Αφηρημένο

Ιστορικό

Κυκλοφορούν DNA του όγκου (ctDNA) φέρει πληροφορίες σχετικά με το φορτίο του όγκου. Ωστόσο, το φάσμα μετάλλαξη είναι διαφορετική μεταξύ όγκους. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να εξετάσει τη χρησιμότητα της ctDNA για την παρακολούθηση φορτίο όγκου βασίζεται σε ένα ατομικό προφίλ μετάλλαξης.

Μεθοδολογία

Το DNA που εξάγεται από ένα σύνολο 176 δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένης της πριν και μετά επιχειρησιακή πλάσματος, πρωτογενών όγκων, και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), από 44 άτομα με ορθοκολικό όγκο που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή των όγκων παχέος εντέρου, καθώς και εννέα υγιή άτομα. Χρησιμοποιώντας ένα πάνελ 50 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια, από όγκο μοναδικό μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση των παραλλαγών μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNVs) από όγκους και PBMCs με ένα sequencer Ion PGM. Μία ομάδα από τους όγκους μοναδικές μεταλλάξεις από άτομο όγκοι χαρακτηρίζονται ως μεμονωμένες μεταλλάξεις σημειωτή (MMS) για την ανίχνευση του φορτίου του όγκου με ctDNA χρησιμοποιώντας σταγονιδίων ψηφιακό PCR (ddPCR). Από αυτά τα πειράματα, αξιολογήθηκαν τρεις μεγάλους στόχους: (α) Tumor-μοναδικές μεταλλάξεις? (Β) φάσμα μετάλλαξη ενός όγκου? και (γ) μεταβολές στη συχνότητα αλληλόμορφου του MMS σε ctDNA μετά από θεραπευτική εκτομή του όγκου.

Αποτελέσματα

Ένα σύνολο 128 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου εντοπίστηκαν σε 27 παχέος όγκους. Είκοσι-έξι γονίδια μεταλλάχθηκαν σε τουλάχιστον 1 δείγμα, ενώ 14 γονίδια βρέθηκαν να μεταλλαχθεί σε μόνο 1 δείγμα, αντίστοιχα. Ένας μέσος όρος 2,7 γονιδίων μεταλλάχθηκαν ανά όγκο. Στη συνέχεια, επελέγησαν 24 MMS από SNVs για την παρακολούθηση φορτίο όγκου. Μεταξύ των MMs βρεθεί από ddPCR με & gt? 0.1% συχνότητα παραλλαγή αλληλόμορφου στο DNA του πλάσματος, το 100% (8 από 8) επέδειξε μία μείωση στην μετεγχειρητική ctDNA, ενώ κανένα από τα 16 MMs βρέθηκαν από ddPCR με & lt? 0,1% συχνότητα παραλλαγή αλληλόμορφου στο DNA του πλάσματος παρουσίασαν μείωση.

Συμπεράσματα

Αυτή η ομάδα των 50 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια φάνηκε να είναι επαρκής για να προσδιορίσει μεμονωμένα, με όγκο μοναδική, μεταλλαγμένα δείκτες ctDNA στον καρκίνο ασθενείς. Το MMS έδειξε την κλινική χρησιμότητα στην παρακολούθηση θεραπευτικά επεξεργασμένο βάρος του παχέος όγκου, εάν η συχνότητα αλληλόμορφο της MMS στο DNA στο πλάσμα είναι πάνω από 0,1%

Παράθεση:. Sato KA, Ηαοΐιϊγα Τ, Iwaya Τ, Kume Κ, Τ Ματσούο , Kawasaki Κ, et al. (2016) Ανίχνευση Εξατομικευμένη μετάλλαξη στα κυκλοφορούντα καρκινικά DNA για την παρακολούθηση του παχέος όγκου Βάρος Χρησιμοποιώντας μια σχετίζονται με τον καρκίνο Γονίδιο αλληλουχίας Panel. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10.1371 /journal.pone.0146275

Επιμέλεια: Alvaro Galli, CNR, Ιταλία

Ελήφθη: 11 Ιουνίου 2015? Αποδεκτές: 15 Δεκέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 4, Γενάρη 2016

Copyright: © 2016 Sato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Keiryoukai Ίδρυμα Ερευνών No.125 της Iwate Ιατρικό Πανεπιστήμιο [KAS]? και του Υπουργείου Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία για MIAST (Ιατρική Εταιρεία της Καινοτομίας από την προηγμένη επιστήμη και τεχνολογία) του έργου της επιχορήγησης-in-Aid Στρατηγικών Ίδρυμα Ερευνών σε Ιδιωτικά Πανεπιστήμια [S1001001 να SSN]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ποσοτική αξιολόγηση των κυκλοφορούντων DNA όγκου (ctDNA) έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμη για την παρακολούθηση φορτίο του όγκου σε απόκριση προς θεραπεία [1, 2]. Ωστόσο, μεταλλαγμένα γονίδια σε πολλούς τύπους καρκίνων αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό ποσοστό του συνόλου αριθμό γονιδίων παρόν, υποδεικνύοντας ότι μόνο ένας περιορισμένος αριθμός γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [3, 4]. Ως εκ τούτου, ένα σύνολο εκλεκτικών γονιδίων που είναι γνωστό ότι σχετίζεται με τον καρκίνο είναι θεμελιωδώς απαιτούνται για την παρακολούθηση του φορτίου του όγκου. Στην πραγματικότητα, η παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με ctDNA έχει πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας μια σειρά από καλά μελετημένη γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των

KRAS

,

BRAF

,

HER2

, και άλλοι [5 -9]. Από την άλλη πλευρά, οι πληροφορίες σχετικά με το βάρος της παρακολούθησης του όγκου μετά από χειρουργική επέμβαση είναι περιορισμένη, διότι παραμένει άγνωστο ποια όγκο μοναδικό μεταλλαγμένα γονίδια θα πρέπει να παρακολουθούνται για κάθε ασθενή [10]. Στην πραγματικότητα, τα δεδομένα έχουν υπονοείται ότι ένας περιορισμένος αριθμός μεταλλάξεων όγκο μοναδική μπορεί επαρκώς αντιπροσωπεύουν τον όγκο και τα χαρακτηριστικά (π.χ., αντοχή φαρμάκου) των επιμέρους όγκων [11]. Εάν ένας μικρός αριθμός μεταλλάξεων όγκο μοναδικό ταυτοποιούνται από πρωτογενείς όγκους, τότε θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση των μεταλλάξεων στο ctDNA. Αυτό αντιπροσωπεύει μια συμφέρουσα και αποδοτική προσέγγιση για την παρακολούθηση του φορτίου του όγκου μετά από χειρουργική επέμβαση.

