Abstract

Τα υπεραντιγόνα (βυθίσεις) είναι μικροβιακές τοξίνες που υποδοχείς Τ κυττάρων διασταυρούμενη σύνδεση με κύρια κατηγορία ιστοσυμβατότητας II (ΜΗΟΙΙ) μόρια που οδηγούν στην ενεργοποίηση των μεγάλων αριθμών Τ κυττάρων. Εδώ, περιγράφουμε την ανάπτυξη και προκλινικές δοκιμές ενός νέου όγκου με στόχευση SAg (TTS) θεραπευτική κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την στρεπτοκοκκική πυρετογόνος εξωτοξίνη C (SPEC) κρεμάει και στόχευση καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν το 5Τ4 σχετιζόμενο με τον όγκο αντιγόνο (ΤΑΑ). Για την αναστολή δυνητικά επιβλαβείς διαδεδομένη ενεργοποίηση ανοσοκυττάρων, μια μετάλλαξη spec εντός της υψηλής συγγένειας διεπαφή δέσμευσης ΜΗΟΙΙ δημιουργήθηκε (SPEC

D203A) που έδειξε μια έντονη μείωση στην μιτογόνο δραστικότητα, αλλά αυτό μεταλλαγμένο θα μπορούσε ακόμη να επάγει ανοσολογική μεσολάβηση κυττάρων θάνατο των καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Για να στοχεύσετε 5Τ4

+ καρκινικά κύτταρα, θα κατασκευαστεί μια εξανθρωπισμένη μεταβλητή θραύσμα (scFv) μονής αλυσίδας αντίσωμα να αναγνωρίζει 5Τ4 (scFv5T4). Ειδική στόχευση scFv5T4 επαληθεύτηκε. SPEC

D203A συγχωνευμένο με scFv5T4 διατήρησε την ικανότητα να ενεργοποιεί και να επάγουν ανοσολογική μεσολάβηση κυττάρων κυτταροτοξικότητα του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καθιερωμένων ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, αποδείξαμε ότι το spec που βασίζεται TTS ήταν σε θέση να ελέγχουν την ανάπτυξη και την εξάπλωση των μεγάλων όγκων

in vivo

. Αυτό που απαιτείται τόσο στόχευση από scFv5T4 και λειτουργική δραστηριότητα SAg ΤΑΑ. Οι μελέτες αυτές θέτουν τα θεμέλια για την ανάπτυξη της στρεπτοκοκκικής κρεμά ως «επόμενης γενιάς», τα TTS για ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Patterson KG, Dixon Pittaro JL, Bastedo PS, Hess DA, Haeryfar SMM, McCormick JK (2014 ) Έλεγχος της Ιδρύθηκε καρκίνου του παχέος εντέρου Ξενομοσχεύματα χρησιμοποιώντας μια πρωτεΐνη Μυθιστόρημα Ανθρωποποιημένα ενιαία αλυσίδα αντισώματος-στρεπτοκοκκικής υπεραντιγόνου Fusion Στόχευση του 5Τ4 ογκοεμβρυϊκά αντιγόνου. PLoS ONE 9 (4): e95200. doi: 10.1371 /journal.pone.0095200

Συντάκτης: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus Μετσόβιο Πολυτεχνείο-Δρέσδη, Γερμανία

Ελήφθη: 3, Φεβρουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 25, Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 15, Απριλίου του 2014

Copyright: © 2014 Patterson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR) επιδότηση λειτουργίας για JKM (MOP-64176). SMMH κατέχει ο Καναδάς Έρευνας Έδρα Viral Ασυλία και Παθογένεια και JKM ήταν ο αποδέκτης ενός βραβείου Νέα ανακριτής από τον CIHR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα υπεραντιγόνα (βυθίσεις) είναι μικροβιακές τοξίνες που λειτουργούν ως ισχυροί ενεργοποιητές των κυττάρων Τ και είναι μεσολαβητές του συνδρόμου τοξικού σοκ [1]. Αυτά τα μόρια λειτουργούν μέσω σύνδεσης σε πλευρικές επιφάνειες των μεγάλων ιστοσυμβατότητας τάξης II μόρια (MHC-II) [2] – [5], ενώ ταυτόχρονα εμπλέκεται περιοχές βλαστικής σειράς κωδικοποιημένων εντός της μεταβλητής περιοχής του υποδοχέα Τ κυττάρου (TCR) β-αλυσίδας ( νβ) [6] – [9]. Δεδομένου ότι υπάρχουν περίπου 50 λειτουργικά γονίδια νβ στον άνθρωπο [10], [11], και επειδή διαφορετικά κρεμά μπορεί συχνά στοχεύουν πολλαπλούς νβ [12], οι τοξίνες αυτές διεγείρουν ένα πολύ μεγάλο ποσοστό των εκτιθέμενων κυττάρων Τ που οδηγεί στην επακόλουθη απελευθέρωση προ- φλεγμονώδεις κυτοκίνες (π.χ. IL-2, ΙΡΝ-γ, και ΤΝΡ-α) [1]. Παρά το γεγονός ότι κρεμά δεν εμπλέκονται μόρια MHC Ι, οι τοξίνες αυτές ενεργοποιούν τόσο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα [13], και αυτό μπορεί στη συνέχεια να οδηγήσει σε ενεργοποίηση των παρευρισκομένων των βοηθητικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ΝΚ [14]. Σε ειδικές περιπτώσεις, κρέμασμα μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει αντισυμβατικό υποσύνολα Τ κυττάρων, όπως αμετάβλητα φυσικοί φονείς Τ (

i

ΝΚΤ) κύτταρα [15] και γδ Τ κύτταρα [16].

