Αφηρημένο

CD44 είναι μια διαμεμβρανική γονίδιο του υποδοχέα υαλουρονικού οξέος που κωδικοποιεί πάνω από 100 διαφορετικές ισομορφές της πρωτεΐνης ιστού-ειδικό. Η πλέον πανταχού παρούσα, CD44 πρότυπο, έχει χρησιμοποιηθεί ως ένας δείκτης καρκινικό κύτταρο στελέχους σε καρκίνους των ωοθηκών και άλλων. Η έκφραση της επιθηλιακής παραλλαγής CD44 που περιέχουν εξόνια v8-10 (CD44v8-10) έχει συσχετισθεί με περισσότερο στη χημειοθεραπεία και μεταστατικών όγκων στο γαστρεντερικό και του μαστού, αλλά ο ρόλος της στον καρκίνο των ωοθηκών είναι άγνωστη? Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε η χρήση του ως προγνωστικός δείκτης σε αυτή την ασθένεια. Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του 254 δείγματα όγκων από τον καρκίνο Γονιδιώματος Atlas RNAseqV2 αναλύθηκαν για την παρουσία ισομορφών CD44. Μια τάση για μεγαλύτερης διάρκειας επιβίωση παρατηρήθηκε σε ασθενείς με υψηλή έκφραση των ισομορφών CD44 που περιλαμβάνουν τα εξώνια v8-10. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) όγκων για παρουσία CD44v8-10 εκτελέστηκε σε μια ανεξάρτητη ομάδα από 210 ασθενείς με υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία ιστό όγκου. διαστρωμάτωση των ασθενών με βάση την ανάλυση του λογισμικού της χρώσης αποκάλυψε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην επιβίωση σε ασθενείς με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης (κορυφή 10 ή 20%) σε σύγκριση με εκείνους με τη χαμηλότερη έκφραση (κάτω 10 και 20%) (p = 0,0181 , ρ = 0,0262 αντίστοιχα). Έκφραση CD44v8-10 σε πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών συσχετίστηκε με μια κυρίως επιθηλιακού φαινοτύπου χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση των επιθηλιακών δεικτών και χαμηλή έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών με qPCR, στύπωμα Western, και IHC. Αντιστρόφως, ανίχνευση διασπώνται πρωτεολυτικά και διαλυτή εξωκυτταρική περιοχή του CD44v8-10 σε δείγματα ασθενών ασκίτη συσχετίστηκε με σημαντικά χειρότερη πρόγνωση (ρ & lt? 0,05). Ως εκ τούτου, η παρουσία διαμεμβρανικών CD44v8-10 στην επιφάνεια των πρωτογενών κυττάρων όγκου μπορεί να είναι ένας δείκτης μιας ιδιαίτερα επιθηλιακών όγκων με καλύτερη πρόγνωση ενώ ενζυματική διάσπαση του CD44v8-10, όπως ανιχνεύεται από την παρουσία του διαλυτού εξωκυτταρικού τομέα σε υγρό ασκίτη, μπορεί να είναι ενδεικτική μιας πιο μεταστατική νόσο και χειρότερη πρόγνωση

Παράθεση:. Sosulski Α, Χορν H, Zhang L, Coletti C, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 Splice Variant v8-10 ως δείκτης της υδαρής καρκίνου των ωοθηκών πρόγνωση. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10.1371 /journal.pone.0156595

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 28 Σεπτέμβρη 2015? Αποδεκτές: 17 Μαΐου 2016? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιουνίου 2016

Copyright: © 2016 Sosulski et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και τα αρχεία Στήριξη Πληροφορίες του ή στην ιστοσελίδα TCGA σε https://cancergenome.nih.gov/

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. αυτός συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου μεταξύ των γυναικών με γυναικολογικό καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με την υψηλή θνησιμότητα που αποδίδεται στην προχωρημένο στάδιο στο οποίο έχει διαγνωστεί, συνήθως πολύ καιρό μετά έχει συμβεί ενδοπεριτοναϊκή μεταστατική εξάπλωση [1]. Για να συμβεί μετάσταση, τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών συχνά μεταβάλλουν την έκφραση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην εξωκυτταρική αλληλεπίδραση μήτρας, όπως CD44, για να διαμορφώνει εισβολή [2, 3]. Ως ένα κυτταρικό μόριο προσκόλλησης και μια σημαντική εξωκυτταρική γλυκοπρωτεΐνη, ο CD44 υποδοχέας υαλουρονικό οξύ έχει εμπλακεί στην εισβολή και μετάσταση όγκων στο μαστό, πνεύμονα, και γαστρεντερικούς καρκίνους [2].

CD44 κωδικοποιείται από ένα μέγιστο 20 εξόνια, 10 από τα οποία αναφέρονται ως παραλλαγή εξόνια. Το πρότυπο ισομορφή (CD44s) περιέχει μόνο 10 εξόνια, συμπεριλαμβανομένων των πρώτων 5 εξόνια του 5 ‘άκρου και τα τελευταία 5 εξόνια του 3’ άκρου, χωρίς έτσι τα εξώνια παραλλαγή στη μέση, που αναφέρεται ως v1-v10 ή εξώνια 5α -15 στο πρότυπο ονοματολογία [1, 4, 5]. CD44s είναι η πιο πανταχού παρούσα ισομορφή, ευρέως εκφράζονται στην επιφάνεια των περισσοτέρων ιστών και όλες hematopoieitic κύτταρα όπου είναι υπεύθυνος για λεμφοκυττάρων και άλλων κυττάρων-κυττάρου και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας. Ένας μεγάλος αριθμός εναλλακτικών ισομορφών συρραφής του CD44 υφίστανται οι οποίες περιέχουν ένα συνδυασμό παραλλαγής εξόνια (V1 έως V10) εισάγεται στην παραμεμβρανική εξωκυτταρική περιοχή υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών πρωτεϊνών επιθηλιακών splicing (ΕΠΕΑ) 1 και 2 [6]. Πολλοί ισομορφές παραλλαγή CD44 έχουν ιστο-ειδική έκφραση? CD44v8-10 εκφράζεται σε επιθηλιακούς ιστούς και σε καρκινώματα επιθηλιακής τύπου του παγκρέατος, του προστάτη, του μαστού, του πνεύμονα και [7], όπου έχει μελετηθεί εκτεταμένα ως ειδικός δείκτης κακοήθων κυττάρων, με αυξημένη έκφραση που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της γαστρικής καρκινογένεσης σε ένα μοντέλο ποντικού και στο αδένωμα έως την πρόοδο καρκινώματος σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου [8-10] και γαστρικών καρκίνων [11].

