Αφηρημένο

Σε προηγούμενη εργασία έχουμε τεκμηριώσει την πυρηνική μετατόπιση των ενδοθηλιακών NOS (eNOS) και τη συμμετοχή της στη συνδυαστική σύμπλοκα με υποδοχέα οιστρογόνων Beta (Ετβ) και υποξία επαγώγιμοι Παράγοντες (HIFs) που καθορίζουν εντοπισμένη αναδιαμόρφωσης χρωματίνης σε απόκριση προς οιστρογόνο (Ε2) και ερεθίσματα υποξίας, με αποτέλεσμα μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με δυσμενείς πρόγνωση στον καρκίνο του προστάτη (PCA). Για να διερευνήσουν το ρόλο της πυρηνικής eNOS στην απόκτηση των επιθετικών φαινοτύπου σε προστάτη, πραγματοποιήσαμε τσιπ αλληλουχίας σε χρωματίνη που σχετίζονται με eNOS από κύτταρα από έναν πρωτοπαθή όγκο με κακή έκβαση και από μεταστατικά κύτταρα LNCaP. Βρήκαμε ότι: 1. οι eNOS-δεσμεύεται περιοχές (κορυφές) είναι ευρέως κατανεμημένη σε όλη την γονιδίωμα περιλαμβάνει πολλούς παράγοντες μεταγραφής θέσεις δέσμευσης, συμπεριλαμβανομένων των οιστρογόνων Response Elements. 2. Ε2 αύξησε τον αριθμό των κορυφών, υποδεικνύοντας ορμονοεξαρτώμενου eNOS re-εντοπισμό. 3. διανομής Peak ήταν παρόμοια με /χωρίς Ε2 με ≈ 55% από αυτούς σε extragenic περιοχές του DNA και μια ενδιαφέρουσα συμμετοχή του τομέα 5 ‘των πολλών Mirs απελευθερωθεί στην ΣΕΣΣ. Πολυάριθμες εν δυνάμει νέων eNOS στόχευση γονιδίων έχουν ταυτοποιηθεί υποδηλώνοντας ότι eNOS συμμετέχει στη ρύθμιση των μεγάλων συνόλων γονιδίων. Η παράλληλη διαπίστωση αρνητική ρύθμιση ενός συμπλέγματος των Mirs, συμπεριλαμβανομένων των miR-34a, στα κύτταρα του προστάτη που σχετίζεται με κακή έκβαση μας οδήγησαν να παρουσιάσει ένα μοριακό σύνδεσμο μεταξύ της eNOS και SIRT1, μια επιγενετική ρυθμιστής της γήρανσης του πληθυσμού και της ογκογονικότητας, αρνητικά ρυθμίζεται από miR-34a και με τη σειρά του την ενεργοποίηση της eNOS. Ε2 ενισχύει miR-34a προς τα κάτω ρύθμιση ενισχύοντας έτσι την έκφραση SIRT1, που απεικονίζει μια αλληλεπίδραση μυθιστόρημα eNOS /SIRT1 τελειοποιηθεί από την Ε2-ενεργοποιημένη σηματοδότηση ER, και υποδηλώνει ότι η eNOS μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επιθετική προστάτη

Παράθεση:. Nanni S, Aiello Α, Re Α, Guffanti Α, Benvenuti V, Colussi C, et al. (2013) που εξαρτώνται από οιστρογόνα Δυναμική Προφίλ του eNOS-DNA Ενώσεων στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (5): e62522. doi: 10.1371 /journal.pone.0062522

Επιμέλεια: Costanza Emanueli, Πανεπιστήμιο του Μπρίστολ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 20, Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 22 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 3, 2013

