Αφηρημένο

Η πλειοψηφία του καρκίνου του προστάτη (PCA) των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με εκτομή των ανδρογόνων τελικά να αναπτύξουν ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Αναφέραμε προηγουμένως ότι η θεραπεία ανδρογόνων καταστέλλει Skp2 και c-Myc μέσω υποδοχέα ανδρογόνου (AR) και επαγόμενη διακοπή κύκλου κυττάρου σε G1 ανδρογόνα ανεξάρτητο LNCaP κύτταρα 104-R2, ένα στάδιο CRPC μοντέλο αργά κυτταρική γραμμή. Ωστόσο, ο μηχανισμός της ρύθμισης των ανδρογόνο Skp2 σε CRPC κύτταρα δεν ήταν πλήρως κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την ανδρογόνο ρύθμιση των Skp2 σε δύο AR-θετικά πρότυπα CRPC κυτταρική γραμμή, η LNCaP 104-R1 και PC-3

AR κύτταρα. Ο πρώην μία είναι ένα πρώιμο στάδιο, τα κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-ανεξάρτητες, ενώ η τελευταία το ένα είναι κύτταρα PC-3 εκ νέου εκφράζουν είτε άγριου τύπου AR ή μεταλλαγμένο AR LNCaP. Πολλαπλασιασμό των LNCaP 104-R1 και PC-3

AR κύτταρα δεν εξαρτάται, αλλά καταστέλλεται από ανδρογόνων. Παρατηρήσαμε σε αυτή τη μελέτη ότι ανδρογόνου αγωγή μείωσε πρωτεΐνη έκφραση του Cdk2, Η cdk7, Κυκλίνη Α, κυκλίνη Η, Skp2, c-Myc, και E2F-1? μειώνεται η φωσφορυλίωση της Thr14, Tyr15, και Thr160 για Cdk2? μειωμένη δραστηριότητα της Cdk2? που προκαλείται από το επίπεδο της πρωτεΐνης του p27

Kip1? και προκάλεσε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε LNCaP 104-R1 κύτταρα και PC-3

AR κύτταρα. Η υπερέκφραση του Skp2 πρωτεΐνης σε LNCaP 104-R1 ή PC-3

AR κύτταρα μπλοκάρει εν μέρει τη συσσώρευση του p27

Kip1 και την αυξημένη δραστηριότητα Cdk2 υπό θεραπεία ανδρογόνων, η οποία μπλοκάρει εν μέρει τις ανδρογόνες κατασταλτικές επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου. Αναλύοντας on-line δεδομένα συστοιχίας γονιδίων των 214 κανονικών και προστάτη δειγμάτων έδειξε ότι το γονίδιο η έκφραση του Skp2, Cdk2, και κυκλίνης Α συσχετίζεται θετικά με το άλλο, ενώ Η cdk7 συσχετίζεται αρνητικά σε αυτά τα γονίδια. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι ανδρογόνων καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRPC εν μέρει μέσω της αναστολής της κυκλίνης Α, Cdk2, και Skp2

Παράθεση:. Kokontis JM, Lin HP, Jiang SS, Lin CY, Fukuchi J, Hiipakka RA, et al. (2014) ανδρογόνα καταστέλλει την διάδοση των ανδρογόνων υποδοχέων-Θετική Ευνουχισμός-ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη μέσω αναστολής των CDK2, κυκλίνη και Skp2. PLoS ONE 9 (10): e109170. doi: 10.1371 /journal.pone.0109170

Επιμέλεια: Allen Gao, UC Davis Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιουλίου 2014? Αποδεκτές: 28 Αυγ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 1η Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Kokontis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από CA58073 και AT00850 από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας ΗΠΑ για SL? CS-103-PP-14 (Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα), CA-103-SP-01 (Υπουργείο Υγείας και Πρόνοιας), οι περισσότεροι 103 έως 2325-B-400-001 (Υπουργείο Επιστημών και Τεχνολογίας) στην Ταϊβάν για CPC , και το Εθνικό Πυρήνας Πρόγραμμα διευκόλυνσης για τη Βιοτεχνολογία από την Ταϊβάν (NSC 102-2319-B-400-001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η αντίστοιχη συγγραφέας Δρ Chih-Pin Chuu είναι μέλος συντακτικής επιτροπής PLoS ONE, ωστόσο, οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει την τήρηση όλων των PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

το 1941, ο Charles Huggins ανέφεραν ότι θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων προκάλεσε υποχώρηση των πρωτογενών και μεταστατικό εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη (PCA) [1]. θεραπεία εκτομή ανδρογόνων, χρησιμοποιώντας αγωνιστές ωχρινοτρόπου ορμόνης-απελευθέρωσης ορμόνη (LH-RH) ή διμερείς ορχεκτομή, έχει γίνει μια βασική θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [2]. Η πλειοψηφία των ασθενών βιώνουν μια αρχική ταχεία μείωση του PSA ακολουθούμενη από βραδύτερη μείωση στο ναδίρ [2]. Ωστόσο, το 80-90% των ασθενών τελικά αναπτύσσουν ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) 12-33 μήνες μετά τη θεραπεία ανδρογόνων με διάμεση συνολική επιβίωση των 12-24 μηνών [3]. Υποδοχέα ανδρογόνου (AR) παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, την εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη [4]. Αύξηση AR mRNA και πρωτεΐνη παρατηρείται σε CRPC όγκους σε σύγκριση με τις πρωτογενείς όγκους του προστάτη [5], [6].