Η ιδέα της χρησιμοποίησης ctDNA από ασθενείς με καρκίνο για την παρακολούθηση φορτίου όγκου μας οδήγησε να σχεδιάσει την τρέχουσα μελέτη επικεντρώθηκε σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο που είχαν λάβει θεραπευτική αφαίρεση του όγκου. Η στρατηγική μας ήταν να συλλέξει μεμονωμένα δείγματα ορθοκολικού όγκου μέσω ενδοσκοπική ή λαπαροσκοπική ορθοκολικού όγκου θεραπευτική εκτομή καθώς και δείγματα αίματος. Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες με τη χρήση εξαιρετικά προηγμένων όγκων, συμπεριλαμβανομένων των περιπτώσεων με ατελή εκτομή [1, 2, 7], τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι οι μεμονωμένες μεταλλάξεις δείκτη (MMS) σε ctDNA μπορεί να είναι χρήσιμη για την παρακολούθηση της μετεγχειρητικής, χειρουργήσιμη παχέος φορτίο όγκου για το βάσει της μειωμένης συχνότητας αλληλόμορφου του ctDNA στη μετεγχειρητική πλάσμα.

ασθενείς και Μέθοδοι

Ανθρώπινα δείγματα και ο σχεδιασμός της μελέτης

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Iwate Ιατρικό Πανεπιστήμιο, σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι (HG H24-22). Ένα άτομο γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες και όλες οι αναλύσεις έγιναν ανώνυμα. Κατ ‘αρχήν, οι ασθενείς ήταν επιλέξιμοι αν χειρουργική ή ενδοσκοπική εκτομή τους υποδείχθηκε για την καλοήθη ή Στάδιο 0 έως ΙΙΙ όγκους του παχέος εντέρου, και δεν είχαν προηγούμενο ιστορικό οποιασδήποτε θεραπείας κατά το χρόνο της εν επιγνώσει συναίνεση. Όλα αναλυθούν περιπτώσεις που απαιτείται να παρέχει τις ακόλουθες τέσσερις τύπους υλικών: πριν και μετά την επιχειρησιακή πλάσματος (τουλάχιστον 24 ώρες μετά την εκτομή του όγκου), πρωτοπαθή όγκο, και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs). Ελήφθησαν δείγματα αίματος για συνήθεις πριν και εργαστηριακές εξετάσεις μετεγχειρητική. Είτε οκτώ ή 16 ml αίματος συλλέχθηκαν σε ένα σωλήνα συλλογής αίματος BD Vacutainer CPT (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ). Μέσα σε δύο ώρες μετά τη συλλογή, οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν στα 1800

g

για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να διαχωρισθεί σε πλάσμα και στρώματα PBMC. Η ανώτερη φάση του οκτώ ml αίματος στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα σωληνάριο πέντε ml επισημασμένου με τον αριθμό αναγνώρισης ασθενή μοναδική. Οι σωλήνες αποθηκεύονται αμέσως στους -80 ° C μέχρι την απομόνωση του DNA. Ολικό γενωμικό DNA εκχυλίσθηκε χρησιμοποιώντας το QIAamp δανείζεται Nucleic Acid Kit για το πλάσμα και το QIAamp DNA Mini Kit για πρωτογενείς όγκους και PBMCs (Qiagen, Venlo, Ολλανδία). Η ποσότητα του εκχυλισμένου DNA μετρήθηκε με τη χρήση του dsDNA δοκιμασία υψηλής ευαισθησίας Qubit® 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Στην παρούσα μελέτη, προκαταρκτικό πείραμα μας επιβεβαίωσαν ότι αφήνοντας 5-7mm του στρώματος «buffering» από το φλεγμονώδη πλακούντα μετά η φυγόκεντρος αποτρέπει επαρκώς το στρώμα πλάσματος από μόλυνση του αίματος και των κυτταρικών υπολειμμάτων, και οι αποδόσεις αποδεκτή ποιότητα του DNA [12, 13]. Σχετική αριθμός αντιγράφων του γονιδιώματος στο DNA πλάσμα επίσης εκτιμήθηκε με ποσοτική-PCR (qPCR) για το γονίδιο LINE-1 χρησιμοποιώντας τα σύνολα εκκινητών που περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Εξαγωγή DNA από ανθρώπινου κόλον κυτταρική γραμμή καρκίνου

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, HCT116, αποκτήθηκε το 2008 από τη διαίρεση των καρκινικών θεραπεία και τη διάγνωση των όγκων Repository, Εθνικό Ίδρυμα καρκίνου (NCI MTA # 1-2093-08). Η κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και το γονιδιωματικό DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Venlo, Ολλανδία) εντός τριών διόδων μετά την απόψυξη.