Copyright: © 2013 Nanni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Associazione Italiana Ricerca sul Cancro να AFA? Ιταλικό Υπουργείο Παιδείας, το Πανεπιστήμιο, και Κονδυλίων Έρευνας: ΠΡΙΝ 2008NY72SJ και FIRB RBFR087JMZ να AFA και FIRB RBFR10URHP για S.N. V.B. είναι αποδέκτης ενός FIRC (Federazione Italiana Ricerca sul Cancro) υποτροφία. Α.Α. υποστηρίζεται με τη χρηματοδότηση από το Susan G. Komen για το Ίδρυμα Cure. C.G. έρευνα υποστηρίζεται από το LOEWE Κέντρο Κυτταρικής και Γονιδιακής Θεραπείας, Πανεπιστήμιο Goethe της Φρανκφούρτης (DE). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: συν-συγγραφέας AG είναι μια Genomnia srl ​​των εργαζομένων και μια Fe είναι σύμβουλος της Genomnia srl. Συν-συγγραφείς CG διαφήμιση MCC είναι PLoS ONE Editorial μελών του Διοικητικού Συμβουλίου. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) και συνθετάσες της επιτυγχάνεται διασημότητα μεταξύ των ογκολόγων, λόγω των αποδείξεων συχνή απελευθέρωση της παραγωγής ΝΟ σε αρκετές όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη (PCA, [1], [2], [3], και από την ανακάλυψη μιας βασικό ρόλο που διαδραματίζει η ενδοθηλιακή NOS (eNOS) στη συντήρηση και την εξέλιξη του όγκου [1 ], [3], [4] πριν πειραματικά αποτελέσματα μας δίνουν επίδειξη της φυσιοπαθολογικών ρόλο των eNOS σε τρία κυτταρικά πλαίσια:. φυσιολογικά ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) πριν και μετά τη θεραπεία με 17β-οιστραδιόλη (Ε2)? καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων . από προστάτη έκφυτα καλλιεργούνται στη βασική κατάσταση ή με Ε2? και δείγματα ιστού του προστάτη από ασθενείς του προστάτη Ομοεστιακή μικροσκόπιο και ανοσοϊστοχημεία έχουν τεκμηριώσει, ιδίως, eNOS πυρηνική μετατόπιση και στα τρία πειραματικά μοντέλα [1], [5] και με την προϋπόθεση τα ακόλουθα αποδεικτικά στοιχεία: (θ) «πυρηνική» σηματοδότηση της eNOS-NO είναι ένα βασικό μονοπάτι στα ενδοθηλιακά ανταπόκριση των κυττάρων στην αγγειογενετική ερεθίσματα και στην απόκτηση μιας πιο επιθετικής φαινότυπο σε προστάτη? και (ii) την ύπαρξη και λειτουργικό ρόλο ζωτικής συνδυαστικής συγκροτήματα χρωματίνης, eNOS /ΕΚα εμπλέκονται ειδικά στην διατήρηση της αγγειακής ομοιόστασης [6], [7] και eNOS /ΕΚβ, eNOS /HIF-1α ή eNOS /HIF-2α ειδικότερα σχετίζεται με δυσμενή κλινική έκβαση προστάτη [1]. Στο μοντέλο όγκου, αυτά τα σύμπλοκα καθορίζουν εντοπισμένη αναδιαμόρφωση της χρωματίνης σε απόκριση προς τα οιστρογόνα και υποξία ερεθίσματα, με αποτέλεσμα την μεταγραφική ρύθμιση των προγνωστικών γονιδίων στόχων [1]. Είτε eNOS και οι συνεργάτες της είναι παρόντα ως ένα αστερισμό των συντεταγμένων σύμπλοκα ή με τη μορφή μιας μακρο-πολυπαραγοντική συγκρότημα μένει να αξιολογηθεί.

Τα τελευταία χρόνια, ένα σημαντικό ρόλο στον ανθρώπινο καρκίνο έναρξη, εξέλιξη και μετάσταση έχει έχουν ανατεθεί επίσης στην απορύθμιση των microRNAs (Mirs) [8], [9]. Πώς η έκφραση των προγνωστικών γονιδίων στόχων ρυθμίζεται στο πλαίσιο της PCA είναι επί του παρόντος υπό διερεύνηση αν και αρκετές εκθέσεις [10], [11], [12], [13], [14] έχουν εντοπίσει σμήνη ιδιαίτερα σημαντική για τον καρκίνο του προστάτη. Εδώ έχουμε επεκταθεί σε αυτή την πτυχή με την τεκμηρίωση σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση ενός συμπλέγματος των Mirs, αποκλειστικά στα κύτταρα του προστάτη που σχετίζεται με δυσμενή κλινική έκβαση (κύτταρα G1). Αυτό το σύμπλεγμα περιλαμβάνει miR-34a, η πρώτη miR προσδιορίζονται ως ρυθμιστής της δεακετυλάσης SIRT1 [15] μια κρίσιμη επιγενετική ελεγκτή της γήρανσης του πληθυσμού και ογκογενετικότητας [16].

Αξίζει να σημειωθεί eNOS και ΟΧΙ έχουν επίσης εμπλακεί στην διαδικασία γήρανσης, μια σχετική παρατήρηση αφού γήρανση θεωρείται ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της γήρανσης, eNOS συχνά απελευθερωθεί και η συνήθης ΝΟ βιοσύνθεση μετασχηματίζεται στην παραγωγή των ελευθέρων ριζών. Αυτό το αποτέλεσμα συμβάλλει στην βλάβη του DNA και της γονιδιωματικής αστάθειας παρέχει ένα ευνοϊκό έδαφος για την ανάπτυξη του καρκίνου. Πράγματι eNOS έχει πρόσφατα σχετίζεται με τη συντήρηση του καρκίνου του παγκρέατος [4] και στην εξέλιξη της προστάτη [1], ένα από τα πιο κοινή μορφή καρκίνου στους ηλικιωμένους. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο ρόλος του eNOS κατά τη διάρκεια της διαδικασίας γήρανσης συνδέεται στενά με τη λειτουργία του SIRT1. Σε φυσιολογικές συνθήκες, SIRT1 ενεργοποιεί eNOS με αποακετυλίωση. Γήρανση, αλλοιώνοντας τη λειτουργία SIRT1 καθορίζει μια μειωμένη απόδοση του μεταβολισμού της γλυκόζης, καθώς και η μειωμένη παραγωγή των κατάλληλων επιπέδων NO, επιδεινώνεται έτσι το ενδοκυτταρικό περιβάλλον.