έχουν CD44s και ισομορφές παραλλαγή CD44 έχουν εμπλακεί σε αντίσταση στο φάρμακο και προσδιορίζονται ως δείκτες αρχέγονων κυττάρων [ ,,,0],12]. Στον καρκίνο των ωοθηκών, μελέτες που χρησιμοποιούν έκφραση CD44s και παραλλαγής ισομορφές του στην αξιολόγηση πρόγνωση έχουν παραχθεί αντιφατικά αποτελέσματα, με μερικά παρουσίαζαν μειωμένη πρόγνωση, και άλλοι βελτιωμένη πρόγνωση, ή καθόλου επίδραση [13]. Ωστόσο, οι μελέτες σε ισόμορφα που περιέχουν διαφορετικά εξόνια επιμέρους παραλλαγή στον καρκίνο των ωοθηκών έχουν προτείνει γενικά βελτιωμένη συνολική επιβίωση σχετίζεται με ισομορφές ματίσματος του CD44 [14]. Η παραλλαγή επιθηλιακά συναρμογής 8-10, εκφράζοντας V8, V9, και v10 μαζί, δεν έχει εξεταστεί σε υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνο των ωοθηκών? Ως εκ τούτου, είναι η αξιοπιστία και η σκοπιμότητα στην πρόβλεψη πρόγνωση διερευνήθηκε σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ο Καρκίνος Γονιδιώματος Atlas (TCGA) ανάλυση δεδομένων

Τα δεδομένα έκφρασης (Επίπεδο 3 ) σε τεκμηριωμένες CD44s και CD44 παραλλαγής ισομορφές για όγκους του ωοθηκικού ορώδους κυσταδενοκαρκίνωμα αναλύθηκε σε μία ομάδα από 255 άτομα στην TCGA (μετά λογοκρίνει δείγματα από επαναλαμβανόμενες όγκους και εστιάζεται μόνο στις υψηλής ποιότητας νόσο (G2 και G3)). Χρησιμοποιήσαμε Επίπεδο 3 δεδομένων για να αποφευχθεί η εκ νέου ανάλυση των πρώτων συνόλων δεδομένων? Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλούμε δείτε την αρχική δημοσίευση [15]. Με βάση το αρχείο σχολιασμών για την ανάλυση RNAseqV2 (S1 πίνακα), ορίσαμε μια ισομορφή CD44 ως v8-10 περιέχει τα CHR11 εξώνια: 35.229.652 με 35.229.753: +, CHR11: 35231512 έως 35231601: + και CHR11: 35.232.793 με 35232996: +. Επιβίωση ανάλυση του άνω και κάτω 10% με βάση την μέση έκφραση των τριών (v8-10) εξώνια, διεξήχθη με τη χρήση της «επιβίωσης» και το πακέτο «survMisc» στο R. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε το supremum (Renyi) έκδοση η δοκιμασία log-rank το οποίο έχει σχεδιαστεί για την ανάλυση της διέλευσης καμπύλες επιβίωσης.

όγκου ιστών αναλύσεις μικρο-συστοιχία

Μια δεύτερη ομάδα από 210 υψηλής ποιότητας ασθενείς ωοθηκών ορώδες κυσταδενοκαρκινώματος νοσηλεύονται στο Massachusetts Γενικό Νοσοκομείο και το Νοσοκομείο Brigham and Dana Farber Cancer Κέντρο Γυναικών μεταξύ 1993-2009 [16] μελετήθηκαν στο πλαίσιο των εσωτερικών επιτροπή δεοντολογίας (IRB) εγκεκριμένα πρωτόκολλα (MGH2007P00001918 ή DFCI 02-051). πυρήνα του όγκου δείγματα (3 mm) ελήφθησαν κατά την αρχική χειρουργική επέμβαση debulking, σημείωσε, σύμφωνα με τις (FIGO) κατευθυντήριες γραμμές Διεθνούς Ομοσπονδίας Gynécologie Obstétrique, και ήταν φορμόλη σταθερό και ενσωματωμένες σε παραφίνη. Όλες οι όγκοι βιοψίες, απορρίπτονται δείγματα αποχαρακτηριστούν ασκίτη, και τις αντίστοιχες πληροφορίες για τον ασθενή συλλέχθηκαν στο πλαίσιο IRB-εγκεκριμένα πρωτόκολλα μετά λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. Κάθε νέο μπλοκ παραφίνης περιείχε 24 τυχαία κατανεμημένα πυρήνες του όγκου, με τουλάχιστον 2 πυρήνες ανά ασθενή, και ήταν χωρισμένο σε 7 πάχος micron όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε πλάκες με μικροδιάταξη όγκου (TMA) τμήματα όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [16] προτού μπλοκάρει χρησιμοποιώντας διάλυμα 1% αλβουμίνης βόειου ορού (BSA) με 2% ορό γαϊδάρου σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία, επωάζεται με ένα αντίσωμα προς CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] σε 1: 12.500 για όλη τη νύχτα σε υγροποιημένο θάλαμο στους 4 ° C, πλύθηκαν με PBS, και επωάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-αρουραίου υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) συζευγμένο αντίσωμα ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas ΤΧ) σε 1: 200 για 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν και βάφτηκαν με ένα διάλυμα διαμινοβενζιδίνης (DAB), σε αντίθεση βάφονται με Αιματοξυλίνη (Dako, Carpinteria CA), αφυδατωμένα, και καλύφθηκαν πριν σαρώνεται και ψηφιοποιείται με ένα Scanscope (Leica, Buffalo Grove IL) και αναλύθηκαν με το λογισμικό Aperio Imagescope (Leica, Buffalo Grove IL). Θετικότητα και Ένταση (PI) βαθμολογίες υπολογίζεται ως το γινόμενο του κλάσματος λεκιασμένη περιοχή (θετικότητα) και την ένταση του. Για τους σκοπούς της ανάλυσης χρώσης, εξετάσαμε μόνο πυρήνες στην οποία περισσότερο από το 50% του ιστού παρέμειναν ανέπαφα στη γυάλινη πλάκα. Με βάση αυτό το κριτήριο είχαμε 6 ασθενείς για τους οποίους υπολογίζεται το σκορ PI χρησιμοποιώντας ένα ενιαίο πυρήνα, και 203 με την οποία πήραμε το μέσος όρος PI από 2 πυρήνες, για ένα σύνολο 209 ασθενών που αναλύθηκαν. επιβίωση των ασθενών υπολογίζεται από την ημερομηνία της διάγνωσης με ημερομηνία του θανάτου, ή την είσοδο σε νοσηλείας εκτός νοσοκομείου, όταν δεν είναι διαθέσιμα και μετατρέπεται από ημέρες έως μήνες διαιρώντας τον αριθμό των ημερών από 30. Η συνολική επιβίωση αναλύθηκε με οικόπεδα Kaplan-Meier και η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί από log-rank τεστ. Συσχετίσεις με τις κλινικές παραμέτρους έγιναν χρησιμοποιώντας ανάλυση chi-square. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Prism 6 λογισμικού (Graphpad, La Jolla CA).

