Αφηρημένο

Ανοησίες μεσολάβηση mRNA Decay (NMD) υποβαθμίζει μεταλλαγμένο mRNA που περιέχει πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού (PTC-mRNAs ). Εδώ αξιολογούμε τη συνέπεια της NMD δραστηριότητα σε ορθοκολικούς καρκίνους (CRCs) δείχνει αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) των οποίων η εξέλιξη συνδέεται με την συσσώρευση του PTC-mRNAs που κωδικοποιούν ανοσογόνες πρωτεΐνες λόγω μετατόπισης πλαισίου μεταλλάξεις σε αλληλουχίες κωδικοποίησης επανάληψης. Αναστολή της UPF1, ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες NMD, επιτεύχθηκε με siRNA στο HCT116 κυτταρική γραμμή MSI CRC και τα προκύπτοντα αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες έκφρασης. Ο αντίκτυπος της NMD δραστηριότητας διερευνήθηκε επίσης στην πρωτοβάθμια CRCs MSI με την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των διαφόρων mRNAs σε σχέση με μεταλλάξεων την κατάστασή τους και σε ενδογενείς UPF1 και την έκφραση UPF2. ανοσίας του ξενιστή αναπτύχθηκαν εναντίον καρκινικών κυττάρων MSI εκτιμήθηκε από την ποσοτικοποίηση του αριθμού των Οϋ3ε-θετικών λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (TILs). UPF1 σίγηση οδήγησε στην ανοδική ρύθμιση του 1251 γονιδίων σε HCT116, μεταξύ των οποίων ένα ποσοστό από αυτούς (δηλαδή 38%) σημαντικά υψηλότερο από το αναμενόμενο από την τύχη περιείχε μία κωδικοποιητική μικροδορυφόρων (

P

& lt? 2 χ 10

-16). Σε MSI πρωτογενή ΚΕΣ UPF1 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε σύγκριση με φυσιολογικά παρακείμενα βλεννογόνο (

P

& lt? 0.002). Τα δεδομένα μας παρείχε στοιχεία για διαφορική αποσύνθεση του PTC-mRNAs σε σύγκριση με το αγρίου τύπου που συσχετίστηκε θετικά με την ενδογενή επίπεδα έκφρασης UPF1 (

P

= 0,02). Παρατηρήθηκε μία αρνητική επίδραση της έκφρασης UPF1 και UPF2 επί απόκριση κατά του όγκου του ξενιστή (

P

& lt? 0,01). Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NMD επηρεάζει βαθιά MSI με γνώμονα την ογκογένεση σε μοριακό επίπεδο και δείχνουν μια λειτουργική αρνητικές επιπτώσεις αυτού του συστήματος στην αντικαρκινική ανοσία του οποίου η ένταση έχει ‘επανάληψη αποδειχθεί ότι είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας ευνοϊκό αποτέλεσμα στην CRCs.

Παράθεση: El-Bchiri J, Guilloux Α, Dartigues P, Loire Ε, Mercier D, Buhard O, et al. (2008) Ανοησίες-διαμεσολαβούμενη mRNA Decay Επιπτώσεις MSI-Driven Καρκινογένεση και αντι-όγκου Ασυλία σε παχέος εντέρου. PLoS ONE 3 (7): e2583. doi: 10.1371 /journal.pone.0002583

Επιμέλεια: Cathal Seoighe, Πανεπιστήμιο του Κέιπ Τάουν, Νότια Αφρική

Ελήφθη: 2 Απρίλη του 2008? Αποδεκτές: 28η Μάη 2008? Δημοσιεύθηκε: 9, Ιουλίου, 2008