Οι χώροι αυτοί, μαζί με την αρχική διαπίστωση μας ότι η οδός ΝΟ αντιπροσωπεύει μια «

primum movens

»μιας μεταγραφικής πρόγραμμα για την προώθηση της απόκτησης ενός επιθετικού φαινοτύπου στα κύτταρα του προστάτη, και ότι η πυρηνική μετατόπιση της eNOS επηρεάζει σημαντικά χρωματίνης αναδιαμόρφωση ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου του προστάτη προγνωστικών γονιδίων [17], μας ώθησε να διερεύνηση του πλήρους δυναμικού του καίριου αυτού μορίου σηματοδότησης ως κύριο γονίδιο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Στόχος και πρόκληση μας ήταν να ξεσκεπάσει τη λειτουργία του eNOS σε κλίμακα γονιδιώματος σε επίπεδο από μια προσέγγιση τσιπ Sequencing, με την ελπίδα της αποκαλύπτοντας ένα γενικό μηχανισμό που σχετίζεται με την παρουσία πυρηνικών eNOS σε όγκους του προστάτη. Εδώ παρουσιάζουμε πειραματικές αποδείξεις που καθορίζει ένα μοριακό κύκλωμα που συμβάλλει στην επιθετική και μεταστατική προστάτη και μπορεί να ρυθμίζεται με αναστολείς της eNOS ή SIRT1 με πιθανές επιπτώσεις στις τρέχουσες θεραπείες για την PCA.

Μέθοδοι

Ορμόνες και αναστολείς

17β-οιστραδιόλη (Ε2 Sigma), NG-νιτρο-L-αργινίνη μεθυλεστέρα (L-NAME? Αλέξης), TSA (Sigma-Aldrich), MS275, MC1568, sirtinol, η ρεσβερατρόλη ήταν ένα δώρο είδος του Antonello Mai (Ρώμη, Ιταλία)

Αντισώματα

αντι-ΕΡα (HC-20 [Santa Cruz Biotechnology]?. αντι-ΕΚβ (L-20 [Santa Cruz Biotechnology], αντι- eNOS (eNOS /ΝΟΣ Τύπος III [BD Biosciences]? Abcam, Cambridge, UK και Κυτταρικής σηματοδότησης, MA, USA), αντι-HDAC1 (Abcam, Cambridge, UK και Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA), αντι-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), αντι-HDAC3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), αντι-HDAC4 (Abcam, Cambridge, UK και Santa Cruz, CA, USA)? αντι-HDAC5 (Abcam, Cambridge, UK) αντι -SIRT1 (Abcam, Cambridge, UK)? αντι-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), αντι-5-μεθυλκυτιδίνη (Eurogentec, Seraing, Βέλγιο), αντι-α-ακτίνης (Sigma-Aldrich), και αντι- HSP70 (StressGen βιοτεχνολογίες, San Diego, CA).

Cell Culture

HUVEC και LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται [1], [5]. Πρωτοβάθμια προστάτη καλλιέργειες καρκίνου ελήφθησαν από φρέσκα εκφυτευμένη δείγματα καρκίνου του προστάτη μετά από έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας Θεσμικών όπως περιγράφεται [17]. Απαθανάτισε PCA-κύτταρα ελήφθησαν με μεταγωγή του hTERT και SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο, όπως περιγράφεται [1]. Κλινικών δεδομένων των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη έχουν ήδη αναφερθεί αλλού [17]. Η έκβαση των ασθενών (επιβίωση, μετάσταση, τοπικές ή /και βιοχημική υποτροπή) ακολούθησε μέχρι τον Δεκέμβριο του 2012 (περίοδος παρατήρησης, Ιούλιος 2002 – Δεκέμβριος 2012). Κακή ομάδα πρόγνωση (G1) των ασθενών με προστάτη ορίστηκε από την παρουσία των βιοχημικών /τοπικής υποτροπής, μετάστασης, ή ειδική θνησιμότητα της νόσου, και η ομάδα καλή πρόγνωση (G2) ορίστηκε από την πλήρη ύφεση μόνο με χειρουργική επέμβαση. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ασθενείς έχουν ανατεθεί αντίστοιχα στο G1 (C1IM, C11IM, C13IM, C19IM, C27IM, C43IM, C45IM) ή G2 (C14IM, C24IM, C25IM, C35IM, C38IM, C39IM, C40IM, C41IM) φαινοτύπους.

οι επιμολύνσεις, Εκχυλίσματα κυττάρων και Western Blot

Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με την τεχνική της Jet Pei ™ (Poly Plus επιμόλυνση). eNOS φορέα που κωδικοποιεί S1177A ήταν ένα δώρο από τον Ο.Μ. Μετρητής (Duke University Medical Center, Durham, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) [4]. Συνολικά εκχυλίσματα για Co-IP ανοσοκατακρήμνιση ελήφθησαν με ΗΠΑ Ρυθμιστικό (Tris-HCl 50 mM ρΗ = 7.5? EDTA 5 mM? NaCl 250 mM? Triton 0,1%? NaF 50 mM), πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18 ].

Θεραπείες

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10

-7 Μ Ε2, 5 mM L-NAME, 500 nM TSA, 500 nM MS275, 10 μΜ MC1568, 10 μΜ sirtinol, 25 μΜ ρεσβερατρόλη, μόνα ή σε συνδυασμό για τους χρόνους που υποδεικνύονται στο σχήμα θρύλους. Τουλάχιστον 72 ώρες πριν από την πειραματική χρήση, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με ορμόνες στερούνται ορό [19].