Κυτταρικές Γραμμές

Μια σειρά πρωτογενών κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών προέρχεται από ασκίτη ασθενή, ανά IRB-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (# 2007P001918 /MGH) [16]. Εν συντομία, μετά από φυγοκέντρηση του υγρού ασκίτη, τα κυτταρικά σφαιρίδια εισάγονται σε ιστοκαλλιέργεια υπό δύο διαφορετικές συνθήκες (προσκολλημένα και σφαιροειδείς). Σε προσκολλημένες καλλιέργειες, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες συρροή για αρκετές εβδομάδες έως αρκετούς μήνες μέχρι να παρατηρηθούν σφιχτά επιθηλιακών κυτταρικών κλώνων. Προσμείξεως τύπους κυττάρων (λευκοκύτταρα, μεσοθηλιακά, και κύτταρα ινοβλαστών) απομακρύνθηκαν με επαναλαμβανόμενη πέψη μερική θρυψίνη μέχρι μπορούσε να παρατηρηθεί κανένα τύπων μολυσματικής κυττάρων. Ακολούθως τα κύτταρα πέρασαν τουλάχιστον 5 φορές σε αραίωση 1:10 για τον υπολογισμό σταθερών ομοιογενές κυτταρική γραμμή. Εναλλακτικά, για σφαιροειδές καλλιέργειες (συμβολίζεται με το-SPH κατάληξη), τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τακτά φιάλες για 24 ώρες και τα μη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε νέες φιάλες εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση, ενώ συνδεδεμένα κύτταρα απορρίφθηκαν. Σφαιροειδείς καλλιέργειες ανακαλλιεργήθηκαν με διαχωρισμό και αραιώνονται 1:10 για τουλάχιστον 5 περάσματα να αντλήσει σταθερές ομοιογενείς κυτταρικές σειρές. Ο πίνακας των πρωτογενών κυτταρικών σειρών αποτελείται από 16 ορώδες επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, ΜΔ, ΜΔ-SPH, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL- SPH, ptAM-SPH, Ptak-SPH), ένα ενδομητριοειδές επιθηλιακών καρκίνων (ptAP-SPH), και ένα βλεννώδες επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (PTG) αναπτύχθηκαν σε προσκολλημένα ή /και σφαιροειδές συνθήκες καλλιέργειας.

πρωτογενείς κυτταρικές σειρές ήταν διατηρούνται σε καλλιέργεια κυττάρων σε μονοστοιβάδες σε DMEM: F12 μέσο με 10% FFBS 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 1% Ε-γλουταμίνη (Corning, Νέα Υόρκη ΝΥ) ή ως μη-προσκολλημένα σφαίρες σε μέσα σφαίρα όγκου χωρίς ορό [16] στο 37C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2. Επιπλέον, ο καρκίνος των ωοθηκών καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές OVCAR5 [18] και OVCAR8 [19], διατηρήθηκαν σε μέσα DMEM με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 1% Ε-γλουταμίνη (Corning, Νέα Υόρκη ΝΥ).