Copyright: © 2008 El-Bchiri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από την Ένωση pour la Recherche contre le Καρκίνο (αριθμός πιστωτικής 3946). JEB, την Ελλάδα και PDLG ήταν αποδέκτες μιας υποτροφίας από το Ministère Français de la Recherche (MRT)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανοησίες μεσολάβηση mRNA αποσύνθεση (NMD) είναι ένας εξελικτικά συντηρημένη μηχανισμός επιτήρησης mRNA που αναγνωρίζει και εξαλείφει παρεκκλίνουσα mRNAs που φιλοξενούν πρόωρα κωδικόνια τερματισμού (PTC), εμποδίζοντας έτσι τη συσσώρευση των δυνητικά επιβλαβή κομμένων πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα. [1] Μετά προ-mRNA ματίσματος, οι NMD στόχοι αναγνωρίζονται μέσω ενός πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα εξονίου-διασταύρωση (EJC) που εναποτίθεται 24 νουκλεοτίδια ανοδικά από κάθε σύνδεση εξονίου-εξονίου. Κατά γενικό κανόνα, έχει αποδειχθεί ότι παρεκκλίνουσα mRNAs που περιέχουν PTC βρίσκονται είτε λιγότερο από 50-55 νουκλεοτίδια ανοδικά της τελευταίας σύνδεση εξονίου-εξονίου ή στο τελευταίο εξόνιο δεν αποικοδομούνται από NMD (NMD-άσχετος) [2]. Ο πυρήνας της NMD τελεστές περιλαμβάνει τα εξελικτικά συντηρημένες πρωτεΐνες UPF, UPF1 /Ενοικίαση1, UPF2 /RENT2, και δύο παράλογα της UPF3, UPF3 (ονομάζεται επίσης UPF3a) και UPF3X (ονομάζεται επίσης UPF3b). UPF1 είναι μια ελικάση RNA του οποίου η δραστηριότητα ρυθμίζεται από τους κύκλους της φωσφορυλίωσης /αποφωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση του UPF1 απαιτεί UPF2 και UPF3 και καταλύεται από SMG1, μια πρωτεϊνική κινάση που σχετίζονται με την φωσφοϊνοσιτιδίου-3-κινάση της οικογένειας. φωσφορυλίωση UPF1 με SMG1 έχει αποδειχθεί ότι είναι το περιοριστικό του ρυθμού στάδιο στην NMD [3], [4]. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η δραστηριότητα SMG1 δεν είναι μόνο αφιερωμένη στην NMD, αλλά παίζει επίσης ρόλο στο DNA σηματοδότηση βλάβης και επισκευής, κυρίως μέσω φωσφορυλίωσης p53 [5]. Η αποφωσφορυλίωση του UPF1 διαμεσολαβείται από SMG5, SMG6 και SMG7, τρεις πρωτεΐνες που δρουν ως προσαρμογείς μεταξύ φωσφορυλιωμένης 2Α UPF1 και την πρωτεϊνική φωσφατάση [3]. UPF1 λειτουργία είναι ζωτικής σημασίας για την NMD, ενώ UPF3 και UPF3X είναι εν μέρει περιττές [6] και UPF2 είναι περιττή, σε ορισμένες περιπτώσεις, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη ενός NMD οδού UPF2-ανεξάρτητο [7]. UPF1 δρα όχι μόνο σε NMD μεσολάβηση αποικοδόμηση ανώμαλων μεταγράφων αλλά και στην φυσιολογική φθορά των διαφόρων mRNAs, που ρυθμίζουν την έκφραση του 3-10% του μεταγραφικό [8], [9]. Αποσιώπηση του UPF1 και, σε μικρότερο βαθμό UPF2 έχει αναφερθεί ότι διαμορφώνουν το επίπεδο έκφρασης ενός αριθμού φυσιολογικών υποστρωμάτων του NMD, συμπεριλαμβανομένων μεταγραφές με ανάντη ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης στην 5 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή, οι μεταγραφές που περιέχει ένα ιντρόνιο εντός 3’τους αμετάφραστη περιοχή όπως επίσης και μεταγραφές προέρχονται από τρανσποζόνιο ή ενδογενούς ρετροϊού [8], [10]. NMD έχει επίσης προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος, αφού αναλύσεις αλληλουχίας με βάση την πρόβλεψη ότι περίπου το 35% των εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος θηλαστικών παράγουν PTC περιέχουν ματισμένα παραλλαγές. Παρ ‘όλα αυτά, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι οι περισσότερες παραλλαγές ματίσματος PTC που περιέχει παράγονται σε χαμηλά επίπεδα σε ανθρώπινα κύτταρα, ανεξάρτητα από την δράση της NMD, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πλειονότητα αυτών των ΡΤΟ-εισάγοντας τα γεγονότα δεν είναι υπό θετική πίεση επιλογής και, συνεπώς, δεν είναι αναμένεται να συμβάλει σημαντικά λειτουργικά ρόλους [11].

Μέχρι σήμερα, οι συνέπειες της NMD δραστηριότητας έχουν ως επί το πλείστον διερευνηθεί σε μονογονιδιακές κληρονομικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των κληρονομικών όγκων [12]. NMD έχει αναφερθεί ότι προστατεύουν ετερόζυγοι φορείς από τα επιβλαβή αποτελέσματα κάποιων παρεκκλίνουσα PTC-mRNAs που κωδικοποιούν κολοβωμένες πρωτεΐνες με κυρίαρχη-αρνητική δραστικότητα [12]. Αντιστρόφως, NMD αδυναμία στην αποικοδόμηση NMD-άσχετη μεταγραφές έχει προταθεί να ευνοήσουν την φαινοτυπική έκφραση των κυρίαρχων κληρονομικών ασθενειών [12]. Επειδή τα καρκινικά κύτταρα είναι γενετικά ασταθείς και συσσωρεύονται πολλές σωματικές μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε γονίδια με αναμενόμενη ρόλο στον μετασχηματισμό των κυττάρων, το NMD σύστημα έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [12]. Ωστόσο, η εκτίμηση του συνολικού αντίκτυπου του σε αυτή τη διαδικασία έχει ανεπαρκώς περιγραφεί και παραμένει δύσκολο να προσδιοριστεί, δεδομένου ότι εξαρτάται από τη φύση και τον αριθμό των μεταλλακτών συσσωρευτεί σε καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Μέχρι σήμερα, NMD αναστολή έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία ως

in vitro

στρατηγική για να ανακαλύψουν νέα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο που φιλοξενούν περικοπή μεταλλάξεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί πράγματι να έχει ένα ρόλο στην ευνοούν την επιλογή κάποιων συχνών συμβάντα μεταλλάξεως σε διάφορους τύπους όγκων [13]. Είναι αξιοσημείωτο ότι NMD δραστηριότητα έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά μεταβλητή, οδηγώντας σε ατελείς και διαφορική αποσύνθεση του υποθετικά NMD-σχετικών mRNAs περιέχει μια PTC (που αναφέρεται ως NMD-διαφυγής) [14], [15], [16].

MSI όγκοι φιλοξενούν επισκευή ασυμφωνία (MMR) ανεπάρκεια είναι συχνή σε ανθρώπους. Αντιπροσωπεύουν περίπου το 15% των σποραδικών κολοορθικός, γαστρικός και του ενδομητρίου όγκων και περιλαμβάνουν νεοπλάσματα προκύπτουν στο σύνδρομο Κληρονομική μη πολυποδίαση ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC). Δεκάδες μεταλλάξεις που επηρεάζουν γονιδίων που περιέχουν ακολουθίες κωδικοποίησης επαναλαμβανόμενες έχουν αναφερθεί σε αυτούς τους όγκους, που καθορίζει το λεγόμενο μονοπάτι μεταλλάκτη του οποίου ο ρόλος είναι ύποπτο να είναι ζωτικής σημασίας για την MSI με γνώμονα ογκογένεση [17]. Μέχρι σήμερα, ένας μεγάλος αριθμός δημοσιεύσεων έχουν αναφερθεί πλαισίου μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται σε διάφορα βιολογικά μονοπάτια, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (π.χ.

TGFBR2

,

IGF2R

,

TCF4

,

AXIN2

,

PTEN

,

RIZ

), απόπτωση (π.χ.

ΒΑΧ

,

CASP5

,

BCL10

,

APAF1

,

FAS

), επιδιόρθωση του DNA βλάβη (π.χ.

