Abstract

Ιστορικό

Η ciglitazone ανήκει στην κατηγορία θειαζολιδινοδιόνες των αντιδιαβητικών οικογένεια φαρμάκου και είναι ένας συνδετήρας υψηλής συνάφειας για τον πολλαπλασιαστή υπεροξυσώματος ενεργοποιημένου υποδοχέα γ (ΡΡΑΚγ). Εκτός από την αντιδιαβητική της δραστηριότητα, το μόριο αυτό δείχνει αντινεοπλαστική αποτελεσματικότητα σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Χρήση RT4 (που προέρχεται από ένα καλά διαφοροποιημένο βαθμού Ι θηλώδες όγκου) και T24 (προερχόμενο από ένα μη διαφοροποιημένο βαθμού III καρκίνωμα) καρκινικά κύτταρα κύστης, διερευνήσαμε τις δυνατότητες της σιγλιταζόνη να επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και χαρακτηρίστηκε των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται. Σε κύτταρα RT4, η επαγόμενη φάρμακο G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου χαρακτηρίζεται από υπερέκφραση της ρ53, ρ21

WAF1 /Cip1 και ρ27

Kip1 σε σύμπτωση με μείωση της κυκλίνης Β1. Αντίθετα, στα κύτταρα Τ24, το προκάλεσαν απόπτωση

μέσω

εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια. Κυττάρων σύλληψη κύκλου και επαγωγή απόπτωσης συνέβη σε υψηλές συγκεντρώσεις μέσω οδών ενεργοποίησης-ανεξάρτητο ΡΡΑΚγ. Δείχνουμε ότι

in vivo

θεραπεία των γυμνών ποντικών με σιγλιταζόνη αναστέλλει υψηλού βαθμού ανάπτυξης καρκίνου της ουροδόχου κύστης ξενομοσχεύματος. Εντοπίσαμε ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο κιγλιταζόνη σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα. Κιγλιταζόνη up-ρυθμίζονται διαλυτά και δεσμευμένα σε μεμβράνη TRAIL και αφήστε TRAIL-ανθεκτικά κύτταρα Τ24 να ανταποκριθεί σε μονοπάτι μέσα από την ενεργοποίηση της κασπάσης, υποδοχέα θανάτου μονοπάτι σηματοδότησης και της διάσπασης προσφορά. Έχουμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το TRAIL απόπτωση που επάγεται μερικώς οδηγείται από κιγλιταζόνη μεσολάβηση κάτω ρύθμιση των επιπέδων c-FLIP και πρωτεΐνη survivin μέσω ενός μηχανισμού αποικοδόμησης πρωτεασώματος εξαρτώμενη.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Συνεπώς , κιγλιταζόνη θα μπορούσε να είναι κλινικά σημαντική, όπως chemopreventive ή θεραπευτικό μέσο για τη θεραπεία του TRAIL-πυρίμαχα υψηλής ποιότητας ουροφόρων καρκίνους

Παράθεση:. Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard Η, Lascombe Ι (2011) αντιδιαβητικών φαρμάκων Η ciglitazone Προκαλεί υψηλή κύτταρα βαθμού καρκίνο της ουροδόχου κύστης απόπτωση μέσω του Up-κανονισμός του TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10.1371 /journal.pone.0028354

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 16 του Αυγούστου 2011? Δεκτές: 7 Νοέμβρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Δεκ 2011

Copyright: © 2011 Plissonnier et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από την Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Comité du Doubs). Μ.Ι. Plissonnier υποστηρίχθηκε από μια υποτροφία από το Cancéropôle du Grand-Est. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ουροθηλιακά καρκίνωμα των λογαριασμών της ουροδόχου κύστης για ~ 5% όλων των θανάτων από καρκίνο στον άνθρωπο. Η πλειοψηφία των όγκων της ουροδόχου κύστης (75%) είναι μη διηθητικό κατά τη διάγνωση και μετά την τοπική χειρουργική θεραπεία, έχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής και μια τάση να προχωρήσουν στο βαθμό ή το στάδιο [1]. Μύες επεμβατικές όγκους (25%) έχουν χειρότερη πρόγνωση [2] από το 50% των ασθενών θα υποτροπιάσουν με μεταστατική νόσο μέσα σε 2 χρόνια θεραπείας. Παρά τις προόδους με τη χειρουργική επέμβαση και την ενδοκυστική ανοσοανεπάρκειας και χημειοθεραπείας στην αντιμετώπιση των ασθενών και παρόλο νέα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (αναστολείς κινάσης τυροσίνης, αντι-αγγειογόνοι παράγοντες …) χρησιμοποιούνται, δεν έχει παρατηρηθεί βελτίωση στην επιβίωση. Έτσι, την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών χημειοθεραπευτικών σχημάτων με λιγότερες παρενέργειες σίγουρα χρειάζονται για να μειώσετε την νοσηρότητα και τη θνησιμότητα του καρκίνου του ουροφόρων.

