Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) είναι ένα περίεργο ιό Epstein Barr ( EBV) -associated κακοήθεια που κυριαρχεί στη Νότιο-Ανατολική Ασία. Πεπτιδυλ-προλυλ

cis-trans ισομεράση

NIMA-αλληλεπιδρώντας 1 (PIN1) ισομερίζεται ειδικών υπολειμμάτων φωσφορυλιωμένων αμινοξέων, η οποία καθιστά ένα σημαντικό ρυθμιστή στην επιβίωση των κυττάρων και την απόπτωση κάνει. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συμβολή PIN1 στο NPC ογκογένεση και δυναμικό ρόλο PIN1 ως θεραπευτικό στόχο.

Μέθοδοι

Η έκφραση της PIN1 εξετάστηκε σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών NPC, ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους. Οι λειτουργικούς ρόλους των PIN1 στα κύτταρα NPC έχουν διευκρινιστεί από το νοκ ντάουν και υπερέκφραση του PIN1 στο

in vitro

και

in vivo

γυμνά μοντέλα ποντικών με siRNA και lenti-ιικό επιμόλυνση, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα κατά των όγκων του αναστολέα PIN1 Juglone στα κύτταρα NPC αξιολογήθηκαν επίσης.

Αποτελέσματα

Εμείς αποκάλυψε τη συνεπή υπερέκφραση του PIN1 σε όλες σχεδόν τις NPC κυτταρικές σειρές από EBV, ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους. καταστολή PIN1 ήταν ικανή να αναστέλλει την έκφραση της κυκλίνης D1 και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε κύτταρα NPC. Είναι θετικά ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού NPC, ο σχηματισμός αποικίας και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Η αναστολή της PIN1 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει την ογκογόνο ρόλο της PIN1 στο NPC ογκογένεση, και δείχνει ότι η υπερέκφραση του μπορεί να ενισχύσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση του cyclinD1. Τα ευρήματά μας ενημερώσει για την ανάπτυξη νέων θεραπειών που στοχεύουν PIN1 για τους ασθενείς NPC

Παράθεση:. Xu M, Cheung CC-M, Chow C, Lun SW-Μ, Cheung ST, Lo KW (2016) Η υπερέκφραση του PIN1 Ενισχύει καρκίνο του ανάπτυξη και την επιθετικότητα με την κυκλίνη D1 επαγωγής σε EBV-Associated ρινοφαρυγγικού καρκινώματος. PLoS ONE 11 (6): e0156833. doi: 10.1371 /journal.pone.0156833

Επιμέλεια: Pierre Busson, Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 8η, Οκτωβρίου 2015? Αποδεκτές: 21 Μαΐου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 3, Ιουνίου 2016

Copyright: © 2016 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (Έρευνα Focus Σχέδιο-Α), και το Συμβούλιο Κονδυλίων Έρευνας του Χονγκ Κονγκ – GRF ( 470413, 470312, 471211), CRF (CUHK8 /CRF /11R), AoE NPC (AoE /M-6.8), Θέμα-Based Σύστημα Έρευνας (T12-403 /11 και T12-401 /13-R).

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) είναι ένα ξεχωριστό είδος της κεφαλής και του καρκινώματος του λαιμού που προκύπτει από το επιθηλιακό κύτταρα που καλύπτουν την επιφάνεια και επένδυση του ρινοφάρυγγα. Αυτή η κακοήθεια παρουσιάζει μια ξεχωριστή εθνοτική και γεωγραφική κατανομή, και είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη στη νότια Κίνα, όπου σχεδόν όλες οι περιπτώσεις nonkeratinizing καρκινώματα που σχετίζονται με τη μόλυνση από EBV [1, 2]. Η ένωση αυτή με EBV, εκτός από την ύπαρξη πολλαπλών γενετικών ανωμαλιών [3], αυξάνει την πολυπλοκότητα της έρευνας NPC. Τα πενιχρά αποτελέσματα επιτυγχάνονται με τις συμβατικές χημειο-ακτινοθεραπεία για τους ασθενείς με προχωρημένη τοπική-περιφερειακή ασθένειες και απομακρυσμένες μεταστάσεις αποτελούν μια θεραπευτική πρόκληση [4]. Δεδομένου του υψηλού υποτροπή και τα ποσοστά μετάσταση, είναι υψίστης σημασίας ότι οι εναλλακτικές θεραπευτικές προσεγγίσεις να αναζητηθούν και να αναπτυχθούν. Ανάπτυξης

Καρκίνος συνεπάγεται μια περίπλοκη σειρά από μονοπάτια ανώμαλης σηματοδότησης που οδηγεί ουσιαστικά σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων που ελέγχονται από προλίνη σε σκηνοθεσία φωσφορυλίωση [5]. PIN1 είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη ένζυμο που συνδέεται προς και ισομερίζεται ειδικών φωσφορυλιωμένων υπολειμμάτων σερίνης ή θρεονίνης προηγούμενες προλίνη (Ser /Thr-Pro) δεσμούς. Προκαλεί διαμορφωτικές αλλαγές σε ορισμένες πρωτεΐνες που προτροπή αλλαγές στις ιδιότητές τους, συμπεριλαμβανομένων των καταλυτικών δραστηριοτήτων, υποκυτταρικό εντοπισμό, αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και το ποσοστό του κύκλου εργασιών [5, 6]. Έτσι, PIN1 θεωρείται σημαντικός ρυθμιστής σε κυτταρικές διεργασίες, όπως ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική σηματοδότηση, τη μεταγραφή και το μάτισμα, οι αποκρίσεις βλάβη του DNA, η επιβίωση των κυττάρων και της αντίστασης στα φάρμακα [5, 7, 8].