Μάρκες και Re-chips

chip και την εκ νέου τσιπ αναλύσεις από καλλιεργημένα κύτταρα πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [1] χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα προς ΕΚβ, eNOS, SIRT1, HDAC1, HDAC 3, HDAC 4. οι αρνητικοί μάρτυρες ήταν απουσία του αντισώματος (NoAb) ή κανονικό IgG. Ανάλυση μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-5-μεθυλκυτιδίνη διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [5]. DNA θραύσματα ανακτήθηκαν και αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR όπως περιγράφεται [1]. Οι εκκινητές παρουσιάζονται στο τμήμα συμπληρωματικών.

Για τσιπ αλληλουχίας, τσιπς διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [1], [6] με τροποποιήσεις. Εν συντομία, χρωματίνη διαλύματα παρασκευάστηκαν με κατεργασία υπερήχων χρησιμοποιώντας Bioruptor UCD-200 (Diagenode) για να ληφθούν θραύσματα DNA μεταξύ 150-500 bps σε μήκος. Προ-εκκαθάριση της χρωματίνης διαλύματος διεξήχθη με πρωτεΐνη G-αγαρόζης (Pierce) και η ανάκτηση των ανοσοσυμπλεγμάτων με πρωτεΐνη G κορεσμένο με BSA σε τελική συγκέντρωση 1 μg /μl. Ανοσοκατακρημνίστηκαν και τα δείγματα DNA εισόδου διαλύθηκαν σε διπλά αποσταγμένο H

2O. Επικύρωση του DNA πριν από την αλληλούχιση έγινε με qPCR χρησιμοποιώντας ειδικά για τους αναδόχους hTERT και PS2 εκκινητές (βλέπε τμήμα συμπληρωματικών).

Βιβλιοθήκη Παρασκευή, Chip-αλληλουχίας και βιοπληροφορική ανάλυση

NGS προετοιμασία της βιβλιοθήκης και στερεό αλληλούχιση εκτελέστηκαν σε Genomnia. δείγματα DNA σε 50 μΐ Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, ρΗ 8 είχαν διατμηθεί με χρήση του S2 System Covaris ™, με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: κύκλος 10%, ένταση 5%, οι κύκλοι /ριπή 200, χρόνος κύκλου 60 s , ο αριθμός των κύκλων 3. μέγεθος του DNA μετά την κοπή, ελέγχονται Bioanalyzer, ήταν 25-400 nt, με αιχμή περίπου 140 nt. Διασπασμένο DNA (50 ng) επισκευάστηκε στο άκρο και συνδέθηκε με τη χρήση κιτ Quick απολίνωση (New England Biolabs) σε 27 pmoles του προσαρμοστή multiplex Ρ1 και 27 pmoles ενός (διαφορετική για κάθε απολίνωση) της ράβδου κωδικοποιημένων multiplex P2 δίκλωνο προσαρμογείς (στερεά ™ θραύσμα Βιβλιοθήκη ολιγονουκλεοτίδια Kit, Applied Biosystems PN 4401151). Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Agencourt® AMPure® Kit, και nick-μετάφρασης εκτελέστηκε σε μη συνδέθηκε 3′-άκρα. Τέλος τα μόρια της βιβλιοθήκης ενισχύθηκαν με PCR για 15-17 κύκλους και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Kit Agencourt® AMPure® όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δείγματα ποσοτικά με τη χρήση qubit dsDNA ΕΣ ή BR εξαρτήσεις και ελέγχθηκαν την Bioanalyzer (Technology Agilent) χρησιμοποιώντας ένα τσιπ DNA 1000. Για την απόκτηση της πρόσδεσης και την κλωνική ενίσχυση θραυσμάτων βιβλιοθηκών στην επιφάνεια των σφαιριδίων της αλληλουχίας, οι 8 συνενώθηκαν βιβλιοθήκες DNA προστέθηκαν στην αντίδραση PCR γαλάκτωμα εκτελέστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Μετά την ενίσχυση, το γαλάκτωμα έσπασε με βουτανόλη, χάντρες εμπλουτίστηκαν για το πρότυπο θετικών σφαιρίδια, 3′-άκρο επεκτείνεται και ομοιοπολικά συνδεδεμένα επάνω σε ένα slide αλληλουχίας, και καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τυπικές ρυθμίσεις επί της στερεάς έκδοσης του συστήματος 3.5 να παράγει 50 νουκλεοτιδίων μακρύ διαβάζει.