Οι θειαζολιδινεδιόνες (ΤΖΟ), συμπεριλαμβανομένης της ροσιγλιταζόνης, η τρογλιταζόνη, η πιογλιταζόνη και κιγλιταζόνη είναι μια κατηγορία ινσουλίνη ευαισθητοποίηση των ναρκωτικών. Εκτός αυτού, η ροσιγλιταζόνη και πιογλιταζόνη βρίσκονται σήμερα σε κλινική χρήση για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου II για εκατομμύρια ασθενείς. Αυτά ΤΖϋ είναι υψηλής συγγένειας συντίθενται χημικά προσδέματα του ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γ (ΡΡΑΚγ) [3], [4]. ΡΡΑΚγ είναι ένας συνδετήρας-ενεργοποιημένου παράγοντα μεταγραφής της υπεροικογένειας πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων. Εκτός από τα γνωστά ρόλο της στην ρύθμιση του μεταβολισμού και της φλεγμονής, PPARγ έχει επίσης ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση που βασίζονται σε μελέτες που δείχνουν την ικανότητά της να διαμορφώνει την κυτταρική διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Εκτός από την αντιδιαβητική δράση τους, ΤΖΟ προκαλούν ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης

in vitro

σε καρκινικά κύτταρα διαφόρων προελεύσεων ιστού και

in vivo

[5]. Λίγες μελέτες δείχνουν ότι η πιογλιταζόνη ή τρογλιταζόνη εμφάνισαν αντιπολλαπλασιαστική ή προ-αποπτωτικών δραστηριότητες κατά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικών σειρών [6] – [9], και ουροθήλιο αρουραίου [10]. Μόνο μία μελέτη ανέφερε ότι σιγλιταζόνη εκτίθενται ανασταλτικά αποτελέσματα επί του αριθμού των κυττάρων σε μία σειρά κυτταρικών σειρών μοντελοποίηση μεταστατικό καρκίνωμα μεταβατικού κυττάρου της ουροδόχου κύστης (TSU-Pr1, TSU-Pr1-B1 και TSU-Pr1-Β2) [6].

παρουσιάζεται απόπτωση

μέσω

δύο ξεχωριστούς μηχανισμούς αλλά συνδεδεμένους μεταξύ σηματοδότησης: η επαγόμενη από υποδοχέα μονοπατιού εξωγενή θάνατος ενεργοποιείται από τα σήματα προαποπτωτική υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια, και η εγγενής μιτοχόνδρια μεσολάβηση οδός ενεργοποιείται από μιτοχονδριακό σήματα από μέσα ο κυττάρου [11]. Τα βασικά μεσολαβητές απόπτωσης είναι κασπασών, μία οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης που διασπούν μια κρίσιμη σειρά κυτταρικών πρωτεϊνών κοντά συγκεκριμένων υπολειμμάτων ασπαρτικού οξέος.

Μεταξύ δυναμικό αποτελεσματικές αντικαρκινικές θεραπείες, TRAIL (απόπτωση που επάγει πρόσδεμα ΤΝΡα συνδέονται) είναι ένα υποσχόμενες αντι-νεοπλασματικό παράγοντα, διότι διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα με μόνο αμελητέα επίδραση επί των φυσιολογικών κυττάρων [12]. TRAIL ενεργοποιεί αλληλουχίας κασπάσης

μέσω

η εξωγενής αποπτωτικό μονοπάτι μέσω αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς TRAIL-απόκρισης θάνατος (DR), όπως DR4 και DR5, που οδηγεί στο σχηματισμό του θανάτου που επάγει σηματοδότηση σύμπλοκο (DISC), την πρόσληψη και ταχεία ενεργοποίηση της κασπάσης 8. τύπου Ι κύτταρα, TRAIL-R που επάγεται ενεργοποίηση της κασπάσης-8 οδηγεί άμεσα σε κατάντη ενεργοποίηση της κασπάσης και απόπτωση, ενώ στον τύπο II κύτταρα κασπάσης-8 ενεργοποίησης είναι αναποτελεσματική και το σήμα πρέπει να ενισχύεται μέσω caspase- 8-διάσπαση του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bid και η ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού αποπτωτικό μονοπάτι [13] μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης 9. Αμφότερες οι κασπάσες 8 και 9 ενεργοποιούν το executioner κασπάσης 3, η οποία είναι η κύρια ενεργοποιητής των αποπτωτικών κατακερματισμού του DNA και οδηγεί σε καρκίνο κυτταρικής απόπτωσης [14].

Σουρβιβίνης και κυτταρική FLICE-ανασταλτική πρωτεΐνη (c-FLIP) είναι κατάντη και ανάντη αντι-αποπτωτικό ρυθμιστές του αποπτωτικού καταρράκτη σηματοδότησης, αντίστοιχα.

όπως και άλλοι αναστολείς της απόπτωσης (ΙΑΡ), survivin δρα κατάντη των μιτοχονδρίων να αποτρέψει την επεξεργασία ή την ενεργοποίηση του εκκινητή κασπάσης-9, με αποτέλεσμα την αναστολή της δραστηριότητα των κασπασών τελεστών. Ωστόσο, ο ρόλος της survivin δεν περιορίζεται στην αναστολή της απόπτωσης, αλλά περιλαμβάνει επίσης τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης [15]. C-FLIP είναι η κύρια πρωτεΐνη που αποτρέπει κασπάσης 8 από την ενεργοποίηση από τους υποδοχείς θανάτου μέσω σύνδεσης προς Fas σχετιζόμενη περιοχή θανάτου και κασπάσης 8 στο δίσκο. Αν και έχουν περιγραφεί πολλαπλές ισομορφές ματίσματος του mRNA c-flip, μόνο δύο από αυτούς, c-FLIP

S και C-FLIP

L, έχουν σημαντικά μελετηθεί σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Αμφότερες οι πρωτεΐνες μπορούν να προσληφθούν στο σύμπλοκο σηματοδότησης που επάγει θάνατο και αναστέλλουν τον υποδοχέα απόπτωση που διαμεσολαβείται από το θάνατο [16]. Τόσο γ-FLIP

L και C-FLIP

S είναι γρήγορες πρωτεΐνες του κύκλου εργασιών? ως εκ τούτου, τα επίπεδα τους υπόκεινται σε ρύθμιση από ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [17], [18].

