Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης χημειοθεραπεία με βάση την σε μη-μικρού κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα είναι περιορισμένη από την επίκτητη αντοχή φαρμάκου. Ταυτοποίηση των RNAs που σχετίζονται με την αντίσταση σισπλατίνη μπορεί να βοηθήσει να βελτιώσει τα ποσοστά κλινικής ανταπόκρισης.

Μέθοδοι

προφίλ έκφρασης μικροσυστοιχιών του mRNA, lncRNA και miRNA διεξήχθη σε κύτταρα Α549 και σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα Α549 /CDDP . Διαφορικά εκφρασμένων mRNAs, lncRNAs και miRNAs, επαληθεύεται από πραγματικό χρόνο RT-PCR, υποβλήθηκαν σε μονοπάτι ανάλυση. Έκφραση των NKD2 και β-κατενίνης εκτιμήθηκε με πραγματικό χρόνο RT-PCR και ανάλυση κηλίδας western. Η επίδραση της lncRNA AK126698 στην σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται ερευνήθηκε από αννεξίνης-V /PI κυτταρομετρία ροής.

Αποτελέσματα

Συνολικά, 1471 mRNA, 1380 lncRNAs και 25 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε Α549 /CDDP και τα κύτταρα Α549. Μεταξύ αυτών, 8 mRNA, 8 lncRNAs και 5 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε ανάλυση γονιδίων τσιπ επικυρώθηκαν. Ανάλυση μονοπατιού High-εμπλουτισμού προσδιορίζεται ότι μερικές κλασικές οδούς συμμετείχαν σε πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, η αποφυγή της απόπτωσης, και ο μεταβολισμός του φαρμάκου ήταν διαφορετικά εκφράζονται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. δίκτυο γονίδιο συν-έκφραση εντοπίστηκαν πολλά γονίδια όπως FN1, CTSB, EGFR, και NKD2? lncRNAs συμπεριλαμβανομένων BX648420, ENST00000366408 και AK126698? και miRNAs όπως miR-26a και αφήστε-7i πιθανώς έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην αντίσταση σισπλατίνη. Μεταξύ των οποίων, η κανονική οδός Wnt ερευνήθηκε επειδή αποδείχθηκε να απευθύνονται τόσο από lncRNAs και miRNAs συμπεριλαμβανομένων lncRNA AK126698. Νοκ ντάουν lncRNA AK126698 μειώθηκε όχι μόνο σημαντικά NKD2 οποίο μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά Wnt /σηματοδότησης β-κατενίνης αλλά και αύξησε τη συσσώρευση και την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης και σημαντικά κατάθλιψη ποσοστό απόπτωση που προκαλείται από τη σισπλατίνη σε κύτταρα Α549.

Συμπέρασμα

αντίσταση Σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα μη μικροκυτταρικού του πνεύμονα μπορεί να σχετίζεται με τις αλλαγές στη μη κωδικοποιητική RNAs. Μεταξύ αυτών, AK126698 φαίνεται να προσδίδουν ανθεκτικότητα σισπλατίνη με τη στόχευση του μονοπατιού Wnt

Παράθεση:. Yang Υ, Li H, Χου S, Hu Β, Liu J, Wang J (2013) μη κωδικευμένη Έκφραση RNA προφίλ και η επίδραση της lncRNA AK126698 για Cisplatin Αντίσταση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (5): e65309. doi: 10.1371 /journal.pone.0065309

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 7 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 29 Απρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81071910, 81070042). πειράματα μικροσυστοιχιών LncRNA πραγματοποιήθηκαν από KangChen Bio-tech, Σαγκάη της Κίνας. πειράματα μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκαν από Genminix Πληροφορικής ΕΠΕ, Σαγκάη, Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. πειράματα μικροσυστοιχιών LncRNA πραγματοποιήθηκαν από KangChen Bio-tech, Σαγκάη της Κίνας. πειράματα μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκαν από Genminix Πληροφορικής ΕΠΕ, Σαγκάη, Κίνα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές ανθρώπινους καρκίνους παγκοσμίως και συνεχίζει να συνδέεται με τα υψηλότερα ποσοστά επίπτωσης και θνησιμότητας όλων των καρκίνων [1], [2]. Σύμφωνα με το σχέδιο του ΠΟΥ GLOBOCAN, 1,6 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου του πνεύμονα, αντιπροσωπεύοντας το 12,7% της συνολικής εμφάνισης του καρκίνου του κόσμου, διαγνώστηκαν το 2008 [3]. καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα [4]. Η πιο αποτελεσματική θεραπεία για NSCLC είναι πλήρης εκτομή του πνεύμονα. Ωστόσο, το ποσοστό επιβίωσης μετά την πλήρη εκτομή του πνεύμονα δεν είναι καθόλου ικανοποιητική και οι περισσότεροι ασθενείς σε χημειοθεραπεία ως εναλλακτική λύση, ιδίως σισπλατίνη (CDDP? Cis-διαμμινοδιχλωρολευκόχρυσος II) -με βάση τη χημειοθεραπεία