ATR

,

DNA-PKcs

,

RAD50

,

MSH3

,

MSH6

,

MBD4

,

MLH3

,

BLM

,

CHK1

) και άλλοι [17]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η φθορά του πλαισίου mRNAs μετάλλαξη προέρχεται εξής

in vitro

αποσιώπηση του UPF1 ή /και UPF2 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών MSI CRC ήταν απόκλιση και ατελής [14]. Εάν δεν αποικοδομούνται πλήρως, μετατόπισης πλαισίου μεταλλαγμένο mRNAs κωδικοποιούν πρωτεΐνες που περιέχουν παρεκκλίνουσα Ο-τερματικό ουρές, μεταξύ των οποίων ορισμένες έχουν δειχθεί ότι εμφανίζουν ανοσογόνες ιδιότητες [18], [19]. Αρκετές μελέτες έχουν τονίσει το γεγονός ότι, σύμφωνα με αυτή τη διαδικασία, MSI όγκοι αξιοσημείωτα διεισδύσει από κυτταροτοξικά ενδο-επιθηλιακά διηθούν όγκο Τ λεμφοκύτταρα (TILs) και ότι μια τέτοια κυτταρική ανοσοαπόκριση ήταν προβλεπτική της σχετικά ευνοϊκή έκβαση ανεξαρτήτως της αρχικής το στάδιο του όγκου και άλλους κλινικούς παράγοντες [20]. Ως εκ τούτου, NMD δραστηριότητα μπορεί να επηρεάσει αντικαρκινικής ανοσίας, περιορίζοντας την έκφραση ορισμένων από αυτές τις παρεκκλινουσών πρωτεϊνών. Χρησιμοποιώντας MSI καρκίνο του παχέος εντέρου ως μοντέλο, έχουμε ως στόχο εδώ στην περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της NMD στην ογκογένεση.

Αποτελέσματα

μεταγραφικό αλλάζει δευτερεύουσα σε UPF1 φίμωση στα κύτταρα HCT116 CRC και τη σχέση τους με αστάθεια μικροδορυφόρου

Χρησιμοποιώντας 1,0 συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης Affymetrix GeneChip® Ανθρωπίνων εξόνιο ST, η έκφραση των γονιδίων 1363 βρέθηκε να απελευθερωθεί σημαντικά κατά UPF1 αποσιώπηση στην HCT116 κυτταρική σειρά (MSI) CRC, με μια φορές αλλαγή ≥1.5 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Πίνακας S1). Με 111 άλλους, UPF1 ήταν, όπως αναμενόταν, ένα από τα γονίδια να είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται. Το επίπεδο της αναστολής ήταν σημαντική (& gt? 75%) και συμφώνησε καλά με τα δεδομένα μας που λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Συνολικά, 1.251 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά UPF1 σίγηση (1251/1363, ήτοι το 92% του συνόλου των απελευθερωμένης γονιδίων υπό αυτές τις συνθήκες), μεταξύ των οποίων 472 (38%) περιείχε ένα μονονουκλεοτίδιο επαναλαμβανόμενη αλληλουχία τουλάχιστον 7 ζεύγη βάσεων στην περιοχή κωδικοποίησης (Πίνακας S2). Ενδιαφέρον, ο συνολικός αριθμός των γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα με ένα ≥7N κωδικοποίηση επανάληψης σωλήνα είναι χαμηλότερη (4470/22218?. 20% Τα δεδομένα δεν φαίνονται), κάνοντας σημαντικά υψηλότερο από ό, τι αναμένεται από την τύχη του συνολικού αριθμού των εν λόγω γονιδίων στόχων ανάντη ρυθμίζεται σε HCT116 μετά UPF1 σίγηση (

P

& lt? 2 × 10

-16? τεστ chi2).

Μεταξύ των προαναφερθέντων 472 γονίδια στα κύτταρα HCT116, 22 γονίδια που περιέχουν μια κωδικοποίηση μονονουκλεοτίδης επανάληψη από 7 έως 10 νουκλεοτίδια επιλέχθηκαν λόγω του υποτιθέμενου ρόλου τους στην καρκινογένεση του παχέος και διαλογή για μεταλλάξεις εισαγωγής /διαγραφής σε αυτά τα κύτταρα (Πίνακας 1). Όλα αυτά τα γονίδια αλλά 3 (

MBD4

,

MSH3

,

TGFBR2

) δεν είχε ποτέ αναφερθεί πρόκειται να μεταλλαχθεί σε MSI CRCs (Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, θα ανιχνευθεί ή να επιβεβαιώνεται ομόζυγη μεταλλάξεις στο

SLC35F5

,

TGFBR2

,

ARV1

,

MSH3

,

SMAP1

γονιδίων και ετερόζυγο μεταλλάξεις στο

MBD4

,

EFHC1

,

TTC3

, και

WDR19

γονίδια (Σχήμα 1α). Όλοι οι αντίστοιχες μεταλλαγμένο mRNA που έτρεφε ένα PTC βρίσκονται σε περιοχές κωδικοποίησης που μπορεί να είναι επιρρεπείς σε NMD. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι 4 άλλα γονίδια-στόχους με προηγουμένως περιγράφεται ετερόζυγη πλαισίου μεταλλάξεις σε HCT116 (

ΒΑΧ

,

RECQL

,

RAD50

και

MSH6

) δεν ήταν σημαντικά εκ νέου εκφράζεται εξής UPF1 σίγηση (Σχήμα 1α). Τα ποσοστά επανέκφραση για PTC-mRNA που προκαλείται από UPF1 φίμωση σε HCT116 φαίνεται στο Σχήμα 1α και υπογραμμίζουν το γεγονός ότι, όπως περιγράφεται [14], UPF1 μεσολάβηση διάσπαση mRNA είναι εξαιρετικά μεταβλητή μέσα σε μια σειρά από ενδογενώς μεταλλαγμένων PTC-mRNAs αν ειδικές δοκιμασίες έκφρασης αλληλόμορφο δεν χρησιμοποιείται για τη διαφοροποίηση μεταξύ των μεταλλαγμένων και των mRNAs άγριου τύπου στην περίπτωση ετερόζυγο πλαισίου αλλαγές.

