Αφηρημένο

Με στόχο να διευκρινιστεί η αιτιολογία της ραδιοαντοχή, διερευνήσαμε τις γενετικές αλλοιώσεις σε μη ακτινοανθεκτικά vs . ανθεκτικά οισοφάγου καρκινικά κύτταρα που αποκτήθηκαν από μακροχρόνια ακτινοθεραπείας. Βρήκαμε AKR1C3, ένα Aldo-κετο αναγωγάσης εκφράζεται σπάνια στους περισσότερους ανθρώπινους ιστούς, εξέφραζαν υψηλότερα σε κύτταρα ραδιοαντοχή-αποκτηθεί. Καταστολή της AKR1C3 μέσω RNAi ή χημικοί αναστολείς του αποκατέστησε την ευαισθησία των κυττάρων του όγκου που αποκτήθηκαν και ξενομοσχεύματος BALB /c γυμνά ποντίκια σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). Κυτταρική παρακολούθηση του οξειδωτικού στρες στα AKR1C3-αυξημένα κύτταρα έδειξαν ότι IR που προκαλείται από τη συσσώρευση των ROS και η συνακόλουθη βλάβη του DNA ήταν σημαντικά μετριαστεί, και όπως προστατευτικό αποτέλεσμα εξαφανίστηκε κατά AKR1C3 νοκ ντάουν. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν την πιθανή συμμετοχή της AKR1C3 στην απομάκρυνση των κυτταρικών ROS και να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, την απέκτησε ραδιοαντοχή από AKR1C3 υπερέκφραση. Μια αναδρομική ανάλυση του οισοφάγου καρκινώματα έδειξε επίσης μια σημαντική έκφραση της AKR1C3 σε ραδιο-ανθεκτικά, αλλά δεν χειρουργικά δείγματα ραδιο-ευαίσθητα. Η μελέτη μας μπορεί να παρέχει ένα πιθανό βιοδείκτη για την πρόβλεψη της πρόγνωσης της ακτινοθεραπείας και ακόμη και να κατευθύνει μια στοχευμένη θεραπεία για καρκίνο του οισοφάγου και άλλων όγκων

Παράθεση:. Xiong W, Zhao J, Yu H, Λι Χ, Sun S, Li Υ , et al. (2014) η αυξημένη έκφραση του AKR1C3 αυξάνει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην ιονίζουσα ακτινοβολία μέσω της διαμόρφωσης του οξειδωτικού στρες. PLoS ONE 9 (11): e111911. doi: 10.1371 /journal.pone.0111911

Επιμέλεια: Marianne Koritzinsky, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας, Καναδάς

Ελήφθη: 18 Ιούν 2014? Δεκτές: 2, Οκτωβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Σύμφωνα με PLoS One απαίτηση και τις κατευθυντήριες γραμμές MIAME, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας έχουν κατατεθεί στο NCBI γονιδιακής έκφρασης Omnibus ως GSE61620, GSE61772 και GSE61816

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Πρόγραμμα 2010CB12300 για DM Zhou), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (91029711, 20932001 και 20852001) και χρηματοδότηση από το Υπουργείο Παιδείας (20110001110054). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) είναι η πιο αποτελεσματική μη χειρουργική θεραπεία για τους περισσότερους όγκους [1]. Τέτοια θεραπευτική παρέμβαση συνήθως βασίζεται στην αλληλεπίδραση μεταξύ IR και ύδωρ μορίων σε κύτταρα που παράγουν υπερβολική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και ως εκ τούτου θέτει καρκινικών κυττάρων κάτω από εκτεταμένη οξειδωτικού στρες [2]. Τα εξαιρετικά ασταθές ROS αντιδρούν με το DNA και άλλων μακρομορίων στην περιοχή, που παράγουν γονιδιακό ελάττωμα, χρωμοσωμική ανωμαλία και άλλες ζημιές [3]. βλάβη μιτοχόνδρια με IR μπορεί ακόμη και να οδηγήσει σε παράταση του οξειδωτικού στρες και έτσι περαιτέρω βλάβες του DNA και άλλων κυτταρικών μορίων [4]. Η συσσώρευση της βλάβης του DNA είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ενεργοποίηση IR προκαλούμενη βλάβη της κυτταρικής διαίρεσης και του πολλαπλασιασμού που οδηγεί στην κυτταρική απόπτωση [5].

Παρά της θεραπευτικής σημασίας, αντίσταση IR αποτελεί μείζον εμπόδιο για τη θεραπεία του καρκίνου [ ,,,0],6]. Έχει αναφερθεί ότι η επιδιόρθωση του ΙΚ-επαγόμενης βλάβης του DNA, είτε θραύσεων διπλής έλικος ή ελαττώματα μόνο σκέλος, είναι ένας σημαντικός μηχανισμός υποκείμενου υποτροπής του καρκίνου και ραδιοαντοχή [7] – [11]. Η αφαίρεση του IR-δημιουργούνται ROS με αντιοξειδωτικά ένζυμα, αποτελεί εναλλακτικό μηχανισμό που οδηγεί σε ραδιοαντοχή. Η γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx), peroxiredoxin (ΤΡΧ) και υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η μεγαλύτερη τάξη των αντιοξειδωτικών ενζύμων, έχουν τέτοια ικανότητα να μειώνει IR επαγόμενη ROS συσσώρευση [12] – [14]. Ορισμένα καρκινικά κύτταρα και καρκινικά βλαστικά κύτταρα περιέχουν μια υψηλότερη έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων και έτσι κατά προτίμηση γλιτώσει από ακτινοβόληση [15], [16]. Ανακάλυψη άλλων κυτταρικών ενζύμων που εμπλέκονται στην αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες μπορεί να είναι χρήσιμη για τη διάγνωση της μη-ευαίσθητους ασθενείς στην ακτινοθεραπεία και ακόμη και να κατευθύνει μια αποτελεσματική στοχευμένη θεραπεία για κακοήθεις όγκους.