Η σισπλατίνη κυρίως πράξεις προκαλώντας DNA. ζημιές [5]. Ωστόσο, η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να γίνει ανθεκτικός σε CDDP παραμένει ένα σημαντικό εμπόδιο στην επιτυχή χημειοθεραπεία. Προηγούμενες μελέτες έχουν προτείνει μια σειρά πιθανών μηχανισμών αντίστασης σισπλατίνη [6]. Όμως, υπάρχει μια συνεχής ανάγκη να εντοπίσουν τους ακριβείς μηχανισμούς που εμπλέκονται, προκειμένου να βρει νέους στόχους για την πρόληψη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Η ταχεία ανάπτυξη της μοριακής βιολογίας καθιστά δυνατή την ανίχνευση μοριακές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυττάρων. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να παρέχει σημαντικές ενδείξεις σχετικά με την αντίσταση του φαρμάκου. Η κατανόηση των σχέσεων μεταξύ της αντίστασης σισπλατίνη και μοριακές αλλαγές θα βοηθήσουν στην πρόβλεψη της αντίστασης σισπλατίνη εκ των προτέρων και να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής παρέμβασης.

Το ανθρώπινο μεταγραφικό περιλαμβάνει μεγάλο αριθμό αγγελιοφόρων RNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη (mRNAs), μαζί με μια μεγάλη σειρά από μη πρωτεϊνικό κωδικοποίησης μεταγραφές συμπεριλαμβανομένων των μεγάλων μη-κωδικοποίησης RNA και microRNA που έχουν δομική, κανονιστικές ή άγνωστες λειτουργίες [7], [8]. Long μη κωδικοποιητική RNAs (lncRNAs), τα οποία χαρακτηρίζονται από την πολυπλοκότητα και την ποικιλομορφία των ακολουθιών και των μηχανισμών δράσης τους είναι διαφορετικά από τα μικρά RNAs ή δομικών RNAs και πιστεύεται ότι λειτουργούν είτε ως κύρια ή ματίσματος [9]. Τα αλλαγμένα επίπεδα του lncRNA έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε ανώμαλη έκφραση των γονιδιακών προϊόντων που μπορεί να συμβάλει σε διαφορετικές καταστάσεις ασθένειας συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [10], [11]. Ωστόσο, η συνολική παθοφυσιολογική συμβολή των lncRNAs με σισπλατίνη αντίσταση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια οικογένεια ~22nt μικρές, μη-κωδικοποίησης, ενδογενή, μονόκλωνο RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων. Ώριμη miRNAs και Argonaute (πριν) πρωτεΐνες σχηματίζουν το RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC), η οποία μεσολαβεί μετα-μεταγραφική γονιδιακή αποσιώπηση μέσω επαγωγής αποικοδόμησης του mRNA ή της αναστολής της μετάφρασής [12]. Μερικά miRNAs είχαν βρεθεί παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση σισπλατίνη [13], [14], αλλά χρειάζεται περισσότερη έρευνα για να διερευνήσει τις σχέσεις μεταξύ των miRNAs, lncRNAs και mRNAs στη διαδικασία του καρκίνου βιολογίας.

Το Wnt /β κατενίνης κανονικό μονοπάτι σηματοδότησης ήταν προηγουμένως θεωρείται ότι παίζει κεντρικό ρολό για τον καθορισμό της κυτταρικής τύχης [15]. Η οδός Wnt έχει τώρα βρεθεί ότι μεταβάλλεται σε πολλούς τύπους καρκίνου [16]. Μετά τη δέσμευση του Wnt στον υποδοχέα του, Dishevelled πρωτεΐνες (Dsh /ϋνΙ) ενεργοποιούνται, οδηγώντας στην αδρανοποίηση της αξίνης /αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) /γλυκογόνο συνθάσης κινάσης (GSK) σύμπλοκο 3β που αποτρέπει την αποικοδόμηση του β-κατενίνης [ ,,,0],17]. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα σταθεροποιημένες β-κατενίνης που μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με μέλη της /λεμφοειδών παράγοντα αύξησης-δεσμευτικός παράγοντας Τ κυττάρων (TCF /LEF) οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων, και είναι σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση ενός ευρέος φάσματος στόχευση γονιδίων για τη ρύθμιση τύχες των κυττάρων.

Wnt-β-κατενίνης οδού [18] ελέγχονται με ακρίβεια από έναν αριθμό ρυθμιστικών αρχών. Μεταξύ αυτών, η οικογένεια γυμνή επιδερμίδα (NKD) περιλαμβάνει Drosophila γυμνός επιδερμίδα και έχουν δύο ορθόλογα σπονδυλωτό του NKD1 και NKD2 δειχθεί ότι ρυθμίζουν αρνητικά κανονική σηματοδότηση Wnt μέσω σύνδεσης με ϋνΙ. Ωστόσο, αν η οδός Wnt εμπλέκεται σε σισπλατίνη αντίσταση ή ρύθμισή της είναι ακόμη άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη, προφίλ έκφρασης lncRNA, miRNA και mRNA συγκρίθηκαν σε άγριου τύπου Α549 και σισπλατίνη κυτταρικές γραμμές αντίστασης Α549 /CDDP χρησιμοποιώντας γενετική τεχνολογία Chip. Μια ολοκληρωμένη ανάλυση που συνδυάζει τις αλλαγές στις τρεις ομάδες του RNA εντός διαφορετικών γενετικών δικτύων χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση γονιδίων και μονοπατιών που μπορεί να σχετίζονται με σισπλατίνη αντίσταση σε NSCLC. Πειράματα με lncRNA AK126698 νοκ ντάουν χρησιμοποιήθηκαν για να παρατηρούν τις επιπτώσεις της στα κανονικά Wnt μονοπάτι και κυττάρων απαντήσεις σε σισπλατίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς Α549 και σισπλατίνη ανθεκτική παραλλαγή κυτταρικής σειράς Α549 /CDDP αγοράστηκαν από το Πεκίνο Ένωση Medical College, το Πεκίνο, Κίνα. Α549 και Α549 /CDDP κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (τεχνολογίες ζωής) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Gran Island, ΝΥ, USA) σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C . Η /CDDP μέσο κυτταρικής Α549 περιείχε επιπροσθέτως 2 mg /L σισπλατίνη προκειμένου να διατηρηθεί ανθεκτικά στα φάρμακα φαινότυπο της. Τα κύτταρα στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα.