Ο τελικός στόχος της ανοσοθεραπεία του καρκίνου είναι να αξιοποιήσει το ανοσοποιητικό μεσολάβηση μηχανισμών να στοχεύει ειδικά και την εξάλειψη καρκινικών κυττάρων. Υπήρξαν σημαντικές προσπάθειες για το σχεδιασμό ανοσοτοξίνες SAg που βασίζεται, επίσης γνωστή ως υπεραντιγόνα όγκου με στόχευση (TTS), για να τεχνητά «δύναμη» τα Τ κύτταρα να αναγνωρίζουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκο (ΤΑΑ) σε ένα μη-HLA-περιορισμένο τρόπο. Οι αρχικές TTS αντιπροσώπευε την σύντηξη ενός θραύσματος αντισώματος ποντικού (Fab) στόχευση ενός παχέος αντιγόνο καρκίνου, προς την άγριου τύπου σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Α (SEA) SAg. Σε αυτή την πρωτοποριακή εργασία, ο Fab :: SEA TTS κατέδειξαν σημαντική μείωση του φορτίου του όγκου και της θνησιμότητας χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μετάστασης Β16 ποντικού [17]. Μεταγενέστερες μελέτες που χρησιμοποιούνται τη σύντηξη ενός Fab ποντικού για τη στόχευση του 5Τ4 ογκοεμβρυϊκό αντιγόνο με μια μεταλλαγμένη εκδοχή του SEA (με στόχο τη μείωση δέσμευσης MHC-II) και αυτό είχε ως αποτέλεσμα μείωση -95% της μάζας του όγκου σε ένα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ( NSCLC) μοντέλο [18]. Επιπλέον, θεραπείες συνδυασμού με τα TTS έχουν επίσης δείξει υπόσχεση σε προκλινικά μοντέλα σε συνδυασμό με θεραπείες κυτοκίνης (π.χ. IFN-α) [19] και αποκλεισμό των CTLA-4 [20]. Αυτές και άλλες μελέτες κατέδειξαν σαφώς το δυναμικό της τα TTS για ανοσοθεραπεία καρκίνου. Παρ ‘όλα αυτά, οι τα TTS μέχρι σήμερα έχουν κατασκευαστεί με τη χρήση αποκλειστικά των μελών της κατηγορίας SE της χαλάρωσης, και SE που είναι επίσης παράγοντες της σταφυλοκοκκική τροφική ασθένεια, μια δραστηριότητα που πιστεύεται ότι είναι ανεξάρτητη από την ικανότητα να ενεργοποιούν τα Τ κύτταρα [21]. Αν και διαχειρίσιμο, ορισμένες από τις ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν σε TTS Φάσης Ι και Φάσης ΙΙ των κλινικών δοκιμών που περιλαμβάνονται ναυτία, έμετος και διάρροια [22] – [24], και μπορεί να έχουν σχέση με τις εμετικές ιδιότητες του θαλασσινού [25]. Επιπλέον, πολλοί ασθενείς είχαν προϋπάρχουσες αντισώματα προς SEA που απαιτείται εξατομικευμένη δοσολογία TTS [26]. Προκειμένου να μειωθεί η αντιγονικότητα του θεραπευτικού TTS, αντι-5Τ4 Fab συνδέεται με ένα γενετικά SEA /SEE σύντηξης (που ονομάζεται Naptumomab estafenatox? ABR-217620) [27]. Αυτή η τελευταία θεραπευτική TTS έχει υποστεί μια φάση Ι κλινική δοκιμή ως μονοθεραπεία σε ασθενείς με προχωρημένο NSCLC, καρκίνο του παγκρέατος και του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων (RCC), και ως συνδυαστική θεραπεία με docetaxel σε ασθενείς με NSCLC, αποδεικνύοντας ότι ABR-217620 ήταν καλά ανεκτό με κάποια απόδειξη της δραστικότητας κατά του όγκου [24]. Πρόωρη πληροφορίες από μια ολοκληρώθηκε πρόσφατα Φάσης ΙΙ /ΙΙΙ μελέτη με ABR-217620 σε ασθενείς με RCC σύγκριση ABR-217620 και ιντερφερόνη-α, με ιντερφερόνη-α μόνο, δεν έφτασε στο πρωτεύον καταληκτικό σημείο της συνολικής επιβίωσης? Ωστόσο, φαίνεται ότι πολλοί ασθενείς είχαν υψηλότερο από ό, τι αναμενόταν αρχικά επίπεδα των αντι-SEA /SEE αντισώματα, τα οποία μπορεί να έχουν συμβάλει σε αναντίστοιχο θεραπεία [28].

Η βακτηριακή γονιδιωματικής αλληλουχίας προσπάθειες κατά την τελευταία δεκαετία έχουν πλέον αποκαλυφθεί μια εκτεταμένη «οικογένεια» της χαλάρωσης οικοτοξίνες τόσο

Staphylococcus aureus

και

Streptococcus pyogenes

. Ένα γενικό χαρακτηριστικό αυτών των τοξινών είναι ότι γενετικά διακριτή κρεμά είναι επίσης αντιγονικά διακριτές και, επιπλέον, διακριτή κρεμά και τυπικά εμφανίζει μοναδικά προφίλ ενεργοποίηση νβ [12]. Έτσι,

S. aureus

και

S. pyogenes

παρείχαν μια αφθονία μιτογόνων Τ κυττάρων που θα μπορούσαν ενδεχομένως να κατασκευαστεί ως τα TTS για θεραπεία του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία, επιδιώξαμε να επεκτείνει το ρεπερτόριο της τα TTS να συμπεριλάβει το πρώτο στρεπτοκοκκική SAg χρησιμοποιώντας στρεπτοκοκκική πυρετογόνος εξωτοξίνη C (SPEC), όπως το πρωτότυπο. Ένα πιθανό πλεονέκτημα της μηχανικής μια στρεπτοκοκκική κρεμούν καθώς ένα TTS είναι ότι αυτές οι τοξίνες δεν έχουν καλόπιστους εμετική δραστηριότητα [29], η οποία μπορεί να οδηγήσει σε λιγότερες παρενέργειες. Επίσης, Spec είναι πολύ καλά μελετηθεί από την άποψη τόσο δομής [4], [30], [31] και η λειτουργία [9], [32] – [35] για την εμπλοκή των υποδοχέων ξενιστή, παρέχοντας μια πλατφόρμα για την προσαρμογή δραστηριότητα. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι spec μεταλλάχθηκαν κατά την εξαρτώμενη από ψευδάργυρο, πεδίο σύνδεσης υψηλής συγγένειας MHC-II (SPEC