οισοφάγου καρκίνος είναι μια κοινή μορφή καρκίνου με ένα 5-ετή ποσοστό επιβίωσης 5-19% [17]. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις που υποδηλώνουν ότι ραδιοαντοχή του καρκίνου του οισοφάγου μπορεί να είναι συγγενής,

δηλ.

που σχετίζονται με το φύλο και την εθνικότητα, ή να προκαλείται από τον τρόπο ζωής, όπως το κάπνισμα [18]. Ως εκ τούτου, οισοφαγικό καρκίνωμα μπορεί να παρέχει ένα ιδανικό μοντέλο για την ταυτοποίηση των κυτταρικών παραγόντων με τους οποίους επάγεται ραδιοαντοχή. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η απόκτηση του ραδιοαντοχή συνέπεσε με αυξημένη έκφραση του AKR1C3 σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα, και η καταστολή της έκφρασης AKR1C3 αποκατέστησε την ευαισθησία των κυττάρων του όγκου που αποκτήθηκαν και ξενομοσχεύματος ζώα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR). Επιπλέον, κυτταρική παρακολούθηση του οξειδωτικού στρες στα AKR1C3-αυξημένα κύτταρα έδειξαν ότι ROS συσσώρευση και η συνακόλουθη βλάβη του DNA ήταν σημαντικά μετριαστεί, και όπως προστατευτικό αποτέλεσμα εξαφανίστηκε κατά AKR1C3 νοκ ντάουν. Μια αναδρομική ανάλυση έδειξε μία σημαντική έκφραση AKR1C3 σε ραδιο-ανθεκτικά, αλλά μη ανθεκτικά χειρουργική του οισοφάγου καρκινώματα. Τα ευρήματά μας μπορεί να παρέχει ένα νέο βιοδείκτη για την πρόβλεψη των μη ευαίσθητων ασθενών με ακτινοθεραπεία και ακόμη και να κατευθύνει μια στοχευμένη θεραπεία για καρκίνο του οισοφάγου και άλλων όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

πολιτισμό τηλέφωνα και ακτινοβολία

KY170 και TE13, δύο ανθρώπινα οισοφάγου καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων γραμμές, και τα παράγωγα ακτινοανθεκτικά κυτταρικές σειρές τους KY170R και TE13R δόθηκαν ως δώρο από το Τμήμα Ακτινολογίας, MD Anderson Cancer Κέντρο, USA. Αυτές οι κυτταρικές σειρές, που είχε αναφερθεί αρχικά από μια ιαπωνική ομάδα [19], είχαν επικυρωθεί και ελεγχθεί από τον παροχέα χρησιμοποιώντας επανάληψη προφίλ και καρυότυπου δοκιμές μικρής παράλληλα. Τα κύτταρα περάστηκαν για λιγότερο από 1 μήνα πριν τον πειραματισμό. Ένα κλάσμα του υπο-απόθεμα χρησιμοποιήθηκε για τις μελέτες που περιγράφονται εδώ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI υψηλής γλυκόζης 1640 (

Invitrogen

) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (

HyClone

) και 50 μονάδες /ml πενικιλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C και χωρίζεται κάθε 3-4 ημέρες. ακτινοβόληση του όγκου των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με γραμμική 6MV-Χ-ray επιταχυντή.

RNAi, AKR1C3-φίμωση σταθερή κύτταρα

AKR1C3 στόχευση shRNA και αγωνίζομαι-shRNA κασέτες κατασκευάστηκαν με PCR χρησιμοποιώντας μέχρι αρχικό τεμάχιο (hU6 προαγωγός): TGGATCCaaggtcgggcaggaagag, κάτω-αστάρι (αγωνίζομαι): AGGATCCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCGTCCTTT? down-εκκινητή (shRNA1): 5′-AGGATCCAAAAACCA GAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ‘, (shRNA2): 5′-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCG AGTAGTGGAGATTTCTGTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3′, (shRNA3): 5’-AG GATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ‘. Οι κασέτες ελήφθησαν κλωνοποιήθηκαν σε pSD31 για συστατική έκφραση του shRNA ακολουθώντας τη μέθοδο που προδιαγράφεται προηγουμένως [19]. Λεντοϊών παραγωγή φορέα διεξήχθη σύμφωνα με το τυπικό πρωτόκολλο της Invitrogen. Πειράματα για lentivector σταθερή μεταγωγή διεξήχθησαν ως ακολούθως: 1 × 10

6 κυττάρων ρεπλικονίου σε μια φιάλη Τ25 σπάρθηκαν και μετάγονται την ημέρα 2 με την παρουσία 8 mg /ml πολυβρενίου. Η επιλογή πραγματοποιήθηκε μετά από την ημέρα 3 με 800 ng /ml πουρομυκίνης μέχρι τα γονικά κύτταρα σε παράλληλα πειράματα εντελώς πεθάνει.

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας και όγκων ακτινοβολία

Μια μονοστοιβάδα κυττάρων σε εκθετική φάση του ανάπτυξη ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή 6 MV-X-ray σε κατάλληλες δόσεις (2, 4, 8 Gy) και τα ακτινοβολημένα κύτταρα απλώνονται να αναπτυχθούν σε πλακίδια έξι φρεατίων. Μετά από επώαση για 7-10 ημέρες, τα επιζώντα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και στη συνέχεια μετρήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές. ακτινοβόληση του όγκου διεξήχθη ως εξής: όταν η διάμετρος των όγκων ξενομοσχεύματος επιτυγχάνεται σε 6-8 mm, τα οπίσθια άκρα του ξενομοσχεύματος ποντίκια ακτινοβολήθηκαν με μία μοναδική δόση (15 Gy). Μετά την ακτινοβόληση η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για μέχρι και 36 ημέρες.

