Αφηρημένο

Η κυτταρική σειρά FET, που προέρχεται από ένα καρκίνωμα πρώιμο στάδιο του παχέος εντέρου, είναι μη ογκογόνων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Μηχανικής FET κύτταρα που εκφράζουν τον ΤΟΡ-α (FETα) οθόνη ουσιαστικά δραστική EGFR /ErbB σηματοδότησης. Αυτά τα κύτταρα που σχηματίζονται ευκόλως ξενομοσχεύματος όγκων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Σημαντικά, τα κύτταρα FETα διατήρησε την ανταπόκρισή τους στον ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη αναστολή της ανάπτυξης, και, όπως και τα γονικά κύτταρα FET, η έκφραση ενός υποδοχέα κυρίαρχο αρνητικό τύπου ΤΟΡ-β II (DNRII) σε κύτταρα FETα (FETα /DNRII) καταργείται αποκρισιμότητα σε ΤΟΡ -β-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και της απόπτωσης υπό συνθήκες στρες

in vitro

και αυξημένη μεταστατική πιθανότητα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο

in vivo

, που υποδεικνύει δραστικότητα καταστολέα μετάστασης του ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε αυτό το μοντέλο. αγγειογένεσης του καρκίνου θεωρείται ευρέως ως ένα βασικό χαρακτηριστικό για το σχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ο TGF-β σηματοδότηση αναστέλλει την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα Α (VEGFA) και ότι η απώλεια του αυτοκρινούς ΤΟΡ-β σε κύτταρα /DNRII FETα οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του VEGFA. Ρύθμιση έκφρασης VEGFA με ΤΟΡ-β δεν είναι σε μεταγραφικό επίπεδο, αλλά στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΤΟΡ-β μειώνει την σταθερότητα της πρωτεΐνης VEGFA μέσω ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση σε ένα PKA- και Smad3-εξαρτώμενη και Smad2-ανεξάρτητο μονοπάτι. Ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύσεις του ορθοτοπική όγκων έδειξαν σημαντικά μειωμένη σηματοδότηση TGF-beta, αυξημένη CD31 και χρώση VEGFA σε όγκους των κυττάρων FETα /DNRII σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων ελέγχου φορέα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του ΤΟΡ-β σηματοδότηση αυξάνει την έκφραση και την αγγειογένεση VEGFA, οι οποίες θα μπορούσαν ενδεχομένως να συμβάλλουν στη βελτίωση μετάσταση αυτών των κυττάρων

in vivo

. Μελέτες IHC πραγματοποιήθηκε σε δείγματα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλον έδειξε ότι η ΤΟΡ-β σηματοδότηση συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφραση VEGFA, υποδεικνύοντας ότι υπάρχει TGF-beta-μεσολαβούμενη καταστολή της έκφρασης VEGFA σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Geng L, Chaudhuri Α, Ταλμών G, Wisecarver JL, Wang J (2013) TGF-βήτα Καταστέλλει VEGFA αγγειογένεσης σε Colon Cancer μετάσταση. PLoS ONE 8 (3): e59918. doi: 10.1371 /journal.pone.0059918

Επιμέλεια: Lu-Zhe Sun, Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστημών Υγείας Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14η, Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 20 του Φλεβάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρ 2013

Copyright: © 2013 Geng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί P20RR018759 και R01CA140988-01 (https://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8215881 icde=14708223 ddparam= ddvalue= ddsub= cr=1 csb=default cs=ASC) να JW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β) περιλαμβάνει μια ομάδα πολυλειτουργικά πολυπεπτίδια τα οποία ρυθμίζουν διαφορετικές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση, tumorigenecity και μετάσταση, μέσω της σύνδεσης με τους υποδοχείς ΤΟΡ-β. Πολλές μελέτες δείχνουν ότι ΤΟΡ-β δρα είτε ως υποκινητή όγκου ή ένα ογκοκατασταλτικό σηματοδότησης. Η λειτουργία υποκινητή όγκου του ΤΟΡ-β έχει συνδεθεί με την ικανότητά του να επάγει επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο προσδίδει αντοχή στα αποπτωτικά αποτελέσματα του ΤΟΡ-β [1] – [3]. Ωστόσο, και άλλοι έχουν αποδείξει πειραματικά ότι ΤΟΡ-βήτα μεσολαβεί δραστικότητα καταστολέα όγκου σε μια ποικιλία καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, και ότι η απώλεια του ΤΟΡ-β σηματοδότηση οδηγεί σε απόκτηση και την πρόοδο της κακοήθειας [4] – [11]. πρόσφατες μελέτες μας δείχνουν ότι ο TGF-β σηματοδότηση καταστέλλει την μετάσταση σε ένα υποσύνολο καρκινικών κυττάρων κόλου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο

in vivo

[12]. Ως εκ τούτου, τον προσδιορισμό του μηχανισμού (ες) με την οποία TGF-β προκαλεί μετάσταση κατασταλτική λειτουργία του είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση της εξέλιξης του όγκου και για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών.