D203A) μείωσε σούπερ-αντιγονικότητας ενώ διατηρούν ογκοκτόνο ιδιότητες. Έχουμε δημιουργήσει μια spec

πρωτεΐνη σύντηξης TTS D203A με βάση τη χρήση ενός μηχανικής ανθρώπινου scFv που στοχεύει ειδικά την ανθρώπινη 5Τ4 (scFv5T4). Σε ένα εξανθρωπισμένο μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου, έχουμε αποδείξει ότι η scFv5T4 :: spec

D203A TTS ελέγχει την ανάπτυξη και μεταστατικό δυναμικό ενός καθιερωμένου όγκου καρκίνου του παχέος εντέρου, και ότι αυτή η δραστηριότητα κατά των όγκων απαιτεί τόσο ειδική στόχευση από το ήμισυ scFv5T4 , καθώς και η λειτουργία κρεμά.

Υλικά και Μέθοδοι

καταστάσεων Δεοντολογίας

τα πειράματα χρησιμοποιώντας πρωτογενή ανθρώπινα λεμφοκύτταρα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου Δυτικής για Επιστημών Υγείας Έρευνας συμμετοχή ανθρώπινα υποκείμενα. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους αιμοδότες. Όλα τα πειράματα σε ζώα ήταν σύμφωνα με το Καναδικό Συμβούλιο του Οδηγού Φροντίδας Ζώων για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματοζώων, και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την χρήση υποεπιτροπή των ζώων στο Western University (Λονδίνο, Οντάριο).

Αντισώματα και βαφές

χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα και βαφές: ΡΕ αντι-ανθρώπινο CD4 (κλώνος RPA-Τ4? BD Pharmingen)? AlexaFluor700 αντι-ανθρώπινου CD8 (κλώνος RPA-T8? BD Pharmingen)? APC αντι-ανθρώπινο CD3 (Κλώνος UCHT1? BD Pharmingen)? CellTrace CFSE (καρβοξυφλουορεσκίνη διοξική? Molecular Probes)? 7-AAD (7-αμινοακτινομυκίνης D? Molecular Probes)? αντι-ανθρώπινο 5Τ4 (ab88091? Abcam)? IgG2b ισοτύπου (eBioscience)? FITC αντι-ποντικού IgG (eBioscience)? strepativdin-IRDye800 (Rockland Immunochemicals)? στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ (Rockland Immunochemicals).

Τα βακτηριακά στελέχη

Escherichia coli

XL1-Blue (Stratagene) ή ϋΗ5α (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκαν για σκοπούς κλωνοποίησης και

ΜΙ. coli

BL21 (DE3) (Novagen) χρησιμοποιήθηκε ως ο ξενιστής έκφρασης πρωτεΐνης.

Ε. coli

στελέχη αναπτύχθηκαν αεροβίως στους 37 ° C σε ζωμό Luria (LB) που περιέχει καναμυκίνη (50 μg /ml), αμπικιλλίνη (200 μg /ml) ή χλωραμφαινικόλη (10 μg /ml) για να διατηρηθεί πλασμίδια.

κλωνοποίηση διαδικασίες

κατασκευάσματα πλασμιδίου είτε δημοσιευθεί προηγουμένως [34], [35] ή παράγονται με τυποποιημένες τεχνικές κλωνοποίησης [36], είτε σε ρΕΤ-41α (Novagen) ή ρΕΤ-32α (Novagen) και συνοψίζονται στον πίνακα S1. Όλα πλασμίδιο ένθετα αλληλουχήθηκαν στο Sequencing Facility Robarts Research Institute (London, Ontario, Canada). Πρωτεΐνη κλώνοι έκφρασης σε pET-32a ή ρΕΤ-41α μεταβλήθηκαν έτσι ώστε η θέση διάσπασης εντεροκινάσης (DDDDK ↓ X) αντικαταστάθηκε με έναν ιό Tobacco Etch (TEV) θέση διάσπασης πρωτεάσης (ENLYFQ ↓ S). φορείς επιμόλυνση pCMV6-XL5, pCMV6-XL5 :: 5Τ4 και ρΕΟΡΡ-Ν1 αγοράστηκαν από ΟηΟεηε Technologies, και Clonetech Laboratories, αντίστοιχα. Όλα τα άλλα πλασμίδια διαμόλυνση δημιουργήθηκαν με τυποποιημένες τεχνικές κλωνοποίησης. Το μυϊκό scFv5T4 cDNA [37] είχε κωδικοποιηθεί εκ νέου και στη συνέχεια κατασκευάζεται από GenScript Inc. να δημιουργήσει μια εξανθρωπισμένη ακολουθία. Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων έγιναν στην αλληλουχία ραχοκοκαλιά scFv5T4 από την αρχική αλληλουχία scFv ποντικού, που προσδιορίζεται από την ευθυγράμμιση με μία ανθρώπινη συναινετική αλληλουχία. Η CDR βρόχοι ειδικό για 5Τ4 [37], και οι άμεσες αμινοξέα που πλευρίζουν τις προβλεπόμενες θηλιές δεν μεταβλήθηκαν για να διατηρήσει την ειδικότητα των αντισωμάτων.

