Burlington, ΟΝ, Canada). Τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκε με ορό 15% εμβρυϊκό ορό (FBS, Invitrogen) για τις καλλιέργειες μύτη και 10% FBS για τις κυτταρικές γραμμές ΕΓΚ.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (Q-PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) από δείγματα κατεψυγμένου όγκου ή απ ‘ευθείας από κύτταρα που αναπτύσσονται σε 80% συρροή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. ποιότητα RNA παρακολουθήθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης και με το 2100 Bioanalyzer, χρησιμοποιώντας το RNA 6000 Νανο κιτ LabChip (Agilent Technologies, Waldbronn, Γερμανία). Η σύνθεση του cDNA διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κιτ QuantiTect Αντίστροφη Μεταγραφή (Qiagen Inc., Mississauga, ΟΝ, Canada) χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA. Το ληφθέν διάλυμα cDNA αραιώθηκε δέκα φορές και δείγματα 5 μΐ χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση Q-PCR. Ποσοτικές ενισχύσεις ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την Platinum® SYBR® Πράσινο Q-PCR Supermix UDG (Invitrogen) και το ακόλουθο ζεύγος εκκινητών: 5’-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 ‘και 5′-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3’ για το

ΗγΑΙ 1

, 5′-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 ‘και 5′-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3′ για ΕΚα, 5’-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 ‘και 5′-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3′ για ΕΚβ, 5’-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 ‘και 5′-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC-3 «για τον υποδοχέα προγεστερόνης (PR), 5’-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3 ‘και 5′-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3’ για το

ERK1

. Οι ανωτέρω αλληλουχίες εκκινητών ΕΚα, ΕΡβ και PR λήφθηκαν από μια προηγούμενη δημοσίευση [33].

ERK1

επιλέχθηκε ως γονίδιο ελέγχου που βασίζεται σε σταθερή έκφραση του σε δείγματα των ωοθηκών, που αποτελείται από την κανονική και διαφορετικών υποτύπων EOC [34], [35], και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Φθορισμού συνελήφθη χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο iCycler iQ (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Πολλαπλασιασμοί διεξήχθηκαν στους 50 ° C για 2 λεπτά (UDG επώασης), 95 ° C για 3 λεπτά (αποδιάταξη), και 50 κύκλοι των 95 ° C /30 sec, 58 ° C /30 sec και 72 ° C /45 sec , που ακολουθείται από μια καμπύλη τήξης 70 κύκλοι των 0.5 ° C αύξηση /κύκλο ξεκινώντας στους 60 ° C. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες εισήχθησαν σε όλα τα πειράματα, και η καθαρότητα και η εξειδίκευση των προϊόντων PCR σποραδικά παρακολουθήθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές για κάθε δείγμα cDNA σε ξεχωριστά πειράματα. Σχετική αξία έκφραση λήφθηκε από το 1/2 μέθοδο

ΔΟΙ χρησιμοποιώντας το

ERK1

ως το γονίδιο ελέγχου. Σε αυτή τη μέθοδο, η διαφορά στο C

T (ΔΟ

Τ) μεταξύ του στόχου και των γονιδίων ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση του γονιδίου με τον τύπο 2

ΔCt. Μια κανονικοποιημένη τιμή της έκφρασης για το γονίδιο-στόχο σε σχέση με το γονίδιο ελέγχου στη συνέχεια λαμβάνεται με τον υπολογισμό ενός δεύτερου

ΔCt. Όλες οι τιμές mRNA έκφραση ήταν αναλογίες σε σχέση με τον έλεγχο

ERK1

γονίδιο.

Για την παρακολούθηση της βιολογικής απόκρισης του ΕΚα έκτοπη έκφραση σε κύτταρα TOV21G (βλέπε παρακάτω), Q-PCR πραγματοποιήθηκε για τη μέτρηση mRNA τα επίπεδα των γνωστών στόχων Ετα, π.χ.