Χαρτογράφηση της αλληλουχίας δεδομένων

Χαρτογράφηση

της Space αλληλουχίας χρώμα διαβάζει στο γονιδίωμα αναφοράς (UCSC Homo sapiens hg19 από UCSC) πραγματοποιήθηκε με την Lifetech Lifescope 2.5.1 βιοπληροφορικής σουίτα λογισμικού, μετά από «ένα priori «διόρθωση σφάλματος με τη διαδικασία SAET. Τα αρχεία που προκύπτουν ευθυγράμμισης (ζεύγη εισόδου και πειράματος) σε μορφή standard.bam αναλύθηκαν για αιχμής καλώντας άμεσα με την έκδοση MACS λογισμικού 1.4.1 [20]. Επιπλέον, the.bam ευθυγραμμίσεις μετατράπηκαν σε the.bed μορφή με το βοηθητικό πρόγραμμα bedtools bamToBed και χρησιμοποιούνται για την κορυφή κλήση με το λογισμικό ανάλυσης sicer [21], προκειμένου να λάβει υπόψη την ετερογενή φύση αυτών των DNA – αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης, η οποία μπορεί να περιλαμβάνει αρκετά μεγάλη περιοχές αλληλεπίδρασης. Όλες οι διασταυρώσεις μεταξύ των αρχείων κρεβάτι MACS και sicer και τα χαρακτηριστικά του γονιδιώματος σε επίπεδο πραγματοποιήθηκε με την bedTools v2.17.0 σουίτα λογισμικού (https://code.google.com/p/bedtools/).

Peak Προσδιορισμός

Διερευνητική ανάλυση δεδομένων των αποτελεσμάτων αλληλούχισης και τη χαρτογράφηση, την ποιότητα κορυφή MACS, της σχετικής σχολιασμό και την περαιτέρω αιχμής καλώντας έγιναν με την εμπορική Integromics SeqSolve σουίτα βιοπληροφορικής λογισμικού. Συσχέτιση MACS και sicer κορυφές (Πείραμα

έναντι

εισόδου) με γνωστή δομή του γονιδίου NCBI REFSEQ και σχολιασμός έγινε με in-house σενάρια Genomnia Perl ή με τη βιβλιοθήκη ChIPpeakAnno Bioconductor, έκδοση 2.10 [22]. Διαφορική ανάλυση κορυφής πραγματοποιήθηκε με την SICER-df.sh ρουτίνα του λογισμικού sicer ή με τη βιβλιοθήκη Bioconductor DiffBind [23], η οποία συμπληρώνεται από την in-house Genomnia σενάρια perl. Απομάκρυνση των ανοικτών χρωματίνης (false positives) περιοχές πραγματοποιήθηκε με τη χρήση «Μια ολοκληρωμένη συλλογή των περιφερειών τεχνούργημα σήματος μαύρη λίστα στο ανθρώπινο γονιδίωμα», Anshul Kundaje, ftp://encodeftp.cse.ucsc.edu/users/akundaje/rawdata/blacklists/hg19 /). Στατιστική δοκιμή που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά ακολουθία (αξιολόγηση των TSS και μήκους κορυφή μέση διαφορές) αξιολογήθηκαν με τη Welch Δύο Δείγμα t-test με την Ε έκδοση 2.15.1 στατιστική γλώσσα. Ακολουθία που συνδέονται με στατιστικές αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων υπολογισμών της πυκνότητας ετικέτας πυρήνα, πραγματοποιήθηκαν με τις κατάλληλες στατιστικές ρουτίνες και βιβλιοθήκες του R έκδοση 2.15.1 στατιστική γλώσσα (https://www.r-project.org/). Short-διαβάσει δεδομένα αλληλουχίας και των σχετικών πληροφοριών πείραμα έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων EBI ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) με τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-1204.

SIRT δραστηριότητα

η ενζυμική δραστικότητα αξιολογήθηκε με κιτ δοκιμασίας HDAC (Upstate) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 40micrograms των συνολικών εκχυλισμάτων.

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

συνεστιακή ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1]. Δείγμα αναλύθηκαν με Zeiss LSM 510 Meta Ομοεστιακή Μικροσκόπιο με 63x μεγέθυνση. Για κάθε δείγματα 10 ανεξάρτητα πεδία αναλύθηκαν και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες. μάσκα Κοινός εντοπισμός ελήφθη από το λογισμικό LSM 510 για να παράγει εικόνες που περιέχουν αποκλειστικά colocalized περιοχές.

Exiqon μικροσυστοιχίες και Ανάλυση Δεδομένων

Σύνολο καθαρισμό RNA, συμπεριλαμβανομένων miRNAs, πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ miRNeasy (QIAGEN) και τα δείγματα φυλάχθηκαν αμέσως στους -80 ° C. RNA ποσοτικοποίηση και την ακεραιότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop και Agilent 2100 Bioanalyzer. Μόνο δείγματα με αριθμό ακεραιότητα RNA (RIN) Για την αντιμετώπιση αυτών των ζητημάτων χρωματίνης ανοσοκαταβυθίσεις σε συνδυασμό με μαζική παράλληλη αλληλουχίας (τσιπ επόμενα) πραγματοποιήθηκαν πριν και μετά τη θεραπεία με 17β-οιστραδιόλη (Ε2, 10

-7M) σε δύο κυτταρικές σειρές:

i

. κύτταρα C27IM προέρχονται από ένα πρωτογενή καρκίνο του προστάτη με ένα επιθετικό φαινότυπο και καλά χαρακτηρίζεται από ανοσοφαινότυπο, κυτταρογενετική δείκτες, την ανάπτυξη και τον σχηματισμό αποικίας, ενίσχυση γονιδίου, του γονιδίου mRNA και το προφίλ miR [1], [17], και

ii

. σε κύτταρα LNCaP, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη που προέρχεται από ένα μετάσταση λεμφαδένα [25], έτσι εκπρόσωπος της «μεταστατικό» φαινότυπο. Η συγκρατημένη αποκρισιμότητα αυτών των κυττάρων σε στεροειδείς ορμόνες του φύλου, δύο ανδρογόνα και οιστρογόνα [19], [26], τα καθιστά βέλτιστο έλεγχο για μια ορμόνη που ανταποκρίνεται πρωτογενούς όγκου επιθετική, αλλά δεν έχει ακόμη μεταστατικό.