Η αγγειογένεση είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της εξέλιξης του όγκου. Συμπαγείς όγκοι δεν μπορούν να αναπτυχθούν πέρα ​​από ένα ορισμένο μέγεθος χωρίς επαρκή προμήθεια αγγειακή να παρέχει αρκετό οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά. Η οδός VEGF /VEGFR είναι ένας κύριος μεσολαβητής της αγγειογένεσης [13] και VEGFA δρα ως ισχυρός όγκου αγγειογόνο παράγοντα [14]. VEGFA διεγείρει την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων, τα οποία παρέχουν όγκων με χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά [14], [15]. Έκφραση VEGFA έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται στο μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο [16] – [19]. Ρύθμιση της έκφρασης VEGFA από τον TGF-β σηματοδότηση δεν έχει μελετηθεί πολύ καλά. Έχει αναφερθεί ότι ο ΤΟΡ-β επάγει την έκκριση του VEGF σε ανθρώπινα κύτταρα κυτταροτροφοβλαστικά [20]. Αντίθετα, μια άλλη ομάδα έδειξε ότι ο TGF-β αντιπαράλληλα ολιγονουκλεοτίδια αυξάνει την έκφραση VEGFA σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και ινοβλάστες του δέρματος

in vitro

[21]. Ως εκ τούτου, ΤΟΡ-βήτα μπορεί διαφορικά ρυθμίζει VEGFA έκφραση εξαρτάται από κυτταρικό περιβάλλον.

Η κυτταρική σειρά καρκινώματος κόλου FET, το οποίο απομονώθηκε από ένα καλά διαφοροποιημένο καρκίνο πρώιμο στάδιο, διατηρεί αυτοκρινούς δραστικότητα ΤΟΡ-βήτα. Αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν ένα μικρό οζίδιο όγκου στην θέση του εμβολιασμού σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς που δεν προοδευτικά αυξάνεται και στη συνέχεια να υποχωρήσει πάνω από 3-5 εβδομάδες [5], [22]. Η ανικανότητα αυτών των κυττάρων που προέρχονται καρκινώματος κόλου να παράγει προοδευτική ανάπτυξη του όγκου

in vivo

υποδηλώνει ότι, σε σχέση με τις πιο προοδευμένη μοντέλο κυτταρικές σειρές, FET κύτταρα διατηρούν πολλές φυσιολογικούς ελέγχους της ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένης της ανασταλτική απόκριση σε ΤΟΡ-βήτα. Ως εκ τούτου, FET κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν ΤΟΡ-α (FETα), το οποίο ενεργοποιεί ιδιοσυστατικά EGFR /ErbB σηματοδότηση. Αυτά τα κύτταρα (FETα) σχηματίζεται εύκολα ξενομοσχεύματος όγκων σε γυμνούς ποντικούς [22]. Ωστόσο, τα κύτταρα που διατηρούνται FETα απόκρισή τους σε ΤΟΡ-βήτα-διαμεσολαβούμενη αναστολή αύξησης και σπάνια κάνει μετάσταση

in vivo

. Η έκφραση ενός υποδοχέα κυρίαρχο αρνητικό τύπου ΤΟΡ-β II (DNRII) σε κύτταρα FETα, που ορίζεται FETα /DNRII, κατήργησε αποκρισιμότητα σε ΤΟΡ-βήτα-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και της απόπτωσης υπό συνθήκες στρες

in vitro

και σημαντικά αυξημένη μεταστατική δυναμικό σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο

in vivo

[12]. Έτσι, φαίνεται ότι η απώλεια του ΤΟΡ-β απόκριση καταστολής όγκου είναι ανεκτικό για την ανάπτυξη της μετάστασης από κύτταρα FETα, το οποίο παρέχει αποδείξεις προς υποστήριξη της λειτουργίας μετάστασης καταστολέα του ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε αυτό το μοντέλο των κυττάρων. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιεί την FETα /φορέα και FETα /DNRII πρότυπο σύστημα τηλέφωνο για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι ο TGF-β σηματοδότηση μεσολαβεί αγγειογένεση μέσω της ρύθμισης της έκφρασης VEGFA, τα οποία θα μπορούσαν να συμβάλουν στη λειτουργία μετάσταση καταστολέα του TGF-β. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι, σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, ΤΟΡ-β αναστέλλει την έκφραση VEGFA στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, πιθανώς μειώνοντας την σταθερότητα της πρωτεΐνης VEGFA μέσω ουβικιτινίωση και υποβάθμιση. Ο παρών κανονισμός είναι Smad3-εξαρτώμενη και Smad2-ανεξάρτητη. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι ο TGF-β-μεσολάβηση κάτω ρύθμιση της έκφρασης VEGFA είναι μέσω μιας μεσολαβεί η ΡΚΑ οδό. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η απώλεια του αυτοκρινούς ΤΟΡ-β σε FETα /DNRII κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση του VEGFA σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου και τα δύο

in vitro

και

στο viv

o, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια πτυχή της αυτοκρινούς ΤΟΡ-β δραστικότητα στο πλαίσιο μετάσταση καταστολέα του καταστέλλει την αγγειογένεση. Τέλος, IHC μελέτες των τμημάτων του ανθρώπινου κολονικού αδενοκαρκινώματος αποκαλύπτουν ότι ΤΟΡ-β σηματοδότηση συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφραση VEGFA, υποδεικνύοντας ότι η σύνδεση μεταξύ της απώλειας του ΤΟΡ-β δραστικότητα και αυξημένη έκφραση VEGFA υπάρχει επίσης σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα πειράματα με ζώα έχουν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο φροντίδας Θεσμικών Ζωικά και Χρήση Επιτροπής (IACUC #: 07-043-08-FC).