Multiplex PCR και βιβλιοθήκης κατασκευής χρησιμοποιώντας CHPv2

Το CHPv2 είναι μια ομάδα εκκινητών PCR που στοχεύουν 207 αμπλικόνια για 2885 μεταλλάξεις στο 50 που σχετίζεται με καρκίνο γονίδια [15] (Life Technologies, Carlsbad, CA). Ολόκληρη η λίστα των γονιδίων είναι διαθέσιμα μέσω της ιστοσελίδας του προμηθευτή (https://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Περίπου 10 ng του DNA ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή αμπλικονίου με πολλαπλή PCR χρησιμοποιώντας το ιόν AmpliSeq CHPv2 και Ion AmpliSeq Βιβλιοθήκη Kit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Το προκύπτον πολλαπλή πισίνα αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή της βιβλιοθήκης αλληλουχία στόχο. Αλληλουχίες εκκινητή για την πολλαπλή PCR υπέστη μερική πέψη για απολίνωση προσαρμογείς barcode (Ίων P1 ρεύματος και Ion XpressTM Bacode Χ, Life Technologies, Carlsbad, CA) ακολουθούμενη από ένα σύστημα καθαρισμού νουκλεϊκών οξέων με βάση σφαιρίδια (αντιδραστήριο AMPure® XP, Life Technologies, Carlsbad , CA). Μετά την επιβεβαίωση ότι το τελικό μέγεθος θραύσμα βιβλιοθήκη κορυφώθηκε στους 130 bp, τα θραύσματα βιβλιοθήκης κλωνικά ενισχυμένο με γαλάκτωμα PCR (Ion PGM Template OT2, Life Technologies, Carlsbad, CA). Τα σωματίδια που περιέχουν γαλάκτωμα κλωνικά ενισχυμένο PCR θραύσματα στη συνέχεια εφαρμόζεται πάνω σε ένα τσιπ ημιαγωγού αλληλούχισης (Ίων 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) για μαζική παράλληλη ανάλυση αλληλουχίας σε αλληλουχητή Ion PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA).

στόχος βαθιά αλληλουχίας

Τα δεδομένα αλληλουχίας σώθηκαν σε μορφή BAM για τους μεταγενέστερους ανάλυση. Η ευθυγράμμιση αλληλουχίας αξιολογήθηκε με Torrent Σουίτα V.3.6.2 Λογισμικού (Life Technologies, Carlsbad, CA) για να αναλύσει γραμμικό κώδικα διαβάζει και να ευθυγραμμίσει το διαβάζει στο γονιδίωμα αναφοράς (ανθρώπινου γονιδιώματος build19? Hg19). Για την ανίχνευση των μεταβολών στην αλληλουχία-στόχο, ο βαθμός κάλυψης της κάθε αμπλικόνιο ορίστηκε να αποκτήσει τουλάχιστον το μέσο βάθος των 1400 x για πρωτοπαθείς όγκους και 700 x για το DNA στο πλάσμα, όπου ορίστηκε η v3.6 Ion Torrent Παραλλαγή καλούντος σε μία συχνότητα αλληλόμορφου άνω του 0,1% για μια παραλλαγή. Μια ενοποιητική Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) χρησιμοποιήθηκε επίσης για να απεικονίσει την ευθυγράμμιση, η οποία επέτρεψε για μας να επιθεωρήσει ψευδώς ορίζεται παραλλαγές από προκατάληψη σκέλος και τα λάθη αλληλουχίας.

ταυτοποίηση και τον εντοπισμό των γονιδίων για τους δυνητικούς MMs

MMS από τις πρωτογενείς όγκους ορίστηκαν να δοθεί προτεραιότητα παραλλαγές μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNVs) που ήταν πιθανό να ανιχνεύεται στα ctDNA. Η στοχευμένη αλληλούχιση από τον Πίνακα καρκίνου που έχουν αναγνωριστεί SNVs όγκους μοναδικό (δηλαδή, σωματικές μεταλλάξεις), συγκρίνοντας τα αποτελέσματα αλληλούχισης του πρωτογενούς όγκου και των αντίστοιχων PBMCs (δηλαδή, βλαστικής σειράς πολυμορφισμοί). Εν συντομία, ο αλγόριθμος για την ταυτοποίηση των μεταλλάξεων όγκο μοναδικό είναι ως εξής: (α) Φίλτρο σύντομο διαβάζει (& lt? 50 nt) χρησιμοποιώντας το αρχείο fastaq για το DNA από τον όγκο, PBMCs, και πλάσματος? (Β) Χάρτης φιλτράρεται θραύσματα σε hg19 χρησιμοποιώντας Burrows-Wheeler Aligner για το DNA από τον όγκο, PBMCs, και το πλάσμα? (Γ) Εντοπισμός SNVs χρησιμοποιώντας GATK Unified Genotyper για το DNA από τον όγκο ή PBMCs? (Δ) κατάλογος όγκο μοναδική SNVs με σύγκριση SNVs από τον όγκο και PBMCs? και (ε) Προσδιορισμός μεταλλάξεων όγκο μοναδική από τις SNVs όγκο μοναδικό που χαρτογραφήθηκαν στην αλληλουχία στόχο από CHPv2. Η όλη διαδικασία της εκτέλεσης αλγορίθμου διαρκεί έξι ώρες, χρησιμοποιώντας ένα συνηθισμένο επιτραπέζιο υπολογιστή (Intel Core 2 Duo επεξεργαστές με 3 GB μνήμη τυχαίας πρόσβασης) την για 1,5 GB δεδομένων αλληλουχίας. Τα προκύπτοντα όγκο μοναδικό μεταλλάξεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες ctDNA. Μας αλγόριθμο in-house προσδιορίζει πρωτοπαθούς όγκου SNV θραύσματα που είναι διαφορικά ανιχνεύονται από PBMC DNA. Επιτρέπει την επιλογή των θραυσμάτων με υψηλή συχνότητα αλληλόμορφο, η οποία κατέχει μια υψηλή πιθανότητα ανίχνευσης σε ctDNA [11]. Από τα προκύπτοντα όγκο μοναδικό μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε συχνότητες παραλλαγή SNVs, MMS για κάθε όγκου προτεραιότητα με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: (α) κάλυψη περισσότερο από 10 παραλλαγή? (Β) περισσότερο από 5 παραλλαγή κάλυψης εάν δεν μεταλλάξεις είχαν περισσότερα από 10 παραλλαγή κάλυψη? και (γ) τη διαθεσιμότητα των επικυρωμένων QX200

TM σταγονιδίων Ψηφιακή

TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ακολουθίες εκκινητή και ανιχνευτή (S1 πίνακα). Η συχνότητα αλληλόμορφου του MMS στο πλάσμα παρακολουθήθηκε με ddPCR χρησιμοποιώντας τα συγκεκριμένα σύνολα εκκινητών και ανιχνευτών.