LNCaP είναι ένας συχνά χρησιμοποιούμενος κυτταρική γραμμή εγκατεστημένος από ανθρώπινο λεμφαδένα μεταστατικής αλλοιώσεως προστατικού αδενοκαρκινώματος. LNCaP κύτταρα εκφράζουν υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και ειδικό αντιγόνο προστάτη (PSA) [7], [8]. Προηγουμένως, έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο εξέλιξης του προστάτη χρησιμοποιώντας κύτταρα LNCaP. Εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP 104-S κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ανδρογόνα απεμπλουτισμένο να μιμούνται τους ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία ανδρογόνων [9] – [11]. Ένας μικρός πληθυσμός του ευνουχισμού-ανθεκτικών κυττάρων που ονομάζεται LNCaP 104-R1 προέκυψε στους 10 μήνες [9] – [11]. Μετά από επιπλέον 8 μήνες καλλιέργεια σε ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο, ​​LNCaP κύτταρα 104-R1 οδήγησε σε κύτταρα LNCaP 104-R2, τα οποία πολλαπλασιάστηκαν πολύ γρηγορότερα από 104-R1 κύτταρα [10]. Ο πολλαπλασιασμός των LNCaP 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2 είναι ανεξάρτητος από ανδρογόνο αλλά καταστέλλεται με φυσιολογικές συγκεντρώσεις των ανδρογόνων [9], [10], [12], [13]. LNCaP 104-R1 και 104-R2 κύτταρα μιμούνται πρώιμη και όψιμη CRPC κύτταρα, αντίστοιχα [14]. Μετά ανδρογόνων θεραπεία, οι πλειοψηφίες των LNCaP 104-R1 και 104-R2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε G1 κυττάρων κύτταρα συλλάβουν και πέθανε τελικά με μόνο ένα μικρό πληθυσμό των κυττάρων επιβίωσαν και συνεχίζεται να αυξάνεται, το όνομα R1Ad [10] και R2Ad [15], αντίστοιχα. Ωστόσο, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων R1Ad είναι ανδρογονο-εξαρτώμενη και μπορεί να ελεγχθεί από θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων [12], ενώ ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων R2Ad είναι ανδρογόνα αναίσθητος και δεν ανταποκρίνεται σε περαιτέρω θεραπεία με αυξητική ορμόνη [15]. Ως εκ τούτου, ασθενής με όγκους CRPC πρώιμο στάδιο μπορούν να επωφεληθούν από ανδρογόνων θεραπεία. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η θεραπεία ανδρογόνων καταστέλλει S-φάσης πρωτεϊνικής κινάσης που σχετίζεται με 2 (Skp2) και c-Myc μέσω AR σε κύτταρα LNCaP 104-R2, επάγοντας έτσι διακοπή κύκλου G1 κυττάρου και αναστολή της ανάπτυξης [15]. Ογκογόνο δράση και ανδρογόνο ρύθμιση του c-myc έχουν μελετηθεί εντατικά. Ωστόσο, ανδρογόνο ρύθμιση των Skp2 σε CRPC κύτταρα είναι λιγότερο κατανοητή.

Skp2, ένα F-box πρωτεΐνης, και συμπαράγοντας της Cks1 είναι οι υποστρώματος-υπομονάδες στόχευσης της (πρωτεΐνη Skp1 /Cul1 /F-box) SCF ubiquitin συγκρότημα λιγάση. SCF είναι ένα συγκρότημα Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης που ρυθμίζει την είσοδο S φάση των κυττάρων επάγοντας την υποβάθμιση του αναστολείς κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη p21

Cip1 και p27

Kip1 [16], [17]. στόχοι Skp2 p27

Kip1 με φωσφορυλίωση p27

Kip1 σε T187 για ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση [18] – [20]. Skp2 σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με την κυκλίνη Α-κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 2 (Cdk2) [20]. Skp2 φωσφορυλιώνεται από Cdk2 σε Ser64 [20] και από Akt σε Ser72 [21]. Η φωσφορυλίωση του Ser64 και Ser72 σε Skp2 συμβάλλει στη σταθεροποίηση της Skp2 εμποδίζοντας τη σύνδεσή της με την APC /CCdh1 [17], [18], [20], [21]. Τόσο αυλού και βασικών επιθηλιακών κυττάρων σε κανονικό προστάτη εμφανίζουν πολύ χαμηλά επίπεδα Skp2, ωστόσο, τα επίπεδα Skp2 αυξήσει δραματικά τόσο προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) και προστάτη [22], [23]. Up-ρύθμιση του Skp2 συσχετίζεται με μείωση της p27

έκφραση Kip, υψηλότερη βαθμολογία Gleason, και πιο προχωρημένο παθολογικό στάδιο του προστάτη [22], [24]. Up-ρύθμιση του Skp2 στο PCA είναι επίσης ανεξάρτητα συνδέεται με υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής προστάτη μετά την επέμβαση [22], [24]. Skp2 υπερέκφραση σε κύτταρα προστάτη διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη και αυξάνει την ογκογένεση σε μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου [25].

Cdk2 είναι μέλος της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάση της οικογένειας της πρωτεΐνης κινασών Ser /Thr [26]. Συγκρότημα Cdk2-κυκλίνης E απαιτείται για τη μετάβαση των κυττάρων από G1 προς S φάση, ενώ η πρόσδεση μεταξύ Cdk2 και κυκλίνης Α απαιτείται να προχωρήσει μέσα από τη φάση S [26]. Η ενεργοποίηση της Cdk2 συμπλοκών απαιτεί αποφωσφορυλίωση Thr14 και Tyr15 στην Cdk2 από cdc25 φωσφατάση και φωσφορυλίωση Thr160 επί Cdk2 [26], [27], η οποία διαμεσολαβείται από CAK, ένα σύμπλεγμα Η cdk7 και κυκλίνη Η. [28] Η κυκλίνη Α είναι ένα μέλος της οικογένειας της κυκλίνης, μια ομάδα πρωτεϊνών που λειτουργούν στη ρύθμιση της προόδου διαμέσου του κυτταρικού κύκλου. Η μεταγραφή του κυκλίνης Α ρυθμίζεται στενά και συγχρονισμένο με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με την E2F παράγοντα μεταγραφής σε ένα βρόχο αρνητικής ανάδρασης [29].

