Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο πολλαπλασιασμός επαγωγής συνδέτη (Απρίλιος) είναι μέλος του όγκου παράγοντα νέκρωσης (TNF) σούπερ οικογένεια. Συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς της και εμπλέκεται σε πολλές διεργασίες κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμού. Υψηλά επίπεδα έκφρασης Απριλίου φέρουν συσχετίζεται στενά με την ανάπτυξη, μετάσταση, και 5-FU αντοχή φαρμάκου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει ένα συγκεκριμένο πεπτίδιο σύνδεσης Απρίλιο (BP) είναι σε θέση να μπλοκάρει δραστηριότητα Απριλίου, ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή θεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Μια βιβλιοθήκη έκθεσης φάγων χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση πεπτιδίων τα οποία δεσμεύονται επιλεκτικά με τη διαλυτή ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Απρίλιο (sAPRIL). Τα πεπτίδια με την υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για sAPRIL ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA. Τα αποτελέσματα του sAPRIL-BP επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου /απόπτωση

in vitro

αξιολογήθηκαν με χρήση του προσδιορισμού CCK-8 και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Ένα

in vivo

μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της sAPRIL-BP.

Αποτελέσματα

Τρεις υποψήφια πεπτίδια χαρακτηρίστηκαν από οκτώ φάγων κλώνοι με υψηλή συγγένεια σύνδεσης για sAPRIL. Το πεπτίδιο με την υψηλότερη συγγένεια επιλέχθηκε για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Το ταυτοποιημένο sAPRIL-BP κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα LOVO με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

In vivo

σε ένα μοντέλο πρόκλησης παχέος ποντικού, ο sAPRIL-BP μείωσε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου σε γυμνούς ποντικούς με αναστολή του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης εντός του όγκου. Επιπλέον, σε μια

in vivo

μετάσταση μοντέλο, sAPRIL-BP μειωμένη ηπατική μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων.

Συμπεράσματα

sAPRIL-BP κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου

στο vitro

και

in vivo

και θα μπορούσε να είναι υποψήφια για τη θεραπεία του παχέος εντέρου που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Απριλίου

Παράθεση:. Αυτός Xq, Guan J, Liu F, Li J, Εκείνος κ (2015) Προσδιορισμός της sAPRIL σύνδεσης πεπτιδίου και Ανάπτυξης Αναστολή των επιπτώσεών του στον καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10.1371 /journal.pone.0120564

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 1 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 5 Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το αντικείμενο της Guangzhou Επιστήμης και Τεχνολογίας Προγραμματισμένη Έργα (2012J4300091)

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο κοινές πεπτικό καρκίνους παγκοσμίως και οι ασθενείς συχνά πεθαίνουν από καρκίνο κύτταρο μετάσταση [1]. Παραδοσιακά χημειοθεραπεία έχει μειονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένων, διαφορετικούς βαθμούς της κυτταροτοξικότητας και εκτός επιδράσεις στόχο που μπορεί να βλάψει υγιείς ιστούς, οι παρενέργειες αυτές έχουν αρνητικές επιπτώσεις στην ποιότητα ζωής του ασθενούς. Είναι σημαντικό να υπάρξει μια στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου που έχει χαμηλή κυτταροτοξικότητα και είναι εξαιρετικά επιλεκτική για τη βελτίωση του ρυθμού πρόγνωση και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μια Διάδοσης-συνδέτη που επάγει (Απρίλιος) είναι ένας συνδετήρας στο νέκρωσης όγκων παράγοντα (TNF) που λειτουργεί ως ένα διαλυτό παράγοντα [2]. Το APRIL είναι κυρίως εκφράζεται από αιμοποιητικά κύτταρα και έχει βιολογικούς ρόλους στην επιβίωση των κυττάρων Β και την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων [3-5]. Φυσιολογικών ιστών εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα του Απριλίου, ωστόσο, καρκινικές κυτταρικές σειρές και όγκους, όπως του πεπτικού καρκίνου, αιματολογικές κακοήθειες και ο καρκίνος ουροθηλιακά, εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Απριλίου [6-9]. Το APRIL είναι εμπλέκεται σε πολλαπλές διαδικασία που σχετίζονται με ογκογένεση, όπως η προώθηση του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση σε διάφορους τύπους καρκίνου [10-14]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, η υψηλή έκφραση του Απριλίου συσχετίζεται στενά με την ανάπτυξη του όγκου, μετάσταση, και 5-φθοροουριδίνης (5-FU) αντίσταση [12, 13, 15].