LncRNA μικροσυστοιχιών

Εν συντομία, Α549 και Α549 /CDDP κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να συνθέσουν δίκλωνο συμπληρωματικό DNA (cDNA). Το δίκλωνο cDNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε με τον 8 × 60 K LncRNA Έκφραση Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Η μικροσυστοιχία έκφραση lncRNA χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή ταξινομεί κυρίως ανιχνευτές της ως εξής υποτύπος: 1). LncRNAs Enhancer: Περιέχει προφίλ δεδομένα όλων των LncRNAs με ενισχυτή που μοιάζει με τη λειτουργία [19]. 2). Rinn lincRNAs: Περιέχει προφίλ δεδομένα όλων των lincRNAs βασίζονται στα έγγραφα John Rinn [20], [21]. 3). σύμπλεγμα HOX: Περιέχει προφίλ δεδομένων όλων των ανιχνευτών σε τόπους τέσσερις HOX, στοχεύοντας 407 διακριτές περιοχές μεταγραφή, lncRNAs και κωδικοποίησης μεταγραφές [22]. 4). LincRNAs κοντά κωδικοποίησης γονιδίων: Περιέχει τα διαφορικά εκφρασμένων lincRNAs και σε κοντινή απόσταση κωδικοποίησης ζεύγη γονιδίων (απόσταση & lt? 300 kb). 5). Enhancer LncRNAs κοντά κωδικοποίησης γονιδίων: Περιέχει τα διαφορικά εκφρασμένων ενισχυτή-όπως LncRNAs και τα κοντινά γονιδίων που κωδικοποιούν τους (απόσταση & lt? 300 kb). Μετά την υβριδοποίηση και πλύση, επεξεργασία διαφάνειες σαρώθηκαν με την Agilent DNA μικροσυστοιχιών Scanner (αριθμός μέρος G2505B). Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Extraction (έκδοση 10.7.3.1) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση εικόνων που array. Ποσοστημόριο εξομάλυνση και η επακόλουθη επεξεργασία των δεδομένων έγιναν με τη χρήση του v11.5.1 πακέτο λογισμικού GeneSpring GX (Agilent Technologies). Κάθε κυτταρική γραμμή που εκτελούνται lncRNA μικροσυστοιχιών εις τριπλούν.

Mirna μικροσυστοιχιών

μικροσυστοιχιών προφίλ για miRNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συστοιχίες Affymetrix GeneChip miRNA (Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg του ολικού RNA από τα κύτταρα σημάνθηκε με ροΙγΑ πολυμεράση χρησιμοποιώντας το κιτ Genisphere FlashTag HSR ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή (Genisphere, Hatfield, ΡΑ). RNA υβριδίστηκε με τη συστοιχία Affymetrix miRNA όπως συνιστάται από τον προμηθευτή. Τυπική χρώση κασέτα συστοιχία Affymetrix, πλύση και σάρωση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ μετα-υβριδισμού (# 900720? Affymetrix) και σαρωτή GeneChip 3000. Εξαγωγή χαρακτηριστικών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Affymetrix Command Console. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ακόλουθη σειρά: ανίχνευση φόντο ακολούθησε RMA παγκόσμια φόντο συσχέτισης, ποσοστημόριο κανονικοποίηση, η διάμεση εκτίμηση και log2-μετασχηματισμού χρησιμοποιώντας το εργαλείο λογισμικού miRNA QC (Affymetrix). Κάθε κυτταρική γραμμή πραγματοποιήθηκε miRNA μικροσυστοιχιών εις τριπλούν.

In vitro ευαισθησία φαρμάκου δοκιμασίας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 48 ώρες στους 37 ° C. Μετά την προσθήκη 20 μί CellTiter 96R υδατική διάλυμα (Promega) σε κάθε φρεάτιο, οι πλάκες επωάστηκαν για 2,5 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση κάθε βυθίσματος στα 490 nm (Α490) αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Η συγκέντρωση στην οποία κάθε φάρμακο που παράγεται 50% αναστολή της ανάπτυξης (IC50) υπολογίστηκε από τη σχετική καμπύλες επιβίωσης. Τρία ανεξάρτητα πειράματα σε έξι φρεάτια εις διπλούν.