εκχύλιση RNA και Microarray

Το RNA εκχυλίστηκε από κάθε καλλιεργημένη κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας SV Total RNA Isolation Kit (

Promega

) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο RNA στη συνέχεια κατεργάστηκε με RNase-Free σετ DNase (

QIAGEN

) για την απομάκρυνση τυχόν μολυσματικό γονιδιωματικό DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Gene προφίλ, εις τριπλούν, πραγματοποιήθηκε από Illumina Shanghai Corporation χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες του φωτίσει Ανθρώπου-6 V3 και τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό Φωτιζόμενο Beadstudio Εφαρμογών (GSE61620, GSE61772 και GSE61816). Γονίδια με Illumina DifferScore της ≥20 θεωρήθηκαν ότι αντιπροσωπεύουν πάνω ρύθμιση, ενώ αυτοί με Illumina DifferScore των ≤-20 θεωρήθηκαν ρύθμιση προς τα κάτω. P & lt? 0,05 έδειξε μία σημαντική διαφορά

Real-time RT-PCR

Το απομονωμένο ολικό RNA ποσοτικοποιείται με ένα φασματοφωτόμετρο UV (

Eppendorf

) και, στη συνέχεια, 1,0 μg του. RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας First Strand cDNA Synthesis Kit (

ΤΟΥΟΒΟ, Ιαπωνία

) με τυχαία εναύσματα σε όγκο αντίδρασης 20 μΙ. Η αντίδραση PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Go Taq qPCR Master Mix (

Promega

) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή και το cDNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως ένα εκμαγείο για την ανίχνευση των διαφορετικών γονιδιακή έκφραση. Εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν από Primer 3.0 και μια αναζήτηση έκρηξη για να ελέγξετε την ειδικότητα τους. Εναρκτήρες για PCR ενίσχυση του AKR1C3 ήταν 5’ATTTGGCACCTATGCACCTC 3 ‘(ανάντη) και 5’TGAGTTTTCCAAGGCTGGTC 3’ (κατάντη) και β-δρώσες 5 ‘AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT 3’ (ανάντη) και 5’GGGCACGAAGGCTCATCATT 3 ‘(κατάντη). Τα σχετικά επίπεδα mRNA των διαφορετικών γονιδίων υπολογίστηκαν ως εξής: ΔCt (δείγμα) = CT (γονίδιο) – CT (GAPDH)? ΔΔCT = ΔCt (μετά την ακτινοβόληση χρονικό σημείο) – ΔΟΙ (0 h)? Σχετική έκφραση = 2

-ΔΔCT. Κάθε RT-PCR επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Western

δοκιμασία κηλίδος

καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, στη συνέχεια λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (1% SDS, 50 mM Tris, ρΗ 7,4, 0,15 Μ NaCl, 1 mM NaF, 10 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM EDTA) για 5 λεπτά και διέρχεται μέσω μιας βελόνας 27-gauge. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000

g

για 1 λεπτό και οι συγκεντρώσεις πρωτείνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad DC. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 4~20% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα ή 3% αλβουμίνη βόειου ορού σε TBST (10 mM Tris, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) για 1 ώρα. Πρωτογενής και δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αυτό ακολουθήθηκε από ανίχνευση με ένα ενισχυμένο τεχνική χημειοφωταύγειας (

Amersham Biosciences

). Western ποσοτικοποιήσεις πραγματοποιήθηκαν ως εξής: στυπώματα Western σαρώθηκαν με ένα πυκνόμετρο για να ληφθεί η πυκνότητα κάθε ζώνης. Στη συνέχεια, ο λόγος της πυκνότητας μιας ζώνης ενδιαφέροντος με εκείνη της ζώνης εσωτερικού ελέγχου (GAPDH) ήταν σε σχέση με την αναλογία από τα πειράματα αρνητικού ελέγχου. Κάθε κηλίδωση Western επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές

Η υπερέκφραση του AKR1C3

AKR1C3 cDNA Ανθρώπου αγοράστηκε (

ΟηΟεηε

, Cat Νο:. SC321532)., Κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 και στη συνέχεια επιμολύνονται σε KY170 κύτταρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται.

η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες

κύτταρα μονιμοποιημένα με αιθανόλη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RNase Α (0.1 mg /ml) για 30 λεπτά που ακολουθείται από επώαση με PI (35 μg /ml). περιεχόμενο DNA των κυττάρων ΡΙ-χρώση αναλύθηκε με FACScan (Becton Dickinson) και το ποσοστό των κυττάρων με G1, S, G2 και περιεχόμενο DNA /Μ υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ. Μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής dihydroethidium (DHE) -fluorescence χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της κυτταρικής επίπεδα ROS. Καλλιέργειες μονοστιβάδας επωάστηκαν σε 10 μΜ DHE για 45 λεπτά και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. DHE-φθορισμός αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (μήκος κύματος διέγερσης 488 nm, εκπομπή 585 nm). Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) υπολογίστηκε μετά από διόρθωση για αυτοφθορισμό και την πολλαπλή μεταβολή υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα να αγωνίζομαι-KY170R. Κάθε κυτταρομετρία ροής δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές.