Εκτός από τη σημασία των PIN1 στη ρύθμιση της ενεργοποίησης των διαφόρων μορίων σηματοδότησης, έχει επίσης δειχθεί να σταθεροποιήσει ιικές ογκοπρωτεΐνες, όπως το ανθρώπινο τύπου Ι Tax πρωτεΐνη του ιού της λευχαιμίας των Τ-κυττάρων [9]. Επιπλέον, PIN1 έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στη λειτουργία των διαφόρων ιών, συμπεριλαμβανομένου του ιού σάρκωμα Kaposi που σχετίζεται με τον έρπητα [10], ανθρώπινο ιό ανοσοανεπάρκειας τύπου Ι [11, 12] και τον ιό της ηπατίτιδας C [13]. Είναι ενδιαφέρον, έχει επίσης αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με EBV-κωδικοποιούν πρωτεΐνη [14], αν και πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της στην EBV καθώς κακοήθεια έχει αποδειχθεί σπανίζουν.

Αυτή η μελέτη είχε ως σκοπό να διευκρινιστεί ο ρόλος του PIN1 στην ανάπτυξη του NPC που συνδέεται σταθερά με λοίμωξη EBV. Με τη διερεύνηση των επιπτώσεων της έκφρασης PIN1 για EBV καθώς NPC, εμείς αποκάλυψε τη συμβολή του στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους

Τρεις κυτταρικές γραμμές NPC C666-1 (ένα φυσικώς συνδεδεμένης με ΕΒν, αδιαφοροποίητο τύπο του NPC) [15], ΚΘ1 (ενός αρνητικού EBV, καλά διαφοροποιημένο τύπο του NPC) [16], ΚΘ1-EBV (ΚΘ1 μολυνθεί με EBV) [17], αθανατοποιημένες κανονική ρινοφάρυγγα επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (NP69 και NP460) [18] εγκατεστημένοι στα εργαστήριά μας χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το τραχηλικό καρκίνο κυτταρική σειρά HeLa ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). Δύο EBV θετικούς NPC ξενομοσχευμάτων-ξενο-666 [15], ξενο-2117 [19], C15 και C17 [20] συμπεριλήφθηκαν επίσης. Xen-666 και ξενο-2117 καθορίστηκαν με την ομάδα NPC μας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15, 19]. C15 και C17 ελήφθησαν από τον καθηγητή Pierre Busson, που ιδρύθηκε αυτές ξενομοσχευμάτων [20]. Για την ανοσοϊστοχημική (IHC) μελέτη χρώση, 70 αρχειακό φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) πρωτογενή βιοψίες NPC είχαν προσληφθεί από την τράπεζα ιστών του Τμήματος Ανατομικές και κυτταρικής παθολογίας στο Prince of Wales Hospital, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (CUHK ). Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του CUHK. Όλα τα δείγματα αξιολογήθηκαν ως ιστολογικά αδιαφοροποίητο ή κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα και επιβεβαιώθηκε ότι είναι ΕΒν θετικά, όπως προσδιορίζεται με Eber

in situ υβριδισμού

[21]. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Επιμόλυνση και φαρμακευτικές θεραπείες,

ΚΘ1, ΚΘ1-EBV, C666-1 και HeLa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% Ε-γλουταμίνη (Life Technologies). Τα κύτταρα NP69 καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού (KSFM) με εκχυλίσματα βόειου υπόφυσης και του ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Invitrogen). Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δύο σιλανσιέ Επιλέξτε επικυρωθεί siRNAs που στοχεύουν PIN1 (siPin1 544 και siPin1 545) και την καθολική αρνητικού ελέγχου siRNA (Life Technologies) επιμολύνθηκαν παροδικά σε C666-1 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία για περαιτέρω ανάλυση. MG132 (Calbiochem) εφαρμόστηκε σε ΚΘ1 και NP69 κύτταρα (στα 10 και 15 μΜ και 5 και 10 μΜ, αντίστοιχα) για να μελετηθεί η αποικοδόμηση πρωτεασώματος του PIN1. Ο αναστολέας PIN1 Juglone (Calbiochem) χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της αναστολής PIN1 σε κύτταρα C666-1 (στις 2, 4, 6 και 8 μΜ). Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Για τον προσδιορισμό της IC50 του Juglone, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές δοσολογίες Juglone (0,03 έως 20 μΜ) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία WST-1.