LNCaP κύτταρα εκφράζουν ένα μεταλλαγμένο AR (T877A) που εμφανίζει εξειδίκευση δέσμευσης συνδέτη χαλαρή [30 ], [31], που έτσι δημιουργείται AR-θετική PC 3-κύτταρα που υπερεκφράζουν είτε άγριου τύπου AR (PC-3

AR) ή LNCaP μεταλλαγμένο AR (PC-3

LNCaP-AR) στο AR-αρνητικό PC-3 κύτταρα και άλλα CRPC βάρη κυττάρου. Χρησιμοποιήσαμε LNCaP κύτταρα 104-R1, ένα μοντέλο μιμείται πρώιμο στάδιο CRPC, καθώς και PC-3

AR και PC-3

LNCaP-AR κύτταρα για να εξετάσει την ανδρογόνο ρύθμιση του Skp2 και συναφών εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες ( CDKs), καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αυτά τα CRPC κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Συνθετικά ανδρογόνα R1881 και αντιανδρογόνο Casodex (βικαλουταμίδη) ελήφθησαν από την Perkin Elmer (Boston , MA, USA) και η AstraZeneca (Wilmington, DE, USA), αντίστοιχα. [A-

32Ρ] dCTP (3000 Ci /mmole) και [G-

32Ρ] ΑΤΡ (5000 Ci /mmole) ήταν από την Amersham (Arlington Heights, IL, USA). Τα πεπτίδια συντέθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Cancer Research Center εγκατάσταση σύνθεση ολιγοπεπτιδίου.

καλλιέργειας κυττάρων

LNCaP κύτταρα 104-R1 και PC-3 sublines ήταν δώρα από τον Dr. Shutsung Liao (Πανεπιστήμιο του Chicago, IL, USA). LNCaP κύτταρα 104-R1 προήλθαν από γονικά κύτταρα LNCaP 104-S εξαρτώμενων από ανδρογόνα, τα οποία δημιουργήθηκαν από LNCaP FGC κλώνο (ATCC CRL-1740). Τα κύτταρα LNCaP 104-R1 και PC-3 sublines έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [10] – [13], [15], [32] – [34].

LNCaPAR LNCaP κύτταρα 104-R1, PC-3, PC-3

AR, και PC-3 ήταν να διατηρήσει σε DMEM με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (CS-FBS).

Δυτική κηλίδωση ανάλυση

LNCaP κύτταρα 104-R1 ή PC-3 sublines πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε 2 χ Laemmli ρυθμιστικού διαλύματος χωρίς βρωμοφαινόλης μπλε χρωστική. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε με το αντιδραστήριο Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Αντισώματος για Skp2 και p21

Cip1 /WAF1 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα για κυκλίνη Ε, Cdk2, και φωσφο-Cdk2 Thr160 ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA). Η κυκλίνη Α και αντισώματα E2F-1 ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Το p27

Kip1 αντισώματος ήταν από BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA). Τα αντισώματα φωσφο-Cdk2 Tyr15 και φωσφο-Cdk2 Thr14 αγοράστηκαν από Epitomics (Burlingame, CA, USA). CDK7 και κυκλίνης H ήταν από Abnova (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Ανίχνευση α-τουμπουλίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) ή β-ακτίνης (Novus, Littleton, CO, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Για SDS-PAGE Cdk2, ρύθμιση του ρΗ του ρυθμιστικού διαλύματος διαχωρισμού γέλης για 8,5 απαιτήθηκε για την επίλυση του ταχύτερα μεταναστεύουν ισομορφή. Ένταση των ζωνών για διαφορετικές πρωτεΐνες ήταν ποσοτικά με Epson Stylus TX130 χρησιμοποιώντας ΟΗΕ-SCAN-IT gel 6.1 του λογισμικού.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

LNCaP κύτταρα 104-R1 ή PC-3 sublines σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων με 100 μΐ μέσου DMEM που περιείχε 10% CS-FBS. ανιχνεύσεις πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], [15], [33] – [39]. Όλες οι ενδείξεις κανονικοποιήθηκαν προς το μέσο όρο της κατάστασης ελέγχου σε κάθε επιμέρους πείραμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Δέκα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε κατάσταση. Η μέση και τυπική απόκλιση αντιπροσώπευε τον μέσο όρο και την τυπική απόκλιση αντίστοιχα τα αποτελέσματα από όλα τα 30 φρεάτια στα τρία πειράματα.

Ροή Ανάλυση κυτταρομετρίας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

5 κύτταρα σε δίσκους 6-cm. δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [13], [15], [35] – [37]. [39],

πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (ελεύθερη DNA-? Ambion, Austin, ΤΧ). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τυχαία εξαμερή και Moloney ποντικού ανάστροφης μεταγραφάσης ιού λευχαιμίας (Omniscript? Qiagen, Valencia, CA). Η TaqMan εκκινητών /ανιχνευτών σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). Το 5 ‘άκρο του ανιχνευτή σημάνθηκε με ανταποκριτή-φθορίζουσα χρωστική FAM. Το 3 ‘άκρο του ανιχνευτή σημάνθηκε με χρωστική απόσβεσης TAMRA. Οι αλληλουχίες των CDKN1B εκκινητών, 5’-CCGGTGGACCACGAAGAGT-3 ‘και 5′-GCTCGCCTCTTCCATGTCTC-3′? CDKN1B ανιχνευτή, 5’-AACCCGGGACTTGGAGAAGCACTGC-3 ‘. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM σύστημα 7700 (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο QuantiTect Probe PCR (Qiagen). Το κιτ rRNA Ελέγχου (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα επίπεδα μεταγραφής μεταξύ των δειγμάτων.