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Τα κύτταρα FETα /DNRII ελήφθησαν με επιμόλυνση μιας δεσπόζουσας υποδοχέα αρνητικού τύπου ΤΟΡ-β σε κύτταρα II FETα, ενώ τα κύτταρα ελέγχου FETα /φορέα δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση ενός πλασμιδίου ελέγχου. FETα /φορέα, FETα /DNRII, HCT116, RKO, C, CBS, GEO και γονικών κυττάρων καρκινώματος FET κόλον [9] καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 σε McCoy 5Α ελεύθερο ορού μέσο (Sigma) συμπληρωμένο με 5 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, 20 μg /ml ινσουλίνη, και 4 μg /ml τρανσφερίνη, όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΤΟΡ-βήτα 1 αγοράστηκε από την R & amp? D Systems. Κυκλοεξιμίδιο MG132 και PYR41 αγοράστηκαν από Amresco, Sigma και CALBIOCHEM αντίστοιχα.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl , 0,5% ΝΡ-40, 50 mM NaF, 1 mM NaVO

3, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 25 μg /ml απροτινίνη, 25 μg /ml αναστολέα θρυψίνης και 25 μg /ml λευπεπτίνη) στους 4 ° C και χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις Western blot όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], [25]. Εν συντομία, η συνολική πρωτεΐνη από προϊόντα λύσης κυττάρου (30 έως 60 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences). Αντισώματα για κηλίδες Western αναλύσεις VEGFA, Smad2 /3, pSmad2 /3, ΡΚΑ και ακτίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology Inc, Abcam, Chemicon, Cell Signaling Technology και Sigma, αντίστοιχα.

Απομόνωση RNA και ΚΤ- PCR

Ολικό κυτταρικό RNA από FET κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ολικό αντιδραστήριο απομόνωσης RNA ΤπζοΙ (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για RT-PCR, 2 μg του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega,) με τη χρήση ενός τυχαίου εκκινητή. Δύο μικρολίτρα του προϊόντος cDNA χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει ανθρώπινο VEGFA. Αλληλουχίες εκκινητή για VEGFA ήταν 5′-CGGATCAAACCTCACCAAGGCC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGC-3’ (αντίστροφο). Συνθήκες για την ενίσχυση ήταν: ένας κύκλος στους 94 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενα από 30 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Το γονίδιο της ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Η FETα /φορέα και κύτταρα /DNRII FETα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή σε γυάλινες καλυπτρίδες. Αυτά πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο μεθανόλη για 5 λεπτά. Σταθερή κύτταρα διαπερατά με 0,1% Tween 20 σε PBS και αποκλείστηκαν για μη ειδική σύνδεση με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα αντι-VEGFA (1:50 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση στο σκοτάδι for1 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με το δευτερεύον αντίσωμα Dylight488-συζευγμένο με αντι-κουνελιού IgG (1:400 αραίωση, Jackson ImmunoResearch Laboratories). Βαμμένα κύτταρα τοποθετημένα σε vectashield μέσο με DAPI (Vector Labs) στερέωσης hardset και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

δείγματα ιστών

Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) τμήματα ιστού από τις πρωτογενείς όγκους του ποντίκια που φέρουν FETα /φορέα και κυττάρων FETα /DNRII είχαν προηγουμένως περιγραφεί [2]. FFPE μπλοκ του φυσιολογικού ανθρώπινου παχέος εντέρου αφαιρεθεί για λόγους άλλους από την κακοήθεια και εκείνα που περιέχουν επεμβατική παχέος αδενοκαρκινώματα ελήφθησαν από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας και Μικροβιολογίας στο Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο (UNMC). Οι ηλικίες των ασθενών ήταν μεταξύ 55 και 85 χρόνων, με υλικό που προέρχεται από τους άνδρες και τις γυναίκες. Οι ασθενείς με καρκίνο δεν λαμβάνουν αντικαρκινική θεραπεία πριν από την χειρουργική αφαίρεση του όγκου.

Η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας (επιτροπή δεοντολογίας) της UNMC. Tissue χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη λήφθηκε από την περίσσεια υλικού που παραμένει στο μπλοκ παραφίνης μετά την έκδοση της παθολογική διάγνωση. Το έντυπο συγκατάθεσης χειρουργική επέμβαση χρησιμοποιείται σε UNMC περιλαμβάνει μια διάταξη που επιτρέπει τη χρήση πλεονάζον υλικό για ερευνητικούς σκοπούς. Κάθε μορφή είναι στο αρχείο με το Τμήμα Παθολογίας και Μικροβιολογίας και αναθεωρήθηκε πριν από τον πειραματισμό. Ως εκ τούτου, η επιτροπή δεοντολογίας παραιτηθεί από την ανάγκη για πρόσθετη γραπτή συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση

Τέσσερα τμήματα ιστών πάχους μικρών κόπηκαν και αποκηρωμένα στο HistoClear για 15 λεπτά και στη συνέχεια επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας 100%, 95% και 70% των διαβαθμισμένης αλκοόλης επί 5 λεπτά αντιστοίχως. ανάκτησης αντιγόνου για pSmad2 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Novocastra, Επιτόπου Ανάκτηση Λύσεις σε pH 6,0 (Leica). Η επώαση με πρωτογενές αντίσωμα αντι-pSmad2 (1:200 αραίωση, Millipore) που ακολουθείται από NovoLink Polymer (Leica) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της Smad2. ανάκτησης αντιγόνου για VEGFA και CD31 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος Tris-EDTA σε ρΗ 9.0. Για την ανίχνευση VEGFA και έκφραση CD31, αντι-VEGFA αντίσωμα (1:50 αραίωση, Santa Cruz) και αντι-CD31 αντίσωμα (1:100 αραίωσης, Abcam) επωάστηκαν για μία νύχτα σε 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με HRP συζευγμένο κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (1:300 αραίωση, Jackson Laboratories) για VEGFA και με HRP επισημασμένο πολυμερές αντι-κουνελιού (ϋΑΚΟ) για CD31. Για την εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης, Dako Διπλή ενδογενές ένζυμο Block (DAKO) χρησιμοποιήθηκε για VEGFA και CD31, ενώ Novocastra υπεροξειδάσης Block (Leica) χρησιμοποιήθηκε για pSmad2. Τα πλακίδια στη συνέχεια αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρωμογόνου DAB (DAKO) που ακολουθείται από αντι-χρώση με αιματοξυλίνη. Τα πλακίδια τοποθετήθηκαν με Permount (Fisher Scientific) και υποβλήθηκε σε μικροσκοπικές εξετάσεις. πυκνότητα χρώση μετρήθηκε και ποσοτικά με ImagePro συν 7,0 Λογισμικό χρησιμοποιώντας 20 × ή 40 × εικόνες.

Αποτελέσματα

TGF-β σηματοδότηση αναστέλλει την έκφραση VEGFA σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Εξέταση της έκφρασης VEGFA σε ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου έδειξαν ότι κυτταρικές γραμμές με τον άγριου τύπου ΤΟΡ-β RII (CBS, GEO και FET [7]) που εκφράζεται χαμηλότερα επίπεδα VEGFA από αυτούς με μεταλλαγμένο ΤΟΡ-β RII (RKO, C, HCT116 [7]) (Σχ. 1Α, αριστερό πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ ΤΟΡ-β σηματοδότηση και έκφραση VEGFA. Re-έκφραση του άγριου τύπου RII του ΤΟΡ-β σε HCT116, μία από τις κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο ΤΟΡ-β RII, οδήγησε σε μειωμένη έκφραση VEGFA (Εικ. 1Α, δεξί πάνελ). Για να προσδιοριστεί άμεσα αν ΤΟΡ-β σηματοδότηση αρνητικώς ρυθμίζει την έκφραση VEGFA, FET κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 ng /ml ΤΟΡ-β. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, εξωγενούς ΤΟΡ-β μειωμένη έκφραση VEGFA σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, με σημαντική μείωση μετά από 24 ώρες θεραπείας ΤΟΡ-βήτα. SB525334, ένας ισχυρός αναστολέας του υποδοχέα τύπου Ι (RI) κινάση ΤΟΡ-βήτα, χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την επίδραση του ΤΟΡ-βήτα. Θεραπεία της FET κυττάρων με SB525334 ανέστρεψε την ανασταλτική επίδραση της ΤΟΡ-β επί της έκφρασης του VEGFA (Εικ. 1 C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση καταστολής του TGF-β επί της έκφρασης VEGFA, ένα κυρίαρχο αρνητικό ΤΟΡ-β RII (DNRII) εισήχθη σε κύτταρα FETα να καταργήσει ενδογενούς σηματοδότησης ΤΟΡ-β, η οποία φαίνεται από ελαττωμένη Smad2 και φωσφορυλίωση Smad3 (pSmad2 & amp? pSmad3? Σχ. 1D, αριστερό πάνελ). Κατά συνέπεια, η έκφραση VEGFA αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα DNRII σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα (Σχ. 1 D, αριστερό πάνελ). χρώση ανοσοφθορισμού των VEGFA επιβεβαίωσε έκφραση Higer του VEGFA σε κύτταρα FETα /DNRII ό, τι σε κύτταρα /φορέα FETα (Εικ. 1 D, δεξί πάνελ).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης VEGFA σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου και τα κύτταρα HCT116 εκ νέου εκφράζουν ΤΟΡ-β RII. (Β και C) κύτταρα FET αναπτύχθηκαν σε 50% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 4 ng /ml ΤΟΡ-βήτα 1 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα (Β) ή με 4 ng /ml ΤΟΡ-beta1 παρουσία ή απουσία 200 ηΜ SB525334 για 48 ώρες (C). αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν με ένα αντίσωμα αντι-VEGFA για την ανίχνευση της έκφρασης VEGFA. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) κηλίδας Western (αριστερό πάνελ) και ανοσο-χρώση (δεξιά πλευρά) αναλύσεις της έκφρασης VEGFA σε FETα /φορέα και κύτταρα /DNRII FETα. Φωσφορυλίωση της Smad2 και Smad3 (pSmad2 & amp? PSmad3) φάνηκε να υποδεικνύει την ενεργοποίηση Smad (αριστερό πάνελ)

Η

TGF-β αναστέλλει την έκφραση VEGFA στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο

Για να. καθορίζουν τον τρόπο ΤΟΡ-β καταστέλλει έκφραση VEGFA, η έκφραση του mRNA του VEGFA προσδιορίστηκε σε FET κύτταρα επεξεργασμένα με ΤΟΡ-β για διαφορετικές χρονικές περιόδους. RT-PCR αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του mRNA VEGFA παρέμεινε αμετάβλητη μετά την επεξεργασία του ΤΟΡ-β για διάστημα έως 48 ώρες (Σχ. 2Α, άνω πίνακας). Ποσοτικοποίηση των επανειλημμένων πειραμάτων επιβεβαίωσε την παρατήρηση (Σχ. 2Α, κάτω πίνακας). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο TGF-β ρυθμίζει την έκφραση VEGFA στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς μετα-μεταγραφικής ρύθμισης είναι ότι η σταθερότητα της πρωτεΐνης. Για να καθοριστεί εάν ΤΟΡ-β σηματοδότηση ρυθμίζει την σταθερότητα της πρωτεΐνης του VEGFA, κυκλοεξιμίδιο (CHX) προστέθηκε σε FET κύτταρα για να αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση, ενώ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-βήτα. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα επίπεδα της VEGFA μειώθηκαν ταχύτερα σε ΤΟΡ-βήτα-επεξεργασμένα δείγματα από ό, τι τα δείγματα ελέγχου (Εικ. 2Β, άνω πίνακας). Ποσοτικοποίηση και ομαλοποίηση της έντασης των ζωνών VEGFA με εκείνη των αντίστοιχων ζωνών ακτίνης σαφώς έδειξαν ότι η θεραπεία ΤΟΡ-β μείωσε την ημιζωή του VEGFA πρωτεΐνης (Εικ. 2Β, κάτω πλαίσιο), υποδεικνύοντας ότι ο TGF-β ρυθμίζει σταθερότητα VEGFA πρωτεΐνη . Για να αναλύσουμε περαιτέρω τον υποκείμενο μηχανισμό, έναν αναστολέα πρωτεασώματος, MG132, ή αναστολέας Ε1 ουβικιτίνης, PYR41, χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα FET μαζί με TGF-β. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, είτε MG132 ή PYR41 εμποδίζεται ΤΟΡ-β-μεσολαβούμενη καταστολή της έκφρασης VEGFA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β σηματοδότηση μειώνεται η σταθερότητα της πρωτεΐνης VEGFA μέσω ουβικιτινίωση και υποβάθμιση.

(Α) κύτταρα FET αναπτύχθηκαν σε 50% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 4 ng /ml ΤΟΡ-βήτα 1 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

(άνω πάνελ). Η ένταση της κάθε ζώνης VEGFA mRNA ποσοτικοποιήθηκε και ομαλοποιήθηκε με εκείνη του αντίστοιχου συγκροτήματος ακτίνης. Οι τιμές είναι μέσοι ± S.E. από εις τριπλούν πειράματα (κάτω πίνακας). (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης VEGFA διεξήχθη στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία FET κύτταρα επεξεργασμένα με 100 μg /ml κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ) μόνο ή CHX και ΤΟΡ-βήτα μαζί (άνω πάνελ). Η ένταση της κάθε ζώνης VEGFA ποσοτικοποιήθηκε και ομαλοποιήθηκε με εκείνη του αντίστοιχου συγκροτήματος ακτίνης (κάτω πάνελ). (C) Ανάλυση Western blot της έκφρασης VEGFA σε FET κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με ΤΟΡ-β, ΤΟΡ-β με MG132 (10 μΜ) ή ΤΟΡ-β με PYR41 (15 μΜ). (Δ) Η έκφραση της Smad2 και Smad3 σε FET κυττάρων με κενό φορέα ελέγχου (CTR), Smad2 shRNA (Sh-S2) ή Smad3 shRNA (Sh-S3) παρουσιάστηκε στον αριστερό πίνακα. Η φωσφορυλίωση των Smad2 και Smad3 και έκφραση VEGFA ανωτέρω κύτταρα επεξεργασμένα με 4 ng /ml του ΤΟΡ-β αποδείχθηκε στο δεξί πλαίσιο. (Ε) Έκφραση PKACatα σε FET κυττάρων με κενό φορέα ελέγχου (CTR) ή PKACatα shRNA (Sh-PKA) παρουσιάστηκε στον αριστερό πίνακα. έκφραση VEGFA ανωτέρω κύτταρα επεξεργασμένα με 4 ng /ml ΤΟΡ-β για 48 ώρες φάνηκε στη δεξιά πλευρά.

Η

ΤΟΡ-β σηματοδότηση διαμεσολαβείται κυρίως μέσω της ενεργοποίησης Smad. Ωστόσο, Smad-ανεξάρτητη σηματοδότηση ΤΟΡ-β έχει επίσης αναφερθεί σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [23], [24]. Για να προσδιορίσετε αν TGF-beta-μεσολάβηση αναστολή της έκφρασης VEGFA είναι Smad-εξαρτώμενη ή ανεξάρτητη από, Smad2 και Smad3 ήταν γκρέμισε μεμονωμένα σε FET κύτταρα Τα siRNAs ειδικά για Smad2 ή Smad3. Έκφραση της Smad2 ή Smad3 μειώθηκε αποτελεσματικά και συγκεκριμένα στην Smad2 ή Smad3 νοκ ντάουν κύτταρα (Εικ. 2D, αριστερό πάνελ). Ως αποτέλεσμα, οι αυξήσεις στη pSmad2 ή pSmad3 κατά την κατεργασία του ΤΟΡ-βήτα καταργήθηκαν το Smad2 ή Smad3 knockdown κυττάρων αντίστοιχα (Σχ. 2D, δεξί πάνελ). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η αναστολή της έκφρασης πρωτεΐνης VEGFA με ΤΟΡ-β αντιστράφηκε εν μέρει σε Smad3 knockdown κυττάρων ενώ knockdown του Smad2 είχε μικρή επίδραση (Σχ. 2D, δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΤΟΡ-β καταστέλλει την έκφραση του VEGFA σε Smad3-εξαρτώμενη και Smad2-ανεξάρτητο τρόπο. Η μερική αντιστροφή του ΤΟΡ-β-μεσολαβούμενη καταστολή της έκφρασης VEGFA σε Smad3 knockdown κυττάρων μπορεί να αποδοθεί σε ατελή αποσιώπηση της έκφρασης Smad3 σε αυτά τα κύτταρα ή την ύπαρξη ενός Smad3-ανεξάρτητο μηχανισμό.