Δημιουργία σταθερού PIN1-κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

Η pCDH και pCDH-PIN1 πλασμίδια ήταν ένα δώρο, γενναιόδωρα παρασχέθηκε από τον Dr. Roberta Pang, Τμήμα Χειρουργικής, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Ένα λεντοϊού σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η σταθερή PIN1-υπερεκφράζεται NP69 κυτταρική σειρά. Ο φορέας λεντοϊού pCDH συσκευάστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα φακοϊό τρίτης γενιάς, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή του κιτ Lenti Starter του (Σύστημα Biosciences). Viral υπερκείμενο (μέσο καλλιέργειας) συλλέχθηκε από 293TN παραγωγό κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ο ιός (με pCDH ή φορέα pCDH-PIN1 και 10 μg pPACKH1-πλασμίδιο mix) συλλέχθηκε και μεταγωγή με TransDuxand σε NP69 κύτταρα. PIN1 έκφραση επιβεβαιώθηκε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) και κηλίδωση Western. Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) έκφραση ανταποκριτή οπτικοποιήθηκε υπό μικροσκόπιο φθορισμού για να εξασφαλιστεί η παρουσία του σε μεταγωγή του DNA.

Αντίστροφη μεταγραφή (RT) και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR)

δείγματα RNA που παρασκευάστηκε με TRIZOL και εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο υποβλήθηκαν σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας MultiScribe ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Το cDNA που λήφθηκε χρησιμοποιήθηκε για πραγματικό χρόνο qPCR μέσω SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη απαριθμούνται στον Πίνακα 2. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του 7500 Fast σύστημα Real-Time PCR (Applied Biosystems). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Η έκφραση των γονιδίων στόχων κανονικοποιήθηκε έναντι του γονιδίου housekeeping β-ακτίνης χρησιμοποιώντας το 2

[- ΔΔCT].

Η μέθοδος

κηλίδωση Western

Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σύμφωνα με μεγέθη τους με ηλεκτροφόρηση, και στη συνέχεια τα ηλεκτρολογικά μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Bio-Rad Trans Blot-. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύκτα σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά ή 5% αλβουμίνη βόειου ορού. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα. Οι πρωτεΐνες-στόχοι ανιχνεύονται με χημιφωταύγειας υποστρώματα (GE Life Science) και το εκπεμπόμενο σήμα ανιχνεύθηκε σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα κατά της ανθρώπινης PIN1 (Calbiochem), ακτίνη (Santa Cruz), η κυκλίνη D1 (Lab Vision), β-κατενίνης, c-jun, c-Jun (Ser73) και c-Jun (Ser63) (Cell Signaling ).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση

Τα δείγματα FFPE κόπηκαν (4 μm), de-παραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν για τις επόμενες ανοσοχρώση. Μετά ανάκτηση αντιγόνου, η ενδογενής βιοτίνη δραστηριότητα έχει αποκλειστεί από φυσιολογικό ορό βοοειδούς και οι τομές επωάστηκαν σε πρωτογενή αντισώματα (αντι-PIN1, Calbiochem) σε ένα υγρό θάλαμο. Η HRP-σημασμένο δευτερογενές αντίσωμα εφαρμόστηκε στις τομές και, τέλος, το 3,3′-διαμινο-βενζιδίνη (ϋΑΒ) υπόστρωμα εφαρμόστηκε για την ανάπτυξη χρώματος. έκφραση PIN1 και ο εντοπισμός οπτικοποιήθηκε σε κόκκινο και πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, η οποία εμφανίστηκε μπλε. Τα πλακίδια στη συνέχεια αφυδατώθηκαν και στερεώθηκαν με μέσο στερέωσης Permount (Fisher Scientific).

Caspase-3 δραστικότητα δοκιμασίας

Η κυτταρική απόπτωση των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων ανιχνεύθηκε με τη χρήση της CaspACEAssay

Σύστημα TM σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Promega). Wells εις διπλούν που περιέχουν κενές (χωρίς εκχύλισμα κυττάρων), αρνητικού ελέγχου (απόσπασμα από μη επεξεργασμένα κύτταρα), που προκαλείται από απόπτωση (αποσπάσματα από PIN1 κύτταρα αναστολέα-θεραπεία) και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα της κασπάσης (αποσπάσματα από PIN1 inhibitor- και Z-VAD-FMK η κασπάσης κύτταρα αναστολέα-θεραπεία) συμπεριλήφθηκαν στα πειράματα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και η απορρόφηση των χρωμάτων που αναπτύχθηκε μετρήθηκε σε μήκος κύματος 405 nm με μία Perkin Elmer 1420 Multilabel Counter Victor 3 (Perkin Elmer). Η δραστικότητα κασπάσης-ειδική υπολογίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασίες WST-1 και BrdU

Το αντιδραστήριο πολλαπλασιασμού κυττάρου WST-1 (Roche) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ο ρυθμός του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε treated- και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα κατεργασμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε πυκνότητα 3000-8000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε κάθε 24 ώρες με WST-1, συνεχώς, για 5 ημέρες. Η απορρόφηση σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm και κανονικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος 690 nm, που ανιχνεύεται από τον Victor 3 (Perkin Elmer). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε επίσης από την άποψη της ενσωμάτωσης DNA εντός πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BrdU (Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού ELISA, BrdU χρωματομετρική Kit, Roche).

Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης

Το κατεργασμένο και μη κατεργασμένα κύτταρα απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ (βάση αγαρόζη: 1,8% αγαρόζη σε KSFM? top αγαρόζη: 0,9% αγαρόζη προ-αναμιγνύονται με κύτταρα? 2 mL υπέρθεση μέσου KSFM) για την αξιολόγηση της ανάπτυξης τους σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο τρόπο. Οι πλάκες επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C για ένα μήνα. Οι αποικίες έγιναν ορατές με τη χρήση 0,1% ρ-iodonitro τετραζολίου ιώδες (INT) χρώση (Sigma-Aldrich), και στη συνέχεια μετρήθηκαν.

Colony

δοκιμασία σχηματισμού

Το κατεργασμένο και μη επεξεργασμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 8×10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο (C666-1) ή 1X10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο (NP69) σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα επωαστή με 5% CO

2 για 21-28 ημέρες. Οι αποικίες που σχηματίζονται σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και οπτικοποιούνται σε μπλε χρώση Giemsa χρησιμοποιώντας (Sigma-Aldrich). Οι αποικίες που περιέχουν πάνω από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

In vivo

ογκογενετικότητας

Για να διευκρινιστεί η

in vivo

ογκογόνο δράση του PIN1, τα κύτταρα NP69 (επεξεργασία με siRNAs του PIN1 ή με τον φορέα ελέγχου) υποδορίως εμβολιάσθηκαν στα πλευρά θηλυκών BALB /c γυμνά ποντίκια (ηυ /ηυ) (4 ποντίκια ανά ομάδα). Όλοι οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 2,2,2-τριβρωμοαιθανόλη (Avertin) πριν τον εμβολιασμό. Matrigel (BD Bioscience) χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία ενοφθαλμισμού για NP69. Οι ποντικοί επιθεωρούνται καθημερινά για σχηματισμό όγκου και καταγράφηκαν τα μεγέθη των όγκων που σχηματίζονται. Για να προσδιοριστεί η επίδραση κατά του όγκου του αναστολέα PIN1

in vivo

, Juglone (0 mg /kg, 0,5 mg /kg, 1,5 mg /kg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν με C666-1 λουσιφεράση κύτταρα όταν οι όγκοι είχαν φθάσει τα κατάλληλα μεγέθη τους. Το μέγεθος του όγκου καταγράφηκε καθημερινά και το άλας λουσιφεράσης εγχέεται στο γυμνούς ποντικούς τις ημέρες 0, 6 και 8 να παρακολουθεί τις μεταβολές στο μέγεθος του όγκου μέσω ενός IVIS

TM 100 σύστημα απεικόνισης. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν στο τέλος των πειραμάτων με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι διατηρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Δεν ποντίκια ήταν άρρωστος, πέθανε ή απαιτείται πρόωρη λήξη κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης. Δεοντολογική έγκριση ελήφθη από την επιτροπή του Πανεπιστημίου των πειραμάτων σε ζώα Δεοντολογίας (AEEC), CUHK, και η άδεια των ζώων εγκρίθηκε από την κυβέρνηση του Χονγκ Κονγκ, του Υπουργείου Υγείας.

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Το C666 -1 κύτταρα σε 60% συρροή σε πλάκα 96 φρεατίων συν-επιμολύνθηκαν με FR-ΤΚ-Luc πλασμίδιο, PIN1 siRNA και το πλασμίδιο ανταποκριτή. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα λύθηκαν με ένα 1Χ παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega). Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και δραστηριότητες της λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν με τη χρήση της διπλής Luciferase Kit Reporter (Promega) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Το σήμα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με Victor 3 (Perkin Elmer) με ή χωρίς αυτόματο ενέσεις. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η αναλογία της δραστικότητας λουσιφεράσης Firefly να Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης.