Απομόνωση Skp2 cDNA

Ένα cDNA Skp2 απομονώθηκε με ενίσχυση PCR από ένα LNCaP 104-R1 Lambda ZAP- βιβλιοθήκη II cDNA χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εναρκτήρες που λαμβάνονται από την αλληλουχία Skp2: 5′-CAGCTCTGCAAGTTTAATGC-3 ‘και 5′-AAGAAGAGACACCATCCTGC-3’. Το ακόλουθο πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε: προ-ενίσχυση στους 94 ° C 5 λεπτά, 55 ° C 2 λεπτά, 30 κύκλοι των 72 ° C 2 λεπτά, 94 ° C 0.5 λεπτά, 55 ° C 0.5 λεπτό, ακολουθούμενο από 7 λεπτά στους 72 ° ΝΤΟ. Pfu (Stratagene) χρησιμοποιήθηκε ως DNA πολυμεράση και διμεθυλοσουλφοξείδιο σε τελική συγκέντρωση 10% χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση ενίσχυσης. Ένα προϊόν ενίσχυσης 1345 bp εισήχθη εντός EcoRV χωνεμένο φορέα pBluescript II για αυτοματοποιημένη ανάλυση διδεοξυ αλληλουχίας. Ένας κλώνος Skp2 επιλέχθηκε για πιστοποίηση αλληλουχίας και χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα επόμενα πειράματα. Το cDNA Skp2 μεταφέρθηκε από αυτόν τον κλώνο pBluescript στο ρετροϊικό pMV7 για συστατική έκφραση σε LNCaP κύτταρα 104-R1.

Σταθερό ρετροϊική μόλυνση του Skp2

κύτταρα 104-R1 μολύνθηκαν με ρετροϊό pMV7 περιέχουν ένθετα Skp2 που δημιουργήθηκε σε ΦNX-Ampho κύτταρα χρησιμοποιώντας διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως συσκευασίας [10]. Η κυτταρική γραμμή συσκευασίας ΦNX-Ampho δόθηκε από τον Garry Nolan του Πανεπιστημίου του Στάνφορντ. Σταθερά μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με G418.

Η έκφραση του GST-Skp2 πρωτεΐνη

SmaI-HindIII θραύσματα Skp2 cDNAs εισήχθησαν εντός SmaI-HindIII-κομμένο pGEX-KG [40]. Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε E.coli κύτταρα BL-21-CodonPlus-RIL (Stratagene) για ισοπροπυλο θειογαλακτοσίδη επαγόμενη έκφραση του τρανσφεράσης γλουταθειόνης θείο πρωτεΐνες (GST) -Skp2 σύντηξης.

In Vitro

δοκιμασία Cdk2 δραστικότητας

κυτταρολύματα έγιναν από κύτταρα LNCaP 104-R1 έχουν μολυνθεί με τον ιό MV7 κενά και LNCaP κύτταρα 104-R1 υπερεκφράζουν Skp2 αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες παρουσία ή απουσία 10 ηΜ R1881. Δοκιμασία της δραστικότητας Cdk2 χρησιμοποιώντας ιστόνη Η1 ως υπόστρωμα περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Για φωσφορυλίωση Cdk2 ενός συνθετικού πεπτιδίου Skp2, δύο 12 πεπτίδια υπόλειμμα (GHPESPPRKRLK και GHPEAPPRKRLK) που αντιστοιχούν στις θέσεις 60 έως 71 της πρωτεΐνης άγριου τύπου Skp2 και χρησιμοποιήθηκε ως υποστρώματα σε αντιδράσεις κινάσης με ανοσοκατακρημνισθέν Cdk2. Κυτταρολύματα έγιναν από κύτταρα LNCaP 104-R1 που καλλιεργούνται για 4 ημέρες σε παρουσία ή απουσία 10 ηΜ R1881. Κλάσματα του λύματος (ολικής πρωτεΐνης 1 mg) που παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10] επωάστηκαν με 2 mg Cdk2 αντίσωμα που συνδέεται προς πρωτεΐνη G-αγαρόζης. Μετά από πλύση 3 φορές σε ρυθμιστικό λύσης και 2 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης (50 mM HEPES ρΗ 7,5? 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT και 0,02% Triton Χ-100), σφαιρίδια επωάστηκαν με 10 mCi [g-32Ρ] ΑΤΡ και 20 mM πεπτίδιο σε ένα συνολικό όγκο 25 ml για 30 λεπτά στους 30 ° C. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με την προσθήκη 3 ml 0,5 Μ EDTA και 10 ml δείγματα κηλιδώθηκαν επί 2,5 cm δίσκους P-81 φίλτρο (Whatman). Οι δίσκοι πλύθηκαν 5 φορές με 0,5% Η3ΡΟ4 και μία φορά με 50% αιθανόλη /0,05% Η3ΡΟ4 για να απομακρυνθεί μη ενσωματωμένα ΑΤΡ. Ενσωματώθηκε ετικέτα προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία υγρού σπινθηρισμού. Κενά αποτελούνταν από κινάσης αντιδράσεων χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης αντισώματος-φορτωμένο δεν επωάζονται με κυτταρικό λύμα. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τετραπλούν.