GREB1

(ρύθμιση της ανάπτυξης από τα οιστρογόνα στον καρκίνο του μαστού 1) και

TFF1

(τρίφυλλο παράγοντα 1, γνωστή επίσης και ως γονίδιο PS2) [36], [37]. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών: 5′-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 ‘και 5′-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3’ για το

GREB1

, και 5′-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 ‘και 5’- CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 ‘για το

ΤΡΡ1

.

GEO Ανάλυση συνόλου δεδομένων

προφίλ γονιδιακής έκφρασης αρκετών δειγμάτων ιστού από τα τέσσερα μορφολογικά διακριτές καρκίνους των ωοθηκών και του φυσιολογικές ωοθήκες έχει εκτελεστεί χρησιμοποιώντας η συστοιχία Affymetrix HG_U133A [35] και έγινε προσβάσιμη μέσω του National Center for Biotechnology Information (NCBI) (GEO σύνολο δεδομένων GSE6008). Στην παρούσα μελέτη, φορτώθηκε το ακατέργαστο πίνακα για κάθε δείγμα όγκου και επέλεξε τις κανονικοποιημένες τιμές [quantile-κανονικοποιημένη στολισμένα-μέση, log-μετασχηματιστεί με log (max (x + 50,0) 50] για την υβριδοποίηση των ανιχνευτών ενδιαφέροντος. στην περίπτωση της

ΗγΑΙ 1

και PR, η συστοιχία Affymetrix HG_U133A περιείχε μόνο ένας ανιχνευτής για καθένα από αυτά τα γονίδια (210619_s_at και 208305_at, αντίστοιχα). ως εκ τούτου, οι τιμές αυτές χρησιμοποιήθηκαν ως τέτοια στην ανάλυσή μας για . αξιολογεί την έκφραση αυτών των γονιδίων σε μεμονωμένα δείγματα ιστού Ωστόσο, για ΕΚα και ΕΚβ αρκετές ανιχνευτές ήταν διαθέσιμα (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at για Ετα? και 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at για ΕΚβ), και ο μέσος όρος των κανονικοποιημένων τιμών για τους ανιχνευτές του κάθε γονιδίου χρησιμοποιήθηκε στην εργασία μας για να αναλυθεί η έκφραση αυτών των γονιδίων σε μεμονωμένα δείγματα ιστών. Πληροφορίες σχετικά με ιστολογία, βαθμός και το στάδιο αυτών των δειγμάτων ελήφθη από το διαθέσιμο συμπληρωματικό υλικό [35] και συνοψίζεται στον πίνακα 1.

υαλουρονάνη ζυμογραφία

Για την παρακολούθηση της δραστηριότητας υαλουρονιδάσης του κυττάρου προϊόντα λύσης από κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, υαλουρονάνη ζυμογραφία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38] . Κύτταρα που συλλέχθηκαν από 80% συρρέουσες καλλιέργειες επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM ιμιδαζόλιο, 0.25 Μ σακχαρόζη), σε υπερήχους συνοπτικά και σε πρωτεΐνες τους καθορίζονται από το αντιδραστήριο πρωτεΐνης BioRad. Δείγματα (που περιέχει 30 μα πρωτεΐνης) διαχωρίστηκαν με αυτοφυή PAGE (20 mA, 4 ° C) σε ένα πήγμα 8% που περιέχει 0,25 mg /ml ανθρώπινου ομφάλιου λώρου υαλουρονικού οξέος (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada). Η γέλη στη συνέχεια εν συντομία εξισορροπημένη στο ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας ειδικό για ανίχνευση υαλουρονιδάση-1 (100 mM μυρμηκικού νατρίου, 150 mM NaCl, ρΗ 3,7) και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στους 37 ° C. Μετά την επώαση, πηκτώματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,01 mg /ml προνάση (Sigma-Aldrich) σε ένα ρυθμιστικό 20 mM Tris (ρΗ 8,0) επί 4 ώρες, ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό, και χρωματίστηκαν διαδοχικά με 0.5% μπλε της Αλσατίας και 0.1% Coomassie blue R , και τα δύο σε 30% methanol:10% οξικό οξύ. Πηκτώματα de-βάφονται μέχρι την εκκαθάριση λωρίδες πέψη υαλουρονικό ήταν εμφανής. ζυμογραφία Gel επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα κυττάρου από διαφορετικούς πολιτισμούς.