Σηματοδοσίας συστοιχία μονοπάτι

A Cancer 10 Διαδρομή αναφοράς λουσιφεράσης Kit (SA Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό σηματοδότησης εκτροπές μονοπάτι στα κατεργασμένα κύτταρα. Εν συντομία, πλασμίδια ανταποκριτές στην Cignal Finder Array Plate επαναιωρήθηκαν και αναμίχθηκαν με 0,8 αντιδραστήριο Fugene μι HD (Roche) σε 100 μι μέσου ΟΡΤΙ-ΜΕΜ (Invitrogen). Το συγκρότημα διαμόλυνση αφέθηκε να σχηματιστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Τα κατεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και να αντιστρέψει-επιμολυσμένα με πλασμίδιο ανταποκριτή σε πυκνότητα 1.5X10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Η δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης διεξήχθη μετά από 24 ώρες επώασης.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος με τυποποιημένες μέσο σφάλμα (SEM) . Student t-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα, με μία

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του PIN1 σε NPC πρωτογενείς όγκους και γραμμές όγκου

Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση, ανιχνεύσαμε την υπερέκφραση του PIN1 σε 70/70 (100%) NPC πρωτογενών όγκων, σε σύγκριση με το γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο ρινοφαρυγγική (Σχήμα 1Α). PIN1 υπερέκφραση καταδείχθηκε επίσης σε μια ομάδα EBV-θετική κυτταρική σειρά NPC (C666-1) και ξενομοσχεύματα (C15, C17, ξενο-2117 και ξενο-666) με κηλίδωση Western, ενώ μόνο ασθενή έκφραση PIN ανιχνεύθηκε στο απαθανάτισε κανονική ρινοφαρυγγικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές (NP460 και NP69) (Σχήμα 1Β). Παρά τη δραματική μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης PIN1 στα αθανατοποιημένη φυσιολογικά κύτταρα NPC, υπάρχουν προφανείς διαφορές στο

PIN1

μεταγραφές mRNA παρατηρήθηκαν μεταξύ των κανονικών κυτταρικές σειρές NP και των όγκων NPC. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει μία μετα-μεταφραστική ρύθμιση του PIN1 σε φυσιολογικά ρινοφαρυγγικά κύτταρα.

χρώση (Α) IHC χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσουν την υπερέκφραση της PIN1 σε αντιπροσωπευτικές πρωτογενείς όγκους NPC (NPC1-NPC4). Όλες οι περιπτώσεις ήταν EBV-θετικοί αδιαφοροποίητα καρκινώματα. NPC1, NPC3 και NPC4 είναι από τους ασθενείς με το στάδιο 3 της νόσου. NPC2 είναι από έναν ασθενή με το στάδιο 2 NPC. σήματα Ισχυρή PIN βρέθηκαν στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία υποδεικνύονται με κίτρινα «

*». Το γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο χρησίμευσε ως μάρτυρας στην οποία παρατηρήθηκαν ασθενή σήματα PIN1. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν την κανονική ρινοφαρυγγικής επιθήλιο. (Β) Έκφραση PIN1 στις γραμμές NPC όγκων, ξενομοσχεύματα και αθανατοποιημένα φυσιολογικά κύτταρα ΝΡ, ανιχνεύεται με qRT-PCR (άνω πάνελ) και κηλίδας Western (κάτω πίνακας). Για qRT-PCR, η

PIN1

μεταγραφή σε NP460 χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. Η σχετική έκφραση του

PIN1

μεταγραφές υποδείχθηκε ως φορές διαφορά πάνω από την αναφορά. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση φόρτωσης. Ομοίως, ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτισης σε ανάλυση κηλίδος Western. Η ασθενής έκφραση PIN1 στην NP69 και NP460 πρότεινε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των PIN1 εμπλεκόμενων μετα-μεταφραστική ρύθμιση.

Η

Για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός της μετα-μεταφραστική ρύθμιση σχετικά με τις πρωτεΐνες PIN1, HK-1 και NP69 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ο MG132 αναστολέας πρωτεασώματος (καρβοβενζοξυ-Leu-Leu-λευκίνη). Τα αποτελέσματα στυπώματος Western αποκάλυψε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης PIN1 τόσο ΚΘ1 και κυττάρων NP69 μετά τη θεραπεία MG132 (S1 Εικ). Αυτό δείχνει ότι η έκφραση της πρωτεΐνης PIN1 ρυθμίζεται από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος.

Η συνεπής υπερέκφραση του PIN1 υποδηλώνει δυνατότητες ογκογόνο ρόλο της στην ανάπτυξη NPC. Για να διερευνηθεί ογκογόνο λειτουργία του, siRNAs και ο αναστολέας PIN1 Juglone χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η επίδραση της καταστολής PIN1 στην κυτταρική ανάπτυξη NPC. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της έκφρασης PIN1 στην κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση σε φυσιολογικά ρινοφαρυγγικά επιθηλιακά κύτταρα (NP69) επιμολύνονται με ένα φορέα έκφρασης PIN1.