Τα πειράματα σε ζώα

Άντρας BALB /c γυμνά ποντίκια (SPF, αγοράστηκε από Vital River Laboratories, Πεκίνο, Κίνα), ηλικίας 4-6 εβδομάδων, στεγάστηκαν με ένα αντίστροφο 12 ώρας κύκλο ημέρας-νύχτας με φώτα αναμμένα στις 8:30 μ.μ. σε θερμοκρασία (22 ± 1 ° C) και υγρασίας (55 ± 5%) που ελέγχεται δωματίου. Όλα τα ποντίκια δόθηκε νερό και τροφή για

κατά βούληση

ανά πάσα στιγμή. Ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών δημιουργήθηκαν ως ακολούθως: KY170R-shRNA1 και τα κύτταρα KY170R-σκαρφάλωμα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο σε 70% έως 80% της πυκνότητας. Μετά θρυψίνη, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, και απαριθμήθηκαν. Το αρσενικό, 4 εβδομάδων έως 6-εβδομάδων γυμνά ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες και ενέθηκαν στο άνω τμήμα ενός οπίσθιου άκρου με μια πυκνότητα 2 * 10

6/100 μΐ KY170R-shRNA1 και κύτταρα KY170R-αγωνίζομαι, αντίστοιχα. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά και όταν η διάμετρος του όγκου έφθασε 6 έως 8 mm, τα ζώα «ομάδα ακτινοβολία» ακτινοβολήθηκαν μία φορά με μία δόση 15 Gy. Η οπισθοδρόμηση σε ορθότροπων ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για μέχρι 36 ημέρες, ο όγκος του όγκου υπολογίζεται ως τύπο V = π /6 (α * β

2), όπου α είναι η μεγαλύτερη και b είναι η μικρότερη κάθετη άξονα όγκου. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε έως ότου οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο περίπου 1.0 εκατοστό

3. Στη συνέχεια, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση για τα επόμενα πειράματα.

Ανοσοϊστοχημεία τομών ιστού

ανοσοϊστοχημεία των διατομών των ανθρωπίνων καρκίνο του οισοφάγου ιστό, αποκτήθηκε από το τμήμα παθολογίας του Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο, και ξενομοσχεύματος όγκων πραγματοποιείται ως εξής: 4-6 μm τομές ιστού στερεώθηκαν και θερμάνθηκαν στους 72 ° C για 30 λεπτά. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη EtOH και ξεπλένονται με 0,1 Μ Tris-HCl (ρΗ 7.6). Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε δι ‘επωάσεως των τομών ιστού με 3% Η

2O

2 για 30 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με Μ νάτριο ρυθμιστικό 0.01 κιτρικού οξέος (ρΗ 6,0) στους 95 ° C για 1 ώρα. Μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με επώαση των τομών ιστού με 0.1 Μ Tris-HCl που περιέχει 10% ορό κατσίκας επί 2 ώρες. AKR1C3 στη συνέχεια προσδιορίστηκε με επώαση των τομών με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού AKR1C3 σε αραίωση 1:200 στο παραπάνω διάλυμα μπλοκαρίσματος σε υγρό θάλαμο στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύσεις με 0.1 Μ Tris-HCl, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1:400 αραίωση του δευτερεύοντος αντισώματος βιοτινυλιωμένο αλόγου αντι-ποντικού και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Μετά από περαιτέρω έκπλυση με 0,1 Μ Tris-HCl, σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με επώαση των τομών ιστού με συζευγμένο με HRP στρεπταβιδίνη σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. DAB-H

2O

2 υπόστρωμα προστέθηκε στη συνέχεια στις διαφάνειες που επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για επιπλέον 4 λεπτά. τομές ιστού βάφτηκαν με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη αλκοόλη, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο, και τοποθετείται με Permount Τοποθέτηση μέσων για την οπτικοποίηση του φωτός μικροσκόπιο.

Η στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήθηκε Η Student t-test για να προσδιοριστεί η στατιστική διαφορά μεταξύ των μέσων των δύο ομάδων και των δεδομένων. Ρ τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη των ζώων πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Και γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς και τις οικογένειές τους για την έρευνα με τη χρήση αυτών των δειγμάτων ιστού. Όλες οι κυττάρων, τα πειράματα σε ζώα και ανοσοϊστοχημεία της μελέτης τμημάτων ιστού έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Institutional Review (Πιστοποιητικού Αρ IRB00001052-12037).

Αποτελέσματα

Τα διαφοροποιημένα εκφράσεις AKR1C3 σε καρκινικά κύτταρα

Για να διευκρινιστεί η αιτιολογία της ραδιοαντοχή, δύο ακτινοανθεκτικά οισοφάγου κλώνους όγκου, KY170R και TE13R, έχουν καθιερωθεί από τη συνεχή κλασματοποιημένη ακτινοβόληση των γονικών κυττάρων τους, KY170 και TE13 [20]. Γονιδίωμα-ευρύ προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε KY170R

ν.

KY170 και TE13R

ν

TE13 χρησιμοποιώντας φωτίσει Ανθρώπου-6 V3 μικροσυστοιχιών. Έδειξαν ότι πάνω από 900 γονίδια βρέθηκαν να διαφοροποιούνται σημαντικά (Εικ. 1Α), σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση [21]. Μεταξύ αυτών, AKR1C3, ένα Aldo-κετο αναγωγάσης υπάρχουσες σε χαμηλό επίπεδο στις περισσότερες ανθρώπινους ιστούς, την προσοχή μας λόγω της σημαντικής έκφρασης του σε δύο ραδιοανθεκτικά κύτταρα. Πραγματικού χρόνου RT-PCR (Εικ. 1Β) και κηλίδωση Western (Εικ. 1 C) αναλύσεις επιβεβαίωσαν την αυξημένη έκφραση του AKR1C3 σε KY170R και TE13R κύτταρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα τους: ~ 10-φορές σε επίπεδο mRNA και πολύ υψηλότερο σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Αυτό το προφίλ αποκάλυψε την σύμπτωση της αυξημένης έκφρασης του AKR1C3 και ραδιοαντοχή στο οισοφάγου KY170R και τα καρκινικά κύτταρα TE13R. δοκιμασίες Colony-σχηματισμός επαλήθευσε ότι KY170R και TE13R ήταν πράγματι πιο ανθεκτικά στην IR από τη γονική KY170 και TE13 κύτταρά τους, με την εκτιμώμενη δόση για μείωση της επιβίωσης κατά 90% για KY170 vs. KY170R ως 5,5 Gy έναντι 7,8 Gy (Σχ. 1C ).