Ο στόχος της μελέτης μας ήταν να εντοπίσει, στο μικροπεριβάλλον του προστάτη, οι πρωτογενείς μεταγραφική στόχοι της Ε2 σηματοδότηση που σχετίζεται με eNOS. Εστιάσαμε σε μια μικρή ορμονική θεραπεία (45 λεπτά) με βάση τις προηγούμενες μελέτες από εμάς και άλλους που υποδεικνύεται με σαφήνεια αυτό το χρονοδιάγραμμα ως βέλτιστη για μετά τις πρωτογενείς και άμεσες επιδράσεις της Ε2-εξαρτώμενη μεταγραφή, πριν από την ενεργοποίηση της δευτερεύοντες στόχους [1 ], [6], [19], [27], [28].

eNOS τσιπ επόμενα διεξήχθη και eNOS που σχετίζεται με το DNA περιοχές (κορυφές) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο αλγορίθμων, MACS 1.4.1 ( Linux έκδοση ή όπως έχει ενσωματωθεί στην εμπορική SeqSolve λογισμικού ™ από Integromics) και sicer v1.1, για την ελαχιστοποίηση κορυφή προκατάληψη καλούντα και να εξετάσει την «εκτεταμένη» φύση της αλληλεπίδρασης των συμπλεγμάτων eNOS /ER με χρωματίνης [20], [21] . Διαφορική ανάλυση ονομάζεται κορυφών ή να επεκταθεί περιοχές (νησιά) πραγματοποιήθηκε επίσης με δύο μεθόδους, τη σύγκριση και τέμνει τα αποτελέσματα, για τους ίδιους λόγους (βλέπε Μέθοδοι και [22], [23], [29], [30]).

Ο αριθμός των αλληλούχιση διαβάζει και eNOS δέσμευσης γεγονότα για κάθε κυτταρική σειρά, ακατέργαστα ή εκτίθενται σε Ε2

, φαίνονται στον πίνακα S1. Κάτω από αμφότερες τις συνθήκες, οι eNOS που περιέχουν κορυφές DNA βρέθηκαν ευρέως κατανεμημένη σε όλη την γονιδίωμα με συντηρημένες περιοχές hyperdensity, όπως φαίνεται επάνω στο ανθρώπινο χρωμόσωμα ιδεογράμματα και για τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S2). Αυτό το πρότυπο, που θυμίζει της γονιδιωματικής διανομή των τόπων ERE περιγράφεται από Carroll

et al.

[31], υποστηρίζει τα προηγούμενα ευρήματα μας για την ύπαρξη των συμπλοκών eNOS /ER [1], [5], [6] .

προσδιορίζονται από την ανάλυση MACS αιχμής κλήση σε C27IM και LNCaP κύτταρα, αντίστοιχα 12.034 και 2.344 eNOS που σχετίζεται με αιχμές πριν από τη θεραπεία Ε2, και 57.802 και 34.560 στη συνέχεια (Πίνακας S2). Αξίζει να σημειωθεί ότι η απομάκρυνση των ανοιχτών περιοχών της χρωματίνης που είναι γνωστό ότι παράγουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα σε πειράματα τσιπ επόμενα (οι λεγόμενες «περιοχές εξαιρετικά υψηλής τεχνούργημα σήμα») άφησε ουσιαστικά αμετάβλητα τα αποτελέσματα από την άποψη του αριθμού αιχμής: 11.694 και 2.333 σε μη επεξεργασμένα C27IM και τα κύτταρα LNCaP και 57.616 ή 34.451 σε C27IM και LNCaP κύτταρα κατά την αγωγή Ε2 (Πίνακας S2 και Σχήμα 1Α) (βλέπε Μέθοδοι και [32].

Α) Venn διάγραμμα των περιοχών που εμφανίζουν eNOS-πρόσληψης με την απουσία ( ΝΤ) ή παρουσία οιστραδιόλης (Ε2). Αριθμός διακριτών γονιδιωματικής κορυφές eNOS-πρόσληψης προσδιορίζονται από ChIP-Seq στην C27IM_NT και C27IM_E2 (αριστερά), LNCaP_NT και LNCaP_E2 (δεξιά) χρησιμοποιώντας ανάλυση MACS (FDR & lt? 0,1 και P p & lt τιμή? 1e-5). Επικάλυψη μεταξύ των κορυφών σε NT και E2condition προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας όριο του 1 nt. Β) τη διανομή Μήκος της eNOS κορυφές C27 IM_NT, C27 IM_ Ε2 (αριστερά) και LNCaP NT, LNCaP Ε2 (δεξιά). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επάλληλα οικόπεδα κουτί μήκη αιχμής για Ε2 αγωγή (μαύρο) ή χωρίς θεραπεία (γκρι). Μαύρη γραμμή είναι οι κορυφές Ε2 σημαίνει μήκος, γκρι γραμμή είναι οι κορυφές NT μέσο μήκος. p & lt? 2.2e-16 NT vs Ε2. Γ) πίτα γράφημα της κατανομής eNOS-κορυφές στις ενδοκοινοτικές συναλλαγές /extragenic περιοχές (αριστερά) ή της απόστασης από το TSS (δεξιά). Οι αριθμοί σε ποσοστό αντιπροσωπεύουν min-max τιμές σε κάθε κατηγορία. Δ) Venn διάγραμμα του MACS-κορυφές στο C27IM_E2 και LNCaP_E2. Επικάλυψη μεταξύ eNOS κορυφών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας όριο του 1 nt. Ε) Επικύρωση με ποσοτική PCR τσιπ-Seq eNOS-κορυφές. eNOS δέσμευση παρακολουθήθηκε σε 9 γονιδιωματικές περιοχές, ειδικότητα αξιολογήθηκε σε ένα «κενό» περιοχή (περιοχή χωρίς eNOS κορυφές) του χρωμοσώματος 5. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή +/- SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0,05 eNOS_E2 vs eNOS_NT