Τα αποτελέσματα από προκλινικές μελέτες με ανασυνδυασμένο TRAIL έχουν επιδείξει σημαντική δραστηριότητα κατά του όγκου του, αναφέροντας τις δυνατότητες αξιοποίησης TRAIL ως αντικαρκινικός παράγοντας [19]. Παρά αυτή την προ-αποπτωτικών ρόλος του TRAIL στα μετασχηματισμένα κύτταρα, πολλά καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν αντίσταση προς TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Έτσι, έχει αναφερθεί ότι η καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές, όπως Τ24 και ΗΤ1376, είναι TRAIL ανθεκτικά [20]. Ταυτοποίηση των φαρμάκων ή παραγόντων που μπορούν να ξεπεράσουν την αντίσταση TRAIL και ευαισθητοποιούν τα καρκινικά κύτταρα προς TRAIL-επαγώμενη απόπτωση είναι επομένως εξαιρετικά σημαντική για τη στόχευση TRAIL ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα. Ο συνδυασμός του TRAIL με ακτινοβολία και ορισμένων χημειοθεραπευτικών παραγόντων [21], [22] έχουν παράσχει περιορισμένη επιτυχία, γιατί ο συνδυασμός αυτός οδήγησε επίσης σε αύξηση της συστημικής τοξικότητας.

Η παρούσα μελέτη ανέφερε τις επιδράσεις της σιγλιταζόνη επί RT4 (που προέρχεται από ένα καλά διαφοροποιημένο βαθμού Ι θηλώδες όγκου) και Τ24 (που προέρχεται από ένα μη διαφοροποιημένο καρκίνωμα βαθμού III) κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η επιλογή αυτών των ιδιαίτερα κυτταρικών γραμμών καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι σχετικό αφού στα κύτταρα RT4, Ρ53 είναι άγριου τύπου και τα μεσεγχυματικά δείκτη Ν-καντερίνης δεν εκφράζεται ενώ ο δείκτης επιθηλιακά E-cadherin ανιχνεύεται. Αντιστρόφως, σε κύτταρα Τ24, P53 είναι μεταλλαγμένο και Ε-καδερίνης είναι απόν και αντικαθίσταται από Ν-cadherin [23]. Έτσι, ανάλογα με διαφοροποιημένη κατάσταση των κυττάρων, δείξαμε ότι σιγλιταζόνη ατομική μεταχείριση που προκαλείται G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου φάση αλλά ενεργοποιείται απόπτωση μόνο σε Τ24 υψηλής ποιότητας καρκινικών κυττάρων κύστης μέσω μηχανισμών ενεργοποίησης-ανεξάρτητο ΡΡΑΚγ. Επιπλέον, για πρώτη φορά, εξ όσων γνωρίζουμε, η θεραπεία των γυμνών ποντικών με σιγλιταζόνη παρεμποδίζει σημαντικά την αύξηση ξενομοσχευμάτων υψηλής ποιότητας όγκου κύστης επιβεβαιώνοντας μας

in vitro

αποτελέσματα. Το πιο ενδιαφέρον, ο συνδυασμός των κιγλιταζόνη και TRAIL εμφανίζεται ότι κιγλιταζόνη ας TRAIL-πυρίμαχων κύτταρα Τ24 να ανταποκριθεί στις TRAIL. Για πρώτη φορά σε καρκινικά κύτταρα κύστης, έχουμε αποκάλυψε ότι κιγλιταζόνη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του TRAIL και σημαντική ελάττωση της c-FLIP και survivin διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω μιας διαδικασίας αποδόμησης proteosomal συμβάλλουν στην κιγλιταζόνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και με την επίδραση ευαισθητοποίησης αυτής της ΤΖϋ επί TRAIL-επαγώμενη απόπτωση.

Αποτελέσματα

μπλοκ Η ciglitazone RT4 (χαμηλής ποιότητας) και Τ24 (υψηλού βαθμού) κυττάρων σε G2 /M φάση αλλά διεγείρει απόπτωση μόνο σε κύτταρα Τ24 μέσω κασπάσης ενεργοποίηση

για να διερευνηθεί η επίδραση της σιγλιταζόνη επί RT4 και Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα απόπτωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (5-60 μΜ) για 24 ώρες και αξιολογήθηκε για ιωδιούχο προπίδιο χρωματίστηκαν περιεκτικότητα ϋΝΑ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής ανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, σε κύτταρα RT4, το φάρμακο προκάλεσε μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση των κυττάρων στην φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου σε συνδυασμό με την αύξηση του επιπέδου έκφρασης του ρ53, ρ21