(Α) Γονιδίωμα-ευρύ προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε ακτινοανθεκτικά KY170R και TE13R

έναντι

ακτινοευαίσθητα KY170 και TE13, αντίστοιχα, σε 0, 8 ώρες και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. (Β) Επικύρωση της αυξημένης έκφρασης του AKR1C3 στο επίπεδο mRNA σε KY170R εναντίον KY170 και TE13R εναντίον κυττάρων TE13 πριν και 8 και 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, όπως προσδιορίζεται με RT-PCR. (Γ) Επικύρωση αυξημένη έκφραση του AKR1C3 σε ραδιοανθεκτικά KY170R προσδιορίζεται με κηλίδα Western και την ευαισθησία των κυττάρων KY170 και KY170R σε ακτινοβολία όπως προσδιορίζεται με μία δοκιμασία αποικίας σχηματισμού.

Η

Η επίδραση της AKR1C3 για την ανταπόκριση των καρκινικών κυττάρων από την ακτινοβολία

με δεδομένη τη σημαντική διαφορά στην έκφραση των AKR1C3 μεταξύ ανθεκτικά και μη ανθεκτικά καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα, ρωτήσαμε αν θα μπορούσε να είναι μια πρωταρχική αιτία ή απλώς ένας μεταγενέστερος συνέπεια της ραδιοαντοχή. Να εξετάσει το θέμα αυτό, τα επίπεδα έκφρασης των AKR1C3 σε KY170R και TE13R ήταν κάτω-ρυθμίζονται από Τα siRNAs παραδίδονται από lentivector pSD31 και τις επιπτώσεις της AKR1C3 νοκ ντάουν για ραδιοαντοχή χαρακτηρίστηκαν. Για να αποκλειστούν τα ζητήματα εκτός στόχου, τρία Τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα να διευκρινιστεί η επίδραση της RNAi σε κύτταρα KY170R με σκαρφάλωμα shRNA ως αρνητικός έλεγχος. Ανάλυση Western blotting κατέδειξε ότι και οι τρεις Τα siRNAs που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη που ασκείται ισχυρή δραστικότητα σε μεταγωγή κύτταρα KY170R με & gt? 80% AKR1C3 να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με το σκαρφάλωμα-shRNA (Σχήμα 2Α).. Χαρακτηρισμός της AKR1C3 νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων έδειξαν ότι KY170R-shRNA1, KY170R-shRNA2 και KY170R-shRNA3 (τρεις σταθερές κυτταρικές σειρές που παράγονται από pSD31 μεσολάβηση μεταγωγή) πολλαπλασιάστηκαν σχεδόν με τον ίδιο ρυθμό όπως κυττάρων KY170R-αγωνίζομαι, το οποίο η ίδια είχε ένα ποσοστό σχεδόν όμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε KY170R και KY170 κύτταρα (Εικ. S1 Α στο αρχείο S1). Αυτό υποδηλώνει ότι AKR1C3 δεν είναι ένα απαιτούμενο γονίδιο για τον πολλαπλασιασμό αυτών των καρκινικών κυττάρων. Αντιθέτως, η ακτινοβόληση αποκαλύπτεται το βιολογικό αποτέλεσμα του AKR1C3 για την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης. δοκιμασίες Colony-σχηματισμός έδειξαν ότι τα μεταχθέντα KY170R-shRNA1, -shRNA2 ή -shRNA3 κύτταρα έγινε ουσιαστικά πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία με λιγότερους κλώνους που σχηματίζονται από τα κύτταρα KY170R-σκαρφάλωμα (Σχ. 2Β-C και το Σχ. S1B σε S1 File), η οποία είχε υπολογίζεται δόση 6,5 Gy για μείωση της επιβίωσης κατά 90%, πολύ υψηλότερο από ό, τι τα κύτταρα KY170R-shRNA1 (~ 4,5 Gy).

(Α) Αντιπροσωπευτική παρατηρήσεις σταθερών knockdown του AKR1C3 σε κύτταρα KY170R από τρεις ανεξάρτητους Τα siRNAs και υπερέκφραση του AKR1C3 σε KY170 κύτταρα. (Β) Τα αποτελέσματα της AKR1C3 νοκ ντάουν στα κύτταρα KY170R και AKR1C3 υπερέκφραση σε KY170 σχετικά με το αποτέλεσμα της ακτινοβολίας, σε δόση 0-8 Gy, προσδιορίζεται με δοκιμασία αποικίας-σχηματισμό. Ένα σκαρφάλωμα shRNA (SCR.) Και το άδειο φορέα pcDNA3.1 λειτούργησε ως αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. (Γ) Οι καμπύλες επιβίωσης για τις συγκρίσεις της επίδρασης του AKR1C3 στην ευαισθησία των κυττάρων KY170R (knockdown) και (Δ) KY170 κύτταρα (υπερέκφραση) σε ακτινοβολία, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες αποικίας σχηματισμού.