TGFBR2

,

SLC35F5

,

ARV1

,

MSH3

,

SMAP1

,

TTC3

,

EFHC1

,

MBD4

,

WDR19

,

ΒΑΧ

,

RECQL

,

RAD50

και

MSH6

λιμάνι ομόζυγη ή ετερόζυγη μεταλλάξεις πλαισίου στην HCT116 κυτταρική σειρά MSI CRC. Χρησιμοποιώντας συστοιχία έκφρασης, πολλαπλές μεταβολές στην έκφραση των αντίστοιχων mRNAs σε σχέση με UPF1 σίγηση προσδιορίστηκαν (fold αλλαγή = Ε

mRNA σε κύτταρα κατεργασμένα με ένα UPF1 siRNA /E

mRNA σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο siRNA). Γονίδια που είναι υπογραμμισμένα είναι εκείνα των οποίων επανέκφραση ήταν σημαντική σε αυτές τις συνθήκες (1,5 φορές, να αλλάξει με μια p-value ≤0.005). Αποδεικτικά στοιχεία για τη μεταβλητή ευαισθησία σε UPF1 μεσολάβηση αποσύνθεση τέτοιων PTC-mRNAs θα μπορούσαν ως εκ τούτου να ληφθεί, αν και ειδικές δοκιμασίες έκφρασης αλληλόμορφο δεν χρησιμοποιήθηκαν για να γίνει διάκριση μεταξύ μεταλλαγμένου και φυσικού τύπου mRNAs σε περίπτωση ετερόζυγο πλαισίου αλλοιώσεις. σι. Κωδικοποίηση πλαισίου μεταλλάξεις σε γονίδια-στόχους σε σχέση με την NMD-κατάσταση στην MSI πρωτογενή CRCs. Οι συχνότητες πλαισίου μεταλλάξεις της ίδιας σειράς των 13 γονιδίων στόχων για την αστάθεια στις 44 MSI πρωτογενή CRCs εκπροσωπούνται. γονιδίων-στόχων των οποίων πλαισίου μεταλλάξεις συχνά επιλέγονται για κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της MSI CRC λιμάνι διαφορετικές ευαισθησίες σε UPF1 μεσολάβηση αποσύνθεσης.

Η

αλλαγής πλαισίου μεταλλάξεις σε MSI πρωτογενή CRCs σύμφωνα με την NMD κατάστασή τους

Όλα τα γονίδια στόχους μεταλλάσσεται σε HCT116 για τα οποία είχε προηγουμένως προσδιορισθεί η επίδραση της NMD σαρώθηκαν για μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε κωδικοποίησης μικροδορυφορικών ακολουθιών σε μια σειρά πρωτογενών MSI CRCs (n = 44). Αυτό περιλαμβάνει γονίδια των οποίων μεταλλαγμένα mRNAs είναι περισσότερο ή λιγότερο ευαίσθητα στην NMD (

TGFBR2

,

SLC35F5

,

ARV1

,

MSH3

,

TTC3

,

EFHC1

,

MBD4

,

SMAP1

,

WDR19

,

ΒΑΧ

,

RECQL

,

RAD50

,

MSH6

) (Σχήμα 1α). Οι συχνότητες μετάλλαξης αυτών των 13 γονιδίων που αντιπροσωπεύουν πιθανούς στόχους για MSI γνώμονα αστάθεια ήταν εξαιρετικά μεταβλητή σε αυτούς τους όγκους (Σχήμα 1β). Με βάση την υψηλή συχνότητα μετάλλαξης τους,

SLC35F5

,

ARV1

,

TTC3

, και

SMAP1

αντιπροσωπεύουν νέα γονίδια στόχους στους οποίους πλαισίου μεταλλάξεις δεν έχουν προηγουμένως έχουν αναφερθεί σε MSI CRC. Είχαν μεταλλαχθεί σε 48% (21/44), 23% (10/44), 32% (14/44) και 73% (32/44) των όγκων, αντίστοιχα (Σχήμα 1β).

Υπερ-έκφραση του mRNA UPF1 σε πρωτογενείς CRCs MSI

με τη μέτρηση των επιπέδων του UPF1 και UPF2 mRNAs με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR σε μια άλλη ανεξάρτητη σειρά MSI πρωτογενούς CRCs του οποίου λαμβάνεται επίσης τα δείγματα που αντιστοιχούν σε ταιριάζουν φυσιολογικό βλεννογόνο, παρατηρήσαμε μια περίπου 7-φορές υπερ-έκφραση του UPF1 σε όγκους (n = 25) σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο (

P

= 0,0015? paired t-test) (Σχήμα 2). Από την ποσοτικοποίηση (7 φορές) της υπερ-έκφρασης πρέπει να ληφθεί με επιφυλακτικότητα, λόγω της μικρής ποσότητας δεδομένων, διαπιστώσαμε ότι UPF1 mRNA ήταν πράγματι υπερ-εκφράζεται σε MSI πρωτογενή CRCs εκτελώντας ένα ποιοτικό τεστ chi-square, η οποία είναι ανθεκτική σε ακραίες τιμές. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, ο αριθμός των περιπτώσεων στις οποίες η έκφραση UPF1 ήταν υψηλότερη σε όγκους σε σύγκριση με ταιριάζουν φυσιολογικό βλεννογόνο (Ν = 20/25) ήταν σημαντικά διαφορετική από ό, τι αναμένεται από την τύχη (

P

= 0,009? Chi-square test ). Αυτά τα δεδομένα απεικονίζονται στο Σχήμα 2, στην οποία 20 και 5 ανοικτοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν δείγματα όγκων MSI υπερεκφράζουν UPF1 ή όχι, αντίστοιχα, εκπροσωπούνται πάνω από μια διακεκομμένης γραμμής που συμβολίζει την έκφραση αυτού του παράγοντα NMD σε φυσιολογικό βλεννογόνο. Ενδιαφέρον, μια τάση για υπερ-έκφραση αυτού του παράγοντα παρατηρήθηκε επίσης σε μη MSI (MSS) CRCs (n = 31) υπό τις ίδιες συνθήκες (