PIN1 ρυθμίζει NPC έκφραση κυτταρικής ανάπτυξης και η κυκλίνη D1

η επίδραση της PIN1 νοκ ντάουν στην κυτταρική ανάπτυξη NPC διερευνήθηκε μέσω επιμόλυνσης C666-1 κύτταρα με PIN1 ειδικά siRNAs (siPin1 544 και siPin1 545). Σχήμα 2Α και 2Β δείχνουν την έντονη μειορύθμιση του

PIN1

mRNA και πρωτεΐνης στα C666-1cells επιμολυσμένα με siPIN1. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας WST-1 επέδειξε παρατηρήσιμη αναστολή της ανάπτυξης των siPIN1-επιμολυσμένα κύτταρα C666-1, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών μειώθηκε σημαντικά στο siPIN1 επιμολυσμένα C666-1 (Σχήμα 2D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση PIN1 ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων NPC. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας BrdU έδειξε σημαντική καταστολή της σύνθεσης του DNA στα κύτταρα knockdown NPC PIN1 (Σχήμα 2Ε). Είναι σημαντικό ότι η έκφραση του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου κυκλίνη D1 καταστάλθηκε στα PIN1 knockdown κυττάρων C666-1 (Σχήμα 2Β). Η συν-επιμόλυνση των pCMV-cyclinD1, μια κυκλίνη D1-φορέα έκφρασης με siPIN1, αποκατέστησε την ικανότητα σχηματισμού έκφραση κυκλίνης D1, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη σύνθεση του DNA και σε κύτταρα αποικία C666-1 σύγκριση με εκείνα των κυττάρων siRNA-αγωγή (S2 Εικ) . Αυτό υποδηλώνει ότι PIN1 ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη NPC με ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης D1.

καταστολή PIN1 αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, τη σύνθεση του DNA, την ικανότητα σχηματισμού αποικίας και την έκφραση της κυκλίνης D1 σε κύτταρα NPC (Α) qRT-PCR και (Β) Δυτική blot χρησιμοποιήθηκαν στην μειορύθμιση PIN1 μεταγραφής και έκφρασης πρωτεΐνης σε PIN1 siRNAs (siPIN1 544 και 545 siPIN1) κύτταρα κατεργασμένα NPC και C666-1, αντίστοιχα. Σε αυτά τα PIN1 knockdown κυττάρων, παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση κυκλίνης D1. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στην ανάλυση στυπώματος Western. (C) WST-1 δοκιμασία αποκάλυψε την αναστολή της ανάπτυξης στα κύτταρα επιμολυσμένα με NPC siPin1 544 και siPin1 ικανότητα 545. (d) σχηματισμός αποικίας ήταν σημαντικά κατέστειλε σε PIN1-σιγήσει κύτταρα C666-1. Εκπρόσωπος φωτογραφίες των αποικιών που σχηματίζεται από siRNA-θεραπεία και τον έλεγχο των κυττάρων εμφανίζονται. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με Student t-test, όπου μια

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01). (Ε) Μια δοκιμασία BrdU χρησιμοποιήθηκε για να αποκαλύψει τη σημαντική αναστολή της σύνθεσης του DNA στο PIN νοκ ντάουν κύτταρα NPC.

Η

αναστολέας PIN1 προκαλεί κασπάσης-3 και μειώνει το μέγεθος του όγκου

Ένα PIN1 αναστολέα, Juglone, χρησιμοποιήθηκε για τη διαλεύκανση των επιδράσεων της αναστολής ΡΙΝ σε κύτταρα NPC

in vitro

και

in vivo

. Μία δοκιμασία WST-1 έδειξε ότι το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC50) του Juglone για C666-1 και ΚΘ1 ήταν 6 και 10 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα 3Α). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι C666-1 κυττάρων με υψηλή έκφραση PIN1 είναι πιο επιρρεπή σε θεραπεία Juglone. Ο αναστολέας PIN1 Juglone κατέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1 σε κύτταρα C666-1 (Σχήμα 3Β, αριστερό πάνελ). Η

in vivo

επίδραση του αναστολέα PIN1 για κυκλίνης D1 καταστολή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την ένεση ενδο-όγκου των Juglone σε C666-1 ξενομοσχεύματα σε γυμνά μοντέλα ποντικών (Σχήμα 3Β, δεξί πάνελ). θεραπεία Juglone επίσης σημαντικά ενισχυμένη δραστικότητα κασπάσης-3 σε κύτταρα C666-1, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Juglone αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα NPC.

(Α) HK-1 (αριστερό πάνελ) και C666-1 (δεξί πάνελ) υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα PIN1 Juglone για 24 ώρες για να προσδιορίζουν την ευαισθησία δόση φαρμάκου. Οι τιμές IC50 του C666-1 και ΚΘ1 κύτταρα ήταν 6 μΜ και 10 μΜ, αντίστοιχα. (Β) Η έκφραση της κυκλίνης D1 καταστάλθηκε από Juglone με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση β-κατενίνης. Η έκφραση της κυκλίνης D1 και β-κατενίνη στην Juglone επεξεργασμένο μοντέλο ξενομοσχεύματος C-666 εξετάστηκε με στύπωση Western. Μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 παρατηρήθηκε στον όγκο που είχαν λάβει θεραπεία Juglone. αναστολή PIN1 οδήγησε σε καταστολή της κυκλίνης D1 τόσο

in vitro

και

in vivo

, και υπήρξε μια μέτρια μείωση του επιπέδου β-κατενίνης στο

in vivo μοντέλο

. (C) Τα κύτταρα C666-1 εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα κασπάσης-3 μετά την αγωγή Juglone, σε σύγκριση με μη ή DMSO επεξεργασμένα αντίστοιχά τους. Αυτό δείχνει ότι η αναστολή PIN1 να ενεργοποιήσετε την κασπάσης αποπτωτικό μονοπάτι σε κύτταρα NPC. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με Student t-test,

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0.01).