Απρίλιος ασκεί τις βιολογικές λειτουργίες του αλληλεπιδρώντας με διάφορους υποδοχείς. Γνωστά υποδοχείς Απρίλιος περιλαμβάνει αντιγόνου Β ωρίμανση κυττάρων (BCMA), διαμεμβρανική ενεργοποιητή και παράγοντα αλληλεπίδρασης συνδέτη κυκλοφιλίνης (ΤΑΟΙ), και πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης (HSPGs) [7, 16]. BCMA εκφράζεται κυρίως σε ώριμα Β λεμφοκύτταρα [17], αλλά είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται επί κυττάρων πολλαπλού μυελώματος [18]. TACI εκφράζεται κυρίως σε ώριμα Β κύτταρα και κύτταρα πλάσματος [19], και HSPGs ευρέως εκφράζονται επί της επιφανείας πολλών κυττάρων θηλαστικών [20]. Κατά την σύνδεση με αυτούς τους υποδοχείς ΑΠΡΙΛΙΟΥ ενισχύει τον πολλαπλασιασμό, ή καταστέλλει την απόπτωση για την προώθηση της προόδου των όγκων μέσω πολλαπλών μοριακών μηχανισμών. Σε Β-κυττάρου χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (Β-CLL), διαλυτό Απρίλιο διεγείρει την ενεργοποίηση ΝΡ Μb, και προστατεύει Β-CLL κύτταρα από αυθόρμητη ή επαγόμενη από φάρμακα απόπτωση [21]. Στο Β κύτταρα μη Hodgkin λέμφωμα (NHL), ανασυνδυασμένη Απρίλιο ενεργοποιεί ΝΡ Μb, ρυθμίζει προς τα πάνω τους αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL, και ρυθμίζει προς τα κάτω την προ-apototic πρωτεΐνη Bax να αναστέλλουν την απόπτωση [14]. Σε κύτταρα γλοιώματος, έκτοπη έκφραση του Απριλίου παρέχει προστασία από συνδέτη θάνατο /απόπτωση με τη μεσολάβηση υποδοχέων ενδεχομένως με προς τα πάνω ρύθμιση αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Χ-συνδεδεμένη αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ) [22]. Στο πολλαπλό μυέλωμα ΑΠΡΙΛΙΟΥ προάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της αύξησης φάση S και G

2-Μ φάσης [23]. Σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, χτυπώντας κάτω Απρίλιο χρησιμοποιώντας μπλοκ παρεμβολή RNA αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (TGF) -μ1 σηματοδότηση και η ενεργοποίηση των εξωκυτταρικών κινασών σήματος ρυθμιζόμενη (ERK) για να προκληθεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [24].

Στόχευση Απριλίου έως καταστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση θα μπορούσε να είναι μια εφικτή στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Άλλοι έχουν δείξει ότι η φίμωση Απρίλιο μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25-27]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι μειορρύθμιση του Απριλίου μειώνει τον πολλαπλασιασμό, αυξάνει την απόπτωση, και ενισχύει την ευαισθησία σε 5-FU στην χημειοθεραπεία ορθοκολικού κυτταρική γραμμή LOVO, το οποίο εκφράζει υψηλά επίπεδα του Απριλίου [28]. Gao

et al

. έχουν αναπτυχθεί με επιτυχία ένα αντι-ΑΠΡΙΛΙΟΣ μονοκλωνικό αντίσωμα και επέδειξε αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του

in vitro

και

in vivo

[29]. Άλλες ομάδες έχουν χρησιμοποιήσει ανασυνδυασμένους υποδοχείς sAPRIL ή μεταλλαγμένο sAPRIL να ανταγωνιστεί με την ενδογενή sAPRIL για την πρόσδεση στους υποδοχείς του [30, 31]. Σε σύγκριση με άλλες στρατηγικές για τη στόχευση ΑΠΡΙΛΙΟΥ όπως siRNA ή αντισώματα αντι-ΑΠΡΙΛΙΟΣ, πολυπεπτίδια έχουν αρκετά πλεονεκτήματα συμπεριλαμβανομένης της χαμηλής ανοσογονικότητας, υψηλό βαθμό ασφάλειας, ευκολίας σύνθεσης και καθαρισμού, η ικανότητα να διεισδύει σε ιστό και όργανα, και μικρότερη τοξικότητα. Ο εντοπισμός και η σύνθεση πολυπεπτιδίων κατά του όγκου έχει γίνει ένα δημοφιλές στρατηγική για την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών κατά του καρκίνου [32, 33]. Ωστόσο, δεν Απρίλιος ειδικά πολυπεπτίδια έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιορίσει sAPRIL ειδικά πεπτίδια πρόσδεσης χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη έκθεσης φάγου, και για την αξιολόγηση του

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινικές επιδράσεις για να παρέχει ένα θεραπευτικό υποψήφιο για χρήση κατά του παχέος εντέρου που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Απριλίου

Υλικά και Μέθοδοι

In vitro panning

η ανθρώπινη ανασυνδυασμένη sAPRIL (R & amp? D, USA). χρησιμοποιήθηκε ως η πρωτεΐνη στόχος για την διαλογή από μία οθόνη φάγου 12-πεπτιδίου βιβλιοθήκη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (ΝΕΒ, USA). Εν συντομία, φάγοι από την βιβλιοθήκη προστέθηκαν επάνω σε sAPRIL επικαλυμμένα τρυβλία ELISA και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά. Χωρίς περιορισμούς φάγοι απομακρύνθηκαν με πλύση με TBST (TBS + 0,1% [ν /ν] Tween-20). Στη συνέχεια, δεσμεύεται φάγοι ξεπλυθεί με γλυκίνη-ΗΟΙ (ρΗ 2.0) και ενισχύθηκαν. Οι φάγοι με συγγένεια σύνδεσης για sAPRIL συλλέχθηκαν μετά από τέσσερις γύρους πρόσδεσης /ενίσχυσης. Εκτός από τον πρώτο γύρο, το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης για την απομάκρυνση των μη δεσμευμένων φάγων ήταν TBST (TBS + 0,5% [ν /ν] Tween-20).