Realtime RT-PCR

Σε πραγματικό χρόνο RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση διαφορική έκφραση των 16 γονιδίων που εντοπίστηκαν από την έκφραση μικροσυστοιχιών LncRNA. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ανάστροφη μεταγραφάση (Takara), ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια με 1 μg RNA από τα ίδια δείγματα με εκείνα που χρησιμοποιούνται στη μικροσυστοιχία. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα S1. Κάθε πραγματικό χρόνο αντίδρασης RT-PCR (σε 20 μΐ) περιείχε 2,5 × SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TIANGEN), 0.5 μΜ αρχικά τεμάχια και 0.5 μί cDNA εκμαγείο. Οι συνθήκες των κύκλων αποτελούμενο από μία αρχική, μόνο κύκλο 2 λεπτά στους 94 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15 s στους 94 ° C, 20 s στους 63 ° C, και 30 s στους 68 ° C. ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν σε τρία αντίγραφα για κάθε δείγμα. επίπεδα έκφρασης γονιδίων προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε σχέση με την έκφραση του 18S χρησιμοποιώντας μια βελτιστοποιημένη μέθοδο τιμή συγκριτική Ct (ΔΔCt). Οι διαφορές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

QRT-PCR των miRNA

Σετ Αρδεννών-loop ™ miRNA qRT-PCR Primer (ενός εκκινητή RT και ένα ζευγάρι qPCR εκκινητών για το καθένα. οριστεί) ειδικά για το miR-17, miR-21, miR-138, miR-194 και miR-ας-7i έχουν σχεδιαστεί από RiboBio (Guangzhou, Κίνα). Εν συντομία, το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα MiRNeasy Mini Kit (QIAGEN). Η miRNA διόγκωση βρόχου μεταγράφηκε αντίστροφα με την Quantscript RT Kit (TIANGEN). Κάθε πραγματικό χρόνο αντίδρασης RT-PCR (σε 25 μλ) περιείχαν 2 χ SuperReal Πρόμιγμα (TIANGEN), 10 μΜ εκκινητών, και 1 μι cDNA εκμαγείο. Οι συνθήκες των κύκλων αποτελούμενο από μία αρχική, μόνο κύκλο 3 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 10 s στους 95 ° C, 20 s στους 60 ° C και 30 s στους 70 ° C. ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν σε τρία αντίγραφα για κάθε δείγμα. Η σχετική ποσότητα των miRNAs ομαλοποιήθηκε κατά U6 snRNA, και η πτυχή της αλλαγής για κάθε miRNA υπολογίστηκε από την 2

-ΔΔCt μέθοδο. P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Για να εκτιμηθεί η αναστολή της AK126698, 50 nM της AK126698 siRNA (Shanghai Genepharma, Κίνα) μετήχθησαν σε Α549. κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κύτταρα επιμολυσμένα με τον παράγοντα μορφομετατροπής και siRNA σκαρφάλωμα ελέγχου (αρνητικός έλεγχος) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τέσσερα ζεύγη siRNA ονομάστηκαν siRNA AK126698-291, siRNA AK126698-341, siRNA AK126698-424 και siRNA AK126698-1492, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, μόνο siRNA siRNA AK126698-291 και AK126698-424 μειώσει με επιτυχία το επίπεδο έκφρασης της lncRNA AK126698. Οι αλληλουχίες των AK126698 siRNA και siRNA ελέγχου σκαρφάλωμα παρατίθενται στον Πίνακα S2.

Western blot ανάλυση

Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο ). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση AK126698 siRNA ή αρνητικό μάρτυρα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης. Η ολική πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε μετουσιωτικό πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου 10%. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με σύστημα Οδύσσεια (Gene Company Limited, USA). Τα πρωτογενή αντισώματα για β-κατενίνης, φωσφο-β-κατενίνης (Ser675) και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Cell Signaling Technology και Sigma-Aldrich, αντίστοιχα. Τα πρωτογενή αντισώματα για μονοπατιού κυτταρικού κύκλου φωσφο-cdc2 (Tyr15), φωσφο-Rb (ser807), φωσφο-Chk2 (Thr68) και φωσφο-ρ53 (Ser15) και για το μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) και φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) αγοράστηκαν από Τεχνολογία κυτταρική σηματοδότηση. Αντίσωμα αραιώσεις ήταν 1:2000 για β-κατενίνης, 1:1000 για φωσφο-β-κατενίνης, 1:1000 για φωσφο-Rb (ser807), 1:1000 για φωσφο-Chk2 (Thr68), 1:1000 για φωσφο-cdc2 (Tyr15), 1:200 για φωσφο-ρ53 (Ser15), 1:200 για φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), 1:200 για φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) και 1:5000 για β-ακτίνη. επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και προσδιορίστηκαν οι αλλαγές.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). 24 ώρες μετά την διαμόλυνση των siRNA AK126698 όπως περιγράφηκε παραπάνω, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP σε μια τελική συγκέντρωση των 10 mg /L. 24 ώρες μετά την αγωγή του CDDP, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης των επιμολυσμένων κυττάρων Α549 με προσδιορισμό της σχετικής ποσότητας του αννεξίνης V-FITC-θετικά-ΡΙ-αρνητικά κύτταρα.

Ανάλυση Δεδομένων

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Αριθμητικά δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι όροι και τυπικά σφάλματα (± SEM). Οι διαφορές μεταξύ των μέσων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS11.0 (Chicago, IL).

Σημαντικές Διαφορικής Ανάλυσης Gene.