P

= 0,08? Paired t-test) (Σχήμα 2). Σε αντίθεση, UPF2 δεν εκφράζονται διαφορικά σε είτε MSI ή MSS CRCs σύγκριση με αντιστοιχία φυσιολογικό βλεννογόνο (

P

= 0,56 και 0,83, αντίστοιχα? Paired t-test). (Σχήμα 2)

Σε 25 MSI και 31 MSS CRCs συγκρίναμε την έκφραση της UPF1 και UPF2 μεταξύ των όγκων και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. Σε όλες τις περιπτώσεις, αλλά 5, υπερ-έκφραση του UPF1 παρατηρήθηκε σε όγκους MSI CRC. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα δείγματα, η υπερ-έκφραση του UPF1 σε όγκους MSI ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 1.5 × 10

-3? Paired t-test). Στο MSS CRCs, μια τάση για υπερ-έκφραση αυτού του παράγοντα παρατηρήθηκε κάτω από τις ίδιες συνθήκες (

P

= 0,08? Paired t-test). Σε ασθενείς με MSI ή MSS ΚΕΣ UPF2 δεν εκφράζονται διαφορικά μεταξύ όγκου και φυσιολογικού βλεννογόνου που ταιριάζουν (

P

= 0,56 και

P

= 0,83, αντίστοιχα? Paired t-test).

Σημαντική φθορά του πλαισίου mRNAs μετάλλαξη που προέρχονται από τα οποία εξαρτώνται από την έκφραση UPF1 στην MSI πρωτογενή CRCs

στη σειρά μας από 44 πρωτοβάθμια MSI ΚΕΣ θα καθορίζεται περαιτέρω η σχετική

in vivo

έκφραση της 18ης MSI γονιδίων στόχων με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας πειραματικές συνθήκες που προηγουμένως προσδιορίστηκε σε μία σειρά κυτταρικών σειρών CRC (

ATR

,

ΒΑΧ

,

BLM

,

CBF2

,

CDX2

,

GRB14

,

GRK4

,

IGF2R

,

MBD4

,

MSH3

,

MSH6

,

RAD50

,

RBBP8

,

RECQL

,

RIZ

,

TCF4

,

TFDP2

,

TGFBR2

) (Σχήμα 3 και Πίνακας S3 για την κατάστασης μεταλλάξεων αυτών των 18 γονιδίων σε MSI CRCs) [14]. Για όλα τα γονίδια εκτός από 3 (

CDX2

,

GRB14

,

TFDP2

), παρατηρήθηκε μια τάση για τη φθορά των μεταλλαγμένων σε σύγκριση με τα mRNA άγριου τύπου. Η διάσπαση του μεταλλαγμένου mRNAs σε σύγκριση με άγριου τύποι ήταν σημαντική για MSH6 (

P

= 0,02? Student t-test) και σχεδόν σημαντική για μερικά άλλα μόνο, π.χ. ΒΑΧ (

P

= 0,08), CDX2 (

P

= 0.10), MSH3 (

P

= 0.10), RIZ (

P

= 0.10 ) και TFDP2 (

P

= 0,10), παρέχοντας ενδείξεις για απόκλιση αποσύνθεση του PTC-mRNAs σε σύγκριση με το αγρίου τύπου στη σειρά των πρωτογενών CRCs, όπως περιγράφεται ήδη σε μία σειρά κυτταρικών σειρών MSI CRC [14] (Σχήμα 3). Συνολικά, υπήρξε μια πολύ σημαντική διάσπαση των PTC-mRNAs στον πρωτογενή CRCs MSI (

P

& lt? 10

-4, έλεγχος τ? Ενότητα δείτε τα «Υλικά και Μέθοδοι» για στατιστικές αναλύσεις ). Ως έμμεση απόδειξη της συμβολής της NMD, η συνολική ένταση αυτής της διαδικασίας σε MSI πρωτογενή ΚΕΣ συσχετίζεται θετικά με το ενδογενές επίπεδο έκφρασης UPF1 (

P

= 0,02, t-test του Student? Δείτε τα «Υλικά και Μέθοδοι «ενότητα για στατιστικές αναλύσεις), ενώ ο αντίκτυπος της UPF2 δεν ήταν σημαντική (

P

= 0,72, t-test του Student) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

οι τιμές ∂Ct αναφέρεται σε σχέση με η μεταλλακτική κατάσταση κάθε γονιδίου στα 44 MSI πρωτογενή CRCs (άγριου τύπου και μεταλλαγμένες δείγματα όγκου υποδεικνύονται με λευκά κύκλους και μαύρα τρίγωνα, αντίστοιχα). Για κάθε γονίδιο, υπολογίστηκαν μέσες τιμές του ∂Ct σχετίζονται με άγριου τύπου (λευκό βέλος) ή μεταλλαγμένες (μαύρο βέλος) δείγματα όγκων. Για όλα τα γονίδια εκτός από 3 (

CDX2

,

GRB14

,

TFDP2

), μια τάση για τη φθορά των μεταλλαγμένων σε σύγκριση με τα mRNA άγριου τύπου παρατηρήθηκε (τιμές ∂Ct είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την έκφραση του γονιδίου). Συνολικά, τα στοιχεία που παρέχουν ενδείξεις για σημαντική φθορά των PTC-mRNAs σε σύγκριση με το αγρίου τύπου mRNAs

in vivo

στην MSI πρωτογενή CRCs (

P

& lt? 10

-4, φοιτητής

t

-τεστ).