Q-PCR και ανάλυση των κύριων συστατικών

Ποσοτική PCR σε πρωτογενείς κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ασκίτη των ασθενών (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, ΜΔ, ΜΔ-SPH , ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH) και για τις καθιερωμένες επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές OVCAR-5 και OVCAR-8. Τα κυτταρικά ιζήματα που λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση, πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και καταψύχθηκαν στους -80 ° C, μέχρι την εκχύλιση του RNA χρησιμοποιώντας ένα Qiagen RNeasy Mini Kit (Germantown, MD) και ποσοτικοποιήθηκαν με Nanodrop. cDNA ήταν αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας 500 ng RNA ανά δείγμα με εκθέτη ΙΙΙ First Strand Synthesis Σούπερ Mix (Invitrogen, Carlsbad CA), και qPCR διεξήχθη για τις καθιερωμένες κατασκευαστές των επιθηλιακών σε μεσεγχυματικά μετατροπή (EMT), και πλειοδυναμία συμπεριλαμβανομένων CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], βιμεντίνη, E-cadherin, ESRP1, Zeb1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-cadherin, και EpCAM, με GAPDH ως εσωτερικό πρότυπο. Σχετική έκφραση προκύπτει από τον προσδιορισμό του ορίου του κύκλου (Ct) και υπολογίζεται με 2 ^ -ΔCt μετασχηματισμού ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH Ct. Ανάλυση των κύριων συστατικών (PCA) πραγματοποιείται με τη χρησιμοποίηση αυτών των τιμών γονιδιακής έκφρασης μετά από μετασχηματισμό log χρησιμοποιώντας το πακέτο «FactoMineR» στο R. PCA με μεσεγχυματικά καθώς και επιθηλιακά δείκτες σαφώς διαχωρισμένοι το πρώτο συστατικό, ενώ ΕΜΤ και πολυδύναμων σημειωτές ήταν κάθετος στον δεύτερο συστατικό, αλλά διαφέρει από κάθε άλλο.

Δυτική Ανάλυση

Οι σβώλοι κυττάρων που συλλέγονται από ένα πάνελ των πρωτογενών ασκίτη κυτταρικές σειρές ασθενών (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, ΜΔ, ΜΔ -SPh, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH, Ptak-SPH) και 2 καθορίζονται καρκινικές κυτταρικές σειρές (OVCAR-5 και OVCAR-8) πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό 10 ml πάγου PBS και τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάζονται σε 1χ ρυθμιστικού λύσης (Cell Signaling Technology, Danvers ΜΑ) σε στείρο νερό που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Indianapolis, ΙΝ) και δισκία αναστολέα φωσφατάσης (Roche, Indianapolis ΙΝ). Η συνολική πρωτεΐνη ανά προϊόν λύσης ελήφθη δια χρησιμοποιήσεως ενός ποσοτικού προσδιορισμού bicinchoninic οξύ Pierce (BCA) Κιτ πρωτεΐνη ποσοτικοποίησης (Thermoscientific, Rockford IL), και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (15 μσ) μείωσε, φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα, και διαχωρίστηκαν με NuPage 4-12% πηκτώματα ( τεχνολογίες της ζωής, Carlsbad CA). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε Immobilon διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica ΜΑ), μπλοκαριστεί σε 5% άπαχο γάλα διαλυμένο σε ένα τρις ​​ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20 (TBST) διάλυμα, και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4C για να ανιχνεύσει την πλήρη μήκος διαμεμβρανική ή ενδοκυτταρική πρωτεΐνη με αντι CD44v8-10 (RV3) πρωτογενές αντίσωμα αρουραίου (1: 1000) [8], ή ποντικού αντι CD44s (R + D, Minneapolis ΜΝ) (1: 500), κουνελιού αντι βιμεντίνης (Abcam, Cambridge ΜΑ) (1: 1000), ή κουνελιού αντι- Ε-καδερίνης (Abcam, Cambridge ΜΑ) (1: 10.000) αντισωμάτων, το καθένα αραιωμένα σε 5% άπαχο γάλα σε TBST. μεμβράνες PVDF στη συνέχεια πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν με ένα κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα, είτε ένα αντι κουνελιού (Cell Signaling Technology, Danvers ΜΑ), αντι-ποντικού (Jackson Laboratories, Bar Harbor ΜΑ), ή αντι αρουραίου (Santa Cruz Biotechnology, Dallas ΤΧ) αντίσωμα συζευγμένο με δείκτη υπεροξειδάσης αρμορακίας, το καθένα σε 1: 10000 σε 5% γάλα σε διάλυμα TBST επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν πάλι σε TBST και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπόστρωμα χημειοφωταύγειας ECL Pico ™ για την οπτικοποίηση της πρωτεΐνης (Thermoscientific, Rockford IL). Σχετική αφθονία πρωτεΐνης μετρήθηκε με πυκνομετρία των ζωνών των Δυτικών κηλίδα και κανονικοποιούνται για την ισότητα των πρωτεϊνών φόρτωση με Β-ακτίνη πυκνότητας με ανάλυση εικόνας J λογισμικού.

ασκίτη των ασθενών ελήφθησαν από φρέσκα θεραπευτική paracenteses, ανά ένα IRB-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (# 2007P001918 /MGH). 1 ml του υγρού ασκιτών υπερκειμένου δείγματα υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους, φυγοκεντρήθηκε σε μέγιστη ταχύτητα για 10 λεπτά για να καθαρίσει, και αραιώνεται 1:50 σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πριν από την εκτέλεση σε κηλίδα western όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με αρουραίου αντι CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) ή ποντικού αντι CD44s (R + D, Minneapolis ΜΝ) (1: 500) όλη τη νύκτα στους 4C και αναπτύχθηκε όπως παραπάνω χρησιμοποιώντας φεμτο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας ECL ™ (Thermoscientific, Rockford IL) για να προσδιοριστεί η παρουσία διαλυτού διασπασμένου και εκκρίνεται εξωκυττάρια περιοχή του CD44v8-10 και CD44s ρίξει σε υγρό ασκίτη ασθενή. Ως έλεγχος φόρτωσης χρησιμοποιήσαμε βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας άλογο-ραπανάκι συζυγές υπεροξειδάσης αντι-ανθρώπινης IgG 1: 20.000 (Life Technologies, Carlsbad CA). Εικόνες συνελήφθησαν από την BioRad XR Gel Doc λογισμικού εργαστήριο εικόνας (BioRad, Hercules CA) και αναλύθηκαν από την Εικόνα-J ως ποσοστό των IgG ελαφριά αλυσίδα αφθονία. Ρίξει το επίπεδο της πρωτεΐνης στη συνέχεια συσχετίστηκαν με την επιβίωση των ασθενών, με παραμέτρους που είναι ημέρα του θανάτου, ή την είσοδο σε νοσηλείας εκτός νοσοκομείου, όταν δεν είναι διαθέσιμα.