ddPCR

Κάθε μίγμα παρασκευάστηκε με 20 μι ρυθμιστικού αντίδρασης, 2 χ ddPCP SuperMix για Probes (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), και 10 ng εκμαγείου DNA. Τα μίγματα αντίδρασης PCR διαχωρίστηκαν σε ομοιόμορφα μεγέθους σταγονίδια γαλακτώματος. Τα σταγονίδια κατανεμήθηκαν σε 96-φρεατίων για χρήση με ένα συμβατικό θερμικό κυκλοποιητή. Μια πρότυπη αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκε ως εξής: 40 κύκλοι των 94 ° C για 30 s και 55 ° C για 60 s? και μία τελική επέκταση στους 98 ° C για 10 λεπτά, εκ των οποίων η θερμοκρασία ανόπτησης ήταν να αλλάξουν ανάλογα με τους εκκινητές. Το προϊόν αποθηκεύθηκε στους 4 ° C. Το PCR προϊόν στη συνέχεια τοποθετήθηκε στον αναγνώστη σταγονίδιο QX200 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Στατιστική ανάλυση

είτε JMP 10.0 (SAS Institute, Cary, NC) ή Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Κλινικοπαθολογοανατομικών και αλληλούχιση τιμές και συχνότητες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το χ

2 τεστ, το ακριβές τεστ του Fisher, και ο μαθητής

t-test

, ανάλογα με τις θεματικές ομάδες.

Αποτελέσματα

ασθενείς

Μεταξύ Μαΐου 2013 και Αυγούστου 2014 37 ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου και 22 ενδοσκοπικά χειρουργικά εξαιρέσιμων όγκων παχέος εντέρου είχαν δώσει τη συγκατάθεσή του για τη μελέτη πριν από την τελική ιστοπαθολογική διάγνωση. Η εγγραφή των ασθενών /υγιών ατόμων και την επισκόπηση της μελέτης παρουσιάζονται (Σχήμα 1). Στην ομάδα χειρουργείο, έξι ασθενείς ήταν μη επιλέξιμα: πέντε ασθενείς βρέθηκαν να έχουν νόσο Σταδίου IV κατά την διάρκεια χειρουργικής επέμβασης και ένας ασθενής είχε πολλαπλές βλάβες πρωτογενή καρκίνο. Μεταξύ των επιλέξιμων ασθενών, η διαδικασία απόκτησης δείγμα απέτυχε σε τρεις περιπτώσεις. Ως εκ τούτου, 28 σύνολα πλήρες δείγμα ελήφθησαν από τις 31 επιλέξιμες ασθενείς. Στην ομάδα ενδοσκόπηση, ένας ασθενής αρνήθηκε να συμμετάσχει στη μελέτη, και ένας ασθενής είχε νεφρική ανεπάρκεια μετά την εισαγωγή. Μεταξύ των επιλέξιμων ασθενών, τέσσερις ασθενείς είχαν όγκους που ήταν πάρα πολύ μικρό για τη δειγματοληψία. Ως εκ τούτου, 16 σύνολα πλήρες δείγμα ελήφθησαν από 20 επιλέξιμων ασθενών. Αίμα από 10 υγιή άτομα (δηλαδή, ασθενείς ηλικίας μεταξύ 22 και 68 χρόνια? Τρεις γυναίκες και επτά άνδρες) ήταν επίσης συλλέγεται χρησιμοποιώντας την ίδια γραπτή συγκατάθεση. Ένας εθελοντής βρέθηκε να είναι έγκυος μετά τη λήψη ενός δείγματος αίματος και ως εκ τούτου αποκλείεται. Συνολικά, τουλάχιστον ένα τύπο του δείγματος λήφθηκαν από 60 άτομα και ένα σύνολο 176 δειγμάτων του συνόλου των τεσσάρων υλικών από 44 ασθενείς ελήφθησαν (Σχήμα 1). Κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών (Πίνακας 1) και τα επίπεδα καρκινικού δείκτη (καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο? CEA) συνοψίζονται (S1 Εικ). Στην ομάδα χειρουργείο, 30 από 31 (96,8%) που μπορούν οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον ένα έτος. Τέσσερα από τα 30 (13,3%) ασθενείς υποτροπίασαν και όχι οι ασθενείς έχασαν τη ζωή τους κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης (διάμεσος: 14,3 μήνες). Κανένας από τους ασθενείς στην ομάδα ενδοσκόπηση δεν είχε ακόμα επισκεφτεί το νοσοκομείο μας μετά την εκτομή του όγκου από το Φεβρουάριο του 2015.

Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν προοπτικά. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από τις ακόλουθες τρεις ομάδες? Χειρουργική επέμβαση, Ενδοσκόπησης, και σε υγιείς εθελοντές. Χειρουργική επέμβαση και Ενδοσκόπηση ομάδες περιέχουν Προ (προεγχειρητική πλάσμα), PBMCs, Tumor, και Ταχυδρομείων (πλάσμα μετεγχειρητική) δείγματα. Δείγματα από ασθενείς που εμφανίζουν τη νόσο σταδίου IV, ανεπαρκές μέγεθος του δείγματος, ή ανεπαρκής ποσότητα DNA που εξάγεται αποκλείστηκαν από τη μελέτη (αναλυτικές πληροφορίες στο κείμενο). Το χρώμα του κάθε κουτιού δείχνει ποιες διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση κάθε τύπο του δείγματος.

Η

Αξιολόγηση της ποιότητας του εξορυσσόμενου DNA

Η διάμεση (εύρος) η συνολική ποσότητα DNA από πρωτογενών όγκων, DNA στο πλάσμα, και PBMCs ήταν 9,4 μg (1,4 έως 12,0), 58,1 ng (15,4 έως 915), και 4,7 μg (03/02 έως 10/03), αντίστοιχα. Η απόδοση του DNA στο πλάσμα ήταν αρκετή για να εκτελέσει κατάντη δοκιμασίες, συμπεριλαμβανομένης της κατασκευής της βιβλιοθήκης σειρά και ddPCR. Η ποσότητα του DNA στο πλάσμα (εύρος? 83-5,435 ng /ml ανά πλάσματος) παρουσίασαν πολύ υψηλή θετική συσχέτιση (r = 0,9651, ρ & lt? 0,0001) με τον αριθμό αντιγράφων του

LINE-1

(εύρος? 3,050,985 -232 689 225 αντίγραφα /ml ανά πλάσματος) (S2 σχήμα). Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 22,9 ng του DNA κατά μέσο όρο μπορεί να ληφθεί από 1 ml πλάσματος.