Η

επιβεβαίωση της επίδρασης AKR1C3 για την ανταπόκριση των καρκινικών κυττάρων από την ακτινοβολία

για να επιβεβαιώσετε την προστατευτική δράση των AKR1C3 αποκαλύπτονται από RNAi, η ακτινοανθεκτικά KY170R και γονικών κυττάρων KY170 της καλλιεργήθηκαν με την παρουσία 200 μΜ ιασμονικού μεθυλίου (MJ) και στη συνέχεια ακτινοβολούνται. MJ είναι μια καθιερωμένη μικρό μόριο με δομή που μοιάζει σε προσταγλανδίνες, το υπόστρωμα του Aldo-κετο αναγωγάσες, και έτσι δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας του AKR1C3. MeJ εμφανίζει μεγάλη δραστικότητα στο κυτταρικό σύστημα λόγω της αυξημένης κυτταρικής πρόσληψης με IC

του 50 για AKR1C3 σε -150 μΜ [22]. Διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία με MeJ ενισχύεται επίσης σημαντικά την απόκριση των κυττάρων KY170R σε ακτινοβολία και τέτοια MJ μεσολάβηση ενίσχυση δεν παρατηρήθηκε σε KY170 κύτταρα (Σχ. S1c σε File S1). Φάνηκε ότι η καταστολή της δραστηριότητας AKR1C3 μέσω χημικής αναστολέας της θα μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιήσει κύτταρα KY170R στο IR. Επιπλέον, εξετάσαμε το εάν η αυξημένη έκφραση του AKR1C3 μόνος θα μπορούσε να προκαλέσει KY170 κύτταρα να είναι ανθεκτικά σε ακτινοβολία. Ένα κατασκεύασμα έκφρασης AKR1C3, pcDNA3.1-AKR1C3, εισήχθη σε γονικά κύτταρα KY170 να παράγουν AKR1C3 υπερεκφράζουν μορφομετατροπείς (Εικ. 2Α). Διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του AKR1C3 σε KY170 κύτταρα, περίπου 5-πλάσια αύξηση, αφέθηκε περισσότερες αποικίες για να επιβιώσουν από ότι στην περίπτωση των κυττάρων pcDNA3.1-επιμολύνθηκαν με την ίδια δόση της ακτινοβολίας (Σχ. 2Β και 2D). Σαφώς, είναι η αυξημένη έκφραση του AKR1C3 που καθιστά τα κύτταρα τόσο KY170R και TE13R ουσιαστικά ανθεκτικά στην ακτινοβολία.

Η επίδραση της AKR1C3 στην ανάπτυξη των ακτινοβολημένων όγκων ξενομοσχεύματος

Στη συνέχεια, διερευνάται κατά πόσον AKR1C3- κυτταρικές ραδιοαντοχή ήταν επίσης λειτουργική στην ξενομοσχεύματος όγκους. Δύο μοντέλα ξενομοσχεύματος ιδρύθηκαν από υποδόρια εμφύτευση KY170R-shRNA1 και τα κύτταρα KY170R-αγωνίζομαι, χωριστά, σε άτριχα ποντίκια. Βρήκαμε ότι και οι δύο ξενομεταμοσχευθέντα όγκοι αναπτύχθηκαν γρήγορα με την πρώην αυξάνεται ελαφρώς πιο αργή από ό, τι το τελευταίο (Εικ. 3Α και Β), που υποστηρίζουν το κύτταρο-based παρατήρηση ότι AKR1C3 έχει πολύ μικρότερη επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Όταν οι όγκοι είχαν φθάσει σε μέσο όγκο περίπου 100 mm

3 (Εικ. 3Α), επιλέχθηκαν 20 ξενομοσχεύματος ποντίκια από κάθε τύπο, οι μισοί από αυτούς υποβλήθηκαν σε τοπική ακτινοβολία σε μία μόνο δόση 15 Gy και μισό παρέμεινε χωρίς θεραπεία . Βρήκαμε όλα ξενομοσχευθέντων όγκους στο 10 ακτινοβολημένα KY170R-shRNA1 ποντίκια ήταν ευαίσθητα στη θεραπεία IR με 8 ποντίκια γίνονται σχεδόν χωρίς όγκο 5 εβδομάδες μετά την ακτινοβολία (Εικ. 3Α-Β και Εικ. S2 σε S1 αρχείου). Χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) αποκάλυψε την απουσία του νεοπλάσματος, αλλά μόνο ένα μικρό συρρικνωμένο υπολειμμάτων στα ακτινοβολημένα xenotransplants (Εικ. 3Α). Αντιθέτως, τα μη ακτινοβολημένα όγκοι ξενομοσχεύματος σε KY170R-shRNA1 και ποντικούς KY170R-σκαρφάλωμα αυξήθηκε σε ένα μέσο όρο όγκου 1000 mm

3 με πλήρη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (Σχ. 3Α-Β και Εικ. S2 σε S1 File). Στην περίπτωση των ποντικών με xenotransplants KY170R-αγωνίζομαι, ακτινοβολία οδήγησε σε μια φτωχή έκβαση: την ανάπτυξη του όγκου ήταν αρχικά καταστέλλεται κατά την ακτινοβολία, αλλά συνεχίζεται μέσα σε δύο εβδομάδες (Σχήμα 3Β.)? εκτεταμένη νεόπλασμα και ισχυρή έκφραση AKR1C3 ανιχνεύθηκε στους ιστούς όγκου (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν την επίδραση της AKR1C3 ανύψωση στην προστασία ξενομοσχεύματος όγκους από ακτινοβολία, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση προέρχονται από τα πειράματα που βασίζονται σε κύτταρα.