Η ανοσοϊστοχημεία των δεικτών επιθηλιακών και μεσεγχυματικών σε PDXa εκφυτευμένη όγκους

τον ασθενή προέρχονται ξενομοσχεύματα από ασκίτη (PDXa), όπου συστάθηκε με την εμφύτευση 5 εκατομμύρια κύτταρα του πρωτογενούς γραμμών χαμηλής διόδου (ptAP-SPH, ΜΔ, ptAM-SPH, ΡΤΗ, ptAB-SPH, PTD) επαναιωρήθηκε 1: 1 σε Matrigel (Corning, Νέα Υόρκη ΝΥ ) και εμφυτεύεται υποδορίως στα πλευρά του NOD /SCID ποντίκια /IL2RGamma Jax ™ (Jackson Laboratory, Bar Harbor μΕ) υπό μία IACUC εγκεκριμένο πειραματικό πρωτόκολλο (# 2009N000033) [16]. OVCAR5 όγκοι προκύπτουν χρησιμοποιώντας ένα πανομοιότυπο πρωτόκολλο ξενομεταμόσχευση χρησιμοποιώντας 1 εκατομμύριο κύτταρα. Προκύπτοντες όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε πάχους 7 μικρόμετρα πάνω Fisher Scientific

Probe Στις συν

πλάκες μικροσκοπίου (Fisher Scientific, New York ΝΥ). Πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε αλκοόλη, και σε μικροκύματα σε ρυθμισμένο κιτρικό νάτριο (0.01 Μ) για ανάκτηση αντιγόνου για 5 λεπτά σε υψηλή ισχύ, 10 λεπτά σε 10% ισχύ, και 10 λεπτά σε 20% ισχύ, κατόπιν ξεπλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό . Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, πλύθηκαν και δεσμεύτηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα 1% BSA με 2% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα CD44v8-10 (RV3 μονοκλωνικό αρουραίου) (1: 12.500), και σε σύγκριση με εκείνους που επωάστηκαν με CD44s (R + D, Minneapolis ΜΝ, μονοκλωνικό ποντικού 16ug /ml), αντι αντίσωμα Ε-καδερίνης (Abcam, Cambridge ΜΑ, κουνέλι) (1: 500), ή αντι βιμεντίνη αντισώματος (Abcam, Cambridge ΜΑ, κουνέλι) (1: 500) όλη τη νύχτα σε υγροποιημένο θάλαμο στους 4 ° C. Μετά από επώαση με HRP κατσίκας αντι-αρουραίου αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Dallas ΤΧ), HRP γαϊδάρου αντι-ποντικού, ή αντίσωμα HRP αντι-κουνελιού γαϊδάρου (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor ΜΑ) επί 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία, slides ξεπλύθηκαν και βάφτηκαν με διάλυμα DAB (Sigma Aldrich, St Louis ΜΟ), και σε αντίθεση βάφονται με αιματοξυλίνης (Dako, Carpinteria CA), αφυδατωμένα, και καλυπτρίδα. Εκπρόσωπος μικρογραφίες λήφθηκαν χωρικών σύγκριση των πρωτεϊνών προηγουμένως εντοπιστεί από τις δυτικές ανάλυση των πρωτογενών κυτταρικών σειρών από το οποίο αναπτύχθηκαν οι όγκοι.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της παραλλαγής ισομορφές CD44 που περιέχει εξόνιο 8 έως 10 ( V8-10) mRNA στο The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 ωοθηκών σύνολο δεδομένων καρκίνου

Για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της CD44s και παραλλαγή V8-10 περιέχει ισομορφές της (Σχήμα 1Α) στο ορώδες όγκους των ωοθηκών, αναλύσαμε ο πόρος RNAseqV2 από TCGA, το οποίο περιλαμβάνει μια ομάδα από δείγματα όγκου 255 βαθμού 2 και 3. Η έκφραση των επιμέρους εξονών V8, V9 και V10 συσχετίζεται έντονα επί όλων των δειγμάτων, η οποία μπορεί επίσης να παρατηρηθεί για τις «πρότυπο» εξώνια 1-5 και 15-18 (S1 Σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι εκφράζονται κυρίως ως ένα μπλοκ V8 -10. Επιπλέον, εξώνια V8-10 φαίνεται να είναι η πιο άφθονη όλων των μεταβλητών εξώνια, υποδηλώνοντας cd44v8-10 περιέχουν ισομορφές είναι τα κυρίαρχα εναλλακτικά ματισμένων μεταγράφων του CD44 (Σχήμα 1Β). Οι ασθενείς ήταν κατηγοριοποιημένα βάσει της μέσης mRNA επίπεδα έκφρασης των εξονίων V8-10 στον όγκο τους και χωρίζονται σε υψηλής και χαμηλής έκφρασης ομάδες (πάνω και κάτω του 10%), από την οποία και καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν υποδεικνύοντας μία σημαντικά καλύτερη πρόγνωση σε υψηλή εκφραστές (p = 0,035) (Σχήμα 1 C). Για να προσδιοριστεί η σχετική συνεισφορά της κάθε ξεχωριστή ισομορφή που περιέχει εξώνια v8-10 συγκρίναμε τη συνολική έκφρασή τους και εκτιμάται ότι η επίδραση στην επιβίωση. Μια τάση προς αύξηση της επιβίωσης παρατηρήθηκε για όλα, αλλά ένα ισομορφές CD44 που περιέχουν V8-10, αν και καμία δεν ήταν σημαντική σε απομόνωση (S2 σχήμα). Η πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση του μοντέλου Cox proportional αναλογία κινδύνου διαπίστωσε ότι μόνο η ηλικία δεν είχε σημαντική επίδραση στη συνολική επιβίωση (Πίνακας 1).