Η έκφραση πρωτεΐνης

Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παράχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα

ΜΙ. coli

σύστημα BL21 (DE3) έκφρασης που περιέχει το πλασμίδιο pBirACm. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αερόβια κατάσταση στους 37 ° C σε μέσο LB σε OD

600 = 0.5 και η έκφραση πρωτεΐνης επάγεται όλη τη νύκτα (18-24 ώρες) σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με 0,2 mM ισοπροπυλ-ϋ-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG? BioBasic Inc .) και βιοτινυλιωμένο με την προσθήκη 50 μΜ D-βιοτίνη (BioBasic Inc.). Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στους 4 ° C και επαναιωρήθηκαν σε κρύο 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 200 mM NaCl που περιέχει 0,25 mg /ml λυσοζύμη (Sigma-Aldrich) και 0,02 mg /ml ϋΝάσης Ι (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα επωάστηκαν επί πάγου για 1 ώρα πριν από την λύση με μία συνεχή κυτταρική ροή κεφαλή διαταράκτης (Constant Systems Ltd.) σε 25 psi, που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους με έξοδο 4, 1 παλμό /ml. Τα κυτταρικά υπολείμματα δισκιοποιούνται σε 4 ° C στα 10.000 χ g. Τα υπερκείμενα εφαρμόστηκαν σε μια φορτισμένη στήλη Νί-ΝΤΑ συγγένειας (Novagen) και αυξανόμενη συγκέντρωση ιμιδαζολίου χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση της καθορισθείσης πρωτεΐνης. Τα καθαρισμένα κλάσματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 3 χ 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 200 mM ρυθμιστικού διαλύματος NaCl και των Ν-τερματικών ετικέτες διασπάστηκαν με autoinactivation ανθεκτικά His

7 :: ΤΕν [38], όπως περιγράφεται [39]. Διασπασμένη πρωτεΐνες εφαρμόστηκαν και εκλούστηκαν από μία δεύτερη στήλη συγγενείας Νϊ-ΝΤΑ για την απομάκρυνση της πρωτεάσης ΤΕν και να αποκτήσουν μια καθαρή πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 3 χ 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 200 mM NaCl ρυθμιστικού ή 0,9% NaCl (αλατούχο διάλυμα) και αξιολογήθηκαν για ομοιογένεια με SDS-PAGE και ποσοτικοποιούνται (BCA Protein Assay, Pierce).

οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές (ΗΤ-29 και WiDr) καλλιεργήθηκαν σε πλήρες του Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM? Gibco) και ΗΕΚ293 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες Minimum Essential Media (cMEM? Gibco). Όλα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Sigma-Aldrich), 10 mM HEPES, ρΗ 7,4 (Gibco), 2 mM Ε-γλουταμίνη (Gibco), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Gibco), 100 μΜ μη απαραίτητα αμινοξέα (Gibco), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco) και 100 U /ml πενικιλίνη (Gibco).

scFv5T4 προσδιορισμούς εξειδίκευσης

ΗΕΚ293 κύτταρα (1 χ 10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων (Corning) με 500 μλ cMEM και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα (24 ώρες) στους 37 ° C με 5% CO

2. σύμπλοκα Liposome:DNA σχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (Invitrogen) και το πλασμίδιο DNA της επιλογής σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σύμπλοκα σχηματίστηκαν σε cMEM χωρίς FBS ή αντιβιοτικά. Η επιμόλυνση των κυττάρων έλαβε χώρα στο ίδιο μέσο για 4 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2, μετά από το οποίο αφαιρέθηκε το μέσο και αντικαθίσταται με cMEM για πλασμίδιο έκφρασης πάνω από 24 ώρες. Μόλις εκφραστούν, scFv5T4 :: mRFP1 (1:100? 2 mg /ml) επωάστηκε με τα κύτταρα για 1 ώρα σε RT και στη συνέχεια πλένονται και εξετάζονται με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού της Olympus IX71. Εναλλακτικά, επιμολυσμένα ΗΕΚ293 κύτταρα (όπως ανωτέρω) ή ΗΤ-29 κύτταρα (1,0 χ 10

6) επωάστηκαν για 1 ώρα με mAb5T4 (1:200) ή scFv5T4-βιοτίνη (1:100? 2 mg /ml), που ακολουθείται από αντι-ποντικού IgG-FITC (1:1000) ή στρεπταβιδίνης-ΡΙΤΟ (1:1000), αντιστοίχως, για 1 ώρα στους 4 ° C και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού ή FACS (BD FACSCanto II), αντίστοιχα. εικόνες Μικροσκοπία πάρθηκαν χρησιμοποιώντας ImagePro Plus Λογισμικό και ανάλυση FACS ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας FlowJo Λογισμικού.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) παρασκευάστηκαν από το ολικό αίμα υγιών δοτών και απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση πυκνότητας σε Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences). Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) με 10% FBS και συμπληρωμένο όπως παραπάνω (cRPMI). Όλα τα κύτταρα καλλιέργειας ιστού διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Ανθρώπινα PBMCs σημάνθηκαν με CellTrace CFSE (Molecular Probes) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα (0.8 × 10

6 – 1,0 × 10

6) καλλιεργήθηκαν σε cRPMI περιέχει 2 μg /ml Πολυμυξίνη Β (ICN Biomedicals Inc.) και έλαβαν θεραπεία είτε με άγριου τύπου SPEC (SPEC

WT) ή παραλλαγές sPEC

Y15A, sPEC

D203A ή spec

Y15A /D203A (1 μg /ml) και επωάζονται για 5 ημέρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-ανθρώπινο CD3 (1:200), αντι-ανθρώπινο CD4 (1:200) και αντι-ανθρώπινο CD8 (1:200) αντισωμάτων για 30 λεπτά επί πάγου και αναλύθηκαν με FACS (BD Canto II ), χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo. Για ραδιενεργό δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, ανθρώπινα PBMCs (2,0 × 10

5) καλλιεργήθηκαν σε cRPMI περιέχει 2 μg /ml Πολυμυξίνη Β (ICN Biomedicals Inc.) με τιτλοδότηση spec παραλλαγές, scFv5T4, scFv5T4 :: SPEC

D203A ή scFv5T4 :: sPEC

Y15A /D203A σε U-πυθμένος πλάκες μικροτίτλου 96-φρεατίων (BD Biosciences). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και στη συνέχεια επισημαίνονται με

3Η-θυμιδίνης (Perkin Elmer Inc.) για 18 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε φίλτρα ινών υάλου και DNA-ενσωματώνεται

3Η-θυμιδίνης μετρήθηκε σε έναν μετρητή βήτα σπινθηρισμού (Wallac Microbeta Counter 1450).