ΗΥΑί-1 ενζυματική δραστικότητα δειγμάτων πλάσματος

Ποσοτικοποίηση

του ΗΥΑί-1 δραστικότητα σε δείγμα πλάσματος προσδιορίστηκε με μία χρωματομετρική μέθοδος για την εκτίμηση της

N

ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης (NADG) που απελευθερώνεται μετά πέψη υαλουρονάνη [39], [40]. Εν συντομία, κλάσματα EDTA επεξεργασμένου πλάσματος (περίπου 4 μΙ, περιείχε 30 μg πρωτεϊνών, όπως προσδιορίζεται από το αντιδραστήριο πρωτεΐνης BioRad) επωάστηκαν με 40 μg υαλουρονάνης από ανθρώπινο ομφάλιο λώρο (Sigma-Aldrich) σε 200 μl τελικό όγκο ρυθμιστικού αντίδρασης (79 mM μυρμηκικού νατρίου, 150 mM NaCl, 0.2 mg /ml BSA, ρΗ 3,9) στους 37 ° C για 24 ώρες. Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 40 μΙ τετραβορικού ρΗ 1,2 Μ κάλιο 9,1 και βράζεται για 3 λεπτά. σχηματισμός χρώματος αποκαλύπτεται με την προσθήκη 1,2 ml

αντιδραστήριο σ

-dimethylaminobenzaldehyde (που παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39], [40]) και επώαση στους 37 ° C για 20 λεπτά στο όξινο περιβάλλον αυτού του αντιδραστηρίου . Τα δείγματα αμέσως διαβάστε στα 585 nm. δραστηριότητα Υαλουρονιδάσης εκτιμήθηκε από έναν NADG (Sigma-Aldrich) πρότυπη καμπύλη (1 έως 10 nmols), και εκφράστηκε ως πρωτεΐνη nmol /μg. περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη πλάσματος προσδιορίστηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης BioRad. Κενά ελήφθησαν, παραλείποντας τα δείγματα πλάσματος. Κάθε δείγμα πλάσματος μετρήθηκε τουλάχιστον τρεις φορές σε χωριστά πειράματα.

διαμόλυνση κυττάρων TOV21G

pCDNA πλασμίδιο (Invitrogen) που περιέχει την αλληλουχία του υποδοχέα άλφα ανθρώπινου οιστρογόνου (που ονομάζεται pERα) έχει περιγραφεί [41] , [42]. κύτταρα TOV21G καλλιεργήθηκαν σε πλήρες OSE (Wisent) μέσο όπως περιγράφεται ανωτέρω μέχρις ότου τα κύτταρα ήταν περίπου 60% συρρέοντα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 1 μg pERα σε μέσο DMEM-F12 (Wisent) χωρίς συμπληρώματα με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης GeneJuice (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από ολονύκτια επιμόλυνση, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο ΟΣΕ, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για ένα επιπλέον 24 ώρες για την έκφραση της πρωτεΐνης. Στο τέλος του πειράματος, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με κατεργασία τρυψίνης-ΕϋΤΑ (0,25% θρυψίνη με 1 mM EDTA? Invitrogen), πλύθηκαν σε PBS και χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση RNA και Q-PCR ή για την εξαγωγή πρωτεΐνης και ανοσοκηλίδωση. Πειράματα επιμόλυνσης επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα λύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, ρΗ 7,4) (TBS) που περιέχει 0.1% Triton Χ-100, 1 mM ορθοβαναδικό, 1 mM NaF, 0.1 mM PMSF και 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Complete-mini, Roche Diagnostics Καναδάς, Laval, QC, Canada). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με το αντιδραστήριο πρωτεΐνης BioRad χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη BSA. Δείγματα (λύματα περίπου 30 μα πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε 12% SDS-PAGE, κάτω από αναγωγικές συνθήκες, και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μη-ειδική δέσμευση στην μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% αφυδατωμένο αποβουτυρωμένο γάλα σε TBS. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (4 ° C, όλη τη νύκτα), πλύθηκαν σε TBS που περιέχει 0.1% Tween, και επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα IgG που χρησιμοποιούνται στο έργο μας ήταν αντι-ΕΡα (H-184, 1:1000, αντίσωμα κουνελιού? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και αντι-ακτίνης (pan Ab-5, 1:1500, αντίσωμα ποντικού? εργαστήριο Vision Corp., Fremont, CA). Αυτά τα αντισώματα δοκιμάστηκαν σε συνθήκες μας ότι είναι ειδικά για πρωτεΐνες-στόχους τους. Υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (1:1000, κατσίκα αντίσωμα? Sigma) και αντι-κουνελιού IgG (1:3000, αντίσωμα κατσίκας? Bio-Rad) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Πρωτεΐνη-αντισώματος αναγνώριση ανιχνεύθηκε με Western Lightning χημειοφωταύγεια αντιδραστηρίου Plus (PerkinElmer, Boston, ΜΑ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