Ποιοτική αξιολόγηση του Ion PGM sequencer

Πριν από το υλικό του ασθενούς αλληλουχίας, την ποιότητα αλληλουχίας του Ion PGM εξασφαλίστηκε με τη χρησιμοποίηση αραιώνονται σειριακά γενωμικού DNA από την ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 εμπλουτίστηκε μέσα στο διάλυμα του γενωμικού DNA από PBMCs ενός υγιούς εθελοντή (Σχήμα 2). Επιβεβαιώσαμε πρώτα ότι τα κύτταρα HCT116 φέρει το 10 μεταλλάξεις γονιδίων από τα 50 γονίδια CHPv2 (S2 πίνακας), ενώ το υγιές ανθρώπινο εθελοντή DNA δεν είχε σημαντικές μεταλλάξεις. Με βάση τις δημόσια διαθέσιμες πληροφορίες, έχουν 1177 μεταλλάξεις στο HCT116 έχουν αναφερθεί (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/HCT-116/mutations/#). Μεταξύ των 10 μεταλλαγμένα γονίδια που βρέθηκαν στην παρούσα μελέτη, 4 έχουν καταχωρηθεί στην κοσμική βάση δεδομένων των HCT116, ενώ το υπόλοιπο 6 ήταν μυθιστόρημα. Αξίζει να σημειωθεί, δεν είναι γνωστό μεταλλάξεις έχασε στα 50 γονίδια που καλύπτεται από τα σύνολα εκκινητών στο CHPv2. Για την αντιμετώπιση της ευαισθησίας, γονιδιωματικό DNA που ελήφθη από έναν υγιή εθελοντή εμπλουτίστηκε με γονιδιωματικό DNA από την κυτταρική γραμμή καρκίνου κόλου HCT116 σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις (100, 1, 0.1, 0.01, και 0.001% σε ν /ν) (Σχήμα 2). Η μέση κάλυψη αλληλουχία όλων των αμπλικονίων για τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις ήταν 1287,7 (100%), 1456,7 (1%), 1412,5 (0,1%), 1708,2 (0,01%), και 1464,3 (0,001%), αντίστοιχα. Επιπλέον, συντελεστές μεταβλητότητας (CV) της παραλλαγής της συχνότητας των μεταλλαγμένων θραυσμάτων ήταν 33,4% (100%), 49,9% (1,0%), 125,6% (0,1%), 84,7% (0,01%), και 115,6% (0,001 %), αντίστοιχα. Συνολικά, η εύλογη γραμμική περιοχή μεταξύ των σετ συγκεντρώσεις και ανιχνεύεται συχνότητα αλληλόμορφου με την sequencer Ion PGM φάνηκε να είναι μεταξύ 0,1 έως 100%. Ως εκ τούτου, η ευαισθησία της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας για τις συχνότητες παραλλαγή χρησιμοποιώντας τον Ion PGM είναι μεγαλύτερη από 0,1% με επαρκή αλληλουχία διαβάζει.

Ο οριζόντιος άξονας δείχνει τη συγκέντρωση του εμβολιασμένου DNA από την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 στην διάλυμα του DNA από ένα υγιή δότη μη καρκίνου. HCT116 είναι γνωστό ότι έχουν πολλές μεταλλάξεις γονιδίων και έτσι η συγκέντρωση του θραύσματος μετάλλαξης αραιώθηκε σειριακά. Ο κάθετος άξονας είναι η συχνότητα αλληλόμορφο που είναι στην πραγματικότητα ανιχνεύεται με το ιόν PGM. Κάθε σημείο χρώμα υποδεικνύει τη ανιχνεύεται συχνότητα αλληλόμορφου του καρκίνου που σχετίζεται με μεταλλάξεις στο αντίστοιχο συγκέντρωση DNA που προέρχεται από HCT116 που κυμαίνεται από 0,001 έως 100%. Τα ονόματα των μεταλλαγμένων γονιδίων που αναφέρονται στη λεζάντα στα δεξιά.

Η

μεταλλάξεων φάσμα των όγκων παχέος εντέρου που προσδιορίζονται από CHPv2

Ένα σύνολο 15.354.178 διαβάζει και ελήφθησαν 1636525575 δεδομένα αλληλουχίας βάσεων από 27 πρωτογενείς όγκους και τις αντίστοιχες PBMCs χρησιμοποιώντας ένα sequencer Ion PGM. Τα μεταλλαγμένα γονίδια όγκο μοναδική στη συνέχεια προσδιορίζονται με τη χρήση in-house αναπτύχθηκε ο αλγόριθμος μας (βλέπε ασθενείς και μέθοδοι). Πρώτα θέτουμε τη συχνότητα παραλλαγή αλληλόμορφου & gt? 0,1% και διαπιστώθηκε ότι 440 από 885 γονιδίου αλλοιώσεις ήταν όγκο μοναδικές μεταλλάξεις με βάση τη σύγκριση μεταξύ PBMCs και πρωτογενείς όγκους. Αποτελέσματα αλληλουχίας των πρωτογενών όγκων που λαμβάνεται από την IonPGM επιβεβαιώθηκαν με ddPCR για τα δείγματα που θα μπορούσαν να αξιολογηθούν (S3 Εικ). Για μια αυστηρή ανάλυση, παραλλαγή κάλυψη είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες για την αξιοπιστία των δεδομένων (S4 σχήμα). Ως εκ τούτου, η ανάλυση διεξήχθη με γονίδια των οποίων η κάλυψη παραλλαγή ήταν & gt? 10, με αποτέλεσμα ένα σύνολο 128 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου (Σχήμα 3Α). Επειδή ορισμένες περιπτώσεις διέθετε πολλαπλές μεταβολές σε ένα ενιαίο γονίδιο, ο συνολικός αριθμός των γονιδίων μεταβάλλεται σε αυτή τη μελέτη για την ανάλυση ήταν 73. Ως εκ τούτου, η μέση μετάλλαξη ανά όγκου ήταν 2,7 από τα 50 γονίδια (μέση ± 2 τυπικές αποκλίσεις: 2,7 ± 2,9) . Είκοσι-έξι γονίδια μεταλλάχθηκαν σε τουλάχιστον 1 δείγμα (26/50, 52%), ενώ 14 γονίδια (14/50, 28%) μεταλλάχθηκαν σε μόνο 1 δείγμα, αντίστοιχα. Συχνά μεταλλαγμένα γονίδια που περιλαμβάνονται