Επιλογή των θετικού κλώνου με ELISA

Είκοσι ενιαία αποικίες από τον τελευταίο γύρο panning και επωάζονται με το

E

.

coli

στέλεχος ξενιστή ER2738 επί 4,5 ώρες στους 37 ° C με ανακίνηση. Μια sAPRIL επικαλυμμένα πλάκα ELISA μπλοκαρίστηκε με λευκωματίνη 5% βόειου ορού (BSA) και στη συνέχεια όλη τη νύκτα υπερκείμενο από ένα μόνο εναιώρημα φάγου αποικία προστέθηκε για 1 ώρα. Για την ανίχνευση δεσμευμένοι φάγοι, μια υπεροξειδάση (HRP) -επισημασμένο αντι-Μ13 αντίσωμα (GE Healthcare, USA) προστέθηκε για 1 ώρα, ακολουθούμενη από τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ) για 10 λεπτά, και στη συνέχεια η αντίδραση διακόπηκε με ένα Η

2SO

4 λύση. Αποικίες με ένα Α

450 που ήταν τουλάχιστον 6 φορές υψηλότερη από το θετικό μάρτυρα θεωρήθηκαν θετικά ως προς τη δέσμευση sAPRIL.

Η ανάλυση της αλληλουχίας των επιλεγμένων θετικών κλώνων και σύνθεση πεπτιδίου

Οι αλληλουχίες του οι θετικοί κλώνοι αναλύθηκαν και μεταφράζεται στις αλληλουχίες αμινοξέων, και τα αντίστοιχα πεπτίδια συντέθηκαν και καθαρίστηκαν (Hangzhou κινέζικα Company πεπτίδιο). Τα πεπτίδια πρόσδεσης sAPRIL μετά ελέγχθηκαν για συγγένεια τους για sAPRIL και ΤΝΡ υπεροικογένεια BAFF μέλος με ELISA. Το πεπτίδιο που είχε την υψηλότερη δραστικότητα πρόσδεσης για sAPRIL επιλέχθηκε για πειράματα παρακολούθησης.

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές παχέος SW620, LOVO, HCT116, ΗΤ29, και SW480 αγοράστηκαν από την ATCC. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% FBS, και 100 KU /L πενικιλλίνη & amp (Gibco BRL Co. Ltd, USA.)? στρεπτομυκίνη στους 37 ° C με 5% CO

2.

In vivo μοντέλο

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος, και έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και Χρήση σε Nanfang νοσοκομείο. Θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Guangdong Medical Laboratory Κέντρο Ζώων και διατηρείται υπό συνθήκες αξενικών. κύτταρα LOVO (2 × 10

6 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως (100 μL /ένεση? ένα σημείο της ένεσης /όγκου) και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 3 εβδομάδες, η υποδόρια όζος θεωρήθηκε ένας όγκος, όταν έφτασε 100-200 mm

3. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες και ενέθηκαν εντός του όγκου με PBS (έλεγχος), 20 mg /kg sAPRIL-BP (χαμηλή δόση), ή 40 mg /kg sAPRIL-ΒΡ (υψηλή δόση) κάθε δύο ημέρες για δύο εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: V = AB

2/2, στην οποία το Α είναι η μέγιστη διάμετρος, και Β είναι η διάμετρος κάθετα προς την γραμμή του Α

Για την παχέος καρκίνο του ήπατος μετάσταση μοντέλο, κύτταρα LOVO (2×10

6 κύτταρα /100 μL) εγχύθηκαν στο σπλήνα μετά λαπαροτομία. Τρεις εβδομάδες μετά την ένεση, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες (Ν = 5) και ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με PBS (200 μί) ως μάρτυρας, η χαμηλή δόση του sAPRIL-BP (20 mg /kg), ή υψηλή δόση του sAPRIL- ΒΡ (40 mg /kg) τις ημέρες 22, 24, 26, 30, 32, και 34 μετά την ένεση του όγκου. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 35. Τα συκώτια συγκομίστηκαν και ο αριθμός και το μέγεθος των μετασταθεί οζιδίων προσδιορίστηκε.

Αντίστροφα αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφάσης πολυμεράσης (RT-PCR)

RNA από τον ορθοκολικό καρκίνο κύτταρο γραμμές εκχυλίζεται με ΤπζοΙ (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας κιτ RevertAID (Fermentas, Καναδάς). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PCR προμίγματος (SBS Genetech, Κίνα). Οι αλληλουχίες εκκινητή για τον Απρίλιο ήταν: προς τα εμπρός 5′-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 ‘και αντίστροφη 5′-CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3′ (προϊόν 394 bp). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές GAPDH ήταν: προς τα εμπρός 5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 ‘και αντίστροφος 5′-AGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (προϊόν 240 bp). Οι συνθήκες αντίδρασης PCR ήταν: 95 ° C για 3 λεπτά, 94 ° C για 50 s, 58 ° C για 30 s, και 72 ° C για 1 λεπτό, για 32 κύκλους, που ακολουθείται από επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης και οπτικοποιούνται με ακτινοβολία UV.