Το μοντέλο τυχαία διακύμανση (RVM) t-test χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων για την ομάδα ελέγχου και πειράματος. Αυτό το μοντέλο έχει περισσότερη δύναμη από ό, τι πρότυπο εξετάσεις για να πάρει μεγάλες αλλαγές στην έκφραση, χωρίς να αυξηθεί το ποσοστό των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων [23]. Μετά τη σημαντική ανάλυση και ανάλυση ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (FDR), επιλέξαμε τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, σύμφωνα με τα κατώτατα όρια προκαθορισμένη τιμή Ρ (& lt? 0.05) [23], [24], [25]. Τα αποτελέσματα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων υποβλήθηκαν σε ανεξέλεγκτους ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster 3.0) και ανάλυση TreeView (Stanford University, Stanford, CA, USA).

πρόβλεψη στόχους microRNA.

Στόχοι mRNAs των miRNAs είχαν προβλεφθεί με βάση TargetScan (https://www.targetscan.org/) έκδοση 5.2. TargetScan προβλέπει βιολογικών στόχων των miRNAs με την έρευνα για την παρουσία διατηρημένες θέσεις 8-μερούς και 7mer που ταιριάζουν με την περιοχή σπόρο κάθε miRNA [26]. Επίσης, προσδιορίζονται οι περιοχές με αναντιστοιχίες στην περιοχή σπόρο που αντισταθμίζονται από συντηρημένα 3 ‘αντιστοίχιση [27]. Στα θηλαστικά, οι προβλέψεις κατατάσσονται με βάση την προβλεπόμενη αποτελεσματικότητα της στοχοθέτησης, όπως υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τα πλαίσια + βαθμολογίες των χώρων ευθυγραμμίσεις [28], [29]. TargetScanHuman θεωρεί αγώνες για να σχολιάσετε την ανθρώπινη UTRs και ορθόλογα τους, όπως ορίζεται από UCSC ευθυγραμμίσεις ολόκληρου του γονιδιώματος. Συντηρημένη στόχευση έχει επίσης εντοπιστεί στο πλαίσιο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs).

ανάλυση Pathway.

ανάλυση δρόμος είχε χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό σημαντικών οδών για τη διαφορική γονίδια, σύμφωνα με την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων , Biocarta και Reatome βάσεις δεδομένων. Χρησιμοποιήσαμε επίσης ακριβή και chi-square τεστ του Fisher για να επιλέξετε σημαντικές οδούς. Το όριο σημαντικότητας ορίστηκε από P-αξία και FDR. Το Re εμπλουτισμός δόθηκε από: (R

e = εμπλουτισμού), όπου είναι ο αριθμός των διαφορικών γονιδίων εντός της συγκεκριμένης κατηγορίας, είναι ο συνολικός αριθμός των γονιδίων εντός της ίδιας κατηγορίας, είναι ο αριθμός των διαφορικών γονιδίων σε ολόκληρο μικροσειρά , και είναι ο συνολικός αριθμός των γονιδίων στο μικροσυστοιχία [30], [31], [32].

GeneRelNet (δίκτυο συνέκφραση).

δίκτυα συνέκφραση Gene χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό αλληλεπιδράσεων γονίδιο [33]. δίκτυα γονίδιο συν-έκφραση κτίστηκαν σύμφωνα με την κανονικοποιημένη ένταση του σήματος των συγκεκριμένων γονιδίων έκφρασης. Για κάθε ζεύγος γονιδίων, υπολογίσαμε το συντελεστή συσχέτισης Pearson και επιλέξτε σημαντικά ζεύγη συσχετισμού για την κατασκευή του δικτύου [34].

Στο πλαίσιο της ανάλυσης του δικτύου, ο βαθμός της γονιδιακής κεντρικότητας ορίζεται ως ο αριθμός των συνδέσεων από έναν κόμβο στο άλλο, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική σημασία του [35]. K-πυρήνες χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση τοπολογία γράφημα. Το k-πυρήνα ενός δικτύου ήταν ένα υποδίκτυο στο οποίο όλοι οι κόμβοι ήταν συνδεδεμένα με τουλάχιστον ‘k’ άλλα γονίδια στο υποδίκτυο. Μέσα σε μια αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, k-core δίκτυα συνήθως περιέχουν συνεκτικές ομάδες πρωτεϊνών [35], [36].

Αποτελέσματα

μικροσυστοιχιών των Α549 και Α549 /κυτταρικές σειρές CDDP

Πρώτον, η σισπλατίνη-αντίσταση του Α549 κυτταρικής σειράς /CDDP ταυτοποιήθηκε με την αξιολόγηση της IC50 τιμής του Α549 /CDDP έναντι του άγριου Α549 κυτταρική γραμμή. Όπως έδειξε στο Σχήμα 1Α, η IC50 της σισπλατίνης για το Α549 κυτταρική γραμμή /CDDP ανθεκτικών στα φάρμακα ήταν 17,06 ± 0,68 mg /L η οποία ήταν 3,9 φορές υψηλότερη από εκείνη του Α549 κυτταρική γραμμή αγρίου τύπου (4,36 ± 0,78 mg /L). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι τα κύτταρα Α549 /CDDP ήταν πιο ανθεκτικά στην σισπλατίνη από τα κύτταρα άγριου τύπου.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης (0,5 mg /L έως 128 mg /L). 48 ώρες αργότερα, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με MTS (Α). χάρτες θερμότητας δείχνουν lncRNA (Β), το mRNA (C) και miRNAs (D) προφίλ που διαφοροποιούν Α549 /CDDP από το Α549. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Τόσο τα κάτω-ρυθμιζόμενη (πράσινο) και up-ρύθμιση (κόκκινο) RNAs εντοπίστηκαν στο Α549.