AR και Skp2 υπερέκφραση σε κύτταρα PC-3

PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με LNCX-2 πλασμίδιο που περιέχει άγριου τύπου μεταλλαγμένο ανθρώπινο AR ή LNCaP κυττάρων AR cDNA και επιλέγονται με νεομυκίνη G418 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. PC-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου AR ή LNCaP μεταλλαγμένο AR συνέχεια συμβολίζεται ως PC-3

AR ή PC-3

LNCaP-AR. PC-3

κύτταρα AR επιμολυσμένα περαιτέρω με LPCX πλασμίδιο που περιέχει Skp2 cDNA ή το πλασμίδιο ελέγχου LPCX επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Αντιβιοτικό-ανθεκτικές αποικίες επεκτάθηκαν και ελέγχθηκαν για αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης στόχου με ανάλυση κηλίδος Western.

δεδομένα Public domain

προφίλ Έκφραση των εκλεκτικών γονιδίων από σύνολα δεδομένων που περιέχουν όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς PCa, συμπεριλαμβανομένων GSE6919 [41], το οποίο περιέχει ιστούς καρκίνωμα 23 φυσιολογικό προστάτη και 89 του προστάτη, και Singh σύνολα δεδομένων του προστάτη [42], το οποίο περιέχει 50 δείγματα φυσιολογικό προστάτη και τα δείγματα καρκινώματος προστάτη 52, είχαν κατεβάσει από Oncomine (http: //www.oncomine .com) χωρίς περαιτέρω επεξεργασία.

Ανάλυση δεδομένων

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή +/- SD τουλάχιστον τριών πειραμάτων ή είναι αντιπροσωπευτικά πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. t-test του Student (two-tailed, σε συνδυασμό) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων από πειράματα προσδιορισμού πολλαπλασιασμού.

Αποτελέσματα

θεραπεία ανδρογόνων κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των AR-πλούσια CRPC κύτταρα

Η θεραπεία με συνθετικό ανδρογόνο R1881 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο κατέστειλε κυτταρικό πολλαπλασιασμό των AR-πλούσια LNCaP 104-R1, PC-3 που υπερεκφράζουν άγριου τύπου AR (PC-3

AR), και PC-3 που υπερεκφράζουν LNCaP μεταλλαγμένο AR (PC -3

LNCaPAR) κύτταρα, αλλά όχι έλεγχο AR-αρνητικά κύτταρα PC-3 (PC-3

LNCX-2) (Εικ. 1Α). Αντι-ανδρογόνο Casodex μπλοκάρει την ανδρογόνο καταστολή, επιβεβαιώνοντας ότι ανδρογόνο αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν μέσω AR (Εικ. 1Α). Η θεραπεία με 10 nM R1881 μειώθηκε το ποσοστό του πληθυσμού των κυττάρων στη φάση S και που προκαλείται φάση G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε LNCaP 104-R1, PC-3

AR, και PC-3

LNCaPAR κύτταρα, αλλά όχι έλεγχο PC-3

LNCX-2 κύτταρα (Σχ. 1Β, 1C).

(Α) LNCaP 104-R1 κύτταρα, PC-3 κυττάρων με πλασμίδιο ελέγχου LNCX-2 (PC-3

LNCX-2) , PC-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου AR (PC-3

AR), και PC-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν LNCaP AR (PC-3

LNCaP-AR) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την αύξηση της συγκέντρωσης του συνθετικού ανδρογόνου R1881 ή αντι-ανδρογόνο Casodex για 96 ώρες. Σχετικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία φθορομετρικής DNA περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και κανονικοποιήθηκε προς τον αριθμό κυττάρων των κυττάρων ελέγχου (χωρίς θεραπεία). LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, και PC-3

LNCaP-AR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες. Ποσοστό του κυττάρου πληθυσμός των LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, και PC-3

LNCaP-AR κύτταρα σε φάση S (Β) και G1 φάσης (C ) προσδιορίστηκε με τη ροή PI-χρώση κυτταρομετρίας. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- τυπικό σφάλμα που προέρχεται από 5 ανεξάρτητα πειράματα. Asterisk *, ** και *** δηλώνουν σημαντική διαφορά

σ

& lt? 0,05,

σ

& lt? 0,01,

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα, του επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

η

θεραπεία ανδρογόνων επηρεάζει τη ρύθμιση των πρωτεϊνών στα κύτταρα CRPC

θεραπεία ανδρογόνων ελαφρώς αυξημένη έκφραση AR κυτταρικού κύκλου, αλλά δραματική αύξηση της p27 αναστολέα του κυτταρικού κύκλου

Kip1 σε LNCaP 104-R1,

AR PC-3 και PC-3

LNCaPAR κύτταρα (Εικ. 2). Στην αντίθετη, ανδρογόνο θεραπεία μειωμένη πρωτεΐνη έκφραση του Skp2, Cdk2, φωσφο-Cdk2 Tyr15, φωσφο-Cdk2 Thr14, φωσφο-Cdk2 Thr160, Η cdk7, κυκλίνη Α, κυκλίνη Η, και c-Myc σε LNCaP 104-R1, PC-3

AR, και PC-3

LNCaPAR κύτταρα (Εικ. 2). επίπεδο πρωτεΐνης p27

Kip1 ήταν αντίστροφη-συσχετίζεται με Skp2 σε αυτά CRPC κύτταρα, τα οποία ήταν σύμφωνη με το γεγονός ότι Skp2 στοχεύει p27

Kip1 για ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση [18] – [20]. Αφθονία του p21