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμασίες να μετρηθεί η ικανότητα των διαφόρων πρωτεϊνών για να προκληθεί PBMC μεσολάβηση θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Πρώτον,

in vitro

θανάτωση αξιολογήθηκε με συν-καλλιέργεια ανθρώπινα PBMCs με είτε κύτταρα WiDr ή ΗΤ-29 σε αναλογία 10:01 και τιτλοδότηση κρεμά συμπεριλαμβανομένων spec

WT, SPEC

Y15A, sPEC

D203A, ή sPEC

Y15A /D203A για 48 ώρες. Τα κύτταρα επισημάνθηκαν με 7-AAD ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με FACS (BD Canto II). Χρησιμοποιώντας FlowJo λογισμικό, το WiDr ή ΗΤ-29 πληθυσμοί περίφραξη κατόπιν με σύγκριση της ανθρώπινης μόνος δείγματα PBMC και στη συνέχεια αξιολογούνται για την παρουσία ή απουσία 7-AAD. Δεύτερον, τα ανθρώπινα PBMCs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SAg, scFv5T4 ή πρωτεΐνες σύντηξης, όπως στην δοκιμασία FACS για 48 ώρες σε μία πλάκα μικροτίτλου με πυθμένα σχήματος U (BD Biosciences). Target ΗΤ-29 κύτταρα σημάνθηκαν με (Na)

2

51CrO

4 (Perkin Elmer Inc.) σε cRPMI. PBMCs προστέθηκαν σε effector:target αναλογίες κυττάρων είτε 1:01, 5:01 ή 10:01 κατά ΗΤ-29. Η κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε μετά από 4-6 ώρες επώασης στους 37 ° C με 5% CO

2 σε μια πρότυπη δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου μετρώντας το

περιεχόμενο 51Cr υπερκειμένων καλλιέργειας χρησιμοποιώντας έναν γ-μετρητή (Wallac Οδηγό 1470 αυτόματο μετρητή). Απόλυτος έλεγχος απελευθέρωσης λήφθηκε με έκθεση κυττάρων στόχων στο 1% δωδεκυλο θειικό νάτριο (EMD Millipore). Η ειδική λύση υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο:

Αξιολόγηση της επιβάρυνσης του όγκου και των μεταστάσεων

ανοσοανεπάρκεια NOD.Cg-Prkdc

SCID Il2rgt

m1Wjl /SzJ (NSG) ποντίκια ήταν εκτρέφονται σε μια εγκατάσταση φράγματος ζώο, και στεγάστηκαν κάτω από στείρες συνθήκες με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Με βάση μια προηγουμένως αναπτύξει πρωτόκολλο [18], [40], 13-εβδομάδων ποντικοί ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 3 × 10

6 ΗΤ-29 κύτταρα σε 0.2 mL όχημα (PBS). Τρεις εβδομάδες αργότερα, αφού οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά είτε με φορέα μόνο (n = 3) ή 1 × 10

6 ανθρώπινα PBMCs σε 0,2 mL όχημα (n = 20). PBMC έλαβαν ποντίκια χωρίστηκαν (n = 4) με μια γεννήτρια τυχαίων αριθμών για να λάβουν είτε scFv5T4 :: SPEC

D203A, ή ελέγχει SPEC

D203A, scFv5T4, scFv5T4 :: SPEC

Y15A /D203A, ή όχημα μόνο. Δύο ώρες μετά τη λήψη PBMCs, 2 μΜ /kg της αγωγής, ελέγχει ή φορέα μόνο εγχύθηκε ενδοφλεβίως. Ποντικοί χωρίς PBMCs έλαβαν μόνον όχημα. Ενδοφλέβιες ενέσεις θεραπεία δόθηκαν ημερησίως για 7 επιπλέον ημέρες. Μετά από 4 εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο συνολικός όγκος του όγκου προσδιορίστηκε. Τα ποντίκια επίσης εξετάζονται οπτικά για μακρο-μεταστάσεις και σκόραρε ανάλογα με βάση το βαθμό της περιφερειακής εξάπλωσης μακριά από την αρχική τοποθεσία του όγκου. Όλες οι όγκοι αφαιρέθηκαν, μεγέθους- και το βάρος μετρήθηκαν με τυφλό τρόπο.

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας ένα αταίριαστο Φοιτητής

t

δοκιμασία ή με 2- τρόπος ANOVA με Bonferroni τεστ πολλαπλής σύγκρισης (GraphPad Prism). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός spec με βάση το TTS

spec είναι ένας ισχυρός και καλά χαρακτηρίζεται στρεπτοκοκκική SAg γνωστό ότι στοχεύουν κατά κύριο λόγο Vβ2

+ ανθρώπινα κύτταρα Τ [32] οι οποίες αντιπροσωπεύουν ~ 7% των περίπου 25 εκατομμυρίων διακριτές TCRs [41]. Πριν από την εργασία δείχνει ότι Tyr

15 είναι ένα κρίσιμο υπόλειμμα γι ‘αυτό SAg να εμπλέξει το TCR [34], και Asp

203 είναι απαραίτητο να συντονίσουν μια διασύνδεση υψηλής συγγένειας ψευδαργύρου μεσολάβηση με την β-αλυσίδα MHC-II [4], [35], [42] (Σχήμα 1Α). Πράγματι, η ενιαία Asp

203 → Ala μετάλλαξη στο spec έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν δραματικά την τοξικότητα σε ένα μοντέλο θανατηφόρου συνδρόμου τοξικού σοκ [42]. Αξιολογήσαμε για πρώτη φορά την ικανότητα του άγριου τύπου SPEC (SPEC

WT), SPEC

Y15A, SPEC

D203A, και spec

Y15A /D203A για να ενεργοποιήσετε τα ανθρώπινα PBMCs και να προκαλέσει PBMC μεσολάβηση δολοφονία του καρκίνου κύτταρα. Τόσο SPEC

Y15A και SPEC

D203A είχαν απομειωθεί για την ικανότητα να επεκτείνει PBMCs από -100 φορές σε σύγκριση με το spec