Western Blotting

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κατά ΑΠΡΙΛΙΟΥ D1 κυκλίνης, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε, κυκλίνη Β1, CDK4, CDK6, ρ53, ρ27, και ρ16 (1: 1000, Abcam, USA) και κουνελιού αντι-GAPDH (1: 2000, ZSGB- ΒΙΟ, Κίνα).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

LOVO και SW620 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (2 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σε όγκο 200 μL τη διάρκεια της νύχτας . Προστέθηκαν πέντε δόσεις πεπτιδίου πρόσδεσης ανασυνδυασμένου sAPRIL (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 40 μΜ και 80 μΜ) για 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ CCK-8 (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης ανάλυση

κύτταρα LOVO σπάρθηκαν σε καλλιέργειας 6 φρεατίων πλάκες (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο /mL). Μετά από 24 ώρες, sAPRIL πεπτίδιο (20 μΜ ή 40 μΜ) δεσμευτικός προστέθηκε για επιπλέον 48 ώρες. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής (BD LSR flowcytometer, BD Biosciences, USA), τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 7% αιθανόλη για 24 ώρες σε 4 ° C. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διάλυμα (50 μg /mL ΡΙ, 100 μg /mL RNAse Α, 0,2% Triton Χ-100) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT. Για την ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής, τα μαζεμένα κύτταρα βάφτηκαν με ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, 5 μΐ αννεξίνης V-FITC, και 5 μί PI για 5-15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.

χρώση Ανοσοϊστοχημεία

Όλα ξενομοσχεύματος όγκοι μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη για κοπή. Για ανάκτηση αντιγόνου, τομές ιστών τοποθετήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα 0.01 Μ κιτρικού σε ρΗ 6,0 και στη συνέχεια θερμαίνεται στους 98 ° C έως 100 για 15 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση των τμημάτων σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% (σε φρέσκο ​​μεθανόλη) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τομές ιστών χρωματίστηκαν με πρωτεύον αντισώματα ειδικά για Ki-67 (1: 100, Abcam, USA) και διασπασμένη κασπάση 3 (1: 200, CST, USA). Ένα αντι-ποντικού IgG αντίσωμα συζευγμένο δευτερεύον κουνελιού (1: 200, Abcam, USA) χρησιμοποιήθηκε. Θετική χρώση οπτικοποιήθηκε με DAB. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο της Olympus BX41. Το ποσοστό των Κί67-θετικών κυττάρων όγκου (πολλαπλασιαστική δείκτης) και το ποσοστό των κυττάρων του όγκου διασπάται κασπάση-3-θετικοί (δείκτης απόπτωσης) προσδιορίστηκαν για τρία ξεχωριστά πεδία που περιέχουν τουλάχιστον 1000 γειτονικά κύτταρα για κάθε διαφάνεια.

Στατιστικά

Όλα τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα SPSS έκδοση 17.0 του λογισμικού. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD), εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ή δύο-tailed t test. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκε σημαντική όταν

σ

& lt? 0,05

Αναγνώριση των ειδικών sAPRIL δεσμευτικό πεπτίδιο

χρησιμοποιήθηκε Μια βιβλιοθήκη φάγων

Αποτελέσματα

. για τον εντοπισμό 20 μόνο κλώνους που εκφράζουν το δυναμικό πεπτίδια δέσμευσης sAPRIL. Οι κλώνοι επιλέχθηκαν τυχαία μετά από τέσσερις γύρους panning. Οκτώ απλοί κλώνοι ταυτοποιήθηκαν ως «θετικές» υποδεικνύοντας μία υψηλή συγγένεια σύνδεσης (που ορίζεται ως μια OD ≥6 φορές την OD του θετικού μάρτυρα) για sAPRIL με ELISA (Σχήμα 1Α). Οι οκτώ κλώνοι αντιπροσωπεύονται τρεις αλληλουχίες DNA που αντιστοιχούν στις ακόλουθες πολυπεπτίδια δέσμευσης (ΒΡ): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, και SNLHDNNTEKNV (Πίνακας 1). Η συγγένεια για sAPRIL μετρήθηκε για κάθε πολυπεπτίδιο με ELISA και σύγκριση με ένα άσχετο πολυπεπτίδιο (HWDPFSLSAYFP) ως αρνητικός έλεγχος. Τα τρία πεπτίδια που αναγνωρίζονται με τη χρήση της βιβλιοθήκης φάγων είχε συγγένειες δέσμευσης sAPRIL που ήταν 13,7, 10,8 και 9,3 φορές υψηλότερη από το πεπτίδιο ελέγχου, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Η συγγένεια δέσμευσης του sAPRIL-BPs ελέγχθηκε επίσης ενάντια σε ένα άλλο TNF υπεροικογένειας συνδετήρα BAFF (παράγοντας ενεργοποίησης Β-κυττάρου της οικογένειας TNF). Οι συγγένειες δέσμευσης για κάθε sAPRIL-ΒΡ ήταν 1.2, 1.1, και 0.9, αντίστοιχα (Σχήμα 1Β). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η sAPRIL-ΒΡ συνδέεται ειδικά με τον Απρίλιο και δεν αντιδρούν εγκάρσια με BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) είχε την υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε

in vitro

να εκτιμήσει αν ήταν σε θέση να αναστέλλουν sAPRIL δεσμευτικός ως προς το σταθερό ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά κυττάρων LOVO (Σχήμα 1C). sAPRIL-ΒΡ1 έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στην sAPRIL σύνδεση με τα κύτταρα LOVO. Ως εκ τούτου, sAPRIL-BP1 (εφεξής sAPRIL-BP) επιλέχθηκε για περαιτέρω λειτουργικός χαρακτηρισμός.

(Α) Η συγγένεια δέσμευσης των κλώνων φάγων No.1-20 για sAPRIL προσδιορίστηκαν με ELISA. Ο κλώνος 21 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η αναδίπλωση αλλαγή της οπτικής πυκνότητας κανονικοποιήθηκε προς το θετικό μάρτυρα. Οι κλώνοι που είχαν τουλάχιστον ένα 6-φορές μεγαλύτερη συγγένεια από το θετικό μάρτυρα θεωρήθηκαν «θετικό» για σύνδεση sAPRIL. (Β) Τρεις δέσμευσης πεπτίδια συντέθηκαν και συγγένεια δέσμευσης τους με sAPRIL (μαύρες μπάρες) προσδιορίστηκε και συγκρίθηκε με τον αρνητικό έλεγχο (NC) με τη χρήση ELISA. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα εκτιμήθηκε με μέτρηση της συγγένειας δέσμευσης με τον BAFF (γκρι ράβδοι). (C) Κλώνος BP1 (sAPRIL-BP) αναμίχθηκε με sAPRIL σε διαφορετικές δόσεις για να ανταγωνίζονται για σύνδεση με σταθερά κύτταρα LOVO.

Η

Αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της sAPRIL δεσμευτικών πεπτιδίων σε κύτταρα LOVO

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του Απριλίου στο ορθοκολικό καρκίνο, η έκφραση Απρίλιο ήταν εξετάστηκε σε πέντε ανθρώπινο ορθοκολικό κυτταρικές σειρές με RT-PCR (Σχήμα 2Α και 2Β) και κηλίδωση Western (Σχήμα 2C και 2D). Το κυτταρικές σειρές LOVO HCT116 και είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του Απριλίου του mRNA (

σ

& lt? 0,05) και πρωτεΐνες (

σ

& lt? 0,05) από τις κυτταρικές σειρές SW480, SW620, και ΗΤ29. Ως εκ τούτου, η επίδραση της sAPRIL-BP αξιολογήθηκε σε LOVO και HCT116 (Απρίλιος

υψηλή) κύτταρα, και SW620 και (Απρίλιος

χαμηλή) κύτταρα HT-29. Για να προσδιοριστεί αν υπήρχαν δόση επιδράσεις, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρήθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις sAPRIL-BP. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού αναστέλλεται σημαντικά (

ρ & lt?

0,05) με κατεργασία με sAPRIL-BP σε LOVO και κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3Α) σε ένα χρονικό και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν η περίπτωση σε SW620 και κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 3Β). αποτελέσματα εκεί δείχνουν ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της sAPRIL-BP είναι ειδικά για το μήνα Απρίλιο

υψηλής κύτταρα.

έκφραση Απρίλιο αξιολογήθηκε σε πέντε ανθρώπινου παχέος κυτταρικές σειρές (αναγράφεται) χρησιμοποιώντας RT-PCR (Α) και Κηλίδωση Western (C). Αντιπροσωπευτικά εικόνες gel εμφανίζεται. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι οπτικές πυκνότητες του mRNA Απρίλιο (Β) και της πρωτεΐνης (Δ) ζώνες αναλύθηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς τον εσωτερικό έλεγχο. *

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με SW620, ΗΤ-29, ή SW480

Η

(A) Απρίλιος

υψηλή LOVO και κύτταρα HCT116 και (Β) Απρίλιος

χαμηλή SW620 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις των πεπτιδίων πρόσδεσης sAPRIL για 24, 48, και 72 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ CCK-8. Το ποσοστό της αναστολής του πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε ως: (%) = [(μέση τιμή OD

ελέγχου μέση της OD

πειραματική) /μέση τιμή της OD

έλεγχος] × 100%

Η.