Cip1 ήταν ελαφρώς μειωμένη σε κύτταρα LNCaP 104-R1, αλλά αυξήθηκε σε PC-3

AR και PC-3

LNCaPAR κύτταρα από ανδρογόνα. Αφθονία των E2F-1 ήταν ελαφρώς μειωμένη στα κύτταρα LNCaP 104-R1, αλλά μειώθηκε δραματικά το PC-3

AR και PC-3

LNCaPAR κύτταρα από ανδρογόνα. Αφθονία της κυκλίνης Ε δεν επηρεάστηκε σημαντικά από ανδρογόνο θεραπεία. Η ενεργοποίηση της Cdk2 συμπλοκών απαιτεί αποφωσφορυλίωση Thr14 και Tyr15 στην Cdk2 από cdc25 φωσφατάση και φωσφορυλίωση Thr160 επί Cdk2 [26], [27], η οποία διαμεσολαβείται από CAK, ένα σύμπλεγμα Η cdk7 και κυκλίνη Η. [28] Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση της Thr14 και Tyr15 ήταν ελαφρώς μειώθηκε κατά ανδρογόνων θεραπεία, η φωσφορυλίωση της Thr160 δραματικά καταστέλλεται από ανδρογόνο θεραπεία, πιθανώς λόγω της μείωσης του Η cdk7 και η έκφραση πρωτεΐνης της κυκλίνης Η (Εικ. 2). επεξεργασία των ανδρογόνων αύξηση της p27

Kip1, κυκλίνη Α, και c-Myc, ενώ μειώθηκαν p21

Cip1 και Skp2 στα κύτταρα ελέγχου AR-αρνητικών PC-3

LNCX-2. Επειδή ανδρογόνων δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό και την κυτταρική πρόοδο του κύκλου του PC-3

LNCX-2 κύτταρα, οι ρόλοι αυτών των πρωτεϊνών σε PC-3

κύτταρα LNCX-2 δεν ήταν σαφής. στόχοι Skp2 p27

Kip1 για ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση [18] – [20]. Ωστόσο, σύμφωνα με τη θεραπεία των 0,1 και 10 nM R1881, το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης των CDKN1B (p27

Kip1) αυξήθηκαν 1,3 και 1,7 φορές, αντίστοιχα (Εικ. 3Α). Όπως c-Myc έχει αναφερθεί ότι καταστέλλει FOXO3a διαμεσολαβούμενη μεταγραφή του CDKN1B [43], τη μείωση του c-myc που προκαλείται από ανδρογόνα θεραπεία μπορεί συνέβαλαν στην αύξηση της γονιδιακής έκφρασης CDKN1B (Σχ. 2). Επομένως, πιστεύουμε ότι η μείωση της υποβάθμισης πρωτεΐνης και αύξηση της μεταγραφής του γονιδίου τόσο συνέβαλε στην αύξηση του p27

επίπεδο Kip1 πρωτεΐνη, η οποία μπορεί επομένως να καταστήσει G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη CRPC κύτταρα.

Πρωτεΐνη έκφραση του AR, Skp2, Cdk2, φωσφο-Cdk2 Tyr15, φωσφο-Cdk2 Thr14, φωσφο-Cdk2 Thr160, Η cdk7, κυκλίνη Ε, κυκλίνη, κυκλίνη Η, ρ21

CIP, p27

Kip, c-myc, και E2F-1 ήταν προσδιορίζεται με δοκιμασία Western αποτύπωση σε LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, και PC-3

LNCaP-AR κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με διαφορετική συγκέντρωση του R1881 για 96 ώρες. Πρωτεΐνη αφθονία του α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α) Gene έκφραση του CDKN1B προσδιορίστηκε σε LNCaP 104-R1 κύτταρα επεξεργασμένα με 0, 0,1, ή 10 ηΜ R1881 για 96 h με τη χρήση qRT-PCR. LNCaP κύτταρα 104-R1 επεξεργασία με 10 nm R1881 με την παρουσία ή απουσία 5 μm αντι-ανδρογόνο Casodex για 96 ώρες. Αστερίσκος * υποδηλώνει σημαντική διαφορά

σ

& lt? 0.05 των κατεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. (Β) σχετικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία φθορομετρικής DNA. (C) Ποσοστό του πληθυσμού κυττάρων σε φάση S προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ο αστερίσκος * υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά (

ρ

& lt? 0,05) των επεξεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. φωσφορυλίωση (D) ιστόνη Η1 ανιχνεύθηκε με τη χρήση Cdk2 ανοσοκαταβυθίστηκε από κυτταρικό λύμα που περιέχει 2 mg πρωτεΐνης. Σχετική ραδιενέργεια προσδιορίστηκε με σάρωση με ένα Storm 860 phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). επίπεδο πρωτεΐνης έκφρασης Cdk2, ρ27

Kip1, και β-ακτίνης προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western των ίδιων κυτταρολύματα. Αφθονία των β-ακτίνης πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

θεραπεία ανδρογόνων καταστέλλεται δραστικότητα Cdk2

Cdk2 είναι μια κινάση ιστόνης Η1 υπεύθυνη για την φωσφορυλίωση της ιστόνης κατά τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από G1 στην S φάση [44] – [46]. Για να επιβεβαιωθεί ότι η δραστηριότητα Cdk2 καταστάλθηκε από ανδρογόνο θεραπεία, χρησιμοποιήσαμε ιστόνης Η1 ως υπόστρωμα για τη δοκιμασία δραστικότητας κινάσης. Μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3Β) και μείωση στην κυτταρική φάση S του πληθυσμού (Σχ. 3C) σε κύτταρα LNCaP 104-R1 που προκαλείται από ανδρογόνα θεραπεία ήταν στενά συνδεδεμένες με την μείωση της δραστηριότητας Cdk2 όπως ανιχνεύεται από τη μείωση στη φωσφορυλίωση της ιστόνης H1, η ελάττωση της ταχύτερης-μεταναστεύουν μορφή Cdk2, και αύξηση του αναστολέα p27 Cdk