Η

Σαφώς κατά την κατεργασία με οιστρογόνα, ο αριθμός των κορυφών αυξήθηκε σημαντικά (4.8- και 14-φορές σε κύτταρα C27IM και LNCaP, αντίστοιχα) υποδεικνύοντας μια συγκεκριμένη ορμόνη που εξαρτάται eNOS εκ νέου εντοπισμός κατά μήκος του γονιδιώματος. Μια ποσοτική σύγκριση αλληλουχίας του eNOS που σχετίζεται με κορυφές πριν και μετά τη θεραπεία Ε2 αποκάλυψε την ύπαρξη επικαλυπτόμενες κορυφές μεταξύ των δύο προϋποθέσεων, (6805 κοινές κορυφές στο C27IM και 1368 σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1Α). Ένα αντίστοιχο επικάλυψη του 5190 και 1630 γονιδίων σε C27IM και LNCaP κύτταρα, αντίστοιχα, βρέθηκε επίσης για eNOS-κορυφές που συνδέονται με το πλησιέστερο γονίδιο όπως σχολιάζονται στη βάση δεδομένων NCBI REFSEQ ενσωματωθούν στο πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) , (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα επικαλυπτόμενα κορυφές (και συνδέονται τα γονίδια) αντιπροσωπεύουν έτσι ένα υποσύνολο eNOS δεσμευμένου περιοχές που δεν αποκρίνονται στη θεραπεία οιστραδιόλη, υποδηλώνοντας eNOS αλληλεπιδράσεις με άλλους πρωτεΐνες από ER.

Στις το άλλο άκρο, η πλειοψηφία των κορυφών είναι ευαίσθητα στο Ε2, οδηγώντας σε επαγωγή του

de-novo

eNOS γονιδίωμα δέσμευσης (50811 κορυφές στο C27IM και 33.083 σε LNCaP) ή αποκόλλησης (4889 κορυφές στο C27IM και 965 σε LNCaP ). από ενδιαφέρον, και στις δύο περιπτώσεις, πολλαπλές κορυφές eNOS MACS που προκαλείται από οιστραδιόλη υπάρχουν

ανά

γονίδιο. Σε E2-κατεργασμένα κύτταρα πιο eNOS γονίδια-στόχοι δεσμεύονται μία ή δύο φορές, περίπου 5% ήταν δεσμευμένο 3 φορές, και περίπου 9% ήταν δεσμευμένο 4 ή περισσότερες φορές (Πίνακας S3). Επιπλέον, Ε2 διέγερση μεταβληθεί η κατανομή των eNOS όπως υποδεικνύεται από σημαντικά αυξημένο μήκος κορυφής μετά την θεραπεία Ε2 προτείνοντας μια DNA-eNOS /ER συγκρότημα σταθεροποίηση μετά από ορμονική θεραπεία (Πίνακας S2 και Σχήμα 1Β).

Κατανομή eNOS-κορυφών σε σχέση με τον πλησιέστερο TSS λαμβάνονται με τη χρήση ανάλυσης πυρήνα πυκνότητα ετικέτα αποκάλυψε ότι

i.

η συχνότητά τους είναι επικεντρωμένη στο TSS και μειώνεται στις δύο πλευρές με μια σαφή ασυμμετρία προς τα ενδογονικοί περιοχές (Σχήμα S3A) και

ii

. θεραπεία Ε2 διεύρυνε την παγκόσμια περιοχή που καλύπτεται από τις κορυφές σε C27IM και, σε μικρότερο βαθμό, σε κύτταρα LNCaP, όπως φαίνεται με τη χρήση ενός παραθύρου 10.000 bp, αν και οι κορυφές έδειξαν σημαντική εμπλουτισμό γύρω TSS εξής Ε2 ερέθισμα (Εικ. S3b).

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η παγκόσμια διανομή κορυφή στη σχολιασμένη περιοχές του γονιδιώματος ήταν παρόμοια και στις δύο πειραματικές συνθήκες (+/- Ε2), με ελαφρά επικράτηση (53-58%) των κορυφών εντοπίζεται σε extragenic περιοχές, και το υπόλοιπο σε διαγονιδιακών περιοχών, ιδίως στο πλαίσιο εσώνια (Σχήμα 1C). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1D, υπήρχε σημαντική επικάλυψη μεταξύ των κορυφών επαχθεί από την Ε2 σε κύτταρα C27IM και LNCaP.