Cip1 /WAF1 και ρ27

Kip1 και μείωση του επιπέδου της κυκλίνης Β1 πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β). Αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1C) που δείχνει ότι μια θεραπεία 24 h-σιγλιταζόνη δεν διεγείρει απόπτωση αυτών των κυττάρων ακόμη και σε υψηλή συγκέντρωση 60 μΜ φαρμάκου. Εκτός αυτού, η σιγλιταζόνη δεν προκάλεσε διάσπαση της κασπάσης 3 και PARP υπόστρωμα του (Σχήμα 1 D).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με ή χωρίς σιγλιταζόνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. (Α) Ποσοστό κυττάρων που δείχνει την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. περιεχόμενο (C) υποδιπλοειδή DNA (κορυφή υπο-G1). (Β), (Δ) Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ολικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση του procaspase 3, PARP, ρ53, ρ21

Cip1 /WAF1, ρ27

Kip1 και κυκλίνη Β1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν.

Η

Όπως παρατηρήθηκε για τα κύτταρα RT4, υπήρξε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση του G2 /M κλάσμα των κυττάρων Τ24 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά σε αντίθεση με RT4 κύτταρα, η ανάλυση της κατανομής πυρηνικού DNA σε κύτταρα Τ24 έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 με θάνατο -40% των κυττάρων από 40 μΜ συγκέντρωση (Σχήμα 2Α). Για να χαρακτηριστεί το μονοπάτι κυτταρικού θανάτου που προκλήθηκε από κιγλιταζόνη, η διάσπαση των κασπασών 9, 8, 3 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western ανάλυση. Από μια συγκέντρωση 40 μΜ του φαρμάκου, ένα σημαντικό βελτιωμένη επεξεργασία τόσο κασπάσης 9 και της κασπάσης 8 έως ενεργά θραύσματα τους ανιχνεύθηκε (Σχήμα 2Β). Caspase 3, η οποία αντιπροσωπεύει την κλασσική κατάντη ένζυμο εκτέλεση της κασπάσης 8 και 9 διασπάστηκε σε ενεργή μορφή της (20/18 kDa). Η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 επιβεβαιώθηκε από την διάσπαση του προ-μορφή PARP (116 kDa) προς την ανενεργό μορφή (85 kDa) (Σχήμα 2Β). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, ενώ τα επίπεδα ρ53 και έκφραση Bax παρέμειναν αμετάβλητες, Bcl-2 μειώθηκε δραστικά και Bid περικόπηκε. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα Τ24 θα μπορούσε να ενισχύσει την αποπτωτική σήματος μέσω των μιτοχονδρίων και συμπεριφέρονται σαν τύπου II κύτταρα μετά από έκθεση σιγλιταζόνη.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες σε όχημα ή σιγλιταζόνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. (Α) Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνει την υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA (κορυφή υπο-G1) αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (Β), (Γ) Η διάσπαση των κασπασών 9, 8, 3 και PARP όπως επίσης και η έκφραση του προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση. (D,

αριστερά

) Κύτταρα προεπωάστηκαν 1 ώρα με 50 μΜ κασπάσης 8 (Ζ-IETD-FMK) ή 9 (Ζ-LEHD-FMK) ειδικό αναστολέα πριν από τη θεραπεία με 40 μΜ σιγλιταζόνη για 12 ώρες και την αξιολόγηση των κασπασών 8, 9, 3 και επεξεργασίας προσφοράς αναλύθηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης? (D,

δεξιά

) Μετά υποδεικνύεται θεραπείες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ για ανάλυση κατάτμησης DNA με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? **

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές σε σχέση με κιγλιταζόνη-επεξεργασμένα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά αταίριαστο Μαθητή

Η

Η κασπάσης καταρράκτη ενεργοποίησης είναι ένα σημαντικό γεγονός για την αποπτωτική διαδικασία. Όπως ήταν αναμενόμενο, η επώαση με κασπάση 8 (Ζ-IETD-FMK) ή 9 (Ζ-LEHD-FMK) ειδικοί αναστολείς μπλοκάρει κασπάσες 8 ή 9 επεξεργασίας (Σχήμα 2D, αριστερό πάνελ) και μείωσε την κιγλιταζόνη επαγόμενη απόπτωση όπως αποδεικνύεται από ένα σημαντική μείωση του πληθυσμού υπο-G1 (Εικόνα 2D, δεξί πάνελ) που σχετίζεται με ένα λιγότερο κασπάσης 3 διάσπασης (Σχήμα 2D, αριστερό πάνελ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι RT4 και τα κύτταρα Τ24 δεν είχαν παρόμοια ανταπόκριση στη θεραπεία σιγλιταζόνη. Πράγματι, κιγλιταζόνη επαγόμενη απόπτωση περιορίζεται σε κύτταρα Τ24 μολονότι μπλοκαριστεί Τ24 και RT4 κυττάρων στην φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, τα δύο κύρια αποπτωτικά μονοπάτια, ο υποδοχέας θανάτου και μιτοχονδριακή μονοπάτια, φαίνεται να ενεργοποιείται σε κύτταρα Τ24.