Η

Στη συνέχεια, μια μελέτη του γονιδίου τσιπ πραγματοποιήθηκε σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές για να διερευνήσει τις πιθανές αλλαγές έκφρασης του RNA σε σισπλατίνη αντίσταση στα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα με τη χρήση του ανιχνευτή σύνολο δεδομένων Arraystar που περιλάμβανε 33.045 lncRNAs και 30.215 κωδικοποίησης μεταγραφές. Ιεραρχική συσταδοποίηση έδειξαν συστηματικές μεταβολές στην έκφραση των lncRNAs και RNAs που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (Εικόνα 1Β και 1Γ). Σε σύγκριση με Α549 κυτταρική γραμμή, 725 ανιχνευτές lncRNAs αυξηθεί και 655 ανιχνευτές μειώθηκε στην Α549 /κυτταρική σειρά CDDP. Επιπλέον, 625 απόκλιση mRNA αυξήσεις ανιχνευτή και 846 mRNA μειώσεις ανιχνευτή βρέθηκαν στο Α549 /κυτταρική σειρά CDDP.

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση microRNA μετατράπηκε σε ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη, προφίλ έκφρασης miRNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την Affymetrix γονίδιο τσιπ miRNA που περιείχε 1.105 προ-miRNAs και 1.105 ώριμο-miRNAs ανιχνευτές. Για περαιτέρω ανάλυση που επικεντρώνεται στην ώριμη-miRNAs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε κύτταρα Α549 /CDDP, 16 miRNAs μειωτικά και 9 miRNAs απορυθμίζεται σε σύγκριση με την Α549 κυτταρική γραμμή (Ρ & lt? 0,05? Σχήμα 1Δ). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών που συζητήθηκαν σε αυτό το άρθρο έχουν κατατεθεί στο National Center for Biotechnology Information (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO) και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξης (GEO) Σειρά GSE43494 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE43494).

η επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας qPCR

για να επικυρώνει τα πορίσματα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών, το επίπεδο έκφρασης των 8 mRNAs που πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στο φάρμακο και 8 lncRNAs οποία είχε συσχετίσεις με προγενέστερες mRNAs μεταξύ των RNAs διαφορική έκφραση, αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR). Για lncRNA, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι AK123263, CES1P1-001, RP3-508I15.14, AK126698, TP53TG1, και AC090952.4.1 μειώθηκε, ενώ uc003bgl.1 και NCRNA00210 αυξήθηκε σε Α549 /CDDP (όλα τα P & lt? 0,05? Σχήμα 2Α) . Για mRNA, η έκφραση του ΒΜΡ4, CTSB, NKD2, BAG1, TGFB1, EGFR, Jun και CUL2 έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (Ρ & lt? 0,05? Σχήμα 2Β). Όλα τα αποτελέσματα qRT-PCR ανωτέρω ήταν σύμφωνα με το μικροσυστοιχίας. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ένα σύνολο lncRNAs και mRNAs τα παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε σισπλατίνη κυτταρικές γραμμές αντίστασης.

Η σχετική ποσότητα του κάθε mRNA (Α) και lncRNA (Β) ομαλοποιήθηκε σε 18S rRNA, και κάθε miRNA (C ) κανονικοποιήθηκε σε U6 snRNA. Τα δεδομένα σε ιστογράμματα είναι μέσοι όροι ± SD, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001 σε σύγκριση με το Α549 (t-test)

Η

5 miRNAs μεταξύ εκείνων που φιλτράρεται επικυρώθηκαν με. να είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ της σισπλατίνης ανθεκτική κυτταρική σειρά Α549 /CDDP και την γονική Α549 κυτταρική γραμμή (P & lt? 0,05). Όπως φαίνεται στο (Σχήμα 2C), τα επίπεδα του miR-17, miR-21, και miR-ας-7i ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε Α549 αντί Α549 /CDDP, ενώ το miR-138 και miR-194 έκφρασης ήταν απότομη ανωφέρεια ρυθμίζεται. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών.

μικροσυστοιχιών με βάση την ανάλυση της οδού

Σημαντικές οδοί των διαφορικών γονίδια σε σχέση με τη βάση δεδομένων KEGG, να εξειδικεύσει περαιτέρω και να εντοπίσει τα mRNA στόχων μεταξύ των 1.471 εντοπίστηκαν γονίδια. Αυτά τα γονίδια που φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β. Οι οδοί υψηλής εμπλουτισμού στοχεύονται από υπερεκφράζεται mRNAs συμμετείχαν στη βιοσύνθεση αμινοακυλο-tRNA, την αντιγραφή του DNA και την επεξεργασία πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Αντιθέτως, σημαντικές οδούς που αντιστοιχεί σε υποεκφράζονται mRNAs φάνηκε να είναι υπεύθυνο για τον μεταβολισμό του φαρμάκου, την επεξεργασία αντιγόνου και παρουσίαση αλληλεπιδράσεις υποδοχέα και κυτοκίνης-κυτοκίνης. Μεταξύ αυτών, οι μέγιστες εμπλουτισμένα-οδών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό και μεταβολισμό του φαρμάκου πρότειναν ένα ρόλο στην σισπλατίνη αντίσταση.