Α) Σχηματική αναπαράσταση των εναλλακτικών ισομορφών συρραφής εκφράζοντας μεταβλητή εξώνια V8-V10. Β) Κατανομή των δεδομένων έκφρασης RNAseq2 πάνω από 254 δείγματα για όλα τα εξώνια CD44 στην TCGA σύνολο δεδομένων του καρκίνου των ωοθηκών. Δείγματα χωρίς έκφραση είχαν παραλειφθεί από αυτό το σχήμα. C) Kaplan-Meier γραφική παράσταση της καμπύλης επιβίωσης συγκρίνοντας υψηλής και χαμηλής CD44v8-10 εκφράζουν δείγματα και αντίστοιχο πίνακα με τον αριθμό των ασθενών σε κάθε δεδομένη χρονική στιγμή. Ορίσαμε το σύνολο υψηλή έκφραση (κόκκινο) και το σύνολο εκφράζουν χαμηλά (μαύρο) και τα δείγματα με την υψηλότερη και τη χαμηλότερη έκφραση αντίστοιχα χρησιμοποιώντας το πάνω /κάτω του 10% της εκφραστές, με το οικόπεδο που εκτείνεται σε 5 έτη. Μπαρ αντιπροσωπεύουν λογοκρίνεται σημεία δεδομένων.

Η

CD44v8-10 χρώση σε πρωτογενείς όγκους συνδέεται με μεγαλύτερη επιβίωση σε μια ανεξάρτητη ομάδα από 210 υψηλής ποιότητας ασθενείς με ορώδες ωοθηκικό καρκίνο αναλύθηκαν από μικροσυστοιχιών όγκου ανοσοϊστοχημεία

για να επιβεβαιώσετε τις τάσεις που παρατηρούνται στην ανάλυση των δεδομένων TCGA προτείνοντας μια καλύτερη πρόγνωση συνδέθηκε με CD44v8-10 έκφρασης, αποφασίσαμε να εξετάσει τα επίπεδα της πρωτεΐνης του CD44v8-10 σε βιοψίες όγκων. Επιφανειακή έκφραση της διαμεμβρανικής CD44v8-10 πρωτεΐνη αναλύθηκε σε υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα CD44v8-10 σε μικροσυστοιχία όγκου που περιέχουν δείγματα πρωτογενούς όγκου από μία κοόρτη 210 ασθενών. Όλες οι όγκοι ήταν υψηλής ποιότητας ορώδες ιστολογία με τη συντριπτική πλειοψηφία (71%) βαθμολογήθηκαν ως τουλάχιστον ΦΥΓΩ Stage III, και Βαθμού 3 (89%) κατά τη διάγνωση (Πίνακας 2). Όλα τα δείγματα μικροσυστοιχία πρωτογενούς όγκου εξετάστηκε λήφθηκαν κατά το χρόνο της αρχικής χειρουργικής επέμβασης debulking. Διάχυτη και εστιακή χρώση παρατηρήθηκε στην κυλινδρικό επιθήλιο του θηλές, συχνά στο στρώμα βασικής (βέλη) (Σχήμα 2Α, 2Β και 2C) του επιθηλίου, αλλά όχι στο στρώμα του όγκου σε οποιοδήποτε από τους πυρήνες (Σχήμα 2D), και πάντοτε στην επιφάνεια του κυττάρου μάλλον παρά μία ενδοκυτταρική ή κυτοπλασμική τοποθεσία (Σχήμα 2Β, ένθετο). Συνολική ένταση των θετικών pixels και συνολικό αριθμό των θετικών pixels, όπως προσδιορίζεται από το λογισμικό Imagescope, συνδυάστηκαν σε ένα θετικό αποτέλεσμα ένταση (ΡΙ), το οποίο κατά μέσο όρο και από τις δύο αντιπροσωπευτικές πυρήνες ανά ασθενή, και χρησιμοποιήθηκαν για τη διαστρωμάτωση των ασθενών. Επιλέξαμε το πάνω και κάτω μέρος 10 και 20 τοις εκατό των ασθενών να συγκρίνει τις διαφορές επιβίωσης μεταξύ χαμηλών και υψηλών εκφραστές της επιφανειακής πρωτεΐνης CD44v8-10 διαμεμβράνης και βρήκε μια σημαντική αύξηση στην επιβίωση και για τις δύο κορυφαίες 10% και 20% των ασθενών που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD44v8-10, με διάμεση επιβίωση των 30 και 29 μήνες, όταν σε σύγκριση με τους ασθενείς που εκφράζουν το χαμηλότερο 10% (p = 0,0181) και 20% (p = 0,0262), με διάμεση επιβίωση των 49 και 52 μηνών αντίστοιχα (Σχ 2Ε) . Η σύνθεση του άνω και του κάτω 10% και 20% των ασθενών ήταν παρόμοια κατά την εξέταση κλινικών παραμέτρων FIGO βαθμού, στάδιο, και την ηλικία (S2 Πίνακας), με εξαίρεση μια διαφορά στον μικρό αριθμό βαθμού 2 ασθενείς. Όταν αυτός ο πληθυσμός του βαθμού 2 αποκλείστηκε από την ανάλυση για να αποκλείσει την επίδραση αυτών των σπάνιων κάτω όγκους βαθμό, η διαφορά επιβίωση παρέμεινε σημαντική μεταξύ των υψηλότερων και χαμηλότερων εκφραστές της CD44v8-10 πρωτεΐνης (S3 σχήμα).

Σταθερή ενσωματωμένα σε παραφίνη πυρήνες μικροσυστοιχιών ιστού βάφτηκαν με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον CD44v9, σαρώνονται χρησιμοποιώντας ένα Aperio Scanscope, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Aperio Imagescope θετική pixel αλγόριθμος καταμέτρηση. Εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται σε υψηλές χρώση βασικά επιθηλιακά (40x) εξουσία show σε Α και C, πιο διάχυτη χρώση επιφάνεια επιθηλιακά στο β, και αρνητική στρώμα με απομονωμένο θετικά επιθηλιακά κύτταρα σε d. ε.) Συνολική επιβίωση των ασθενών με υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών από την έκφραση παραλλαγή CD44. Αριστερή υψηλότερης και χαμηλότερης 10% παραλλαγή έκφρασης και το δεξιό υψηλότερη και η χαμηλότερη του 20% της έκφρασης της παραλλαγής, καταδεικνύει σημαντική συνολική επιβίωση στα υψηλότερα εκφραστές με p = 0,0181 και p = 0.0262, αντίστοιχα.