TP53

(19/27, 70%),

KRAS

(10/27, 37%), και

APC

(6/27, 22 %). Τρία δείγματα καρκίνος περιλαμβάνονται όλες από αυτές τις μεταλλάξεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μεταβολές του γενετικού συσσώρευση τυπική για μια αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα μπορεί να έχει συμβεί σε αυτά τα δείγματα [16, 17] (Εικόνα 3Β). Αυτές οι παρατηρήσεις φαίνεται να υποστηρίζει προηγούμενες εκθέσεις από αλληλούχιση exome ορθοκολικών όγκων σε όρους σύλληψη μεταλλάξεων χαρακτηριστικών των όγκων παχέος εντέρου [18], υποδηλώνοντας ότι η 50 καρκινο-συναφές γονίδιο που λογικά ανακεφαλαιώνει τη μεταλλακτική φάσμα των όγκων. Ο ρυθμός μετάλλαξης με βάση το multiplex μήκος PCR που λαμβάνονται από CHPv2 και ο αριθμός των μεταλλάξεων με κάλυψη & gt? 10 (73 μεταλλαγμένα γονίδια) ήταν περίπου 2246 ανά 10

6 νουκλεοτίδια (δηλαδή, 207 ζεύγη εκκινητών του μέσου όρου της PCR μήκους προϊόν 157bp) , γεγονός που υποδηλώνει ότι η CHPv2 εμπλουτίστηκε σε σύγκριση με το ποσοστό ανίχνευσης μετάλλαξης από ένα exome-αλληλουχία, στο οποίο η πλειοψηφία των όγκων παχέος εντέρου έδειξε 1-100 μεταλλάξεις ανά 10

6 νουκλεοτίδια [18].

α, τύπους μετάλλαξης. Έξι τύποι μεταλλάξεων ανιχνεύτηκαν με CHPv2. b, το προφίλ μετάλλαξη Tumor-μοναδική σύμφωνα με τη συχνότητα αλληλόμορφο. Κάθε στήλη υποδηλώνει ένα όγκο μοναδική μετάλλαξη ενός ατόμου όγκου. Κάθε γραμμή δηλώνει σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια σε CHPv2. Το χρώμα υποδηλώνει τη συχνότητα παραλλαγή αλληλόμορφου αναφέρεται στο μπαρ χρώμα.

Η

Ανίχνευση MMS στο DNA στο πλάσμα

Τα επίπεδα του DNA στο πλάσμα διάμεση (εύρος) των υγιών ατόμων, ενδοσκοπικά χειρουργικά εξαιρέσιμων όγκων , και προχωρημένοι καρκίνοι ήταν 4.2 (2.6 – 10.4), 6,8 (2,1 έως 100,6), και 9,2 (3,8 έως 228,8) ng /ml στο πλάσμα, αντίστοιχα (Εικ S5). Για την ανίχνευση μετάλλαξης στο DNA του πλάσματος, επιλέχθηκαν 66 MMS από τα 320 όγκους μοναδική SNVs σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφονται στο Ασθενείς και Μέθοδοι. Οι ακόλουθες μεταλλάξεις, οι οποίες έχουν αναφερθεί σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου, εμφανίστηκε περισσότερο από μία φορά σε πολλαπλούς όγκους:

KRAS

(G12C) x2?

KRAS

(G12D) x4?

KRAS

(G12V) x3?

TP53

(R273C) x2? και

BRAF

(V600E) x3, με αποτέλεσμα συνολικά 57 μοναδικά μηνύματα MMS (S3 Πίνακας). MMs πρώτα διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την Ion PGM, στις περιπτώσεις 1, 2, και 3, αλλά κανένα από τα οκτώ MMs στο DNA του πλάσματος έδειξε μια αρκετά υψηλή παραλλαγή κάλυψης (Σχ 4Α και S4 Πίνακα). Παρά το γεγονός ότι ορισμένα γονίδια αποδειχθεί μειωμένη συχνότητα αλληλόμορφου σε έναν όγκο βάρους-εξαρτώμενο τρόπο, η έκταση της κάλυψης δεν ήταν αξιόπιστα αρκετά υψηλή στις παρούσες υποθέσεις (S6a σχήμα).

α, MMS παρακολουθείται με τη συχνότητα αλληλόμορφου μετάλλαξης χρησιμοποιώντας ένα ion PGM. Τρία, ένα και τρία MMs χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση περιπτώσεις 1, 2, και 3, αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα επίπεδα του CEA στον ορό δείχνονται. β, MMS παρακολουθούνται με τη συχνότητα αλληλόμορφου μετάλλαξης με ddPCR. Ένα ή δύο MMs χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση των εκπροσωπούνται περιπτώσεις. Η οριζόντια διακεκομμένη γραμμή δείχνει το ανώτερο όριο του φυσιολογικού εύρους των επιπέδων στον ορό CEA (3,4 ng /ml). Κάθε αριθμός δίπλα σε κάθε σημείο δεδομένων είναι η συχνότητα αλληλόμορφου για τα γονίδια? και τις αξίες ορό για CEA.

aStop κωδικόνιο,

bSplice ιστοσελίδα.