Όπως φαίνεται προηγουμένως, ΤΟΡ -β ρυθμίζει ΧΙΑΡ μειορύθμιση μέσω μεσολαβεί η ΡΚΑ οδού [25]. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν ΡΚΑ εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης VEGFA από τον TGF-β. Η έκφραση της PKA καταλυτική υπομονάδα α (PKACatα) χτυπήθηκε κάτω από ένα ειδικό shRNA σε FET κύτταρα (Σχ. 2Ε, αριστερό πάνελ). Ως αποτέλεσμα, ΤΟΡ-βήτα-μεσολαβούμενη αναστολή της έκφρασης VEGFA ήταν σχεδόν εντελώς καταργήθηκε σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2Ε, δεξί πάνελ). Λαμβανόμενα μαζί με την παρατήρηση ότι η ενεργοποίηση ΡΚΑ είναι Smad3 εξαρτώμενη [25], τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ΤΟΡ-β /Smad3 /ΡΚΑ σηματοδότηση ρυθμίζει προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης VEGFA σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

ΤΟΡ-β σηματοδότηση αναστέλλει VEGFA έκφραση και καταστέλλει την αγγειογένεση όγκων in vivo

VEGFA είναι ένας βασικός ρυθμιστής του σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων και παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση, η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Δείξαμε παραπάνω ότι ο TGF-β σηματοδότηση αναστέλλει την έκφραση VEGFA (Εικ. 1Β). Δεδομένου ότι ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας μετάσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [12], εξετάσαμε αν η καταστολή της έκφρασης VEGFA με ΤΟΡ-β συμβάλλει στην μετάσταση λειτουργία καταστολής του TGF-β. Χρησιμοποιήσαμε FETα /φορέα και το μοντέλο των κυττάρων FETα /DNRII περιγράφηκε προηγουμένως [12] για να εξετάσει το ζήτημα αυτό. έκφραση VEGFA ήταν πολύ υψηλότερο σε κύτταρα /DNRII FETα από ότι σε κύτταρα /φορέα FETα

in vitro

λόγω κατάργησης της ΤΟΡ-β σηματοδότηση (Σχ. 1D). Όπως φαίνεται προηγουμένως, τα κύτταρα FETα /DNRII έδειξαν σημαντικά αυξημένο μεταστατικό δυναμικό σε σύγκριση με κύτταρα /φορέα FETα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο

in vivo

[12]. Πρωτογενής τομές όγκων που παρασκευάζεται από κάθε ποντικό μεταμοσχεύθηκαν ορθοτοπικά με FETα /φορέα ή κύτταρα /DNRII FETα εξετάστηκαν για ΤΟΡ-β σηματοδότηση. Από FETα κύτταρα εκφράζουν τόσο Smad2 και Smad3 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), η φωσφορυλίωση Smad2 χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για την ενεργό ΤΟΡ-β /Smad2 /3 σηματοδότηση. IHC αναλύσεις χρησιμοποιώντας ένα αντι-φωσφο-Smad2 (αντι-pSmad2) αντίσωμα έδειξε ότι η φωσφορυλίωση της πυρηνικής Smad2 ήταν σημαντικά μειωμένη στις πρωτογενείς όγκους των κυττάρων FETα /DNRII σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων /φορέα FETα (Εικ. 3Α, αριστερός πίνακας). Ποσοτικοποίηση της πυκνότητας χρώσης των πυρηνικών pSmad2 σε πολλαπλά δείγματα έδειξαν ότι ο ΤΟΡ-β σηματοδότηση ανεστάλη στους όγκους των κυττάρων /DNRII FETα κατά περίπου 40% (σχήμα 3Α, δεξιός πίνακας, *

P

& lt?. 0.001) . Για να προσδιορίσετε αν TGF-β σηματοδότηση καταστέλλει την έκφραση VEGFA

in vivo

, εξετάσαμε την έκφραση VEGFA στις πρωτογενείς όγκους χρησιμοποιώντας αναλύσεις IHC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση VEGFA ήταν πολύ μεγαλύτερη στους όγκους των κυττάρων /DNRII FETα από εκείνα των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Η ποσοτικοποίηση της πυκνότητας χρώσης των VEGFA σε πολλαπλά δείγματα έδειξαν ότι η έκφραση VEGFA αυξήθηκε κατά περισσότερο από δύο φορές σε αυτούς τους όγκους (Σχήμα 3Β, δεξιά πάνελ, *

P

& lt?. 0,001), επιβεβαιώνοντας την κατασταλτική ρόλο της ΤΟΡ-β στην έκφραση VEGFA

in vivo

. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση VEGFA έχει οποιεσδήποτε βιολογικές συνέπειες

in vivo

, είμαστε δίπλα αναλύονται σχηματισμό μικροαγγείων εντός των όγκων χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-CD31. CD31 είναι ένας δείκτης των ενδοθηλιακών κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων. Στα όγκους των κυττάρων FETα /DNRII, πυκνότητα μικροαγγείων ήταν περισσότερο από 3 φορές υψηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στα δείγματα ελέγχου (Σχήμα 3C, *