η

UPF1 και UPF2 είναι αρνητικοί προγνωστικοί παράγοντες της ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή έναντι MSI CRCs

Με την εξαίρεση του

TCF4

, δεν υπάρχουν σημαντικές θετικές συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ του ενδογενούς έκφρασης PTC-mRNAs και παρουσία Οϋ3ε-θετικών TILs σε όγκους (

P

TCF4 = 0,06? bootstrapped t-test) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). Η σχέση μεταξύ του αριθμού των TILs και την έκφραση των UPF1 και UPF2 δεν ήταν γραμμική αλλά λογαριθμική γραμμική. Έτσι, η επίδραση της UPF1 και έκφραση UPF2 σχετικά με τον αριθμό των TILs ερευνήθηκε

μέσω

μια δοκιμασία Wald και οι συντελεστές του μοντέλου παλινδρόμησης Poisson εκτιμήθηκαν μέσω επαναληπτικά εκ νέου σταθμισμένων ελαχίστων τετραγώνων. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, η αρνητική επίδραση της UPF1 και της έκφρασης UPF2 σχετικά με το συνολικό αριθμό των Οϋ3ε θετικών TILs καταδείχθηκε (

P

& lt? 0,01 για UPF1 και UPF2? Δοκιμών Wald). Ένα μαθηματικό μοντέλο συσχετισμού του αριθμού των Οϋ3ε-θετικών TILs με την έκφραση αυτών των NMD παράγοντες MSI CRCs καθορίστηκε, προβλέποντας ότι TILs αυξήθηκε κατά περίπου 30%, όταν η έκφραση του UPF1 μειώθηκε κατά το ήμισυ.

Τα στοιχεία αυτά απεικονίζονται για UPF1 και UPF2 στο Σχήμα 4? δείγματα όγκων στις οποίες UPF1 και την έκφραση UPF2 είναι χαμηλές (κάτω από το μέσο όρο) παρουσιάζονται με κυμαινόμενα επιτόκια των Οϋ3ε θετικής TILs ενώ τα δείγματα όγκων στις οποίες UPF1 και την έκφραση UPF2 είναι υψηλά (πάνω από το μέσο όρο) βρέθηκαν να είναι σχεδόν πάντα χαρακτηρίζεται από χαμηλή CD3 μετράνε, κάνοντας UPF1 και UPF2 δυνατόν δείκτες της κακής αντικαρκινική ανοσία σε MSI πρωτογενή CRCs.

Ο συνολικός αριθμός των Οϋ3ε θετικής TILs ήταν σημαντικά σχετίζονται με την ενδογενή έκφραση της UPF1 και UPF2 σε αυτή τη σειρά των 44 MSI πρωτογενή CRCs (

P

& lt? 0,01? δοκιμών Wald). Ενδιαφέροντος, ενώ τα δείγματα όγκων στις οποίες UPF1 και UPF2 έκφραση ήταν χαμηλό (κάτω του μέσου όρου) παρουσιάζονται με κυμαινόμενα επιτόκια των Οϋ3ε θετικής TILs, τα δείγματα όγκων στις οποίες UPF1 και UPF2 έκφραση ήταν υψηλό (πάνω από το μέσο όρο) έχουν σχεδόν πάντα χαρακτηρίζεται από χαμηλή καταμέτρηση CD3 (ελάχιστα αντισώματα CRCs). Τα δεδομένα αυτά καθιστούν UPF1 και UPF2 ειδικούς δείκτες των φτωχών αντικαρκινική ανοσία σε MSI πρωτογενή CRCs. CD3 ανοσοχρώση πρωτεΐνη παρουσιάζονται για 2 δείγματα MSI πρωτογενή CRC δείχνει είτε χαμηλής CD3 μετράνε και υψηλής UPF1 και έκφραση UPF2 (αριστερά) ή υψηλή CD3 μετράνε μαζί με χαμηλή UPF1 και έκφραση UPF2 (δεξιά).

Η

Συζήτηση

με την αξιολόγηση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων στόχων που μεταλλάχθηκαν σε κυμαινόμενα επιτόκια στην κωδικοποίηση επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες τους, που δείχνουν σημαντική φθορά των αντίστοιχων μεταλλαγμένων mRNAs σε σύγκριση με άγριου τύπου σε MSI πρωτογενή CRCs με σημαντικό αντίκτυπο της ενδογενή έκφραση UPF1 σε αυτή τη διαδικασία, με UPF2 παίζει ένα δευτερεύοντα ρόλο στη διαδικασία, όπως περιγράφηκε πρόσφατα από την ομάδα μας σε μια σειρά από κυτταρικές σειρές MSI CRC [14]. Λαμβάνεται ένα προς ένα, παρατηρήσαμε μια σημαντική ή σχεδόν σημαντική φθορά ορισμένων μόνο μεταλλαγμένου mRNAs σε σύγκριση με τον άγριου-τύπους και αυτό δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου ότι: (i) όπως δημοσιεύθηκε πρόσφατα από την ομάδα μας, NMD επιπτώσεις στην έκφραση των μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου που προέρχεται mRNAs είναι εξαιρετικά μεταβλητή από το ένα στο άλλο μετάλλαγμα [14]? (Ii) τις συχνότητες του γονιδίου-στόχου αλλοιώσεις ήταν εξαιρετικά μεταβλητά και μερικές φορές πολύ χαμηλά στη σειρά του όγκου μας? (Iii) ορισμένες μεταλλάξεις σε συγκεκριμένα

(TCF4)

είναι NMD-άσχετο. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ερευνήσει επίσης μεγάλης κλίμακας αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα MSI CRC στο πλαίσιο της NMD αναστολής χρησιμοποιώντας μία ειδική μέθοδο, δείχνοντας ότι οδήγησε στην ανοδική ρύθμιση του 1251 γονιδίων σε HCT116, μεταξύ των οποίων ένα ποσοστό από αυτά σημαντικά υψηλότερο από ό, τι αναμένεται από την τύχη περιείχε μια κωδικοποίηση μικροδορυφόρων. Αν και δεν είναι όλα αυτά που αναμένεται να μεταλλαχθεί σε κύτταρα MSI CRC, όπως φαίνεται εδώ σε μια σύντομη σειρά από πάνω ρυθμισμένα γονίδια στόχους, μπορεί να προχωρήσει η UPF1 είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη διαμόρφωση της έκφρασης δεκάδων γονιδίων μεταλλαγμένου σε MSI CRC κύτταρα. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν για πρώτη φορά, τόσο

in vitro

και

in vivo

, ότι NMD επηρεάζει βαθιά MSI με γνώμονα την ογκογένεση σε μοριακό επίπεδο.