Kip1 αφθονία (Εικ. 3D). Η ταχύτερη-μεταναστεύουν Cdk2 είχε εντοπιστεί στο παρελθόν ως ενεργό μορφή Cdk2 που φωσφορυλιώνεται σε Thr160 [47]. θεραπεία αντιανδρογόνο Casodex μπλοκάρει τις επιδράσεις των ανδρογόνων στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, φωσφορυλίωση ιστόνης Η1, και τη δραστηριότητα των Cdk2 (Σχ. 3Β, C, D).

Η υπερέκφραση του Skp2 μπλοκαριστεί ανδρογόνο καταστολή σε LNCaP 104- κύτταρα R1

Skp2 φωσφορυλιώνεται και ενεργοποιείται από Cdk2 [20], καθώς και σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με τη κυκλίνη Α και Cdk2 [20]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η υπερέκφραση του Skp2 μπλοκάρει μερικώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP 104-R2 [15]. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε τη σχέση μεταξύ υπερέκφραση Skp2 και δραστικότητα Cdk2. Η υπερέκφραση του Skp2 σε κύτταρα LNCaP 104-R1 απαλλαγεί ανδρογονική καταστολή της δραστηριότητας Cdk2 όπως προσδιορίστηκε από

in vitro

φωσφορυλίωση της ιστόνης Η1 ανοσοκαταβυθίστηκαν με Cdk2 (Σχ. 4Α). Μέτρηση της δραστικότητας κινάσης σε Cdk4 ανοσοϊζήματα που παρασκευάζονται από αυτά τα κύτταρα δεν έδειξαν διαφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η υπερέκφραση του Skp2 σε κύτταρα LNCaP 104-R1 μειωθεί μερικώς την επαγωγή του ρ27

Kip1 (Σχ. 4Α), αναστολή ανάπτυξης (Εικ. 4Β), και G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου (σχ. 4C) που προκαλείται από ανδρογόνα θεραπεία. Το βασικό επίπεδο ρ27

Kip1 σε Skp2-υπερεκφράζεται κύτταρα 104-R1 ήταν πολύ λιγότερο σε σύγκριση με τον έλεγχο 104-R1 κύτταρα (Σχ. 4Α). Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί τα κύτταρα 104-R1 που υπερεκφράζουν Skp2 πολλαπλασιαστεί 1,42 φορές γρηγορότερα από τον έλεγχο 104-R1 κύτταρα (Εικ. 4Β).

(A) επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του Skp2 και p27

Kip1 σε LNCaP 104-R1 κύτταρα μολυσμένα με pMV7 άδειο ρετροϊό (έλεγχος) ή ρετροϊός που περιέχει pMV7 Skp2 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες με την παρουσία ή απουσία 10 nm R1881. δραστικότητα Cdk2 μετρήθηκε με

in vitro

φωσφορυλίωση της ιστόνης Η1 με χρήση Cdk2 ανοσοκαταβύθισης. Αφθονία των β-ακτίνης πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων των κυττάρων LNCaP 104-R1 μολυνθεί με pMV7 άδειο ρετροϊό (έλεγχος) ή ρετροϊός pMV7 περιέχουν Skp2 σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ R1881 επί 96 ώρες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία φθορομετρικό DNA και κανονικοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυττάρων ελέγχου ομάδα (καμία επεξεργασία). (C) Ποσοστό κυττάρων LNCaP 104-R1 στην S φάση προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες με την παρουσία ή απουσία 10 nm R1881. Ο αστερίσκος υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά (

ρ

& lt? 0,05) από τα κύτταρα ελέγχου. κύτταρα (D) LNCaP 104-R1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ R1881 για 3 ημέρες. Οι πρωτεΐνες σύντηξης της GST ελέγχου (διαδρομές 1-3) και βακτηριακά-εκφρασμένο GST-Skp2 (διαδρομές 4-6) συνδέεται προς σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης επωάστηκε με 200 μg ολικού κυττάρου προϊόντα λύσης από μη επεξεργασμένα και ανδρογόνο-κατεργασμένων κυττάρων 104-R1 στον παρουσία 10 μθί [

32Ρ] -ΑΤΡ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. «NL» αντιπροσωπεύει, καθώς δεν λύμα. Οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν σε Laemmli ρυθμιστικό φόρτωσης γέλης και διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE γέλη που στη συνέχεια ξηράνθηκε και εκτέθηκε σε Kodak Χ ΟΜΑΤ AR φιλμ για 3 ημέρες. κύτταρα (Ε) 104-R1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ R1881 για 3 ημέρες. Η φωσφορυλίωση του GST εκλουσθέντων (διαδρομές 1-3) και GST-Skp2 (διαδρομές 4-6) πρωτεΐνες σύντηξης προσδιορίστηκε με ανοσοκατακρημνισθέν Cdk2. Cdk2 ανοσοκατακρημνίστηκε από υποπολλαπλάσια του λύματος που περιέχει 1 mg πρωτεΐνης παρασκευάζονται από μη επεξεργασμένα (λωρίδες 2, 5 και 8) ή R1881-επεξεργασία (λωρίδες 3, 6 και 9) κύτταρα 104-R1. λωρίδες ελέγχου (διαδρομές 1, 4 και 7) με την ένδειξη «ni» δεν έδειξαν ανοσοκατακρημνισθέν Cdk2. δραστικότητα Cdk2 προσδιορίστηκε με μεθόδους που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