Συσχέτιση μεταξύ αριθμού θέσεων που προσδιορίζονται από MACS και sicer στα δύο κύτταρα C27IM και LNCaP αποκάλυψαν σημαντική συμφωνία (βλέπε Μέθοδοι ), επικυρωμένη περαιτέρω από τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ChIP φαίνεται στο Σχήμα S4. Για παράδειγμα hTERT, ένα γονίδιο στόχος οιστρογόνων, με αρκετές γνωστές Eres [1], [19], [33], [34] εμφανίζει MACS κορυφές και Ε2-αυξημένη νησιά sicer σε αντιστοιχία προς τόπους καλά χαρακτηρίζεται από τσιπ qPCR (Σχήμα S4A )? pS2 (TFF1), ένα κλασικό γονίδιο στόχο οιστρογόνων, παρουσιάζει Ε2-αυξημένη νησιά sicer που προέρχονται κατά τόπους ενισχύεται με τσιπ qPCR (Σχήμα S4B)? GSTP1, ένα γονίδιο σιγήσει από το σύμπλοκο Ετβ-eNOS σε απουσία συνδέτη [5] δείχνει κορυφές MACS σε αντιστοιχία προς θέσεις ενισχύθηκε με τσιπ qPCR, αποκλειστικά στο μη διεγερμένα κατάσταση (Σχήμα S4C).

Επιπλέον, η μήτρα του κατά ζεύγη συσχετισμού που απεικονίζει DNA πληρότητας βάσει της κορυφής βαθμολογίας καλούντα MACS και συντεταγμένες (Σχήμα S5A), καθώς και την ιεραρχική ανάλυση συστάδων της συγγένειας δέσμευσης (θερμικός χάρτης) δείχνει συγγένειες για διαφορικά δεσμεύεται θέσεις υπολογίζονται από την ανάγνωση δεδομένων αρίθμηση και MACS αιχμής συντεταγμένες (Σχήμα S5B) αποκάλυψε ότι θέσεις πρόσδεσης συγκεντρωμένα πρώτα σε απόκριση προς Ε2, και στη συνέχεια, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου. Ένα σύνολο 692 Ε2 vs NT εκπροσωπείται διαφορικά κορυφές (FDR & lt? 0,05). Εντοπίστηκαν, από αυτά τα 287 με μια θετική αλλαγή φορές και το υπόλοιπο με ένα αρνητικό

Τέλος, επικύρωσε την eNOS τσιπ Seq εμπλουτισμός δεδομένα που παρατηρήθηκαν κατά την αγωγή οιστραδιόλης. Η επίδραση Ε2 παρακολουθήθηκε σε κύτταρα C27IM, χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή Ε2-θεραπεία, χρησιμοποιώντας αντι-eNOS αντίσωμα και το chip-qPCR επί οκτώ υποκινητές γονίδιο που ταυτοποιείται ή προέρχονται από ανάλυση του προφίλ microRNA προηγουμένως (Σχήμα 1 Ε και σχήμα 2Α κατωτέρω) [1] . Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του eNOS-κορυφές, όπως προκύπτουν από τα δεδομένα των τσιπ Seq τίθεται κατά την θεραπεία με οιστρογόνα (Σχήμα S4 και

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

), και τα οιστρογόνα που προκαλείται από την πρόσληψη του eNOS πάνω στο ίδιες περιοχές του γονιδιώματος, όπως εκτιμάται από τα παραδοσιακά τσιπ qPCR. Εμπλουτισμοί κανονικοποιήθηκαν προς την απουσία αντισώματος (noAb), ή μια άσχετη αντίσωμα (Ab IgG). Ιδιαιτερότητα του chip-Seq εξασφαλίστηκε με τη χρήση εκκινητών που ενισχύει μια γονιδιωματική περιοχή εντός του χρωμοσώματος 5 έλλειψη eNOS κορυφές και ταυτόχρονα δείχνει την απουσία των προσλήψεων eNOS από την κλασική τσιπ qPCR.

Α) με επίβλεψη ανάλυση σύμπλεγμα των microRNAs προφίλ (Exiqon array) για τις δύο ομάδες ασθενών όπως ορίζονται από υποτροπή κατάσταση (καλό ή κακό πρόγνωση). Β) Επικύρωση με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διαφορικής επιπέδων miRNAs στο G1 (κακή πρόγνωση n = 7) και G2 (καλή πρόγνωση n = 8) ομάδες, * ρ & lt? 0,05 G1 vs G2. Γ) Διαφορική επίπεδο πρωτογενούς μεταγραφών (PRI-miR) σε G1 (n = 7) και G2 (n = 8), * ρ & lt? 0,05 G1 vs G2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Θηκόγραμμα σε μια κλίμακα λογάριθμο.

Η

ανάλυση Cluster των miRNAs μοτίβο στα κύτταρα του προστάτη.

Με στόχο τη διαφοροποίηση θανατηφόρα και μη θανατηφόρα καρκίνο του προστάτη και τελικά τη βελτίωση της