η

Σχήμα 4Α και 4Β καταδεικνύουν την

in vivo

αντικαρκινική δράση του Juglone στα κύτταρα NPC. Η μέτρηση ROI ήταν εξαιρετικά μειωμένη σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Juglone, σε σύγκριση με εκείνη των μαρτύρων (Εικ 4Α). Όπως δείχνει το Σχ 4Β, τα μεγέθη του όγκου στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Juglone ήταν σημαντικά μειωμένες, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 4Β). Μία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 1 mg /kg και 1,5 mg /kg Juglone.

(α) χρησιμοποιώντας

in vivo

απεικόνισης, η ανάπτυξη του όγκου του λουσιφεράσης με επισύναψη C666-1 αποκαλύφθηκε μετά από θεραπεία με διαφορετικές δόσεις Juglone (ROI μετράει ανά εκατομμύριο φωτόνια ανά δευτερόλεπτο). Το σήμα της λουσιφεράσης αυξήθηκε στα μη επεξεργασμένα όγκους ελέγχου κατά τη διάρκεια της θεραπείας Juglone. Στους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με Juglone σε διαφορετικές δόσεις (0,5, 1 και 1,5 mg /kg), με συνέπεια χαμηλότερα σήματα λουσιφεράσης παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια των περιόδων θεραπείας 8 ημερών. (Β) Σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου φάνηκε σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 0,5, 1 και 1,5 mg /kg Juglone. Τέσσερεις γυμνοί ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα μελέτης. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με Student t-test, όπου μια

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01)

Η

PIN1 προκαλεί αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των ρινοφαρυγγικής επιθηλιακών κυττάρων

Το ογκογόνο δράση του PIN1 υπερέκφραση μελετήθηκε περαιτέρω σε απαθανάτισε ρινοφαρυγγικής επιθηλιακής κυτταρικής σειράς (NP69) επιμολυσμένα. με δύο μιμείται PIN1 (pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PIN1 /»Pin1 1 #» και «Pin1 2 #»). Η υπερέκφραση του

PIN1

μεταγραφές και πρωτεϊνών παρατηρήθηκε στις PIN1-επιμολυσμένα κύτταρα NP69 (Σχήμα 5Α). Σχήμα 5Α δείχνει την υψηλή αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης του PIN1-επιμολυσμένα κύτταρα που εκφράζουν GFP.

(Α) Η υπερέκφραση του PIN1 ανιχνεύθηκε σε NP69 κύτταρα επιμολυσμένα με Pin1 εκφράζουν lenti-ιικών φορέων (Pin1 1 # και Pin1 2 # ) με qPCR (αριστερό πάνελ) και στύπωμα Western (μεσαίο πλαίσιο). Εκπρόσωπος φωτογραφίες του PIN1-επιμολυσμένα κύτταρα με φωτεινό οπτικό πεδίο (δεξιά επάνω πάνελ) και το πεδίο φθορισμού (κάτω δεξιά πλευρά) φαίνονται. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης παρακολουθήθηκε με έκφραση GFP. (Β) Ενισχυμένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ σε NP69 κυττάρων με PIN1-υπερέκφραση, συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου (αριστερό άνω πάνελ, αποικίες σε πλάκες 6-φρεατίων? Αριστερό κάτω πίνακα, οι αποικίες υπό μικροσκόπιο? Δεξιό πάνελ, μέσο δεδομένων σε ιστόγραμμα ). (C-D) Δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση της υπερέκφρασης PIN1 στην κυτταρική ανάπτυξη και τον σχηματισμό αποικιών ικανότητα ανιχνεύθηκε στα αθανατοποιημένα ρινοφαρυγγικής επιθηλιακά κύτταρα NP69, με WST-1 και προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας, αντίστοιχα. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με Student t-test, όπου μια

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (*

P

& lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του PIN1 σε κύτταρα Ν69 επάγεται σημαντικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων στους προσδιορισμούς μαλακού άγαρ (Σχήμα 5Β). Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ από PIN1 κύτταρα που εκφράζουν NP69 ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές του ελέγχου φορέα. Ωστόσο, PIN1 υπερέκφραση δεν προκάλεσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε NP69 κύτταρα (Σχήμα 5C και 5D).