Επειδή τα επίπεδα της ΗΥΑί-1 και υποδοχείς ορμονών δεν ήταν πάντοτε κανονικά κατανεμημένα, χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές δοκιμές για την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα ιστών και ενζυματική δραστικότητα σε δείγματα πλάσματος. Πραγματοποιήσαμε πρώτα μια μη παραμετρική ανάλυση Kruskal-Wallis της διασποράς και όταν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές, πραγματοποιήσαμε Mann Whitney τεστ που συγκρίνουν την ομάδα του φυσιολογικού (για microarray) ή καλοήθη (για Q-PCR και δραστηριότητα) δείγματα με κάθε ένα από τους υποτύπους του όγκου χωριστά . Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε σε

P

& lt? 0,05. συντελεστές συσχέτισης Spearman rank είχαν υπολογιστεί και θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

P

& lt? 0,05. Οι διαφορές στη γονιδιακή έκφραση των επιμολυσμένων και μη επιμολυσμένα κύτταρα TOV21G αναλύθηκαν από τον μαθητή του

t-test

(two-tailed, ίσα-διακύμανσης) και θεωρήθηκαν σημαντικές όταν

P

& lt? 0,05 . Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με τη χρήση Prism4 για Windows, έκδοση 4 (GraphPad Software, Inc.).

Αποτελέσματα

Υαλουρονιδάση-1 έκφραση είναι αυξημένη σε σαφή κυττάρων και βλεννώδες αλλά όχι σε ορώδες και ενδομητριοειδές EOC

στο παρελθόν, η έκφραση του Υαλουρονιδάσης-1 σε καρκίνο των ωοθηκών έχει περιγραφεί ειδικά στο ορώδες όγκους [16], [17], πιθανότατα επειδή αυτή είναι η πιο συχνή υπότυπο EOC [4]. Στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε την έκφραση του mRNA του ενζύμου αυτού με Q-PCR σε δείγματα ιστού με καρκίνο των ωοθηκών που λαμβάνονται από ασθενείς με διαφορετικές μορφολογικές υποτύπους της νόσου αυτής, π.χ. ορώδες (11 δείγματα), ενδομητριοειδές (9 δείγματα), σαφείς κυττάρων (11 δείγματα) και βλεννώδες (8 δείγματα). Τα επίπεδα έκφρασης στη συνέχεια συγκρίθηκαν με εκείνα της 15ης καλοηθών όγκων των ωοθηκών. Οι καλοήθεις όγκοι επιλέχτηκαν για σύγκριση λόγω άφθονη περιεκτικότητά τους σε επιφανειακό επιθήλιο το οποίο είναι πολύ λίγοι σε φυσιολογικές ωοθήκες. Επιπλέον, θέλαμε να αποφευχθεί πιθανή παρεμβολή του ΗΥΑί-1 έκφραση σε άλλους τύπους κυττάρων των ωοθηκών. Για παράδειγμα, έχουμε δείξει ότι το ένζυμο αυτό εκφράζεται σε κύτταρα ποντικού ωοθηκών κοκκιώδη [38]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, τα επίπεδα του