σηματοδότηση μονοπατιών των διαφορικά εκφρασμένων απορυθμίζεται mRNAs (Α) και ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs (Β). Ανάλυση κηλίδας Western των ΜΑΡΚ οδού (C) και μονοπατιού κυτταρικού κύκλου (D) επίπεδα σε κύτταρα Α549 και Α549 κύτταρα /CDDP. P-ρ44 /42 ΜΑΡΚ, φώσφορο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ? P-SAPK /JNK, φώσφορο-SAPK /JNK? P-cdc2, φώσφορο-cdc2? P-Rb, φώσφορο-Rb? P-Chk2, φώσφορο-Chk2? P-p53, φώσφορο-p53. Σηματοδότηση μονοπατιών στην τομή μεταξύ διαφορετικά εκφράζονται mRNAs και προβλεπόμενη γονίδια στόχους από διαφορετικά εκφρασμένη απορυθμίζεται mRNAs (Ε) και ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs (F). Ανάλυση μονοπατιού βασίστηκε κατά κύριο λόγο στη βάση δεδομένων KEGG. P-τιμές & lt? 0.05 χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του δύο όψεων του Fisher είχαν χαρακτηριστεί ως στατιστικά σημαντική. Ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει την κατηγορία οδού και ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει την -λογ10 (τιμή p) αυτών των σημαντικών οδών.

Η

κυτταρικού κύκλου και της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ είχαν επέλεξε να ελέγξει την ακρίβεια των αποτελεσμάτων της ανάλυσης μονοπατιού . Σε σύγκριση με τα κύτταρα Α549, οι βασικοί παράγοντες στην κυτταρικού κύκλου φωσφο-cdc2 (Tyr15) και φωσφο-Rb (ser807 /811) αυξήθηκε το επίπεδο της πρωτεΐνης στο Α549 /κύτταρα CDDP αντιπροσωπεύουν το προς τα πάνω ρύθμιση του μονοπατιού κυτταρικού κύκλου. Η μειωμένη της cdc2 αρνητικός ρυθμιστής φωσφο-Chk2 (Thr68) και φωσφο-p53 (Ser15) ενίσχυσε αυτό το αποτέλεσμα. Επίσης, η φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) και φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), τα οποία είναι οι κύριοι παράγοντες της ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης, μειώθηκαν σε Α549 /κυτταρική σειρά CDDP. Και αυτά τα αποτελέσματα που παρατίθενται στο Σχήμα 3C και 3D.

Τα mRNA στόχο για διαφορικά εκφρασμένων miRNAs έχουν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας TargetScan (https://www.targetscan.org/) και παρατηρήθηκαν 7814 σχέσεις μεταξύ τους (Πίνακας S3) . επιλέχθηκε Η τομή οριστεί για τις προβλεπόμενες mRNAs στόχου και διαφορικά εκφρασμένων mRNAs που αναφέρθηκαν παραπάνω. 497 σχέσεις αριστερά μετά το βήμα αυτό, όπως φαίνεται στον Πίνακα S4. Σημαντικές οδοί για αυτά τα γονίδια (Ρ & lt? 0,05) θεωρείται ότι ρυθμίζεται από miRNAs σύμφωνα με τη βάση δεδομένων KEGG αναλύθηκαν (Σχήμα 3Ε και 3F). Οι σημαντικές οδοί που περιλαμβάνονται Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι, μεταγραφική απορρύθμιση στον καρκίνο και, ινσουλίνη σηματοδότηση μονοπατιών.

Θα προβληθεί από 21 διαφορικά εκφρασμένων mRNAs σε κύτταρα αντίστασης σισπλατίνη (Πίνακας S5) που συσχετίζονται αρνητικά και ενδεχομένως ρυθμίζονται από miRNAs. Αυτά τα mRNAs ενεπλάκησαν σε 11 από τις οδούς που πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση σισπλατίνη.

Καθιέρωση γονιδίου συν-έκφραση δίκτυο

συντελεστές συσχέτισης Pearson υπολογίστηκαν για κάθε γονίδιο και σημαντικές ζεύγη συσχετισμό συγχωνεύθηκαν με miRNAs να διερευνήσει lncRNA, miRNA και mRNA συν-έκφραση. ανάλυση δικτύου έγινε για να διερευνηθεί ποια γονίδιο ή γονίδια που διαδραματίζουν έναν κεντρικό ρόλο στην αντίσταση σισπλατίνη (Σχήμα 4). δίκτυα Gene κατασκευάστηκαν από λειτουργικές ενώσεις γονιδίου, και περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα S6. mRNAs που αλληλεπιδρούν με τα δύο lncRNAs και miRNAs ήταν υπογράμμισε με κίτρινο χρώμα. Στα διαγράμματα του δικτύου, οι κόμβοι του κύκλου αντιπροσωπεύουν γονίδια, και οι ακμές μεταξύ των δύο κόμβων αντιπροσωπεύουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων ποσοτικά με πτυχίο. Βαθμοί εντός του δικτύου περιγράφουν τον αριθμό των απλών γονιδίων που ρυθμίζουν άλλα γονίδια και αντιπροσωπεύουν το μέγεθος του κόμβου κύκλου. Όσο υψηλότερος είναι ο βαθμός, τόσο πιο κεντρική το γονίδιο είναι εντός του δικτύου. Οι ακμές ανάμεσα σε δύο κόμβους συνδέθηκαν με διαφορετικούς μηχανισμούς. LncRNA-mRNA είχε προβλεφθεί από την ανάλυση συσχέτισης για την απώλεια της αποτελεσματικής εξηγήσεις επί του παρόντος. miRNA-mRNA είχε προβλεφθεί από TargetScan η οποία είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για υψηλής απόδοσης πρόβλεψη στόχους δεδομένα microRNA. mRNA-mRNA προσδιορίστηκε με βάση KEGG για πολλές σχέσεις mRNA είχαν συλλεχθεί εδώ. LncRNA-lncRNA και miRNA-miRNA δεν έδειξε γιατί είναι χωρίς νόημα. LncRNA-miRNA δεν μπορεί να υπολογιστεί περιορίζεται από τη βάση δεδομένων και την τεχνική.