Ως πιθανή λειτουργική συνέπεια της NMD δραστηριότητα

in vivo

σε MSI ογκογένεση, διερευνήσαμε κατά πόσον η δράση αυτού του συστήματος ρυθμίζει ανοσία κατά του όγκου. Ενδιαφέροντος, η μόνη μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου του οποίου η παρουσία ήταν σημαντικά σχετίζεται με υψηλότερο αριθμό TILs σε MSI ΚΕΣ στο

TCF4

, το μόνο NMD-άσχετο γονίδιο στόχο που μελετήθηκε στη σειρά μας ως κωδική αλληλουχία επανάληψης της βρίσκεται μέσα σε τελευταίο εξόνιο του. Επιπλέον, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ UPF1 και έκφραση UPF2 και τον αριθμό των Οϋ3ε-θετικών TILs παρατηρήθηκε σε MSI ΚΕΣ και ένα μαθηματικό μοντέλο που συνδέει τον αριθμό των Οϋ3ε-θετικών TILs στην έκφραση του NMD παράγοντες MSI CRCs προέβλεψε ότι TILs αυξήθηκε κατά περίπου 30%, όταν η έκφραση του UPF1 ή UPF2 μειώθηκε κατά το ήμισυ. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι NMD μπορεί να επηρεάσουν αρνητικά την ανοσία του ξενιστή έναντι κυττάρων όγκου MSI με αθροιστικό τρόπο

μέσω

η αντίθεση και ελλιπής αποικοδόμηση των μεταλλαγμένων μετεγγραφής που δίδουν ανοσογόνα πεπτίδια. Θα μπορούσε να σκεφτεί σε αυτό το πλαίσιο που UPF παράγοντες μπορεί να είναι ειδικοί δείκτες της κακής ασυλίας σε MSI πρωτογενή CRCs. Υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, μπορεί έτσι να προχωρήσει ότι η προαναφερθείσα αρνητικές επιπτώσεις της NMD στο ανοσοποιητικό διαδικασία που αναπτύχθηκε από τον ξενιστή εναντίον των καρκινικών κυττάρων MSI θα είναι αποτελεσματική μόνο όταν NMD παράγοντες υπερ-εκφράζεται και δραστηριοποιείται έντονα στην υποβάθμιση της πολλές PTC- mRNAs που κωδικοποιούν για ανοσογόνα πεπτίδια που συντίθενται σε MSI CRCs. Αντίθετα, μπορεί να υποτεθεί ότι, όταν εκφράζονται σε χαμηλότερες τιμές, NMD παράγοντες θα ήταν αναποτελεσματική στην πρόληψη της ανάπτυξης ενός αντι-όγκου ανοσοαπόκριση του οποίου η ένταση θα εξαρτηθεί από τον αριθμό και τη φύση των μετατόπισης πλαισίου μεταβολές συσσωρευτεί σε καρκινικά κύτταρα MSI. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να είναι κλινικά ενδιαφέρον αφού, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, η ανοσία κατά του όγκου θεωρείται γενικά ως ανεξάρτητος παράγοντας του οποίου η ένταση έχει αποδειχθεί με συνέπεια να είναι προγνωστικά της ευνοϊκή έκβαση ανεξάρτητα από το αρχικό στάδιο όγκου κόλου και άλλους κλινικούς παράγοντες [20] .

Δεδομένου ότι η αποδοτικότητα της NMD για αποικοδόμησης μεταλλαγμένο mRNAs από τα γονίδια-στόχους είναι εξαιρετικά μεταβλητή, προτείναμε πρόσφατα ότι NMD μπορεί συνεπώς να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επιλογή των μεταλλάξεων του γονιδίου στόχου με ένα λειτουργικό ρόλο στην καρκινογένεση MSI [14 ]. Αξίζει να σημειωθεί ότι μεταξύ των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά UPF1 αποσιώπηση, τέσσερις δεν έχει ακόμη δημοσιευθεί γονιδίων-στόχων (

SLC35F5

,

TTC3

,

ARV1

και

SMAP1

) είναι εδώ αποδεικνύεται να μεταλλαχθεί συχνά στη σειρά των MSI πρωτογενούς CRCs. Μεταξύ αυτών,

SMAP1

, για στρωματικά μεμβράνης Associated Protein-1, έχει προηγουμένως αναφερθεί για να συμμετάσχουν σε χρωμοσωματικών αναδιατάξεων με

MLL

σε αιματολογικές κακοήθειες [21]. Με μια συχνότητα 73% του πλαισίου μεταβολές στην πρωτογενή MSI CRCs, συμπεριλαμβανομένων ομόζυγη μεταλλάξεις σε πέντε δείγματα CRC (τα δεδομένα δεν φαίνονται), είναι ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια στόχους σε MSI CRCs μαζί με

TGFBR2

και

ACVR2

[17]. Σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας και εκείνα που λαμβάνονται από Ionov et

al.

Χρησιμοποιώντας emethine ως μη ειδικό αναστολέα της NMD συστήματος [14], [22], που επιβεβαιώθηκε στη μελέτη αυτή που

TGFBR2

PTC-mRNA αποικοδομείται μέσω NMD στα κύτταρα MSI CRC. Σε ένα πρόσφατο έγγραφο, Μπορείτε et

al.