ΗγΑΙ 1

mRNA σημαντικά αυξημένα σε σαφή κυττάρων και βλεννώδες καρκίνωμα (δοκιμή Mann Whitney,

P

& lt? 0,05). Αλλά όχι σε ορώδες και ενδομητριοειδές όγκους

Α) Q-PCR για

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA σε καλοήθη όγκο (λευκή γραμμή), και ορώδες (διακεκομμένη γραμμή), ενδομητριοειδές (διαγραμμισμένη ράβδος), σαφείς κυττάρων (σκιασμένη γραμμή) και βλεννώδες (μαύρη γραμμή) δείγματα ΕΓΚ ιστών από ασθενείς. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM της σχετικής

ΗγΑΙ 1

έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με τον έλεγχο της γονιδιακής

ERK1

από διαφορετικούς ασθενείς σε κάθε ομάδα. Η τιμή για κάθε επιμέρους δείγμα cDNA είναι ο μέσος όρος των 3-4 ξεχωριστές μετρήσεις Q-PCR. * Υποδηλώνει

P

& lt? 0,05 σε δοκιμασία Mann Whitney. Β) κανονικοποιημένες τιμές

ΗγΑΙ 1

ανιχνευτή υβριδισμού της συστοιχίας Affymetrix HG_U133A (GEO σύνολο δεδομένων GSE6008) σε δείγματα RNA από φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών (λευκή ράβδος), και ορώδους (διακεκομμένη γραμμή), ενδομητριοειδές (διαγραμμισμένη ράβδος), σαφές κυττάρων (σκιασμένη γραμμή) και βλεννώδες (μαύρη γραμμή) EOCs. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM των πρώτων τιμών του ομαλοποιήθηκαν

ΗγΑΙ 1

υβριδισμού. * Υποδηλώνει

P

& lt? 0,05 σε δοκιμασία Mann Whitney. C) Q-PCR για

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φυσιολογικό επιθήλιο των ωοθηκών (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D? Λευκές ράβδοι) και από ορώδη (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866? Διακεκομμένη bars ), ενδομητριοειδές (TOV112D? εκκολαφθεί bar), σαφείς κυττάρων (TOV21G? σκιασμένη γραμμή) και βλεννώδες (TOV2444? μαύρη γραμμή) EOCs. Μπάρες αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο της σχετικής

ΗγΑΙ 1

έκφρασης κανονικοποιούνται για τον έλεγχο της γονιδιακής

ERK1

για κάθε κυτταρική σειρά. Μετρήσεις Q-PCR επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές για κάθε κυτταρική σειρά cDNA. Οι γραμμές κυττάρων που προέρχονται από διαφορετικούς υποτύπους ΕΓΚ εκπροσωπούνται σε χωριστές γραμμές ως εκ τούτου, δεν υπάρχουν μπάρες σφάλματος εκπροσωπούνται. Κάθετη βέλη δείχνουν σαφή βλεννώδες κυτταρικές σειρές που έχουν υψηλή

ΗγΑΙ 1

έκφρασης του mRNA των κυττάρων και. Δ) Η υαλουρονάνη ζυμόγραμμα κυτταρικών προϊόντων λύσης από την προαναφερθείσα ορώδης, ενδομητριοειδές, σαφείς κυττάρων και βλεννώδες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Το οριζόντιο βέλος σηματοδοτεί τη σαφή ζώνη πέψη υαλουρονάνη. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ζυμοδιάγραμμα.