P

& lt?. 0.001). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του ΤΟΡ-β σηματοδότηση οδηγεί σε αυξημένη έκφραση VEGFA, η οποία συμβάλλει στην αύξηση της αγγειογένεσης. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της αυξημένης μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων /DNRII FETα στο ορθοτοπικό μοντέλο, οι μελέτες μας δείχνουν ότι ΤΟΡ-β σηματοδότηση καταστέλλει VEGFA μεσολάβηση αγγειογένεσης και την εξέλιξη του όγκου.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες του IHC χρώσης φωσφο- Smad2 (Α), VEGFA (Β) και CD31 (C) στους πρωτοπαθείς όγκους του FETα /φορέα και κύτταρα FETα /DNRII (αριστερά πάνελ). πυκνότητα χρώση μετρήθηκε και ποσοτικά με ImagePro συν 7,0 Λογισμικό χρησιμοποιώντας 20 × ή 40 × εικόνες (δεξιά πάνελ). Τέσσερα ζώα αναλύθηκαν για κάθε τύπο κυττάρων. Δεκαπέντε έως είκοσι ιστολογικώς παρόμοια πεδία επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε διαφάνεια για ανάλυση της πυκνότητας χρώσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

P

τιμές υπολογίστηκαν με χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt?. 0.001

Η

Η έκφραση της VEGFA συσχετίζεται αντίστροφα με TGF-β σηματοδότηση στο αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου

Η παραπάνω

in vitro

και

in vivo

αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ο TGF-β ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση VEGFA σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον υπήρξε κάποια συσχέτιση μεταξύ TGF-β σηματοδότηση και έκφραση VEGFA στην ανθρώπινη παχέος αδενοκαρκινώματα. Τμήματα που παρασκευάστηκε από 10 φυσιολογικούς κόλον και 24 μεμονωμένους ασθενείς καρκίνου του παχέος εντέρου εξετάσθηκαν για την ενεργό σηματοδότηση ΤΟΡ-β και έκφραση VEGFA. Από Smad2 και Smad3 σπάνια μεταλλαγμένα σε καρκίνο του παχέος εντέρου [26], η φωσφορυλίωση Smad2 χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη για να δείξει ενεργού ΤΟΡ-β /Smad2 /3 σηματοδότηση. Κανονικό ανθρώπινο κόλον έδειξε ισχυρή και διακριτή πυρηνική χρώση για φωσφορυλίωση Smad2 και ασθενής χρώση για VEGFA στην κρύπτη επιθηλιακά κύτταρα ενώ τα κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα στις περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος εμφανίζεται στο πιο αδύναμη και διαχέεται χρώση για φωσφορυλίωση Smad2 και ισχυρή χρώση για VEGFA με αναλύσεις IHC ( Σχ. 4Α). Το Σχήμα 4Β δείχνει την ποσοτικοποίηση της πυκνότητας χρώσης φωσφορυλίωσης πυρηνικών Smad2 και VEGFA έκφραση των επιμέρους δείγματα ασθενών. Συνολικά, η κανονική επιθηλιακά κύτταρα του κόλου εμφανίζουν υψηλότερα πυρηνική φωσφορυλίωση Smad2 και χαμηλότερη έκφραση VEGFA από αδενοκαρκινώματα, υποστηρίζοντας την άποψη ότι η έκφραση του VEGFA συσχετίζεται αντιστρόφως με ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε κολονικό αδενοκαρκίνωμα άνθρωπο.

Τμήματα παρασκευάστηκε από 10 φυσιολογικούς κόλον και 24 επιμέρους δείγματα των ασθενών καρκίνου του παχέος εντέρου χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-Smad2 και αντι-VEGFA αντισώματα. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του IHC χρώση της φωσφο-Smad2 και VEGFA σε φυσιολογικά δείγματα κόλου και καρκίνου του παχέος εντέρου. (Β) πυκνότητα Χρώση μετρήθηκε και ποσοτικά με ImagePro συν 7,0 Λογισμικό χρησιμοποιώντας 40 × εικόνες σε κάθε δείγμα. Τα φυσιολογικά δείγματα του παχέος εντέρου αντιπροσωπεύονται από τις πλατείες και τα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου από τρίγωνα. Μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές για κάθε ομάδα δειγμάτων.

P

τιμές υπολογίστηκαν με χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

TGF-β σηματοδότηση έχει αποδειχθεί για να καταστείλει το σχηματισμό όγκων και μεταστάσεων σε ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω πολλών διαφορετικών μηχανισμών περιλαμβανομένης της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης [4], [12], [25], [27]. Η ικανότητα των κακοήθων κυττάρων να αντέχει περιβαλλοντικές πιέσεις, ιδιαίτερα εκείνων που σχετίζονται με μετάσταση, θεωρείται βασικός παράγοντας για την ανάπτυξη των όγκων και την εξέλιξη [28]. Από περιβαλλοντική περιορισμός στην ανάπτυξη είναι πολύ συχνή σε συμπαγείς όγκους όπως καρκίνωμα κόλον, ένα μηχανισμό που επιτρέπει αυξημένη αγγειογένεση για να παρέχει επαρκή θρεπτικά συστατικά και οξυγόνο θα ήταν ιδιαίτερα επωφελής για τα κακοήθη κύτταρα και να ενισχύσουν την ικανότητα παρεκκλίνουσα επιβίωσή τους. VEGFA είναι ένας ισχυρός αγγειογόνος παράγοντας που παίζει ουσιαστικό ρόλο στον καρκίνο. Καρκινικά κύτταρα μυστικό VEGFA να προκαλέσει αγγειακό σύστημα για την ανάπτυξη, επιτρέποντας επαρκή παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών [14]. Ως εκ τούτου, VEGFA μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η διαφυγή από TGF-beta-απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου συμβάλλει στην αυξημένη χωρητικότητα επιβίωσή τους και την ενισχυμένη μεταστατικό δυναμικό