Η ciglitazone δεν ενήργησε μέσα PPARγ μεταγραφική ενεργοποίηση

Για να προσδιορίσετε αν PPARγ μετενεργοποίηση ήταν που απαιτείται για την κιγλιταζόνη-προωθείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση, RT4 και T24 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με 40 μΜ του φαρμάκου μόνο του ή σε συνδυασμό με 80 μΜ του GW9662, μιας μη αναστρέψιμης ισχυρός αναστολέας του ΡΡΑΚγ. Η δράση του σιγλιταζόνη επί G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα RT4 δεν ανεστάλη (Σχήμα 3Α, αριστερός πίνακας). Όπως ήταν αναμενόμενο, το αυξημένο επίπεδο έκφρασης της ρ27

Kip1, παρατηρήθηκε με κιγλιταζόνη, δεν επηρεάστηκε όταν GW9662 συνδέθηκε με το φάρμακο (Σχήμα 3Α, δεξιό πλαίσιο). Ο αντίκτυπος της σιγλιταζόνη επί του κυτταρικού θανάτου T24 (Σχήμα 3Β, αριστερό πάνελ) και κασπάσης 3 διάσπασης (Σχήμα 3Β, δεξιό πλαίσιο) δεν αναστράφηκε με την παρουσία του ανταγωνιστή ΡΡΑΚγ. Έτσι, GW9662 δεν είχε καμία ανασταλτική επίδραση αλλά ακόμη ήταν αποτελεσματικό αφού στα κύτταρα Τ24, αυτό μπλοκάρει την υπερέκφραση του στόχου Α-FABP ΡΡΑΚγ κατά την κατεργασία σιγλιταζόνη (Σχήμα 3C), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]. Στο σύνολό τους, αυτό το σύνολο πειραμάτων διαπιστώθηκε ότι σε Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα, σιγλιταζόνη απόπτωση που επάγεται μέσω οδών σηματοδότησης ενεργοποίηση ανεξάρτητη ΡΡΑΚγ.

RT4 και T24 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με 40 μΜ σιγλιταζόνη μόνη της ή σε συνδυασμό με 80 μΜ του GW9662, μιας μη αναστρέψιμης ισχυρός αναστολέας του PPARγ. (Α,

αριστερά

) συσσώρευση κυττάρων RT4 στην G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής? (Α,

δεξιά

) Μετά την επεξεργασία, τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και 20 μg ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση της ρ27

Kip1. (Β,

αριστερά

) Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA (κορυφή υπο-G1) αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής? (Β,

δεξιά

) Μετά τη θεραπεία, λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και 15 μg ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος υποβλήθηκαν σε ανοσοαποτύπωση για την ανίχνευση των προκασπάσης 3. (C) Αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας PPARγ ανταγωνιστή GW9662 σε λιποκύτταρα λιπαρά πρωτεΐνη οξύ Binding (α-FABP), ένα γνωστό στόχο PPARγ στα κύτταρα Τ24 από δυτικές-κηλίδωση ανάλυση. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. *

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά αταίριαστο Μαθητή

Η

Η ciglitazone up-ρυθμίζει διαλυτό και δεσμευμένη σε μεμβράνη TRAIL σε κύτταρα Τ24

Ερευνήσαμε αν σιγλιταζόνη μπορούν να διαμορφώσουν την έκφραση του TRAIL σε κύτταρα Τ24 και RT4. Μετά 40 μΜ έκθεση κιγλιταζόνη, παρατηρήσαμε μια αύξηση του επιπέδου συνδέτη TRAIL σε Τ24 ολόκληρο εκχυλίσματα κυττάρων όπως εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western, μία αύξηση του συνδεδεμένου με μεμβράνη TRAIL, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με ειδικό αντίσωμα TRAIL ΡΕ-συζευγμένο, καθώς επίσης και μια αύξηση του επιπέδου TRAIL σε κύτταρο Τ24 ρυθμισμένα μέσα προσδιορίστηκε με ELISA (Σχήμα 4Α). Από την άλλη πλευρά, κιγλιταζόνη, η οποία δεν επάγουν απόπτωση σε κύτταρα RT4, δεν εγείρει TRAIL σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων, καθώς και στην επιφάνεια του κυττάρου και σε ρυθμισμένα μέσα (Σχήμα 4Β). Εμείς πιστεύουμε ότι έτσι θα μπορούσε να προκαλέσει ciglitzone απόπτωση των υψηλού βαθμού καρκίνο Τ24 κυττάρων κύστης με την αύξηση της έκφρασης TRAIL.

RT4 και T24 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με σιγλιταζόνη στα 40 και /ή 60 μΜ. Σε κύτταρα RT4 (Α) και Τ24 (Β), προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν για έκφραση TRAIL με ανάλυση στυπώματος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-TRAIL-ΡΕ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μετά τη θεραπεία κιγλιταζόνη 40 μΜ για 24 ώρες, ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση του TRAIL μετρήθηκε με ELISA. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τετραπλούν. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά unpaired Student. (C) Οι κυτταρικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κύτταρα Τ24 και υποβλήθηκε σε ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση των DR4 και DR5. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (D) κύτταρα Τ24 εκτέθηκαν σε 40 μΜ σιγλιταζόνη για 12 ώρες, χρωματίστηκαν με αντι-DR4-ΡΕ ή αντι-DR5-ΡΕ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Ε) κύτταρα Τ24 προεπωάστηκαν με ή χωρίς μονοκλωνικά αντισώματα αποκλεισμού DR4 και οι υποδοχείς DR5 (5 mg /ml) για 1 ώρα και διεγέρθηκαν για 12 ώρες με 40 μΜ σιγλιταζόνη ή 50 ng /ml TRAIL για κύτταρα RT4 (