Η

η πολυπαραγοντική ανάλυση των καταγεγραμμένων κλινικές παραμέτρους όπως η ηλικία, το βαθμό, το στάδιο, το καθεστώς debulking και CD44v8-10 ένταση χρώσης αναλύθηκαν για την επίδρασή τους στην πρόγνωση (Πίνακας 3).

η

η ηλικία είχε το ισχυρότερο επίδραση στην πρόγνωση που ακολουθείται από CD44v9 ένταση χρώσης του όγκου, ενώ ΦΥΓΩ στάσης ή ταξινόμησης και debulking κατάσταση δεν ήταν σημαντικές. Δεδομένου ότι η COX ανάλογη αναλογία κινδύνου (Πίνακας 3) έδειξε μια εξάρτηση για την ηλικία και την έκφραση δείκτη επιφανείας CD44v8-10, θελήσαμε να εξερευνήσετε μεταβλητή συσχέτισης χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη διαστρωμάτωση των ασθενών για να δημιουργήσει ένα δέντρο απόφασης που μεγιστοποιεί την προγνωστική διαφορές (Σχήμα 3). Εμείς στρωματοποιημένη ομάδες ασθενών με βάση την ηλικία, το στάδιο της νόσου, ταξινόμηση, την κατάσταση debulking, και την έκφραση CD44v8-10. Η προκύπτουσα ταξινόμηση έδειξε ότι οι ασθενείς της & gt? 59,2 χρόνια της ηλικίας τους δεν επωφελούνται σημαντικά από υψηλότερη έκφραση CD44. Οι νεότεροι ασθενείς παρουσιάζουν ισχυρή συσχέτιση καλύτερη επιβίωση όταν έχουν υψηλό δείκτη επιφανείας CD44. Αυτές οι παρατηρήσεις βελτιώσετε τα ευρήματα από το μοντέλο αναλογία κινδύνου COX και να ορίσετε ένα δέντρο απόφασης που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί κλινικά για να μεγιστοποιήσει την προγνωστική δύναμη της χρώσης του όγκου CD44v8-10 (Σχήμα 3).

Οι ασθενείς από την sampleset σειρά όγκου κατανεμήθηκαν χρησιμοποιώντας Ηλικία, CD44v9 ένταση χρώσης (σ έκφρασης CD44v9), το βαθμό, την κατάσταση debulking και βαθμολογία ΦΥΓΩ. Η πολυπαραγοντική ανάλυση εκτελέσθηκε και το αποτέλεσμα τέτοιο μέγεθος κατετάγη να δημιουργήσει ένα δυαδικό δέντρο απόφασης για τη μεγιστοποίηση της προγνωστική ισχύς κατά τρόπο αμερόληπτο και να εκχωρήσετε στατιστική σημαντικότητα. Μόνο στατιστικά σημαντικές μεταβλητές (ηλικία και χρώση CD44v9) εμφανίζεται μαζί με την επίδρασή τους στη συνολική επιβίωση των ασθενών στις Kaplan-Meier οικόπεδα. Μπαρ αντιπροσωπεύουν λογοκρίνεται σημεία δεδομένων.

Η

Η έκφραση της CD44v8-10 συσχετίζεται με ένα επιθηλιακό φαινότυπο

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση των κύριων συστατικών (PCA) (FactoMiner) στην έκφραση του mRNA, όπως ορίζεται από qPCR τιμές από 2

-ΔCt κανονικοποιημένη προς GAPDH, σε μια σειρά διαφορετικών επιθηλιακών (EpCAM, ESPR1, Ε-καδερίνη) και μεσεγχυματικών (ZEB1, βιμεντίνη, Ν-καντερίνη) δείκτες σε ένα πάνελ 15 πρωτογενών (ptAB, ptAB- SPH, ptAF, ptAF-SPH, ΜΔ, ΜΔ-SPH, ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH) και 2 καθορίζονται κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (OVCAR5, OVCAR8). Η PCA επιβεβαίωσε ότι CD44v8-10 mRNA συνεργάτες έκφρασης με άλλα επιθηλιακά δείκτες, ενώ η έκφραση CD44s συσχετίζεται με δείκτες μεσεγχυματικά στον καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 4Α). Η έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας (LIN28, SOX2, Oct4) συσχετίστηκε με ούτε επιθηλιακά μεσεγχυματικά ούτε δείκτες, γεγονός που υποδηλώνει βλαστική ικανότητα είναι ανεξάρτητη των επιθηλιακών ή μεσεγχυματικών κατάσταση (Σχ 4Α).

Α) ανάλυση κύριων συνιστωσών χρησιμοποιώντας qPCR σχετική ποσοτικοποίηση η έκφραση των επιθηλιακών, μεσεγχυματικών, και δείκτες πλειοδυναμία σε πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Χρωματιστά βέλη δείχνουν τις κατευθύνσεις για κάθε ομάδα δεικτών. Β) Ανάλυση Western των πρωτογενών προϊόντων λύσης πρωτεΐνης κυτταρικής σειράς για την έκφραση της πρωτεΐνης CD44v8-10 χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου για την ανθρώπινη CD44v8-10.