LncRNA-miRNA-mRNA-Δίκτυο Α549 (Α) και Α549 /CDDP (Β). Το μπλε αντιπροσωπεύει ρύθμιση προς τα κάτω και πορτοκαλί αντιπροσωπεύει τη ρύθμιση. κόμβοι κουτί αντιπροσωπεύουν microRNA, κόμβοι κύκλο αντιπροσωπεύουν mRNA, και οι κόμβοι εξάγωνο αντιπροσωπεύουν lncRNA. Μαύρες άκρες περιγράψει την πιθανή σχέση μεταξύ lncRNA και mRNA, πράσινο άκρες περιγράφουν το ανασταλτικό αποτέλεσμα των microRNA στο mRNA, και κόκκινες άκρες αντιπροσωπεύουν τη σχέση μεταξύ του mRNA και mRNA.

Η

συντελεστές Clustering χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της πολυπλοκότητας αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων γειτονικών τον πυρήνα γονίδιο, με την εξαίρεση της συμμετοχής πυρήνα γονιδίου. Όσο χαμηλότερη είναι η ομαδοποίηση συντελεστής, τόσο περισσότερο ανεξάρτητη από τις βασικές γονίδια ήταν από την άποψη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων σε γειτονικές πυρήνες [35]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πολλά γονίδια όπως FN1, CTSB, EGFR, και TGFB1? lncRNAs συμπεριλαμβανομένων BX648420, ENST00000366408 και ENST00000404247? και miRNAs όπως miR-26a και αφήστε-7i πιθανώς έπαιξε καθοριστικό ρόλο στο δίκτυο. Στο υποδίκτυο, πολλά απομονωμένα mRNAs συνδέθηκαν με το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Θα ήταν υποψήφιοι για να μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην σισπλατίνη αντίσταση ρυθμίζεται από lncRNAs.

Το δίκτυο αποτελέσματα ανάλυση έδειξε ότι τα mRNA μπορούν να συν-ρυθμίζονται από διαφορετικές lncRNAs μαζί με διαφορετικές miRNAs. Για παράδειγμα, BAG1 μπορεί να ρυθμιστεί από 3 miRNAs και 3 lncRNAs ταυτόχρονα. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί μερικοί mRNAs προέβλεψε ως πιθανοί στόχοι miRNAs δεν άλλαξε με την αντίθετη κατεύθυνση της αντίστοιχης miRNAs του.

Konckdown της AK126698 ενεργοποιείται κανονικά μονοπάτι σηματοδότησης Wnt και προκαλείται από την αντίσταση σισπλατίνη στην κυτταρική σειρά Α549

Η ανωτέρω οδός αναλύσεις έδειξε ότι μονοπάτι Wnt σηματοδότηση και πολλά απομονωμένα μέλη που αναφέρονται στο σχετικό απομονωμένο δίκτυο ήταν σημαντικά μεταβληθεί σε Α549 /κυτταρική σειρά CDDP. Αυτά τα αποτελέσματα μας πρότειναν ότι Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι είχε εμπλακεί σε NSCLC χημειοαντίσταση. Από εκεί και πέρα, το επίπεδο της AK126698 ήταν συσχετίζεται στενά με πολλά μέλη της μονοπάτι Wnt (όπως φαίνεται στον Πίνακα S7). Έτσι, ο ρόλος των lncRNA AK126698 στη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt εξερευνήθηκε. Επιμόλυνση του siRNA AK126698-424 και siRNA AK126698-291 σε κύτταρα Α549 ως αποτέλεσμα τη μείωση της έκφρασης NKD2 mRNA το οποίο είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt (Σχήμα. 5Α). Εν τω μεταξύ, ο βασικός παράγοντας μεταγραφής σε κανονική Wnt μονοπατιού β-κατενίνης ήταν επίσης αυξημένη σε επίπεδο πρωτεΐνης μετά από AK126698 νοκ ντάουν. Το επίπεδο πρωτεΐνης φωσφο-β-κατενίνης (Ser675), το οποίο αντιπροσωπεύει την μετατόπιση β-κατενίνης, αυξημένη μετά τη θεραπεία του siRNA AK126698. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το siRNA AK126698 ενεργοποιηθεί κανονική Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι /β-κατενίνης (Σχήμα 5Β). Την ίδια στιγμή, η δράση στην εξουθένωση και AK126698-424 siRNA AK126698-291 στην Α549 κυτταρική απόπτωση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία /ΡΙ αννεξίνης-ν.