[23] ανέφεραν αντιφατικά στοιχεία, υποστηρίζοντας ότι αυτό το γονίδιο-στόχο, καθώς και

MSH3

ξεφύγουν NMD στο HCT116 κυτταρική σειρά. Παρουσίασαν τα αποτελέσματα σε μια σειρά PTC-mRNAs που δείχνουν αυτές οι μεταγραφές ήταν είτε εντελώς ευαίσθητα ή πλήρως ανθεκτικά στην NMD στο MMR-ανεπαρκή κύτταρα. Τα δεδομένα τους ελήφθησαν με εκτέλεση δοκιμασιών έκφρασης που δεν ήταν ούτε ποσοτικά ούτε αλληλόμορφο-ειδική. Στην ίδια μελέτη, οι συγγραφείς πρότειναν επίσης μια συστηματική μεταφραστική καταστολή των κομμένων πρωτεϊνών από πλαισίου mRNAs μετάλλαξη που προέρχονται από τα οποία διέφυγαν NMD (NMTR για «Ανοησίες διαμεσολαβείται Μεταγραφική καταστολή») [23]. Επαληθεύσαμε με στύπωση Western ότι η έκφραση των αντίστοιχων πρωτεϊνών για τα δύο από τα ομόζυγο μεταλλαγμένων γονιδίων-στόχων (

TGFBR2

,

MSH3

) δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα HCT116 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση με Μπορείτε et

al

, προτείνουμε ότι η απώλεια του

TGFBR2

και

MSH3

έκφραση οφείλεται κυρίως στην NMD και όχι σε μια υποθετική οδός NMTR. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ύπαρξη ενός μονοπατιού NMTR δεν ταιριάζει καλά με τις ανοσογόνες ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων MSI που εξαρτώνται άμεσα από τη συσσώρευση των ανοσογόνων πεπτιδίων που προέρχονται από τα πολυάριθμα μετατόπιση πλαισίου που σχετίζονται με πρωτεΐνες των οποίων η PTC-mRNAs είναι NMD-σχετικές στις περισσότερες περιπτώσεις [ ,,,0],18], [19], [20]. Ανεξάρτητα από τις διαφορές, όλα αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τον ρόλο της NMD στη ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων των οποίων οι μεταλλάξεις έχουν ήδη αποδείξει

(TGFBR2

,

MSH3

,

MBD4)

ή αναμένεται να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της MSI CRC εξέλιξη [17]. UPF1 εξάντληση με shRNA σε κύτταρα μη-MSI HeLa Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε πρώιμη φάση S λόγω της συμμετοχής του παράγοντα αυτού στην επιδιόρθωση του DNA [24]. Αντιθέτως, η παροδική αποσιώπηση των UPF1 ή /και UPF2 σε MSI και MSS καρκίνου του παχέος κύτταρα (HCT116, LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές της κυτταρικής ανάπτυξης ή /και θάνατο στα χέρια μας (όχι τα δεδομένα απεικονίζεται). Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται τώρα για να καθορίσουν τον τρόπο NMD δραστηριότητα μπορεί να αλλάξει το ρεπερτόριο των γονιδίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση MSI και τις επιπτώσεις της εξέλιξης του όγκου χρησιμοποιώντας MMR μοντέλα ανεπαρκές το ποντίκι στο οποίο τροποποιείται δραστηριότητα UPF1.

Οι παρατηρήσεις μας αφορούν την πιο συχνή πρωτοπαθή όγκο τοποθεσία που σχετίζεται με MSI σε ανθρώπινο, δηλαδή του παχέος εντέρου. Αναφέρουν ότι NMD επηρεάζει βαθιά την έκφραση πολυάριθμων μεταλλακτών με αναμενόμενο κρίσιμο ρόλο στην MSI γνώμονα ογκογένεση και επιδρά αρνητικά η ανοσία ξενιστή εναντίον καρκινικών κυττάρων MSI. Μια τέτοια υποθετική ογκογόνο λειτουργία της NMD σε MSI καρκινογένεση ταιριάζει καλά με το γεγονός ότι έχουμε επίσης έκθεση εδώ για πρώτη φορά ότι είναι σημαντικά UPF1 υπερεκφράζεται σε MSI CRCs σύγκριση με αντιστοιχία φυσιολογικού βλεννογόνου. Αυτή η τελευταία παρατήρηση βασίστηκε στο μέτρο του επιπέδου UPF1 mRNA. Ως προοπτική, έχει τώρα να επιβεβαιώνεται στο επίπεδο της πρωτεΐνης μέσα από μια ποσοτική προσέγγιση, όπως κηλίδωση Western που εδώ δεν πραγματοποιήθηκε λόγω της έλλειψης διαθέσιμων επιπλέον υλικό όγκου. Η ανάπτυξη των κλινικών δοκιμών θα πρέπει τώρα να αναπτυχθεί για να δούμε αν NMD μπορεί να θεωρηθεί ως παράγοντας κακής πρόγνωσης σε MSI CRCs ή όχι. Μικρά μόρια αναστολής NMD είναι τώρα διαθέσιμα [25] και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με την NMD ρόλο σε καρκίνους. Τώρα σχεδιάζουν να χρησιμοποιήσουν αυτά τα φάρμακα στο MMR-ανεπαρκή ποντίκια ανάπτυξη MSI νεοπλάσματα να αξιολογήσει κατά πόσον αυτό μπορεί να αποτελέσει ένα νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία αυτών των όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα όγκων και κυτταρικές σειρές

Ο CRC HCT116 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε DMEM (ϋίβ Technologies) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen) και γλουταμίνη χωρίς αντιβιοτικά για να επιτρέψει πειράματα παροδικής επιμόλυνσης με siRNA. Σαράντα τέσσερις MSI πρωτογενών όγκων ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του παχέος εντέρου? Όλες οι περιπτώσεις ιστοπαθολογικά επιβεβαιωθεί ότι είναι αδενοκαρκινώματα. Συνολικές όγκοι συστηματικά σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη και καταψύχθηκε μετά το χειρουργείο χωρίς καμία προηγούμενη ενσωμάτωση σε υγρό άζωτο. Η κατάσταση MSI καθορίστηκε με φθορίζοντα multiplex PCR περιλαμβάνει 5 quasimonomorphic επαναλήψεις μονονουκλεοτίδιο (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 και NR-27), όπως περιγράφεται [26].