(Α) Αντιπροσωπευτική παρατηρήσεις της αύξησης του ξενομοσχεύματος KY170R-σκαρφάλωμα και όγκων KY170R-shRNA1 , και οι αποκρίσεις αυτών των όγκων σε μια μονή δόση (15 Gy) της ακτινοβολίας όσον αφορά τον όγκο του όγκου, ΗΕ χρώση και ανοσοχημική χρώση των AKR1C3. (Β) Η χρονική πορεία της ανάπτυξης της KY170R-αγωνίζομαι και όγκους ξενομοσχεύματος KY170R-shRNA1 με ή χωρίς τοπική θεραπεία IR.

Η

Μηχανιστικές διαλεύκανση της AKR1C3 μεσολάβηση ραδιοαντοχή

Για να διερευνήσουν ο μηχανισμός με τον οποίο AKR1C3 ασκεί την επίδρασή του για τα αποτελέσματα της ΚΕ, συγκρίναμε τα επίπεδα της κυτταρικής ROS και βλάβη του DNA, τα κρίσιμα μεσολαβητές και την άμεση συνέπεια της IR-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο [23], στην KY170R-shRNA1 έναντι KY170R-αγωνίζομαι κύτταρα. Διαπιστώθηκε ότι πριν από την ακτινοβολία περίπου 2-φορές λιγότερο ROS ήταν KY170R-σκαρφάλωμα παρά σε κύτταρα KY170R-shRNA1 (Σχ. 4Α-Β). Μετά την ακτινοβόληση, το επίπεδο των ROS παρέμεινε χαμηλό στα κύτταρα KY170R-αγωνίζομαι, αλλά εντυπωσιακά αυξημένη στα κύτταρα KY170R-shRNA1 με τη διαφορά σχεδόν 3 πτυχώσεις (Εικ. 4Β). Συμπίπτει με ταυτόχρονη knockdown AKR1C3 και αύξηση ROS σε ακτινοβολημένα κύτταρα KY170R-shRNA, ο αριθμός των εστιών της φωσφο-γ-ιστόνης (Σχ. 4C-D), ένας βιοδείκτης της βλάβης του DNA [24], που συνοδεύεται από πολλές περισσότερες χρωμοσωμικές διαλείμματα και το ακαθάριστο πυρηνική ανωμαλίες (Σχ. S3A-Β S1 File), ήταν πολύ υψηλότερη από ό, τι σε ακτινοβολημένα KY170R-αγωνίζομαι κύτταρα 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Ένα παράλληλο πείραμα διεξάγεται παρουσία Ν-ακετυλο κυστεΐνη (NAC), ένα χημικό καθαριστή του ROS [25], έδειξαν ότι η ΙΚ-προκαλούμενη βλάβη του DNA σε κύτταρα KY170R-shRNA1 και τα παράγωγα μορφολογικά χαρακτηριστικά αποτράπηκαν (Εικ. 4Ε) . Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι AKR1C3 έχει την ίδια ικανότητα, όπως NAC να ανακουφίσει το οξειδωτικό στρες και έτσι μειώνει την ακτινοβολία που προκαλείται από βλάβες του DNA, η οποία παρέχει ραδιοαντοχή.

(Α) Εκπρόσωπος μικροσκοπική άποψη της συσσώρευσης των ROS σε KY170R-αγωνίζομαι

v.

κύτταρα KY170R-shRNA1 βάφονται με DHE. (Β) τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων ROS σε KY170R-σκαρφάλωμα

ν.

KY170R-shRNA1 κύτταρα πριν και 24 ώρες μετά την IR σε μια δόση των 4 Gy. (C) Εκπρόσωπος μικροσκοπική άποψη της φωσφο-γ-ιστόνης εστίες σε KY170R-αγωνίζομαι

ν.

Κύτταρα KY170R-shRNA1. (D) Χαρακτηρισμοί φωσφο-γ-ιστόνης σε κύτταρα δοκιμάστηκε με κηλίδωση Western. (Ε) Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) μεσολάβηση παγίδευσης ROS σε δόση IR 4 Gy. Κάθε ποσοτική μέτρηση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές με ένα μπαρ σφάλμα λιγότερο από 25%.

Η

αναδρομικές μελέτες ραδιοαντοχή και της έκφρασης AKR1C3 στο οισοφαγικό καρκίνωμα

Εμείς πραγματοποιηθεί αναδρομική μελέτες για την αξιολόγηση της πιθανής συνάφειας της AKR1C3 σχετίζονται ραδιοαντοχή στο οισοφαγικό καρκίνωμα. Οισοφάγου δείγματα όγκων, ένα μικρό κομμάτι των δειγμάτων όγκου που λαμβάνονται για την παθολογική διάγνωση, συλλέχθηκαν από 28 ασθενείς οι οποίοι δεν ήταν σε θέση ή δεν επιθυμεί να αποδεχθεί τη χειρουργική επέμβαση (Πίνακας S1 στο αρχείο S1). Αυτά τα δείγματα όγκου υποβλήθηκαν σε διαλογή μέσω ανοσοϊστοχημείας για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης AKR1C3. Όλοι οι ασθενείς γίνονται δεκτές οισοφάγου θεραπεία σύμμορφη ακτινοβολία περιοχή κρεβάτι με τη δόση ακτινοβολίας σε 58-64 Gy. Τα θεραπευτικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με την εξέταση του στήθους CT μία μήνες μετά την ακτινοθεραπεία. Από τους ασθενείς αυτούς, 20 ήταν εκ γενετής ανθεκτικά με όγκους όγκου συρρικνώθηκε λιγότερο από το 50% με την IR? 8 ήταν ευαίσθητα στην ακτινοβολία και έγινε σχεδόν άνευ όγκου μετά από αγωγή με IR. Αναλύσεις

χρώση Ανοσοϊστοχημική έδειξε ότι το 7 (35%) των δειγμάτων ακτινοανθεκτικά όγκου εμφανίζονται υψηλά επίπεδα (+++,

δηλαδή

& gt ? 75 κύτταρα% του όγκου είναι AKR1C3 θετικά), και 8 (40%) εμφανίζονται ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης AKR1C3 (++,

δηλαδή

75% -50% καρκινικά κύτταρα περιέχει AKR1C3 πρωτεΐνη) (Σχήμα 5Α-Β. και το Σχ. S4 στο S1 File). Το υπόλοιπο 5 (25%) είχαν χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης AKR1C3 (+/-,

δηλ.