Η

Δεδομένου ότι ο Ion PGM δεν φαίνεται να είναι αρκετά ευαίσθητη για την ανίχνευση σπάνιων αλληλομόρφων, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε ddPCR για τον εντοπισμό MMS στο πριν και μετά -operative DNA στο πλάσμα. Αν και ψηφιακό PCR απαιτεί ένα συγκεκριμένο εκκινητών /ανιχνευτών που καθορίζονται για κάθε μετάλλαξη που ακολουθείται από την επικύρωση της ποιότητας με qPCR [10], η ψηφιακή PCR είναι τουλάχιστον 3 φορές πιο ευαίσθητη από εκείνη της βαθιάς sequencers [19]. Στην παρούσα μελέτη, μπορέσαμε να επικυρώσει 19 μοναδικά σύνολα εκκινητών /ανιχνευτών με qPCR για χρήση στην ποσοτικοποίηση μεταλλάξεις στο πλάσμα με ddPCR (S1 πίνακα). Δεδομένου ότι σε ορισμένες περιπτώσεις είχαν πολλαπλές MMS, το 19 επικυρωμένη ddPCR αστάρι /σύνολα ανιχνευτών αντιπροσώπευαν συνολικά 24 MMs για 19 περιπτώσεις (S5 Πίνακας). Έντεκα μεταλλάξεις (σε 9 ασθενείς) που ταιριάζουν πρωτοπαθείς όγκους ήταν εμφανώς παρόντες (ελάχιστη συχνότητα αλληλόμορφου 0,032%) σε προ-λειτουργική πλάσματος (Σχήμα 4Β, S5 πίνακα, και S6B σχήμα). Στη μετεγχειρητική DNA στο πλάσμα, 8 των 24 (33,3%) MMs έδειξε μια φθίνουσα τάση που αντιστοιχούσε σε 6 από 19 ασθενείς (31,6%), συμπεριλαμβανομένων δύο ασθενείς με πολλαπλά μηνύματα MMS (Σχήμα 4Β και S6B σχήμα). Είναι σημαντικό, 100% (8 από 8) της MMS με & gt? 0.1% συχνότητα αλληλόμορφου στο DNA προ-λειτουργική πλάσμα παρουσίασαν μείωση στα δείγματα μετά τη λειτουργία (Εικόνα 4Β), ενώ κανένα από τα 16 MMS με λιγότερο από 0,1% συχνότητα αλληλόμορφου στο DNA προ-λειτουργική πλάσμα παρουσίασαν μείωση στην μετεγχειρητική πλάσμα DNA (Σχήμα 4Β και S6B σχήμα). Η μειωμένη τάση που λαμβάνεται με MMS με & gt? 0,1% συχνότητα αλληλόμορφου συσχετίζονται καλά με τα επίπεδα του CEA στον ορό. Υπήρξαν 2 ασθενείς που παρουσίασαν υποτροπή εντός της περιόδου παρατήρησης ένα έτος (Περίπτωση 5 και 6). Και στις δύο περιπτώσεις παρουσίασαν σαφή μείωση των MMS στο μετεγχειρητική ctDNA (Σχήμα 4Β), αλλά δεν υπάρχει αξιόλογη μεταλλάξεων προφίλ εντοπίστηκε στις δύο περιπτώσεις.

Συζήτηση

Το σύνολο των μεταλλάξεων του γονιδίου σε έναν όγκο είναι πολύ διαφορετικές. Ως εκ τούτου, ένα εξατομικευμένο σύνολο των όγκων που προέρχονται από μεταλλαγμένα γονίδια θα πρέπει να είναι κατάλληλα βιοδεικτών για μεμονωμένα άτομα. Ολόκληρο ανάλυση του γονιδιώματος και την ακολουθία exome δεν μπορεί να είναι οικονομικά αποδοτική για το σκοπό αυτό, δεδομένου ότι περισσότερο από το 99,99% της αλληλουχίας του γονιδιώματος ή exome σε πρωτοπαθείς όγκους δεν παρουσιάζει μεταλλάξεις [4, 18]. Εδώ, θα προσδιορίζονται οι μεταλλάξεις όγκο μοναδικό με CHPv2 σε Ion PGM και στη συνέχεια παρακολουθείται το φορτίο του όγκου χρησιμοποιώντας MMS με ddPCR ξεκινώντας από μια εξαιρετικά μικρή ποσότητα του DNA στο πλάσμα. Δεδομένου ότι η προσέγγισή μας φαίνεται να είναι επαρκής για να αποκτήσουν καλής ποιότητας μεταλλάξεων πληροφορίες σε σχέση με το σύνολο των τεχνολογιών αλληλουχία του γονιδιώματος ή exome, μπορεί να είναι άμεσα εφαρμόσιμες στην κλινική πρακτική.