ανδρογόνων ρυθμίζει φωσφορυλίωση Skp2 μέσω Cdk2

Δυστυχώς, τα αντισώματα ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της Ser64 ή Ser72 επί Skp2 δεν είναι εμπορικές διαθέσιμες . Για να προσδιοριστεί εάν ανδρογόνων θεραπεία επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της Skp2, επωάσαμε βακτηριακά εκφρασμένων πρωτεϊνών σύντηξης GST-Skp2 συνδέεται προς σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης με κυτταρολύματα ολόκληρο από μη επεξεργασμένο και ανδρογόνα επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP 104-R1 με την παρουσία [G-

32Ρ] ΑΤΡ. Βρήκαμε ότι κυτταρολύματος από ανδρογόνο-επεξεργασμένα κύτταρα 104-R1 περιείχε λιγότερο δραστικότητα κινάσης ικανό φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών σύντηξης 74 kDa GST-Skp2 σε σύγκριση με το προϊόν της λύσης από μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4D). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι ανδρογόνων θεραπεία μείωσε τη συνολική φωσφορυλίωση σε Skp2. Στη συνέχεια διερευνήθηκε αν Cdk2 φωσφορυλιώνει πραγματικά Skp2. Όταν οι πρωτεΐνες σύντηξης GST-Skp2 χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα σε αντιδράσεις κινάσης με Cdk2 ανοσοκαταβυθίστηκε από κυτταρολύματα LNCaP 104-R1, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όπως εκείνη από το Σχ. 4D (Εικ. 4Ε). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι Cdk2 φωσφορυλιωμένη Skp2 και η δραστηριότητα της Cdk2 να φωσφορυλιώνει Skp2 καταστάλθηκε από ανδρογόνο θεραπεία σε κύτταρα LNCaP 104-R1.

Η υπερέκφραση του Skp2 μπλοκαριστεί ανδρογόνο καταστολή σε PC-3

AR και PC- 3

LNCaPAR κύτταρα

Παρόμοια με LNCaP 104-R1 κύτταρα, η υπερέκφραση του Skp2 μπλοκάρει εν μέρει τα δοσοεξαρτώμενη επιδράσεις των ανδρογόνων αναστολής επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από PC-3

κύτταρα AR ( Εικ. 5).

(Α) Protein έκφραση του Skp2 αναλύθηκε με κηλίδωση Western σε κύτταρα PC-3 εκ νέου τα κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου AR (PC-3

AR) και υπερεκφράζουν είτε φορέα αναφοράς ή Skp2 απουσία ή παρουσία 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες. Επίδραση του ανδρογόνου στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Β) ή εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (C) από αυτούς τους κλώνους που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενη συγκέντρωση του R1881 για 96 ώρες προσδιορίστηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων και η ροή του ΡΙ-χρώση κυτταρομετρίας ανάλυση, αντίστοιχα. Οι αστερίσκοι * και ** υποδηλώνουν μια σημαντική διαφορά

σ

& lt? 0,05 και

σ

& lt?. 0.01, αντίστοιχα, μεταξύ της θεραπείας και τα κύτταρα ελέγχου

Η

Συσχέτιση μεταξύ Skp2, Cdk2, της κυκλίνης Α, και η cdk7 σε όγκους προστάτη

Σύμφωνα με το γεγονός ότι η έκφραση και η δραστικότητα του Skp2 ρυθμίζεται από Cdk2 και κυκλίνης Α σε κύτταρα προστάτη και ότι Skp2, Cdk2, και κυκλίνη Α συντονισμένη ρυθμίζουν την κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα PCa, υποθέσαμε ότι το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου του Skp2 (SKP2), Cdk2 (CDK2), και κυκλίνη Α (CCNA2) μπορεί να δείξει καλή θετική συσχέτιση σε όγκους PCa. Πράγματι, η ανάλυση των oncomine δεδομένα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της SKP2, CDK2, και CCNA2 συσχετίζεται θετικά και στις δύο GSE6919 [41] (Εικ. 6Α) και Singh σύνολα δεδομένων όγκου του προστάτη [42] (Εικ. 6Β). Καθώς η φωσφορυλίωση της Thr160 επί Cdk2 διαμεσολαβείται από Η cdk7 [28], προσδιορίσαμε αν γονιδιακή έκφραση των CDK7 συσχετίζεται με CDK2, SKP2, και CCNA2 σε όγκους PCa. Παραδόξως, η γονιδιακή έκφραση CDK7 συσχετίζεται αρνητικά με CDK2, SKP2, και CCNA2 στις δύο GSE6919 [41] σύνολα δεδομένων όγκου του προστάτη (Σχ. 7Α) και Singh [42] (Εικ. 7Β).

οικόπεδα διασποράς που δείχνουν συσχέτιση του υποδεικνύεται γονιδίων σε GSE6919 (Α) και Singh σύνολα δεδομένων προστάτη (Β). Η τιμή r υποδεικνύεται συντελεστή συσχέτισης. Probe ID για CCNA2, CDK2, και SKP2 ήταν 40697_at, 1792_g_at, και 1941_at στην GSE6919, και 1943_at, 1792_at, και 39449_at στην Singh σύνολο δεδομένων του προστάτη.

Η

οικόπεδα διασποράς που δείχνουν συσχέτιση αναφέρεται γονιδίων σε GSE6919 ( Α) και Singh σύνολα δεδομένων προστάτη (Β). Η τιμή r υποδεικνύεται συντελεστή συσχέτισης.