Η

Επειδή το μέγεθος του δείγματος ομάδα μας θα μπορούσε να θεωρηθεί μικρό, αποφασίσαμε να επικυρώσει τα αποτελέσματά μας με την ανάλυση

ΗγΑΙ 1

έκφρασης mRNA σε ένα διαθέσιμες στο κοινό σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών [35] (GEO σύνολο δεδομένων GSE6008) που περιέχει 41 ορώδες, 37 ενδομητριοειδές, 8 σαφείς κυττάρων και 13 βλεννώδες δείγματα EOC, και 4 φυσιολογικά δείγματα ωοθηκικού ιστού. Η Εικόνα 1Β δείχνει τις κανονικοποιημένες τιμές [ποσοστημόριο-κανονικοποιημένη κομμένα-μέσης, log-μετασχηματιστεί με log (max (x + 50,0) 50] για τον υβριδισμό του κάθε δείγματος με το

ΗγΑΙ 1

ανιχνευτή (210619_s_at) της συστοιχίας Affymetrix HG_U133A. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα Q-PCR μας, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά για το

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA μεταξύ των φυσιολογικών ωοθηκών ιστούς και ότι ορώδους ή ενδομητριοειδές δείγματα όγκου (Σχήμα 1Β). Clear καρκινώματα είχαν μια τάση να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα

ΗγΑΙ 1

mRNA από το φυσιολογικό ιστό των ωοθηκών, αλλά χωρίς στατιστική σημαντικότητα επιτεύχθηκε. σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, βλεννώδες δείγματα είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα

ΗγΑΙ 1

από το φυσιολογικό ιστό (δοκιμή Mann Whitney,

P

& lt? 0,05). (Εικόνα 1Β)

ωοθηκών κυτταρικές γραμμές καρκίνου που προέρχεται από τα δείγματα όγκων αυτών των διαφορετικών μορφολογικών υποτύπων έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί και έδειξε συμπεριφορά παρόμοια με την δείγμα όγκου από το οποίο προέρχονται [29] – [31] παρέχουν ισχυρά εργαλεία για τη διερεύνηση των μοριακών γεγονότων που σχετίζονται με κάθε μορφολογικά διακριτή καρκίνο των ωοθηκών.. Ως εκ τούτου, το επόμενο βήμα μας ήταν να αναλύσουμε το επίπεδο της έκφρασης του

ΗγΑΙ 1

mRNA και πρωτεΐνης σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων του φυσιολογικού επιφανειακού επιθηλίου των ωοθηκών (μύτη) [29] χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Το Σχήμα 1C δείχνει ότι, όπως αναμενόταν, η έκφραση του mRNA της

ΗγΑΙ 1

ήταν ιδιαίτερα υψηλές σε κυτταρικές σειρές TOV21G (που προέρχεται από μια σαφή καρκίνωμα) και TOV2444 (που προέρχεται από ένα βλεννώδες EOC). Ένα ενδιάμεσο επίπεδο του

ΗγΑΙ 1

έκφραση mRNA παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά TOV112D, η οποία προέρχεται από ένα ενδομητριοειδές όγκου ωοθηκών. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών στην αρχική τοποθεσία (TOV81D, TOV2223, TOV1946) ή από το υγρό ασκίτη (OV1946, OV866) έδειξαν χαμηλά επίπεδα του

ΗγΑΙ 1

έκφρασης, συγκρίσιμα με εκείνα των κυτταρικών σειρών μύτη. Για να αποδειχθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, το οποίο μετράται ποσοτικά με σειρά μας εκκινητών, αντανακλούσε την ποσότητα ΗΥΑί-1 πρωτεΐνης σε αυτά τα δείγματα, μετρήσαμε ΗΥΑί-1 ενζυματική δραστικότητα με μια ζυμόγραμμα υπόστρωμα γέλης. Αυτή είναι μία συμβατική μέθοδος για τη μέτρηση της δραστηριότητας υαλουρονιδάσης και είναι ειδικό για Υαλουρονιδάση-1 όταν δοκιμάζεται σε όξινο ρΗ [38]. Το Σχήμα 1Δ δείχνει μια σαφή ζώνη χωνευμένο υπόστρωμα (υαλουρονάνη) μόνο στα προϊόντα λύσης κυττάρων των κυτταρικών γραμμών TOV21G και TOV2444. Η ενζυματική δραστηριότητα ΗΥΑί-1 στα ορώδες και ενδομητριοειδές δείγματα ήταν κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης της δοκιμασίας μας.