PIN1 υπερέκφραση ενεργοποιεί ΜΑΡΚ /JNK οδού

Μια δοκιμασία λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι η ΜΑΡΚ /JNK οδός σηματοδότησης ενεργοποιήθηκε σημαντικά σε NP69 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά PIN1, σε σύγκριση με εκείνους διαμολυσμένα με φορέα (Σχήμα 6Α). Η ενεργοποίηση του Notch, ρ53 και μονοπάτια NF-κΒ παρατηρήθηκε επίσης σε PIN1-εκφράζεται κύτταρα NP69, αν και δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Εκτός από κυκλίνη D1, κηλίδωση Western επιβεβαίωσε την προς τα πάνω ρύθμιση τόσο του c-Jun και φωσφορυλο-c-Jun (Ser63 και Ser73) σε κύτταρα NP69 σταθερά επιμολυσμένα με PIN1 (Σχήμα 6Β). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι PIN1 επάγει την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων ρινοφαρυγγικής ενεργοποιώντας το μονοπάτι ΜΑΡΚ /ϋΝΚ.

(α) χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Cancer 10 Pathway αναφοράς λουσιφεράσης, παρατηρήθηκε σημαντική ενεργοποίηση του /JNK οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ σε δύο σταθερά PIN1-overxpressing κυτταρικές σειρές NP69 (NP69lenti-PIN1 1 # και NP69lenti-PIN1 2 #). Για αυτά τα κύτταρα PIN1 εκφράζουν, η δραστηριότητα επίσης μέτρια δραστηριοποιείται στην εγκοπή, P53 /βλάβη του DNA και τις οδούς NF-κΒ. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε την προς τα πάνω ρύθμιση της c-Jun, φωσφορυλιωμένη c-Jun (Ser63 και Ser73) και κυκλίνης D1 στις σταθερές PIN1-επιμολυσμένα κύτταρα NP69. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με Student t-test, όπου μια

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (*

P

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

σε μια πρόσφατη μελέτη, Lu

et al

. απέδειξε τη σύνδεση των πολυμορφισμών υποκινητή PIN1 και τον κίνδυνο της NPC [22]. Στην παρούσα μελέτη, παρέχουμε τη λειτουργική αποδείξεις σχετικά με τη σημασία της PIN1 υπερέκφραση σε NPC ογκογένεση. Δείχνουμε ότι αναστέλλει την καταστολή PIN1

in vitro

και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου σε κύτταρα NPC, ενώ η υπερέκφραση του προκαλεί την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των ρινοφαρυγγικής επιθηλιακών κυττάρων. Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση PIN1 συμβάλλει στην ογκογένεση NPC, και ότι η αναστολή της μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτική στρατηγική για συνδεδεμένης με ΕΒν NPC.

PIN1 είναι ένα σημαντικό ένζυμο που δεσμεύεται φωσφορυλιωμένη Ser /Thr-Pro μοτίβα και καταλύει το cis /trans-ισομερισμού των πεπτιδίων που περιέχουν προλίνη [5]. Η υπερέκφραση του ΡΙΝ έχει αναφερθεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού [23], του οισοφάγου [24], του προστάτη [25] και του παχέος εντέρου [26, 27]. Σε αυτή τη μελέτη, συστατική υπερέκφραση PIN1 βρέθηκε σε κύτταρα όγκου NPC από EBV, αλλά PIN1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε σχεδόν ρινοφαρυγγικής επιθηλιακά κύτταρα ΕΒν αρνητικά. Δεδομένου ότι

PIN1

μεταγραφή είναι παρόμοια και στις δύο NPC και φυσιολογικά κύτταρα ΝΡ, η υπερέκφραση PIN στα κύτταρα όγκου ρυθμίζεται από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η έκφραση PIN1 ρυθμίζεται από την κατασταλτική του όγκου miRNA miR-296-5p στον καρκίνο του προστάτη [28]. Ωστόσο, παρεκκλίνουσα mir-296-5p έκφραση είναι σπάνια ανιχνεύεται σε NPC [29]. Η αποκατάσταση της έκφρασης PIN στα MG132-κατεργασμένων κυττάρων ΝΡ υποδηλώνει ότι η διαδικασία της υποβάθμισης του πρωτεασώματος είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για τη ρύθμιση της λειτουργίας PIN1. Basu

et al

. έδειξε ότι η αποικοδόμηση του πρωτεασώματος του PIN1 ήταν κρίσιμη αλληλεπίδραση του με BCL2 και την επιβίωση των κυττάρων του όγκου [30]. Μαζί με τα τρέχοντα ευρήματα, η έλλειψη ή ανεπάρκεια της υποβάθμισης του πρωτεασώματος μπορεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός που εξηγεί τη συσσώρευση PIN1 σε EBV καθώς NPC, η οποία στη συνέχεια βοηθά την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Σε πρόσφατη μελέτη μας, αποκάλυψε την αλληλεπίδραση του EBV λανθάνουσα πρωτεΐνη ΕΒΝΑ1 με PIN1 στα κύτταρα NPC (αδημοσίευτα δεδομένα). Παρ ‘όλα αυτά, η σύνδεση δεν αναστέλλουν την αποικοδόμηση του πρωτεασώματος PIN1.