in vivo

[12]. Δείχνουμε εδώ ότι, εκτός από την επαγωγή της απόπτωσης, ΤΟΡ-β σηματοδότηση μπορούν επίσης να αναστείλουν την έκφραση του VEGFA και κατά συνέπεια, την αγγειογένεση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

in vivo

και ότι κατάργηση της ΤΟΡ-βήτα επιτρέπει αυξημένη έκφραση VEGFA και την αγγειογένεση, η οποία θα μπορούσε να διευκολύνει την ανάπτυξη του όγκου και την ανάπτυξη μεταστάσεων. Επιπλέον, μια αντίστροφη σχέση μεταξύ ΤΟΡ-β σηματοδότηση και έκφραση VEGFA παρατηρείται επίσης σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, υποδεικνύοντας τη σημασία των μελετών μας για τον ανθρώπινο καρκίνο. Κατά συνέπεια, η ανασταλτική επίδραση της ΤΟΡ-β επί της έκφρασης VEGFA και αγγειογένεση παρέχει μια άλλη σημαντική και νέα μηχανιστική βάση για ΤΟΡ-β όγκων και μετάσταση λειτουργία καταστολέα.

Αν και η έκφραση του VEGFA μπορεί να ρυθμίζεται στο μεταγραφικό επίπεδο από HIF1α [19], η ρύθμιση της από ΤΟΡ-β είναι στην μετα-μεταγραφικό επίπεδο (Σχ. 2Α). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία ΤΟΡ-β μείωσε την σταθερότητα της πρωτεΐνης VEGFA μέσω ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση (Σχήμα 2Β & amp?. 2C). Επιπλέον, ΤΟΡ-βήτα-διαμεσολαβούμενη μείωση στην έκφραση VEGFA λαμβάνει χώρα μέσω ενός PKA- και Smad3-εξαρτώμενη και Smad2-ανεξάρτητο μονοπάτι (Εικ 2Δ & amp?. 2Ε). Έχει δειχθεί ότι η ενεργοποίηση του ΡΚΑ από τον TGF-β περιλαμβάνει Smad3 αλλά όχι Smad2 και ότι η ενεργοποίηση ΡΚΑ προάγει αποικοδόμηση πρωτεΐνης μέσω ουβικουϊτινίωσης [25]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι ο TGF-β μεσολαβεί αποικοδόμηση VEGFA μέσω της οδού Smad3 /ΡΚΑ. Αυτή είναι μία νέα μηχανισμός με τον οποίο η έκφραση του VEGFA ρυθμίζεται από ΤΟΡ-β σηματοδότηση. Περαιτέρω μελέτες θα είναι αναγκαίο να προσδιοριστεί το υποκείμενο μηχανισμό.

Υψηλή συχνότητα της Smad4 μετάλλαξης και η αδρανοποίηση είναι στενά συνδεδεμένη με την αυξημένη μεταστάσεις και κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [29], [30]. Παρά το γεγονός ότι ο ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας όγκων σηματοδότησης σε ένα υποσύνολο των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου (δηλαδή FET, GEO και CBS, κλπ) που εκφράζουν άγριου τύπου Smad4 [4], [10], [11], Smad4-ανεξάρτητο ΤΟΡ-β σηματοδότηση έχει δειχθεί ότι προάγει τον καρκίνο του παχέος εντέρου μετάσταση [31]. Έχει αναφερθεί ότι ο ΤΟΡ-β επάγει την έκφραση του VEGF σε Smad4-null καρκινικά κύτταρα κόλου [32], υποδηλώνοντας ότι ο TGF-β-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Smad4 ανεξάρτητες οδούς (δηλαδή ΜΕΚ-ΕΚΚ και ρ38 ΜΑΡΚ, κλπ) εμπλέκεται σε η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του VEGF, η οποία μπορεί να συνεργάζεται με άλλα προ-ογκογόνο οδούς για την προώθηση της μετάστασης. Ως εκ τούτου, το αντίθετο αποτέλεσμα του ΤΟΡ-β επί της έκφρασης VEGFA θα μπορούσε να συμβάλει στην απόκλιση του ρόλου της ως καταστολέα όγκων ή προαγωγό όγκου σε διαφορετικό πλαίσιο κύτταρο.

Συνοπτικά, έχουμε εντοπίσει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο ΤΟΡ-β καταστέλλει έκφραση VEGFA, αγγειογένεση και μετάσταση σε ένα υποσύνολο κυττάρων καρκίνου του κόλου. Αυτή η μελέτη είναι σημαντική, δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση του VEGFA αυξάνεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και συνδέεται με τον εντοπισμό της νόσου, το στάδιο και τη μακροχρόνια ασθένεια-ειδικές επιβίωση [33].