Επιδράσεις της sAPRIL πρόσδεσης πεπτιδίων επί του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση σε κύτταρα LOVO

Δεδομένου ότι ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται κυρίως από τον κυτταρικό κύκλο, έχουμε την επόμενη προσδιορίζεται επίσης το στάδιο του κυτταρικού κύκλου επηρεάστηκε από sAPRIL θεραπεία. Με βάση τα αποτελέσματα του πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3Α), επιλέξαμε να δοκιμάσει 20 μΜ και 40 μΜ sAPRIL-BP σε κύτταρα LOVO να καθορίσουν τον τρόπο αναστολή sAPRIL μεταβληθεί τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση. Με κυτταρομετρία ροής, sAPRIL-BP αυξήθηκε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων του G

0 /G

1 φάση σε χαμηλές δόσεις (20 μΜ sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%?

p

& lt? 0.001) και η υψηλή δόση (40 μΜ sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%?

ρ

& lt? 0.001) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP επίσης μείωσε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων στο G

2 /M φάση σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (24,3 ± 0,8%) στη χαμηλή δόση (20 μΜ sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%?

σ

& lt? 0,05) και η υψηλή δόση (40 μΜ sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%?

σ

& lt? 0.001? Σχήμα 4Α και 4Β). Αυτό υποδηλώνει ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της sAPRIL-BP στα κύτταρα LOVO αυτά οφείλονται στη συσσώρευση των κυττάρων στο G

0 /G

1 στάδιο, το οποίο εξέλιξη μπλοκ του κυτταρικού κύκλου. Όσον αφορά τις αποπτωτικά αποτελέσματα του sAPRIL-BP, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι sAPRIL-BP είχε δοσοεξαρτώμενη συνέπειες για το ποσοστό των κυττάρων LOVO σε πρώιμη απόπτωση (ΡΙ

– Annexin V

+ κύτταρα). Σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος (1,76 ± 0,12%) της χαμηλής δόσης (20 μΜ sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%?

σ

& lt? 0,05) και υψηλή δόση (40 μΜ sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %?

σ

& lt? 0,05) αυξήθηκαν σημαντικά στις αρχές αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 4C και 4D). Ερευνήσαμε περαιτέρω το δυνατόν μοριακός μηχανισμός που υπογραμμίζει την επίδραση της sAPRIL-BP στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η θεραπεία με sAPRIL-BP είχε καμία επίδραση στην κυκλίνη Α, Β, Ε1, CDK6, ρ53, ρ27, ρ16 και της έκφρασης (Σχήμα 5Α). Όμως, η έκφραση της G1 /S-ειδική πρωτεΐνη κυκλίνης D1 (Σχήμα 5Α και 5Β) και κινάση κυτταρική διαίρεση εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 4 (CDK4) (Σχήμα 5Α και 5C) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο με κατεργασία με sAPRIL- BP.

κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις sAPRIL-BP επί 48 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ για ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (Α και Β) και ΡΙ + αννεξίνης V για ανάλυση απόπτωσης (C και D) με κυτταρομετρία ροής. *

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? #

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής δόσης

Η

κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις sAPRIL-BP για 48 ώρες.. (Α) Τα επίπεδα έκφρασης των αναφερόμενων πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με ανάλυση Western Blotting. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Το μέγεθος πρωτεΐνη Κυκλίνης D1 είναι 34 kDa, η κυκλίνη Α 49 kDa, Κυκλίνη Ε 50 kDa, κυκλίνη Β1 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 37 kDa, ρ53 53 kDa, ρ27 27 kDa, ρ16 40 kDa, και GAPDH 36 kDa. Οι οπτικές πυκνότητες του κυκλίνης D1 (Β) και CDK4 (C) ζώνες πρωτεΐνης αναλύθηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς τον εσωτερικό έλεγχο ως φορές μεταβολής. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα του οχήματος? #

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με 10 μΜ ομάδα, †

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με 20 μΜ ομάδα

Η

Επίδραση της sAPRIL-BP για το. ξενομόσχευμα ανάπτυξη του όγκου

στη συνέχεια, το

in vivo

επίδραση της sAPRIL-BP αξιολογήθηκε στην παχέος μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου. κύτταρα LOVO εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς που ακολουθείται από έλεγχο, χαμηλή (20 mg /kg) ή υψηλή (40 mg /kg) δόση sAPRIL-BP με ένεση εντός του όγκου άπαξ καθιερώθηκε ο όγκος. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν την ημέρα 14, οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των ποντικών και οι όγκοι που φαίνεται στο Σχ 6Α. Η θεραπεία με sAPRIL-BP δοσοεξαρτώμενο μείωσε τον όγκο του όγκου (Σχήμα 6Α) και το βάρος του όγκου (Σχήμα 6Β) στο μοντέλο ποντικού. Από την ημέρα 8 της ένεσης sAPRIL-BP, το μέγεθος του όγκου των ομάδων χαμηλής και υψηλής δόσης ήταν σημαντικά

(ρ & lt?