Η

Ομοίως, η έκφραση της πρωτεΐνης CD44v8-10 στο κελί που λαμβάνονται από ασθενή λύματα γραμμή με κηλίδα western εμφανίζεται μια τάση συν-έκφραση της CD44v8-10 με Ε-καδερίνης, ή CD44s με βιμεντίνη, σε μια αμοιβαία αποκλειστική περιοχή της μόδας (Σχήμα 4Β), επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα qPCR υποδεικνύοντας ότι CD44v8-10 είναι ένα επιθηλιακό δείκτη και CD44s ένα μεσεγχυματικά δείκτη σε υψηλό βαθμό ορώδες καρκίνο των ωοθηκών.

Για να προσδιοριστεί η χωρική έκφραση της CD44v8-10, και η σχέση του με τα επιθηλιακά ή μεσεγχυματικών όγκων ιστολογίες, ασθενής που προέρχονται από ξενομοσχεύματα του ασκίτη (PDXa του) [16] αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Συνολικά, οι όγκοι αναπτύχθηκαν

in vivo

ανακεφαλαίωνε τον επιθηλιακό ή μεσεγχυματικά ετερογένεια που παρατηρείται στον πρωτογενή κυτταρική γραμμή

in vitro

(Σχήμα 4). Όγκοι με μια ιδιαίτερα επιθηλιακών φαινότυπο εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα βιμεντίνης, η οποία περιορίζεται σε στρωματικά κύτταρα (ΜΔ, OVCAR5) και υψηλά επίπεδα έκφρασης CD44v8-10, η οποία ήταν ειδική για κυτταρική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων του όγκου (Σχήμα 5Α, εισάγετε). Αντιστρόφως, οι περισσότεροι όγκοι μεσεγχυματικής (ΡΤΗ, PtAM σφαίρες, και σφαίρες PtAB) εκφράζεται βιμεντίνη σε αμφότερα τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, καθώς και τα στρωματικά κύτταρα του όγκου, και είχε πολύ χαμηλή έκφραση του CD44v8-10 (Σχήμα 5Β). Οι όγκοι του ενδιάμεσο φαινότυπο με τα δύο χαρακτηριστικά των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών είχαν έκφραση του CD44v8-10 και βιμεντίνης στα επιθηλιακά κύτταρα καθώς και το στρώμα (Εικ 5C).

Αντίσωμα χρώση τομών ιστού από όγκους αναπτύχθηκαν in vivo μετά την έγχυση από 1 έως 5 εκατομμύριο πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή. Αντιπροσωπευτικές τομές από όγκους που προέρχονται από OVCAR5, ptAP-SPH, Pt W (Α), ptAM-SPH, ΡΤΗ, ptAB-SPH (Β) και PTD (C) δείχνονται. CD44v8-10, και βιμεντίνη ανοσοϊστοχημική χρώση εμφανίζεται με αιματοξυλίνης σε μεγέθυνση 100Χ. CD44v8-10 ετικέτες στην επιφάνεια των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων (ένθετο), ενώ vimentin ετικέτες στρωματικά κύτταρα σε περισσότερες επιθηλιακών όγκων και περισσότερα κύτταρα σε περισσότερους όγκους μεσεγχυματικά (ένθετο). Οι όγκοι ομαδοποιήθηκαν σε επιθηλιακά (Α), μεσεγχυματικά (Β) ή μικτό φαινότυπο (C) με βάση την χρώση.

Η

Διαλυτό CD44v8-10 είναι ανιχνεύσιμη στο υπερκείμενο των δειγμάτων ασκίτη και συσχετίζονται με χειρότερη πρόγνωση

Αξιολογήσαμε τη δυνατότητα να ανιχνεύει την διαλυτή εξωκυτταρική περιοχή του CD44v8-10 ως διασπασμένο θραύσμα σε ασκίτη υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιώντας στύπωμα Western από 28 διαφορετικά δείγματα ασκίτη ασθενών. Διαλυτό διασπαστεί CD44S είναι ομοιογενώς εκφράζεται σε όλα τα δείγματα ασκίτη, συμπεριλαμβανομένων των καλοήθων ελέγχους, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι μια πανταχού παρούσα πρωτεΐνη του αίματος. Είναι ενδιαφέρον ότι η σχάση και να ρίξει διαλυτή εξωκυτταρική περιοχή του CD44v8-10 ήταν ανιχνεύσιμη σε 27 από 28 δείγματα ασθενούς ασκίτη ωοθηκών, με εξαιρετικά μεταβλητή επίπεδα, αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε καλοήθεις συκώτι ασκίτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι ειδική για τον καρκίνο. Ένα αντιπροσωπευτικό Western Blot της 6ης ασκίτη ασθενής επιδεικνύεται στο Σχ 6Α. Η πρωτεΐνη αφθονία της διαλυτής εξωκυτταρικής περιοχής του CD44v8-10 μετρήθηκε με πυκνομετρία των ζωνών στυπώματος Western και κανονικοποιημένο για ίση φόρτωση πρωτείνης χρησιμοποιώντας IgG πυκνότητα ελαφρά αλυσίδα με ανάλυση εικόνας J λογισμικού. Μετά διαστρωμάτωση των ασθενών με βάση τα επίπεδα CD44v8-10, σημειώσαμε μία σημαντικά μειωμένη επιβίωση στους ασθενείς με υψηλά επίπεδα διαλυτών CD44v8-10 (άνω του 50%) με διάμεση επιβίωση 39 μήνες έναντι 59,27 μήνες για την κάτω του 50% (p . = 0,0481) (σχήμα 6Β)

Α) δείγματα Ασκίτης (Ν = 28? 6 δείγματα που παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικά) ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπευτική παρακέντηση, και ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western για CD44v8-10, CD44s, και αντι-ανθρώπινης ελαφριάς αλυσίδας IgG ως έλεγχο φόρτισης. Πρωτεΐνη πυκνομετρία εκτελέστηκε και τα δείγματα αναλύθηκαν για επίπεδα έκφρασης του διαλυτού CD44v8-10 και διαχωρίστηκε σε δύο ίσες ομάδες των υψηλά και χαμηλά επίπεδα CD44v8-10.