WT, και το SPEC

Y15A /D203A διπλή μετάλλαξη δεν ήταν σε θέση να επάγουν πολλαπλασιασμό PBMC (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια, τα PBMC εξαρτώμενη θανάτωση του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή WiDr αξιολογήθηκε. SPEC

Y15A προκάλεσε σημαντική μείωση στην WiDr κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με το spec

WT, και τόσο η SPEC

D203A και SPEC

μεταλλάξεις Y15A /D203A απέτυχαν να προκαλέσουν WiDr κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 1Γ). Εκτιμήσαμε επίσης την ικανότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών για την πρόκληση ειδικά πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων CD3

+ CD4

+ και CD3

+ CD8

+ πληθυσμοί Τ κυττάρου σε 1 μg /ml. SPEC

WT και κάθε ένα από τα μονά μεταλλάγματα ήταν σε θέση να επάγουν τον πολλαπλασιασμό των δύο υποσυνόλων, ενώ ο διπλός μεταλλάκτης απέτυχε να επάγει πολλαπλασιασμό είτε υποσύνολο (Σχήμα 1D και 1Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TCR και δέσμευση MHC-II είναι σημαντικά για την επαγωγή ανοσολογικής μεσολάβηση κυττάρων θανάτωση από spec

WT, και ότι SPEC

D203A μπορεί να είναι ένα κατάλληλο μετάλλαγμα για τη μείωση ή την πρόληψη της συστημικής ενεργοποίησης ανοσοκυττάρων, διατηρώντας παράλληλα την πλήρη δέσμευση με τον TCR.

Α) διαρθρωτικά επισκόπηση των προδιαγραφών σε συγκρότημα με ΤΟΚ και MHC-II. αλυσίδα TCR να είναι χρώματος πορτοκαλί, TCR νβ αλυσίδα γκρι χρώμα, οι MHCα-αλυσίδες κόκκινο χρώμα, οι MHCβ-αλυσίδες χρώμα πράσινο, τα αντιγονικά πεπτίδια χρώματος μαύρου, και το άτομο ψευδαργύρου χρωματίζεται ματζέντα. Spec είναι χρώματος μπλε με σημαντικά υπολείμματα διεπαφή Y15 και D203 επισημαίνονται με κίτρινο χρώμα. Το τριαδικό μοντέλο του TCR-φασματικώς (MHC)

2 παρήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] και το διάγραμμα ταινίας δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας PyMOL (https://www.pymol.org). Β) πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων PBMCs που προκαλείται από spec

WT ή πρωτεϊνών που περιέχουν μεταλλαγμένα υπολείμματα Y15A (TCR δέσμευσης μεταλλαγμένης), D203A (MHC-II-δέσμευσης μεταλλαγμένης) ή Y15A /D203A προσδιορίστηκε με την πρόσληψη

3Η- θυμιδίνης μετά από 72 ώρες μετά τη διέγερση (η = 5 εις τριπλούν? αντιπροσωπευτικά δεδομένα ενός ατόμου). Γ) Δόση κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από 7-AAD

+ WiDr κυττάρων μετά από 48 ώρες επώαση με τα ανθρώπινα PBMCs και είτε SPEC

WT, SPEC

Y15A, SPEC

D203A, ή SPEC

Y15A /D203A (n = 3-6 ανά ομάδα). (Δ-Ε) Διάδοση των CFSE επισημασμένα ανθρώπινα PBMCs που προκαλείται από spec

WT ή πρωτεΐνες που περιέχουν μεταλλαγμένα υπολείμματα προσδιορίστηκε με FACS πέντε ημέρες μετά τη διέγερση, ειδικά μέτρησης του συνολικού πληθυσμού CD3

+ Τ κυττάρων, CD3

+ CD4

+ Τ κύτταρα και, CD3

+ CD8

+ Τ κύτταρα (n = 4? FACS αντιπροσωπευτικά δεδομένα ενός ατόμου).

η

Κατασκευασμένο ανθρώπινη scFv5T4 στοχεύει συγκεκριμένα η 5Τ4 που σχετίζεται με όγκο αντιγόνου

για να αναπτύξει έναν ειδικό μηχανισμό στόχευσης για spec

D203A, δημιουργήσαμε μια εξανθρωπισμένη scFv με βάση τις περιοχές προσδιορισμού συμπληρωματικότητας (CDR) του χαρακτηρίζεται ειδικών scFv ποντικού για τον ανθρώπινο 5Τ4 ΤΑΑ [37]. Η αλληλουχία cDNA σχεδιάστηκε για να ενσωματώσει ένα «εξανθρωπισμένο» αλληλουχία σπονδυλική στήλη, με τις CDR υπόλοιπα ειδικό για την ανθρώπινη 5Τ4. Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων προσδιορίστηκαν ευθυγραμμίζοντας την προηγουμένως περιγραφείσα scFv5T4 ποντίκι με 10 ανθρώπινες αλληλουχίες scFv δημιουργώντας ένα συναινετική αλληλουχία. Αυτή η αλληλουχία οϋΝΑ κωδικόνιο βελτιστοποιημένο για

E. coli

και συντίθενται, και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ενός αριθμού ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (Πίνακας S1).

Για να εξεταστεί πρώτα η εξειδίκευση του εξανθρωπισμένου scFv5T4 για πρόσδεση σε ανθρώπινο 5Τ4, το cDNA scFv5T4 ήταν γενετική μηχανική για να περιέχουν ένα Ο-τερματική ετικέτα βιοτίνης, ή γενετικά συγχωνευμένο με μονομερική πρωτεΐνη κόκκινη φθορίζουσα 1 (mRFP1) [43]. Κατά την επώαση με τα ανθρώπινα ΗΤ-29 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα είναι γνωστό ότι εκφράζουν 5Τ4 [44], από τα οποία προέρχονται τα κύτταρα WiDr [45], scFv5T4 δεσμεύεται στην επιφάνεια αυτών των κυττάρων συγκριτικά με την εμπορική αντι-ανθρώπινο 5Τ4 mAb (Σχήμα 2Α). ΗΕΚ293 κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν το αντιγόνο 5Τ4 δεσμεύονται τόσο ο mAb5T4 καθώς και το θραύσμα scFv5T4 όπως φαίνεται με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, ενώ ελέγχουν ΗΕΚ293 κύτταρα που περιέχουν μόνο τον φορέα δεν χρωματίστηκαν είτε με αντίσωμα (Σχήμα 2Β). scFv5T4 ειδικότητα για 5Τ4 προσδιορίστηκε επίσης με επώαση scFv5T4 :: mRFP1 με κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με pEGFP-Ν1 :: 5Τ4, ή φορέα ελέγχου pEGFP-Ν1. Μικροσκοπική ανάλυση του GFP :: 5Τ4 κύτταρα που εκφράζουν ΗΕΚ293 απέδειξε ότι scFv5T4 δεσμεύονται μόνο σε εκείνα τα κύτταρα που εκφράζουν τη σύντηξη 5Τ4 :: GFP, αλλά όχι για τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι το εξανθρωπισμένο scFv5T4 μπορεί ειδικώς συνδέονται προς ανθρώπινο 5Τ4.

Α) Ιστογράμματα που αποδεικνύουν σύνδεση του τα υποδεικνυόμενα αντισώματα επιφάνεια, είτε εμπορικών mAb5T4 ή δημιουργούνται scFv5T4 (άδειο καμπύλες), να 5Τ4 ΤΑΑ επί ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά ΗΤ-29 μετρήθηκε με FACS. Οι σκιασμένες καμπύλες δείχνουν τον έλεγχο IgG2b ισοτύπου (άνω πλαίσιο) ή μόνο (κάτω πίνακας) στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ. Β) Απεικόνιση των εμπορικών mAb5T4, ή scFv5T4, στόχευση των κυττάρων ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με άδειο φορέα (pCMV6-XL5) ή pCMV6-XL5 :: 5Τ4 με μικροσκοπία φθορισμού. Εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται στα 400 × μεγέθυνση. Γ) Απεικόνιση των ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με pEGFP-Ν1 ή pEGFP-Ν1 :: 5Τ4 και επωάζονται με scFv5T4 :: mRFP1. Ίδιο οπτικό πεδίο φωτογραφίες ελήφθησαν υπό αντίθεσης φάσης, και πράσινη και κόκκινη φθορίζουσα φίλτρα σε 100 × μεγέθυνση.

Η

Δημιουργία scFv5T4 :: spec

D203A

Για να στόχου sPEC να 5Τ4, sPEC ήταν μεταφραστικά συγχωνευμένο με scFv5T4 και ανασυνδυασμένη scFv5T4 :: sPEC

D203A εκφράστηκε από το

Ε. coli

BL21 (DE3) και καθαρού (Σχήμα 3). Επιπλέον, τα αντιδραστήρια ελέγχου παράχθηκαν συμπεριλαμβανομένων scFv5T4 μόνη της, και μια πρωτεΐνη μη λειτουργική σύντηξης που περιέχει spec

Y15A /D203A, το καθένα ως διαλυτές πρωτεΐνες που περιέχουν C-τερματικό ετικέτες βιοτίνη (Σχήμα 3).

Α) σχηματική απεικόνιση που αντιπροσωπεύουν τις συνιστώσες των παραγόμενων κατασκευασμάτων πρωτεΐνης σύντηξης. Η πρωτεΐνη αποτελείται από τους δημιουργούνται 5Τ4 στοχευμένες εξανθρωπισμένη μεταβλητή θραύσματα μονής αλυσίδας, V

H και V

L (γκρίζα γραμμή), γενετικά συγχωνευμένο με στρεπτοκοκκική SPEC υπεραντιγόνου (μπλε γραμμή) είτε περιέχει ένα αλανίνης υποκατάσταση στο κατάλοιπο D203 ή μια πρόσθετη υποκατάσταση αλανίνης στο κατάλοιπο Y15. Όλα τα κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν για να περιέχουν μια Ο-τερματική ετικέτα βιοτίνης. Οι καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτείνες φαίνεται από SDS-PAGE (πίνακας Β), και ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western με στρεπταβιδίνη IRDye800 (πάνελ C)

Η

Ανθρώπινα Τ-κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από scFv5T4.: : sPEC

D203A

Πρέπει πρώτα δοκιμαστεί scFv5T4 :: sPEC

D203A και οι πρωτεΐνες ελέγχου για την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται που προκαλείται από την ανθρώπινη PBMCs. scFv5T4 :: SPEC

D203A προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη απόκριση πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων που ήταν συγκρίσιμη με SPEC

D203A (Σχήμα 4Α). Είναι σημαντικό ότι, το θραύσμα αντισώματος scFv5T4 μόνο και το διπλό μετάλλαγμα σύντηξης (scFv5T4 :: SPEC

Y15A /D203A) δεν διεγείρει σημαντικές αποκρίσεις πολλαπλασιασμού. Αυτό δείχνει ότι το spec

τμήμα D203A της σύντηξης είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της ενεργοποίησης των PBMC. Ο ανοσοθεραπευτικός παράγοντας στη συνέχεια αξιολογήθηκε για την ικανότητα να διαμεσολαβούν θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από ανθρώπινα Spec-αντιδραστική PBMCs σε δύο δοκιμασίες. Πρώτον, το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή WiDr χρησιμοποιήθηκε ως στόχος σε μία δοκιμασία θανάτωσης 7-AAD-based. Αποτελεσματική θανάτωση κυττάρων παρατηρήθηκε μετά από ανθρώπινα PBMCs διεγέρθηκαν με 200 ηΜ του παράγοντα για 48 ώρες, σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου SPEC και μη διεγερμένα δείγματα αναφοράς (Σχήμα 4Β). Δεύτερον, ΗΤ-29 κύτταρα επισημαίνονται με