ένθετο

). Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA (κορυφή υπο-G1) αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? **

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές σε σχέση με κιγλιταζόνη-επεξεργασμένα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά αταίριαστο Μαθητή

Η

Η ciglitazone έκανε δεν επηρεάζουν την έκφραση DR4 και DR5 σε κύτταρα Τ24

στα κύτταρα Τ24, δείξαμε μια διάσπαση της κασπάσης 8 και την αύξηση του TRAIL από σιγλιταζόνη. Για να αναλυθεί αν κιγλιταζόνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο εξαρτάται από την τροποποίηση της έκφρασης του υποδοχέα θανάτου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 ή 60 μΜ φαρμάκου επί 24 ώρες. Έχουμε αποδείξει ότι σιγλιταζόνη δεν τροποποίησε επίπεδο έκφρασης DR4 και DR5 όπως αξιολογήθηκε σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από την Western-blotting (Σχήμα 4C) καθώς επίσης και η έκφραση κυτταρικής επιφάνειας τους, όπως αποδεικνύεται από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με ειδικά αντισώματα ΡΕ-συζευγμένο (Εικόνα 4D). Για να διερευνηθεί αν κιγλιταζόνη-ενεργοποιείται απόπτωσης ήταν συνάρτηση του υποδοχέα θανάτου ενίσχυσης σηματοδότησης, DR4 και DR5 διέγερση αποκλείστηκε με προ-επώαση των κυττάρων με αντι-μπλοκαρίσματος DR4 ή αντισώματα αντι-DR5 πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Η αδρανοποίηση των δύο DR4 και DR5 μείωσε σημαντικά την κιγλιταζόνη-προωθείται απόπτωση (Σχήμα 4Ε). Για την επικύρωση της αποτελεσματικότητας αντισωμάτων αποκλεισμού στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται υποδοχέα θανάτου, εκθέσαμε TRAIL-ευαίσθητα κύτταρα RT4 στην TRAIL ως ένας θετικός έλεγχος (Σχήμα 4Ε, ένθετο). Όπως ήταν αναμενόμενο, αδρανοποιώντας κάθε ένα από τους υποδοχείς παρεμπόδισε πλήρως TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα εμφανίζουν ότι σιγλιταζόνη ενεργοποιεί την εξωγενή αποπτωτικό μονοπάτι μέσω DR4 και DR5.

Η ciglitazone αναστέλλει κύστη ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου σε γυμνούς ποντικούς

Για να διερευνηθεί η αντικαρκινική δράση του σιγλιταζόνη

in vivo

(Σχήμα 5), Τ24 και RT4 κύτταρα καθώς και εγχύθηκαν υποδορίως σε 6 εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών. Όταν σχηματίστηκαν ψηλαφητών όγκων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή σιγλιταζόνη (15 mg /kg) με ρυθμό μία ένεση την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα έως ότου θυσιάστηκαν τα ποντίκια. Η συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 100% σε όλα τα ζώα. Ο όγκος των όγκων σε T24 κύτταρα-εμβολιασμένου ποντίκια δεν αυξήθηκαν σε ζώα κιγλιταζόνη αγωγή σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. Υπήρχε μια σημαντική διαφορά από την τρίτη ένεση σιγλιταζόνη (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 5Α, αριστερό πάνελ). Σε RT4 ποντίκια κύτταρα εμφυτευμένες, ο όγκος του όγκου φάνηκε να αναπτυχθεί λιγότερο σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου κατά την κατεργασία σιγλιταζόνη αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (Σχήμα 5Α, δεξιό πλαίσιο). Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της ανάπτυξης όγκου από σιγλιταζόνη οφείλεται στην αναστολή του πολλαπλασιασμού, απόπτωση, ή και τα δύο, αξιολογήσαμε έκφραση Κί67 και κασπάσης ενεργοποίηση 3 σε τομές ιστών όγκου με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Ο αριθμός των Κί67-θετικών κυττάρων ήταν χαμηλότερη σε Τ24 και RT4 κύτταρα-ξενομόσχευμα τομές όγκου από ζώα που κιγλιταζόνη σε σύγκριση με το τομές όγκου από ζώα χωρίς αγωγή. Αντιθέτως, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη ενεργοποιείται κασπάσης 3 σε RT4 τομές όγκων κυττάρων-ξενομόσχευμα και μια ισχυρή ενεργοποιημένη χρώση κασπάσης 3 σε T24 κύτταρα-ξενομόσχευμα τομές όγκου από ζώα που υπέστησαν αγωγή σε σύγκριση με σιγλιταζόνη τομές όγκου από ζώα άνευ αγωγής (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν, για πρώτη φορά, εξ όσων γνωρίζουμε, ότι η σημαντική μείωση του όγκου του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που έλαβαν κιγλιταζόνη (ξενομόσχευμα με καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 κύτταρα) απαιτεί την αναστολή του πολλαπλασιασμού καθώς και την επαγωγή απόπτωσης.

Ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως με εκθετικά αυξανόμενη Τ24 και RT4 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα). Όταν το μέγεθος του όγκου έφθασε 40 mm

3 σε όγκο, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και αγωγής (η = 10). Ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις σιγλιταζόνη είχαν εβδομαδιαία χορηγείται σε μια δόση των 15 mg /kg κατά τη διάρκεια τριών εβδομάδων. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν μόνο αλατούχο όχημα μετά πανομοιότυπο πρόγραμμα. καμπύλες όγκου (Α) Η ανάπτυξη προσδιορίστηκαν με μέτρηση του όγκου του όγκου. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ζώα με τη χρήση αμφίδρομης δοκιμή ANOVA (αξιολόγηση της ανάπτυξης όγκου του όγκου συναρτήσει του χρόνου)? **

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές μεταξύ ελέγχου και ποντίκια με αγωγή σε κάθε χρόνο μετά το μόσχευμα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά unpaired Student. (Β) Η ανοσοϊστοχημική χρώση των αντιπροσωπευτικών τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη όγκων από μη επεξεργασμένα ή κιγλιταζόνη αγωγή ποντικούς. Οι τομές σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για Ki-67 και την ενεργό κασπάση 3. Κάθε πίνακας είναι αντιπροσωπευτική 5 τμημάτων για κάθε μία από δέκα όγκους από τους ποντικούς ελέγχου και κιγλιταζόνη αγωγή. Αρχική μεγέθυνση, × 20.

Η

Η ciglitazone και TRAIL συνδυασμένη θεραπεία προκαλεί συνεργιστική απόπτωση μέσω των υποδοχέων θανάτου μονοπάτι, η ενεργοποίηση της κασπάσης και Προσφοράς σηματοδότησης διάσπαση

Τα κύτταρα Τ24 είναι γνωστό ότι είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στο TRAIL μετά από έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του εξωγενούς διαλυτού ανασυνδυασμένου ανθρώπινου TRAIL που κυμαίνονται από 10 έως 200 ng /ml [25]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η κιγλιταζόνη up-ρυθμίζει την έκφραση TRAIL, εμείς υποτεθεί ότι σιγλιταζόνη σκοτώνει τα κύτταρα Τ24 αποκαθιστώντας την ευαισθησία τους σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Για την επικύρωση αυτή η υπόθεση, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 40 μΜ σιγλιταζόνη για 24 ώρες ή 50 ng /ml ανασυνδυασμένου TRAIL για τα τελευταία 12 ώρες μόνα τους ή σε συνδυασμό. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, έχουμε επίσης έδειξε ότι τα κύτταρα Τ24 ήταν ανθεκτικοί στην TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Ακόμη πιο ενδιαφέρον, υπήρξε μια σημαντική αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε σιγλιταζόνη και κυττάρων TRAIL-συν-επεξεργάζονται σε σύγκριση με κιγλιταζόνη κύτταρα μόνο φάρμακο (Σχήμα 6Α, άνω). Το TRAIL-ευαισθητοποίηση δράση των κιγλιταζόνη οδήγησε σε προ-κασπάσης 8 και 3 επεξεργασία και PARP πρωτεόλυση, αλλά συμμετέχουν επίσης το βρόχο ενίσχυσης μιτοχόνδρια όπως υποδεικνύεται από κασπάσης 9 και διάσπαση Προσφοράς (Σχήμα 6Α, κάτω). Με την παρουσία της κασπάσης 8 (Ζ-IETD-FMK) ή κασπάση 9 (Ζ-LEHD-FMK) ειδικοί αναστολείς, παρατηρήσαμε μια αναστολή είτε κασπάσης 8 ή κασπάση 9 επεξεργασίας και την απουσία διάσπασης Bid, καθώς, με σιγλιταζόνη και TRAIL συν-επεξεργάζονται κύτταρα (Σχήμα 6Β, κάτω). Αυτό συσχετίστηκε με μείωση του κυτταρικού θανάτου με την παρουσία αναστολέων κασπάσης, όπως αποδεικνύεται από τη σημαντική μείωση του DNA κατακερματισμού (Σχήμα 6Β, κορυφή). Για να επιβεβαιωθεί η συμμετοχή της ενεργοποίησης υποδοχέα θανάτου, DR4 και DR5 διέγερση ανεστάλη από την προ-επώαση των κυττάρων με αντι-μπλοκαρίσματος DR4 ή αντισώματα αντι-DR5 πριν από τη θεραπεία (Σχήμα 6C). Αδρανοποίηση κάθε ένα από τους υποδοχείς κατά την TRAIL και κιγλιταζόνη ταυτόχρονης θεραπείας μπλοκάρει αποτελεσματικά τον κυτταρικό θάνατο που επιβεβαιώνει ότι η απόπτωση με τη μεσολάβηση ειδικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ TRAIL και των υποδοχέων του.

κύτταρα Τ24 υπέστησαν κατεργασία ή όχι με 40 μΜ σιγλιταζόνη για 24 ώρες ή ανθρώπινο ανασυνδυασμένο TRAIL (50 ng /ml) για 12 ώρες ή συν-επεξεργάζονται με σιγλιταζόνη και TRAIL (που προστίθεται εδώ για τις τελευταίες 12 ώρες). (Α,

κορυφή

) Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA (κορυφή υπο-G1) αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? **

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σχέση με την ατομική μεταχείριση εκτεθειμένα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά αταίριαστο Μαθητή? (Α,

κάτω

) ανίχνευση Ανοσοκηλίδωση των κασπασών 8, 9 και 3, PARP και προσφοράς. (Β) Κύτταρα προεπωάστηκαν 1 ώρα με 50 μΜ κασπάσης 8 (Ζ-IETD-FMK) ή 9 (Ζ-LEHD-FMK) ειδικός αναστολέας πριν ενδείκνυται η θεραπεία?