0,05). Μικρότερη από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6C)

κύτταρα LOVO ήταν ενέθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς και αφήνεται να αναπτυχθεί για 3 εβδομάδες. Μόλις ο όγκος ήταν καθιερώνει, οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε 3 ομάδες (Ν = 5) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS (έλεγχος), χαμηλής (20 mg /kg), ή υψηλή (40 mg /kg) δόση του sAPRIL-BP κάθε δεύτερη μέρα . (Α) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των όγκων από κάθε ομάδα παρουσιάζεται. Top πίνακα: bar Κλίμακα, 8 mm. Κάτω πίνακα: bar Κλίμακα, 7 mm. (Β) Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από δύο εβδομάδες θεραπείας με sAPRIL-BP και τα βάρη των όγκων καταγράφηκαν. *

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. #

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής δόσης. (Γ) Το μέγεθος του όγκου καταγράφηκε κάθε δύο ημέρες κατά τη διάρκεια της θεραπείας. *

σ

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Επίδραση της sAPRIL-BP στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση στο

ξενομόσχευμα όγκου

Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός με τον η οποία sAPRIL-BP αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος, εκτελέσαμε η &? χρώση Ε (Σχήμα 7Α) στους ιστούς όγκου και βρέθηκε ότι η θεραπεία με είτε χαμηλή δόση ή υψηλή δόση sAPRIL-BP δεν είχαν σημαντικά αποτελέσματα στη μορφολογία των κυττάρων του όγκου και την αρχιτεκτονική μάζα όγκου . Παρατηρήθηκαν Μια μέτρια αριθμό μεγαλύτερων κενών χώρων μεταξύ των κυττάρων του όγκου στην ομάδα υψηλής δόσης από τις άλλες δύο ομάδες. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 επί ξενομοσχεύματος όγκων (Σχ 7Β και 7D) έδειξαν sAPRIL-BP ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vivo

με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση, ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη απόπτωσης διασπασμένη κασπάση 3 (Εικόνα 7C και 7Ε) έδειξαν κατεργασία sAPRIL-BP είχε ως αποτέλεσμα σημαντική και εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. . Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν το sAPRIL-BP αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της αναστολής του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης

παραφίνη ενσωματωμένα ιστούς όγκων χρησιμοποιήθηκαν για μορφολογική ανάλυση με Η &? Ε χρώση (Α), η ανάλυση πολλαπλασιασμού με χρώση Κί67 (Β), και ανάλυση απόπτωσης με διασπασμένης κασπάσης-3 (θρο-Casp-3) χρώση (C). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των όγκων από κάθε ομάδα παρουσιάζεται (μεγέθυνση 200 Χ). Ο δείκτης πολλαπλασιασμού (D) και του δείκτη απόπτωσης (Ε) υπολογίστηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς την ομάδα ελέγχου (Con). *

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. #

σ

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα των 20 mg /kg

Η

Επίδραση της sAPRIL-BP στην μετάσταση όγκου ξενομοσχεύματος

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η sAPRIL- BP αναστολή θεραπεία μετάστασης, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο μετάσταση στο ήπαρ από την έγχυση των κυττάρων LOVO στο σπλήνα. Εκπρόσωπος φωτογραφίες του μεταστατικού ήπατος όγκου φαίνεται στο σχήμα 8Α. Η θεραπεία με sAPRIL-BP μείωσε τον αριθμό των μεταστατικών οζιδίων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 8Β?

ρ

& lt? 0,05). Η κατανομή των μεγεθών οζιδίου ήταν παρόμοια σε κάθε ομάδα (σχήμα 8C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν θεραπεία sAPRIL-ΒΡ όχι μόνο την ανάπτυξη του όγκου μειώνεται, αλλά επίσης μειώθηκε μετάσταση στο ήπαρ σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου.

κύτταρα LOVO ενέθηκαν σε σπλήνες γυμνών ποντικών να παρατηρήσει πειραματική μετάσταση στο ήπαρ. Τρεις εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε 3 ομάδες (Ν = 5) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS (έλεγχος), χαμηλής (20 mg /kg), ή υψηλή (40 mg /kg) δόσεις sAPRIL-BP κάθε δεύτερη μέρα. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από δύο εβδομάδες θεραπείας με sAPRIL-BP. (Α) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των μεταστατικών όγκων του ήπατος από κάθε ομάδα παρουσιάζεται. (Β) Ο αριθμός των μεταστατικών οζιδίων ανά ποντικό καταγράφηκαν. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. #

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής δόσης. (Γ) Ο αριθμός των μεταστατικών οζιδίων με την υποδεικνυόμενη μέγεθος καταγράφηκαν. Συνολικός αριθμός των μεταστατικών οζιδίων:. N = 197 (Con), n = 130 (20 mg /kg), και η = 84 (40 mg /kg)

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν ένα sAPRIL-BP που θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός για τον ορθοκολικό καρκίνο.

In vitro μελέτες έδειξαν

τόσο αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της sAPRIL-BP. Σταθερά, sAPRIL-BP μειώνεται

in vivo

ανάπτυξη του όγκου, μειώνοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εντός του όγκου και αύξηση εντός του όγκου απόπτωση των κυττάρων. Επιπλέον, sAPRIL-BP μείωσε σημαντικά τη μετάσταση ήπατος από ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων σε ένα μοντέλο ποντικού. Τα αποτελέσματα της sAPRIL-BP που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη θα πρέπει να δοκιμάζονται περαιτέρω σε κλινικές δοκιμές. πολυπεπτίδια αντι-καρκίνο έχουν πολλαπλά πλεονεκτήματα, όπως η εύκολη σύνθεση και τον καθαρισμό, χαμηλή ανοσογονικότητα, και το υψηλό ποσοστό διείσδυσης. Αυτό sAPRIL-BP θα μπορούσε να είναι μια εφικτή στρατηγική για την αγωγή Απρίλιο

υψηλή καρκίνους [34-38].