Η χρησιμότητα της ανίχνευσης μετάλλαξης στο ctDNA έχει αναφερθεί σε μεγάλο βαθμό ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου, η πλειονότητα των οποίων παρουσίασαν υποτροπή, την εξέλιξη, ή θάνατο μέσα σε ένα χρόνο μετά την αρχική θεραπεία [1, 2, 5, 9, 20, 21]. Αυτά τα ιδιαίτερα προχωρημένους όγκους (δηλαδή, Stage IV) θεωρούνται ότι έχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής ή εξέλιξης [22], έτσι ώστε ο ρόλος των πρόσθετων δεικτών μπορεί να περιοριστεί στην τρέχουσα πρακτική. Στην πραγματικότητα, η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο του παχέος μπορεί να αντιμετωπιστεί με θεραπευτική πρόθεση (δηλαδή, σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ), του οποίου η 5-χρόνου έχουν ποσοστά ελεύθερη νόσου έχει αναφερθεί ότι είναι περίπου 70% [23, 24], υποδηλώνοντας ότι περίπου το 30 % των ασθενών που εξακολουθούν να απαιτούν προσεκτική παρακολούθηση για υποτροπή. Επί του παρόντος, το CEA είναι ένα από τα λίγα μοριακών δεικτών για χρήση ρουτίνας στην παρακολούθηση μετεγχειρητική παρακολούθηση [25]. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι το πλεονέκτημα επιβίωσης με παρακολούθηση CEA και μετέπειτα χειρουργική θεραπεία είναι πιθανόν να είναι μικρή [26]. Η παρατήρηση αυτή είναι πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι τα αυξημένα επίπεδα CEA είναι: (i) ένα φτωχό μέσο πρόβλεψης για τοπική υποτροπή? και (ii) ένα σχετικά αργά συμβάν [27]. Σε αντίθεση με την CEA, ctDNA ανταποκρίνεται άμεσα, είναι ειδικά για φορτίο όγκου, και είναι ανιχνεύσιμη ανεξάρτητα από ιστολογικού τύπου [2]. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι ένα από τα σημαντικά ζητήματα της χρήσης ctDNA σε ασθενείς σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ είναι η ευαισθησία ανίχνευσης. Η επικράτηση των πρωτογενών μεταλλάξεων όγκου καθοδηγείται σε ctDNA έχει μόνο ένα 0.1-10.0% συχνότητα παραλλαγή αλληλόμορφου, ακόμη και σε εξαιρετικά προχωρημένους όγκους [10, 11, 28]. Ως εκ τούτου, για να ctDNA να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για το στάδιο ΙΙ-ΙΙΙ ή ακόμη και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου Ι, ιδανικά η ευαισθησία είναι μικρότερη από 0,1% [19]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις ψηφιακές τεχνολογίες γονιδιωματικής αλληλουχίας, συμπεριλαμβανομένων χάντρες, γαλάκτωμα, ενίσχυση, και η μαγνητική (ακτινοβολούν) [29], με ετικέτα-αμπλικόνιο βαθιά αλληλουχίας (Tam-Seq) [10], το σύστημα ασφαλείας-αλληλουχίας (Safe-του προσωρινού κανονισμού,) [30] , σφάλματα κατέστειλε πολυπλεξίας βαθιά αλληλουχίας [31], και Duplex αλληλουχίας [32] έχουν προσεγγίσει τη ζήτηση αυτή την ευαισθησία. Αυτές οι μέθοδοι είναι στην πραγματικότητα πολύ ακριβή, αλλά δεν έχουν πλήρη εφαρμογή να ψάξετε μεταλλάξεις με πολλαπλές αμπλικόνια από έναν περιορισμένο αριθμό αντιγράφων των προτύπων, όπως ctDNA [30]. Στην παρούσα μελέτη, αναγνωρίσαμε την πρώτη μεταλλάξεις όγκους μοναδικά από τον Ion PGM, και στη συνέχεια αυτές οι μεταλλάξεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ddPCR. Η ddPCR απαιτεί εκκινητών /σχεδιασμός ανιχνευτή και επικύρωσης για προηγούμενη ταυτοποίηση κάθε μετάλλαξης στον πρωτογενή όγκο, αλλά δεν απαιτεί πισίνα ή βαθιά αλληλούχιση. Επιβεβαιώσαμε ότι ddPCR ήταν κατάλληλο για την ποσοτική μέτρηση των σπάνιων παραλλαγών σε ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο κλάσμα 0,1% ή περισσότερο (ένα μεταλλαγμένο μόριο σε ένα φόντο από 1000 μόρια άγριου τύπου) [1, 33, 34]. Για την πρακτική χρήση του ctDNA ως δείκτης παρακολούθησης φορτίο όγκου, μόνο ένας μικρός αριθμός ασφαλώς ταυτοποιημένες μεταλλάξεις από πρωτογενείς όγκους θα μπορούσε να είναι αξιόπιστος δείκτες. Ως εκ τούτου, τρέχουσα στρατηγική μας είναι λογικές για τις κλινικές φορτίο όγκου παρακολούθησης ιδιαίτερα για μετεγχειρητική ασθενείς με θεραπευτική πρόθεση.

αλλοιώσεις γονίδιο που εμπλέκεται στα πρώιμα στάδια της ογκογένεσης είναι προφανώς συμφέρουσα μορφή MMS, επειδή θα πρέπει να συμμετέχουν στη δημιουργία ογκογόνο κλώνοι [4]. Κατ ‘αρχήν, η γενετική ετερογένεια του όγκου έχει θεωρηθεί ότι είναι το αποτέλεσμα της ετερογενούς συσσώρευσης γενετικών αλλαγών στην κορυφή των προκαρκινικών αλλοιώσεων ή νωρίς τον καρκίνο [35, 36]. Στην πραγματικότητα, οι μεταλλάξεις του

TP53

,

KRAS

,

KIT

, και

CDKN2A

ανιχνεύθηκαν σε όγκους ομάδα ενδοσκόπιο καθώς και προηγμένες μορφές καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι μεταλλάξεις μεταφέρονται στη διαδικασία της ανάπτυξης του καρκίνου και απλώνονται σε ολόκληρο μάζα του όγκου. Εάν μια δεδομένη μετάλλαξη σχετίζεται με την πρώιμη ανάπτυξη του καρκίνου του όγκου, στη συνέχεια, την προκατάληψη ανίχνευση μετάλλαξης σε ctDNA λόγω ανομοιογένειας του όγκου θα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί. Ωστόσο, η ταυτοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται συγκεκριμένα στην πρώιμη ανάπτυξη των ατομικών όγκων μπορεί να είναι προκλητική. Στην παρούσα μελέτη, μπορεί να είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν κλωνική ετερογένεια ενός όγκου στο προφίλ μετάλλαξης με το μικρό πίνακα προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδίου που σχετίζεται με καρκίνο από ένα μόνο βιοψία ανά πρωτογενούς όγκου. Στην ιδανική περίπτωση, όλες οι μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με χαμηλές συχνότητες αλληλόμορφου στον πρωτογενή όγκο από ένα μόνο βιοψίας, θα πρέπει να εξεταστεί σε ctDNA. Ωστόσο, η ανίχνευση της εξαιρετικά χαμηλής συχνότητας αλληλόμορφου μπορεί να μην είναι εφικτή ακόμη λόγω της έλλειψης ddPCR σύνολα εκκινητών /ανιχνευτών για κάθε μεμονωμένο αλλαγή νουκλεοτιδίου όλων των περιοχών κωδικοποίησης. Μεταλλακτικές προφίλ με πολλαπλές βιοψίες από έναν όγκο μπορεί να είναι μια επιλογή για την αντιστάθμιση κλωνική ετερογένεια, αλλά αυτή η προσέγγιση δεν είναι ακόμη δεν είναι δυνατόν για μικρούς όγκους, όπως οι πολύποδες και χειρουργήσιμη όγκους. Ως εκ τούτου, η εκτίμηση των κλώνων ετερογένεια ενός όγκου μπορεί να μην είναι πλήρως εφικτή σε πρώιμους καρκίνους. Εν τω μεταξύ, οι μεταλλάξεις με υψηλό επιπολασμό σε πρωτογενείς όγκους, τα MMS από έναν πίνακα αλληλουχίας του γονιδίου που σχετίζεται με καρκίνο στην παρούσα μελέτη, μπορεί να είναι ένα από τα καλύτερα υποκατάστατα για την προσέγγιση αυτή [11].

Εν ολίγοις,