51Cr χρησιμοποιήθηκαν ως στόχοι. Αποτελεσματική θανάτωση κυττάρου παρατηρήθηκε σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά ανθρώπινα PBMCs διεγέρθηκαν με τον παράγοντα για 48 ώρες και στη συνέχεια προστέθηκαν σε κύτταρα όγκου με την αύξηση λόγους τελεστή προς στόχο (E:T) (Σχήμα 4C). Επιπλέον, το ενιαίο μεταλλάκτης σύντηξης (scFv5T4 :: SPEC

D203A) ήταν πιο αποτελεσματική από εκείνη του παρόμοιων διπλού μεταλλάκτη συγχωνεύσεως (scFv5T4 :: SPEC

Y15A /D203A) ή αντίσωμα μόνο, αλλά ήταν μειωμένη σε σύγκριση με spec

WT. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι scFv5T4 :: spec

D203A είναι λειτουργική για την επαγωγή ανοσολογικής μεσολάβηση κυττάρων θάνατο των καρκινικών κυττάρων και ότι SPEC

D203A, scFv5T4, και scFv5T4 :: SPEC

πρωτεΐνες Y15A /D203A μπορεί να λειτουργήσει ως ακριβής έλεγχοι να αξιολογήσει την απαίτηση για τη στόχευση και τη δραστηριότητα SAg

in vivo

.

Α) πρωτεΐνες spec χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν scFv5T4 μόνη της, scFv5T4 :: sPEC

Y15A /D203A και στη συνέχεια scFv5T4 :: sPEC

D203A στην πρόσληψη

3Η-θυμιδίνης ως μέτρο του πολλαπλασιασμού PBMC μετά από 4 ημερών επώαση (n = 5). Β-Γ) δοσοεξαρτώμενες Spec-διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα PBMC από scFv5T4 :: spec

D203A προσδιορίστηκε με σύγκριση ελέγχους spec, scFv5T4 μόνο και scFv5T4 :: SPEC

Y15A /D203A μετά από 48 ώρες επώαση, χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS WiDr (πίνακας Β), μετρώντας τοις εκατό θανάτου των καρκινικών κυττάρων με χρώση 7ΑΑΌ αποκλεισμού (n = 3) και

51Cr-απελευθέρωσης για να μετρηθεί το ειδικό κυτταροτοξικό δυναμικό (πίνακας C) όταν επωάστηκαν με αυξανόμενες αναλογίες effector:target και

51Cr-επισημασμένα ΗΤ-29 καρκινικών κυττάρων. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται (μέση ± SEM) είναι από τέσσερις ανεξάρτητες ανθρώπινους δότες κάθε εις τριπλούν. * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001, σε σύγκριση με την ανενεργό SPEC

Y15A /D203A πρωτεΐνη ελέγχου

Η

Η ανοσοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας scFv5T4 :: SPEC

D203A

sPEC είναι ειδικό για το ανθρώπινο Vβ2

+ Τ κύτταρα, αλλά αυτή τη SAg δεν αναγνωρίζει Τ κυττάρων ποντικού [32]. Έτσι, τον έλεγχο της SPEC-based TTS απαιτείται ένα μοντέλο που χρησιμοποιεί ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, το ανθρώπινο 5Τ4 scFv στόχευσης έχει ελάχιστη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με ποντικού 5Τ4 [37]. Ως εκ τούτου, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινο 5Τ4 ήταν απαραίτητα για τα πειράματα. Βασίζεται σε ένα παρελθόν που αναπτύχθηκε μοντέλο [18], [40], που απασχολούνται με ανοσοανεπάρκεια NOD SCID IL2Rγ

– /- (NSG) ποντίκια για την εμφύτευση των 5Τ4

+ ανθρώπινη ΗΤ-29 παχέος κύτταρα αδενοκαρκινώματος. NSG ποντίκια στερούνται Τ, Β και ΝΚ κυττάρων [46] και αποτελούν τη βέλτιστη στέλεχος του ποντικιού για ανθρώπινη εμφύτευση του όγκου [47]. Επιπλέον, αυτοί οι ποντικοί επιτρέπουν την επιβίωση των μεταφερόμενων ανθρώπινα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [46], [48]. ΗΤ-29 κύτταρα εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς NSG και μια φορά στερεό όγκοι ψηλαφητοί (σε 3 εβδομάδες μετά την ένεση), θεραπείες άρχισαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ανθρώπινα PBMCs, ακολουθούμενη από 8 ημερήσιες ενδοφλέβιες ενέσεις scFv5T4 :: spec

D203A (Σχήμα 5Α). Ελέγχου NSG ποντίκια δεν έλαβαν PBMCs, ή λαμβάνονται PBMCs χωρίς επιπλέον θεραπείες. Πρόσθετες ομάδες περιλαμβάνονται η scFv5T4 μόνο, SPEC

D203A μόνη της, ή αδρανείς scFv5T4 :: SPEC

Y15A /D203A. εμβαδόν επιφανείας του όγκου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση με παχύμετρο τη διάρκεια του πειράματος και απέδειξαν λίγα σε καμία αύξηση των όγκων στην scFv5T4 :: SPEC

ομάδα θεραπείας D203A, ενώ η αύξηση παρατηρήθηκε σε όλες τις άλλες ομάδες (Σχήμα 5Β). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν την εβδομάδα 8 του πειράματος και οι όγκοι αξιολογήθηκαν κατά τυφλό τρόπο. Το πείραμα αυτό έδειξε μία δραματική μείωση στο συνολικό όγκο του όγκου μετά από αγωγή με scFv5T4 :: spec

D203A που ήταν σημαντικά διαφορετικό από τα ποντίκια που δεν έλαβαν PBMCs, ποντικοί που υπέστησαν αγωγή sham (αλατούχο διάλυμα), και ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν SPEC

D203A ή scFv5T4 :: sPEC

Y15A /D203A (Σχήμα 5C). Είναι σημαντικό ότι η scFv5T4 :: spec

ομάδα θεραπείας D203A έδειξαν επίσης μία σημαντική μείωση των συνολικών μεταστάσεις βαθμολογία σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες (Σχήμα 5D και 5Ε).