Μια βιβλιοθήκη έκθεσης φάγων περιέχει ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών πολυπεπτιδίων που εκφράζονται στην επιφάνεια των φάγων [39]. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται ευρέως για φαρμακευτικούς στόχους διαλογή, αγωνιστή υποδοχέα /ανταγωνιστής, ανάλυση επιτόπου αντιγόνου, το σχεδιασμό εμβολίου και ανάλυση της δομής της πρωτεΐνης [40-42]. Εμείς που απασχολούνται αυτή τη μέθοδο για την ανάπτυξη sAPRIL δεσμευτική ειδικά πεπτίδια. Επειδή ένας από τους μηχανισμούς που διέπουν την ογκογένεση είναι η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης, οι στρατηγικές κατά του καρκίνου που περιλαμβάνουν αναστολή του πολλαπλασιασμού και /ή επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα συνιστάται [43, 44]. Υποθέσαμε ότι οι δεσμευτικές πεπτίδια, τα οποία ανταγωνίζονται με ενδογενείς υποδοχείς Απρίλιο δεσμεύοντας την διαλυτή μορφή του Απριλίου, θα έχουν θεραπευτική αποτελεσματικότητα έναντι Απρίλιο

υψηλή καρκίνους. Παρόμοιες στρατηγικές στόχευσης Απριλίου, τα ως, με τη χρήση των διαλυτών μορφών των υποδοχέων δολώματα για να ανταγωνιστεί με δέσμευση συνδέτη και φίμωσης Απριλίου, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου σε ορισμένα είδη καρκίνων. Για παράδειγμα, η διαλυτή μορφή του BCMA έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την πολλαπλασιαστική δραστικότητα του Απριλίου

in vitro

και μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου σε γυμνά ποντίκια [45]. Προς τα κάτω ρύθμιση του Απριλίου από φακοϊό μεσολάβηση RNAi αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

και

in vivo

[46]. Wang

et al

. [15, 26] χρησιμοποιείται επίσης siRNA να φιμώσουν Απρίλιο σε ένα γυμνό παχέος μοντέλο καρκίνου του ποντικιού και διαπίστωσε ότι ο Απρίλιος νοκ ντάουν αυξημένη καρκινικών κυττάρων απόπτωση και μειωμένη ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. Παρομοίως, έχουμε δείξει παλαιότερα ότι φακοϊό μεσολάβηση RNAi knockdown του Απριλίου αναστέλλει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων LOVO και αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων στην φάση Ο0 /Ο1 και μειώνει τον αριθμό στο /Μ φάση G2 [28]. Συνεπής με την προηγούμενη εργασία, η μελέτη αυτή έδειξε ότι η στόχευση Απρίλιο χρησιμοποιώντας sAPRIL-BP έχει κάποια αποτελεσματικότητα έναντι ορθοκολικού καρκίνου γραμμές.

Προηγούμενες εργασίες [14, 21, 22, 24] πρότεινε ότι οι αντι-αποπτωτικών μηχανισμών της sAPRIL -BP μπορεί να οφείλονται σε μπλοκάρισμα NF-κΒ σηματοδότηση, και η ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2, Bcl-xL, ΧΙΑΡ, ERK, και TGF-β) ή προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως Bax. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί μέσω των οποίων sAPRIL-BP αυξημένη απόπτωση στα κύτταρα LOVO μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. Επιπλέον, η sAPRIL-BP εντοπίσαμε έδειξε ειδική συγγένεια δέσμευσης με sAPRIL και σημαντική ικανότητα να αναστέλλουν συναγωνιστικά δέσμευση σε υποδοχείς Απριλίου σχετικά κύτταρα LOVO sAPRIL. HSPG είναι το μόνο υποδοχέας Απρίλιο, έδειξε σε κύτταρα LOVO (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, αν sAPRIL-BP και HSPG μοιράζονται τις ίδιες δεσμευτικές επιτόπια επί sAPRIL, και τη δομική ομοιότητα μεταξύ HSPG και sAPRIL-BP απαιτεί πρόσθετη μελέτη.

Απρίλιος ρυθμίζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων έχει εμπλακεί σε πολλούς διαφορετικούς καρκίνους, αλλά μέχρι σήμερα υπάρχουν λίγες δημοσιευμένες μελέτες που αποδεικνύουν το μοριακό μηχανισμό που διέπουν ΑΠΡΙΛΙΟΣ-μεσολάβηση ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Wang

et al

. κατέδειξαν μείωση της κυκλίνης D1 και CDK4, τα οποία είναι κρίσιμα ρυθμιστές της μετάβασης G1 /S, όταν Απρίλιο χτυπήθηκε κάτω στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.