0-50% καρκινικών κυττάρων ήταν AKR1C3 θετικά). Αντιθέτως, κανένα από τα δείγματα 8 ακτινοευαίσθητα όγκου βρέθηκαν να εκφράζουν ένα υψηλό επίπεδο (+++) του AKR1C3. Μόνο το 3 (37%) των ακτινοευαίσθητα δείγματα όγκων είχαν ενδιάμεσα επίπεδα AKR1C3 αλλά 5 (63%) παρουσίασαν χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα (+/-) της έκφρασης AKR1C3 (Σχ. 5Α-Β και Εικ. S4 στο S1 File) . Σαφώς, ένας ισχυρός συσχετισμός (ρ & lt? 0.017) υπάρχει ανάμεσα αυξημένη έκφραση του AKR1C3 και ραδιοαντοχή του οισοφαγικού καρκινώματος, πράγμα που σημαίνει ότι θα μπορούσε να είναι AKR1C3 ένας προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του ραδιοθεραπεία

(Α) Υποκειμενική επίπεδα έκφρασης του AKR1C3. , δηλαδή, υψηλή (+++), το ενδιάμεσο (++), χαμηλή ή καμία (+/-), σε οισοφάγου καρκινώματα. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του AKR1C3 στο καρκίνωμα του οισοφάγου από 28 ασθενείς που ήταν εκ γενετής ευαίσθητα ή ανθεκτικά σε IR.

Η

Συζήτηση

ROS είναι οι βασικοί μεσολαβητές του κυτταρικού οξειδωτικού στρες το οποίο καθορίζει το κυτταρικό περιβάλλον οξειδοαναγωγής [26]. Υπερβολικά επίπεδα των ROS είναι κρίσιμες σε IR-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Ακτινοβολημένα κύτταρα, ιδίως εκείνων με διαλείπουσα έκθεση, που θα δημιουργούν υπερβολική ROS, θα υπάρχουν σε μια κατάσταση οξειδωτικού πολιορκίας στην οποία η επιβίωση απαιτεί τα κύτταρα να ενδυναμώσει την άμυνα των συστημάτων τους για να ξεφύγουν από την οξειδωτική βλάβη. Έχει αποδειχθεί ότι η υπεροξειδική δισμουτάση αποτελεί την πρώτη γραμμή της αντιοξειδωτικής άμυνας συστημάτων – καταλύει την διάσπαση του υπεροξειδίου σε υπεροξείδια του υδρογόνου, οι οποίες στη συνέχεια απομακρύνονται με καταλάσης [23]. Αυξημένα εκφράσεις της δισμουτάσης του υπεροξειδίου 1 (SOD1) έχουν αναφερθεί σε ανθρώπινα γλοιώματα και ως εκ τούτου παρέχει ραδιοαντοχή [15], [16]. Γλουταθειόνης υπεροξειδάσης και η μεθειονίνη αναγωγάσης είναι επίσης αντιοξειδωτικά ένζυμα που μεταβολίζουν ROS [23].

Στην παρούσα μελέτη, ανέφερε η σύμπτωση της διαφοροποίησης της έκφρασης AKR1C3, επίπεδο κυτταρικής ROS και τις βλάβες του DNA στο ακτινοανθεκτικά KY170R έναντι μη ανθεκτικά κύτταρα KY170. Προτείνουμε ότι AKR1C3 είναι ένα κυτταρικό συστατικό που συμμετέχουν στη διαδικασία της σάρωσης της κυτταρικής ROS, που μοιράζονται τις ίδιες ιδιότητες όπως αντιοξειδωτικά ένζυμα, τουλάχιστον σε

in vivo

να διαφύγουν οξειδωτική βλάβη (Σχ. 6). Απομάκρυνση των ROS, είτε με αντιοξειδωτικά ένζυμα, AKR1C3 ή άλλων αγνώστων κυτταρικών παραγόντων, θα μπορούσε να είναι ένα κοινό λογαριασμό μηχανισμό για ραδιοαντοχή. Σε αντίθεση με υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) η peroxiredoxin (ΤΡΧ) και υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) τα οποία βρίσκονται σε ουσιαστικά όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, AKR1C3 εκφράζεται σε σχετικά χαμηλό επίπεδο στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς, εκτός από τον προστάτη και του μαστικού αδένα [27], [28 ]. Έτσι, το επίπεδο έκφρασης της AKR1C3 σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως βιοδείκτη για την πρόβλεψη των κυτταρικών ραδιοαντοχή.

Η

AKR1C3 έχει λάβει εκτεταμένη προσοχή λόγω της ισχυρής αναγωγική δράση της προς μια ποικιλία υποστρωμάτων. Είναι καταλύει την NADPH-εξαρτώμενη μείωση της ενδογενούς αλδεϋδών και κετονών προς τις αντίστοιχες αλκοόλες [28], [29]. Είναι επίσης καταλύει την μετατροπή της προσταγλανδίνης D

2 (PGD2) προς 11β-PGF2, PGH2 να PGF2a και κινόνης για κατεχόλη [30].