Επειδή τα αυξημένα επίπεδα ΗΥΑί-1 έχουν προηγουμένως συσχετιστεί με υψηλότερο βαθμό όγκους της ουροδόχου κύστης και του προστάτη [21], [22 ], αποφασίσαμε να ελέγξει αν τα επίπεδα του

ΗγΑΙ 1

mRNA σε σαφή κυττάρων και βλεννώδεις όγκοι των ωοθηκών θα συσχετίζονται με το βαθμό της νόσου ή το στάδιο (βλέπε πίνακα 1 για στοιχεία των ασθενών). Ωστόσο, Spearman συσχέτιση αναλύσεις δεν έδειξαν σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της ΗγΑΙ 1

mRNA

και κάθε βαθμό ή στάδιο σαφή κυττάρων (r = 0,262 και -0,322 για το βαθμό και το στάδιο αντίστοιχα στο σύνολο των δεδομένων μας, και r = 0,055 για το στάδιο των δεδομένων μικροσυστοιχιών, όλα τα

P

& gt? 0,05) ή δείγματα βλεννώδες όγκου (r = -0,655 και -0,577 για το βαθμό και το στάδιο αντίστοιχα στο σύνολο των δεδομένων μας, και r = -0.094 και – 0,378 για το βαθμό και το στάδιο των δεδομένων μικροσυστοιχιών, όλα τα

P

& gt? 0,05). Σφαιρική ανάλυση συμπεριλαμβανομένων όλων των υποτύπων δεν δείχνουν σημαντική θετική συσχέτιση είτε (r = -0,234 και -0,251 για το βαθμό και το στάδιο αντίστοιχα στο σύνολο των δεδομένων μας, και r = 0,185 και 0,042 για το βαθμό και το στάδιο των δεδομένων μικροσυστοιχιών, όλα τα

P

& gt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΗΥΑί-1 έκφραση μπορεί να είναι ένα εγγενές χαρακτηριστικό φαινοτυπικό σαφών κυττάρου και βλεννώδες EOCs και ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης διαγνωστικά /ανίχνευσης για αυτές ωοθηκών υποτύπους καρκίνου.

δραστικότητα Υαλουρονιδάση-1 μπορεί να ανιχνευθεί στο ρυθμισμένο μέσο καλλιέργειας κυτταρικής σειράς TOV21G και είναι μια πιθανή βιοδείκτης ορού /πλάσματος για σαφή κυττάρων και βλεννώδες EOC

έχει δειχθεί ότι ΗΥΑί-1 είναι παρούσα στο μέσο καλλιέργειας των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη και της ουροδόχου κύστης καθώς και στα ούρα των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [21], [26], [27]. Στην παρούσα εργασία, θελήσαμε να εξακριβώσει αν ΗΥΑί-1 επίσης εκκρίνονται από κυτταρικές σειρές EOC και αν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης ορού /πλάσματος για τους δύο υποτύπους μορφολογικές στην οποία είναι αυξημένα επίπεδα έκφρασης του, π.χ. σαφείς κυττάρων και βλεννώδες ΕΓΚ. Το Σχήμα 2Α δείχνει την παρουσία της δραστικότητας ΗΥΑί-1 (σαφής ζώνη πέψη υαλουρονάνης) στο συμπυκνωμένο άνευ ορού ρυθμισμένο μέσο της κυτταρικής καλλιέργειας TOV21G καθώς και στο προϊόν λύσης κυττάρου του. Αντιθέτως, δεν ενζυματική δραστικότητα μπορεί να ανιχνευθεί σε συμπυκνωμένο ρυθμισμένο μέσο και κυτταρολύματος από το TOV1946 κυτταρική σειρά (προερχόμενη από ένα ορώδους EOC). Αφού διαπιστώθηκε ότι ΗΥΑί-1 εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που εκφράζουν αυτό το ένζυμο, ερευνήσαμε εάν αυτή η ενζυμική δραστηριότητα θα μπορούσε να ανιχνευθεί διαφορικά στο πλάσμα των ασθενών με διακριτές μορφολογικές υποτύπους EOC.