κορυφή

, το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής?

κάτω

, κασπασών 8, 9, 3 και διάσπαση Προσφοράς αναλύθηκε από δυτικές-κηλίδωση ανάλυση. (C) Τα κύτταρα προεπωάστηκαν με ή χωρίς μονοκλωνικά αντισώματα αποκλεισμού DR4 και DR5 υποδοχείς για 1 ώρα και διεγείρονται όπως υποδεικνύεται. Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. ανίχνευση (D) Ανοσοκηλίδωση των c-FLIP και survivin από Τ24 ολόκληρο κυτταρολύματα. (Ε) Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 25 μΜ αναστολέα πρωτεασώματος MG132 για 30 λεπτά και διεγείρονται με 40 μΜ σιγλιταζόνη για 12 ώρες?

κορυφή

, το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής?

κάτω

, ανοσοαποτύπωση ανίχνευση των γ-FLIP και survivin. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (B, C, E) Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? **

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές σε σχέση με κιγλιταζόνη και TRAIL συν-επεξεργάζονται τα κύτταρα με τη χρήση του

t

δοκιμασία δύο-ουρά αταίριαστο Μαθητή

Η

κιγλιταζόνη ρυθμίζει προς τα κάτω c-FLIP και survivin μέσω πρωτεασώματος που εξαρτάται από την υποβάθμιση

Ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση της κιγλιταζόνη και τη σύνδεση των κιγλιταζόνη με TRAIL στην έκφραση των αναστολέων της απόπτωσης όπως survivin και c-FLIP είναι γνωστό ότι να εμπλέκεται στη ρύθμιση και των δύο ενδογενών και εξωγενών αποπτωτικά μονοπάτια. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 6D, κιγλιταζόνη, ως μεμονωμένα θεραπεία ή σε συνδυασμό με TRAIL, μειωμένη τόσο c-FLIP επίπεδα

S και πρωτεΐνη survivin στον ίδιο βαθμό και δραματικά ρυθμισμένα προς τα κάτω c-FLIP

L. Αντιθέτως, TRAIL μονή αγωγή δεν επηρέασε σημαντικά c-FLIP επίπεδα και πρωτεΐνη survivin. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κάτω ρύθμιση της c-FLIP και survivin πιθανόν συμβάλλει στην κιγλιταζόνη ενεργοποιούνται απόπτωση και να κιγλιταζόνη μεσολάβηση ευαισθητοποίηση για TRAIL επαγόμενη απόπτωση.

Ο Ουβικουιτίνη-πρωτεασώματος παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [26]. Αρκετές αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως c-FLIP και survivin αντιπροσωπεύουν εξέχοντα στόχους του πρωτεασώματος. Για να προσδιοριστεί αν η κιγλιταζόνη επαγόμενη μειορύθμιση αρνητικών ρυθμιστών όπως απόπτωση προκαλείται μέσω αυτής της διαδικασίας, ερευνήσαμε την επίδραση του MG132 πρωτεοσωμικού αναστολέα. MG132 αποκατέστησε τα επίπεδα της survivin και c-FLIP (Σχήμα 6Ε, κάτω) δείχνει ότι τα κάτω ρύθμιση δύο αναστολείς απόπτωσης ήταν πρωτεασώματος εξαρτώμενη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Ε (κορυφή) στο επίπεδο του πληθυσμού των κυττάρων υπο-G1 σε συν-επεξεργάζονται κύτταρα μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του MG132. Έτσι, η ανάκαμψη του c-FLIP και survivin, αυτό το σημαντικά εξασθενημένη κιγλιταζόνη και TRAIL συνδυασμό επαγόμενη απόπτωση, όφειλε αλλά δεν αρκεί για να ξεπεραστεί ταυτόχρονης θεραπείας-προωθείται απόπτωση σε κύτταρα Τ24.

Συζήτηση

η παρούσα έκθεση έδειξε ότι η προκαλούμενη κιγλιταζόνη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μέσω του ελέγχου πορεία του κυτταρικού κύκλου ή την επαγωγή της απόπτωσης, ανάλογα με το βαθμό του όγκου της ουροδόχου κύστης που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης. Αποπτωτικά αποτελέσματα εμφανίστηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις (40-60 μΜ), ανεξάρτητα από την ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ όπως έχει ήδη αναφερθεί σε άλλα κυτταρικά μοντέλα [27]. Έχουν προταθεί αρκετές δυνητικές PPARγ-ενεργοποίηση ανεξάρτητους μηχανισμούς που μπορεί να διεγείρει απόπτωση. Περιλαμβάνουν την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου [28], της επαγωγής κυτταρικής οξέωσης [29], η συμμετοχή της ανταπόκρισης-1 πρώιμης ανάπτυξης και NSAID ενεργοποιούμενη-γονίδιο 1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου [30].

Για Για πρώτη φορά στην κακοήθη ουροθηλιακά κύτταρα, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι προκαλείται από κιγλιταζόνη G2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης και τις αλλαγές στην ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου.