έχουν

Αφηρημένο

επιφάνεια των κυττάρων γλυκοσυζευγμάτων παρούσα μεταβολές των δομών τους σε χρόνιες παθήσεις και διακριτά επιτόπια ολιγοσακχαριτών έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο. Μεταξύ αυτών, κολοβωμένη γλυκάνες παρούσα τερματικό μη αναγωγικό β-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc) τα κατάλοιπα που είναι σπάνια σε υγιείς ιστούς. Οι λεκτίνες από μη συμβατικές πηγές όπως μύκητες ή ALGI παροχή νέων δεικτών που ειδικώς συνδέονται προς τέτοιους επίτοπους, αλλά η διαθεσιμότητα τους μπορεί να είναι δύσκολο. Μία λεκτίνη ΟΙοΝΑο-δέσμευσης από το σώμα καρποφορίας του μύκητα

Psathyrella velutina

(ΠΛ) έχει παραχθεί με καλή απόδοση σε βακτηριακή καλλιέργεια. Μια ισχυρή ειδικότητα για τερματικά υπολείμματα ΟΙοΝΑο αποδεικνύεται από γλυκάνης συστοιχία. Affinity τιμές που λαμβάνονται με μικροθερμιδομετρία και συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων επέδειξε micromolar συγγένεια για GlcNAcβ1-3Gal επίτοπους και για διπλής κεραίας Ν-γλυκάνες με GlcNAcβ1-2Man καλυμμένο κλαδιά. Κρυσταλλική δομή του ΠΛ σε σύμπλοκο με GlcNAcβ1-3Gal καθοριστεί τη δομική βάση της ειδικότητας. Επισήμανση διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων και τη χρήση των αναστολέων της γλυκάνης μεταβολισμό έδειξε ότι rPVL δεσμεύεται με τερματικό ΟΙοΝΑο αλλά και για σιαλικό οξύ (Neu5Ac). Ανάλυση της γλυκοζυλοτρανσφεράσης έκφρασης επιβεβαίωσε το υψηλότερο ποσό της GlcNAc παρόντες σε καρκινικά κύτταρα. rPVL δέσμευσης είναι ειδική για καρκινικό ιστό και αδύναμη ή καθόλου επισήμανση παρατηρείται για υγιή, εκτός από τους αδένες του στομάχου που παρουσιάζουν μοναδική βλεννινών αGlcNAc-παρουσίαση. Σε πνεύμονα, του στήθους και του παχέος εντέρου καρκινώματα, μια σαφής οριοθέτηση μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ των περιφερειών του καρκίνου και περιβάλλοντες υγιείς ιστούς. ΠΛ εκ τούτου, είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την επισήμανση agalacto-γλυκάνες σε καρκίνο ή άλλες ασθένειες

Παράθεση:. Audfray Α, Beldjoudi M, Breiman Α, Hurbin Α, Boos Ι, Unverzagt C, et al. (2015) ένα ανασυνδυασμένο μυκητιασικές λεκτίνη για την επισήμανση Κατατετμημένη γλυκάνες επί ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10.1371 /journal.pone.0128190

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Els JM van Damme, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 28 Γενάρη 2015? Αποδεκτές: 24 Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: τέταρτης Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Audfray et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. ΠΛ ρίζας συγκρότημα /έχει κατατεθεί στην Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης με κωδικό 4UP4

Χρηματοδότηση:. Agence Natioale de la Recherche: χορηγεί NeoLect-11-BSV5 και ANR-11-LabX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). Ευρωπαϊκή Συνεργασία στην Επιστήμη και Τεχνολογία: CM1102 Δράσης COST (https://www.cost.eu/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι αλλαγές στην κυτταρική επιφάνεια γλυκοζυλίωσης είναι γνωστό ότι σχετίζονται με έναν μεγάλο αριθμό χρόνιων ασθενειών και του καρκίνου των γλυκανών αντιπροσωπεύουν ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο για βιοδεικτών ανακάλυψη [1-3]. Συσχέτιση της φλεγμονής ή μετάστασης με υπερέκφραση σιαλυλιωμένη φουκοζυλιωμένη και επιτόπια, όπως σιαλυλ Lewis χ έχει αποτελέσει το αντικείμενο εντατικής έρευνας. Ωστόσο, σε άλλες περιπτώσεις, το πολύ ενεργό μεταβολισμό και διαίρεση των καρκινικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στην ανώμαλη έκθεση κρυπτικών επιτόπων. Αυτή η εσωτερική μέρος του γλυκοσυζευγμάτων, που θα είχαν διακοσμηθεί από άλλους μονοσακχαρίτες σε φυσιολογικά κύτταρα, επομένως, μπορούν να εκτεθούν στην επιφάνεια του κυττάρου και θα είναι διαθέσιμο για ανίχνευση με αντισώματα ή λεκτίνες [4].

Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc ) είναι ένα υπόλειμμα υδατάνθρακα που υπάρχει στο εσωτερικό μέρος του Ν-γλυκανών, όπως ο πυρήνας χιτοβιόζης συνδέεται με υπόλειμμα ασπαραγίνης και σπανιότερα ως β1-4 που συνδέεται με τον πυρήνα διακλαδισμένης μαννόζης σε διχοτομημένα Ν-γλυκάνες. ΟΙοΝΑο είναι επίσης παρούσα στα κλαδιά των εν λόγω γλυκοσυζευγμάτων, είτε β1-2-συνδεδεμένο με μαννόζη (Man) επί του πυρήνος τριμαννόζης ή β1-3-συνδεδεμένο με γαλακτόζη (Gal) ως μέρος του πολυλακτοζαμίνης επεκταθεί κλάδους (Σχήμα 1Α). Παρ ‘όλα αυτά, λόγω της δραστηριότητας των γαλακτοσυλοτρανσφεράσες και σιαλυλοτρανσφεράσες, αυτά τα υπολείμματα ΟΙοΝΑο δεν είναι σε τερματικές θέσεις σε φυσιολογικούς ιστούς. Ομοίως γλυκοσφιγγολιπίδια περιέχουν GlcNAcβ1-3 ή β1-6 που συνδέονται με Gal, αλλά όχι σε εκτεθειμένες τερματικές θέσεις. Τα επιτόπια είναι παρόμοια σε βλεννίνες με κατάλοιπα φουκόζης (Fuc) ανώτατο όριο των τερματικών επιτόπων Gal, σιαλικό οξύ (Neu5Ac) ή. Η μόνη εξαίρεση είναι μια σπάνια επιτόπιο αποτελείται από α1-4 συνδέονται GlcNAc-τερματίζεται βλεννών από αδενικό βλεννογόνους κύτταρα του στομάχου [5] (Σχήμα 1Α).

Α. Παραδείγματα φυσιολογικών και κολοβωμένη ολιγοσακχαρίτες που μπορούν να βρεθούν σε φυσιολογικά ή καρκίνο ιστούς. Κωδικοποίηση για σχηματική αναπαράσταση μονοσακχαριτών είναι στο κάτω μέρος του σχήματος. Η επτασακχαρίτη χρησιμοποιείται σε πειράματα πρόσδεσης υποδεικνύεται ως «επτα». Β Σύνθεση επτασακχαρίτη αζιδίου 2 αντιστοιχεί σε ολιγοσακχαριτών «επτα» στον πίνακα Α

Η

Η εμφάνιση ανώμαλων επιτόπων βGlcNAc τερματισμού έχει παρατηρηθεί σε ένα περιορισμένο αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων κυττάρων λευχαιμίας [6 ]. έχουν IgGs με κολοβωμένη Ν-γλυκανών έχουν αναφερθεί στον ορό των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [7]. Altered βλεννίνες με τερματικό μοτίβα ΟΙοΝΑο προτάθηκαν για να σχηματίσουν το επιτόπιο Tk, ένας όγκος του κόλου αντιγόνο που σχετίζεται [8]. Η πιο ακριβής χαρακτηρισμός των μεταβολών της γλυκοζυλίωσης με έκθεση των εσωτερικών ΟΙοΝΑο διεξήχθη με glycome ανάλυση των διαφόρων καρκίνωμα, που δείχνουν προς την εμφάνιση μικρού κόλουρου Ν-γλυκανών τερματίστηκε με GlcNAβ1-2Man τόσο κεραία και του ΟΙοΝΑο-τερματίζεται γραμμικά και διακλαδισμένα γλυκοσφιγγολιπίδια , ιδιαίτερα στον πνεύμονα καρκίνωμα μικρών κυττάρων και αδενοκαρκίνωμα, αλλά επίσης σε νεφρό, μαστό και τις ωοθήκες καρκίνωμα [9] (Σχήμα 1Α).

λεκτίνες, γενικά προέρχονται από φυτά, έχουν αποδειχθεί ότι είναι πολύ αποτελεσματική για την ανίχνευση παρεκκλίνουσα γλυκοζυλίωση σε βιολογικά δείγματα. Μια νέα τεχνολογία είναι η χρήση των συστοιχιών λεκτίνη που μπορούν να περιέχουν λεκτίνες με μεγάλες φάσματα ειδικότητας και ως εκ τούτου χαρακτηρίζουν παραλλαγή γλυκοζυλίωσης [10]. Η χρήση των λεκτινών που προέρχονται από φυσικούς οργανισμούς μπορεί να είναι χρονοβόρα και μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα μόλυνσης ή παραλλαγές μεταξύ των παρτίδων. Ως εκ τούτου, η τεχνολογία ανασυνδυασμού λεκτίνη έχει αρχίσει να αναπτύσσεται [11]. Οι λεκτίνες που χρησιμοποιούνται κλασικά για ΟΙοΝΑο-δέσμευση εξάγονται από φυτά, όπως το σιτάρι (WGA), τομάτα (SLT) και

Griffonia simplicifolia

(GSL-ΙΙ). Μια νέα ΟΙοΝΑο-ειδική λεκτίνη (ΠΛ) καθαρίστηκε από τα όργανα καρποφορίας και μυκήλιο του μύκητα,

Psathyrella velutina

[12] και, στη συνέχεια, δομικά χαρακτηρίζεται [13]. Μία στενά συνδεδεμένη πρωτεΐνη, λεκτίνη 2 από μανιτάρι

Agrocybe aegerita

(AAL-2), έχει πρόσφατα κλωνοποιηθεί και αποδείχθηκε ότι δεσμεύεται με κύτταρα ηπατώματος [14]. Η δομή ΠΛ παρουσιάζει μια νέα πτυχή μεταξύ λεκτίνες, με επτά β-φύλλα τοποθετημένα σε ένα φορές β-έλικα. Ως εκ τούτου, η λεκτίνη υιοθετεί ένα σχήμα ντόνατ με έξι θέσεις πρόσδεσης ΟΙοΝΑο, και αναμένεται να παρουσιάσει έντονη απληστία για κυτταρικές επιφάνειες που παρουσιάζουν υψηλή πυκνότητα των τερματικών υπολειμμάτων ΟΙοΝΑο.

Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να παραχθεί μια ανασυνδυασμένη μορφή ΠΛ και να χαρακτηρίσει λεπτή ειδικότητα της έναντι των διαφορετικών επιτόπων ΟΙεΝΑο-τερματιστεί η οποία θα μπορούσε να είναι παρούσα στην παθολογία που σχετίζονται με ακρωτηριασμένες μορφές της ανθρώπινης γλυκοσυζευγμάτων. Η απληστία της λεκτίνης για ΟΙοΝΑο-διακοσμημένη επιφάνεια αξιολογήθηκε σε συστοιχίες. Τέλος, η ικανότητα της λεκτίνης να ονομάσει τα καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς καρκινώματος επίσης περιγραφεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικό

ΟΙοΝΑο έχει αγοραστεί από την Sigma-Aldrich. Δισακχαρίτης GlcNAcβ1-3Gal, γαλακτο-Ν-τετραόζη (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), γαλακτο-Ν-τριόζης (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) χιτοβιόζης (GlcNAcβ1-4GlcNAc), chitopentaose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) έχουν αγοραστεί από Elicityl (Crolles, Γαλλία). Σιαλιδάση από το

perfringens Clostridium

έχει αγοραστεί από την Sigma-Aldrich (ref. N2876) ή New England Biolabs (Ίπσουιτς, ΜΑ). β-D-Ν-ακετυλο-εξοζαμινιδάσης

f από

Streptomyces plicatus

αγοράστηκε από την New England Biloabs. Το οξύ-ειδική λεκτίνη σιαλικό επισημασμένο με βιοτίνη ΚΑΚ αγοράστηκε από Vector Labs (Burlingame, CA)

Σύνθεση του Ν-γλυκάνης 2

Nonasaccharide αζίδιο 1 (Σχήμα 1Β) παρασκευάστηκε από κρόκο αυγού που ακολουθείται από ενζυματική υδρόλυση και αζιδίωση [15, 16]. 5,1 mg (3,1 μmοl) nonasaccharide 1 διαλύθηκαν εντός 203 μΙ φωσφορικού ρυθμιστικού (100 mM, ρΗ 6,8, 1 mM MgCl

2). 10 μονάδες λυοφιλοποιημένου β-γαλακτοσιδάσης (ΕΚ 3.2.1.23) προστέθηκαν στο διάλυμα. Το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C για 3 ημέρες (TLC: 2-προπανόλη, 1 Μ οξικό αμμώνιο, 2: 1). Μετά τη λυοφιλοποίηση, το υπόλειμμα καθαρίστηκε με διήθηση γέλης (Superdex 30, 1,6 χ 60 cm, 0.1 m ΝΗ

4HCO

3, 0,9 ml min

-1). Η κορυφή που εκλούεται στα 86 λεπτά, λυοφιλίστηκε και αφαλατώθηκαν με διήθηση πηκτής (Sephadex G-25, 2,5 χ 15,5 cm, 5% αιθανόλη σε νερό, 0,6 ml min

-1). Η κορυφή που εκλούεται στα 75 λεπτά, λυοφιλίστηκε αποδίδοντας 2,9 mg (2,2 μmοl) του επτασακχαρίτη 2 (70%). [Α]

D

22 = -9.0 (c = 0.5, Η

2O). Η καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με 360 MHz

1 Η NMR σε D

2O (S1 Σχήμα)

1H-NMR (360 MHz, D

2O): δ = 5,03 (d,

J

1,2 & lt? 1 Hz, 1Η, Η-1

4), 4,83 (d,

J

1,2 & lt? 1 Hz, 1Η, Η- 1

4′), 4,68 – 4,64 (m, 2Η, Η-1

1, Η-1

3), 4,53 (d,

J

1,2 = 7,7 Hz, 1Η, Η-1

2), 4,47 (d,

J

1,2 = 8,3 Hz, 2Η, Η-1

5, Η-1

5 ‘), 4.18 – 4.15 (m, 1Η, Η-2

3), 04.12 – 04.09 (m, 1Η, Η-2

4), 4.4 – 4.1 (m, 1Η, Η- 2

4 ‘), 1,99 (s, 3Η, NAc), 1,97 (s, 9Η, NAc). ESI-MS: m /z υπολογίστηκε για C

50Η

83N

7Ο

35: 1341,49? βρέθηκε 1342,62 (Μ + Η)

+, 1365.86 (M + Na)

+

Παραγωγή ανασυνδυασμένης ΠΛ

Μια νουκλεοτιδική αλληλουχία που κωδικοποιεί για το πεπτίδιο ακολουθία του λεκτίνη από καρποφορίας το σώμα του μανιταριού

P

.

velutina

(GenBank, αριθμός πρόσβασης DQ232759) [13] συμπληρωμένο στο Ν-τερματική θέση με τα αμινοξέα MSVVVIS συνετέθη μετά βελτιστοποίηση κωδικονίων για έκφραση σε

Escherichia coli

(GenScript, Piscataway, NJ). Εισήχθη εντός του φορέα έκφρασης pET25b, χρησιμοποιώντας θέσεις περιορισμού NdeI και XhoI. Ο φορέας ΡΕΤ25-rPVL μετατράπηκε σε

E

.

coli

BL21 (DE3) (Novagen), και κύτταρα που φιλοξενούν ΡΕΤ25-rPVL πλασμίδιο αναπτύχθηκαν σε LB ζωμό που περιέχει 100 μg ml

-1 αμπικιλλίνης στους 37 ° C μέχρι Α600 φθάσει 0,7. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 16 ώρες μετά την προσθήκη 0,5 mM ισοπροπυλο-β-ϋ-θειογαλακτοπυρανοσίδη. Μετά από φυγοκέντρηση (7000 χ g για 15 λεπτά), τα βακτήρια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (20 mM Tris /HCl, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl) και με ανάλυση με διάσπαση κυττάρων σε πίεση 1.7 kilobars (Constant Systems Ltd). Μετά από φυγοκέντρηση (50000 χ g, 30 λεπτά στους 4 ° C) και διήθηση, χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη ΟΙοΝΑο-αγαρόζη (εργαστήρια ΕΥ inc.) Πραγματοποιήθηκε στο υπερκείμενο. rPVL αφέθηκε να δεσμεύονται με ακινητοποιημένο ΟΙοΝΑο σε ρυθμιστικό εξισορρόπησης, και μετά το πλύσιμο (20 mMTris /HCl ρΗ 7.5, 1 Μ NaCl), εκλούστηκε με 200 mM ελεύθερου ΟΙοΝΑο σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε διαπίδυση εκτεταμένα έναντι υπερκαθαρού νερού για 7 ημέρες, λυοφιλοποιείται και αποθηκεύεται στους 4 ° C.

Glycan συστοιχία

Τα καθαρισμένα rPVL σημάνθηκαν με Alexa Fluor 488 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και επανακαθορίστηκε σε μια στήλη αφαλάτωσης πολυακρυλαμιδίου D-Salt (Pierce). Alexa-επισημασμένο rPVL χρησιμοποιήθηκε για γλυκάνης πίνακα διαλογής με τη συνήθη διαδικασία της πρωτεΐνης-γλυκάνης αλληλεπίδραση πυρήνα (H) της Κοινοπραξίας για Λειτουργική Glycomics.

Θερμική μετατόπιση ανάλυση

δοκιμασίες θερμική μετατόπιση ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Mini Opticon, μηχανή Real Time PCR (Bio-Rad Laboratories) με 0.5 mg ml

-1 πρωτεΐνης αραιώνεται σε 100 mM NaCl, 20 mM Tris ρΗ 7.5, 100 μΜ CaCl

2, με ή χωρίς ολιγοσακχαριτών σε συνολικό όγκο αντίδρασης 25 μΙ. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής φθορισμού ανιχνεύθηκε στα 530 nm. Η θερμοκρασία ανυψώθηκε χρησιμοποιώντας 1 ° C βήματα /λεπτό από 25 ° C έως 100 ° C και ο φθορισμός αναγνώσεις λήφθηκαν σε κάθε διάστημα. Μια θετική τιμή ΔΤιη υποδεικνύει ότι ο υποκαταστάτης σταθεροποιεί την πρωτεΐνη από μετουσίωση, και ως εκ τούτου συνδέεται με την πρωτείνη. Ένα ελάχιστο δύο ανεξάρτητες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε συνθήκη

Μικροθερμιδομετρία

Η ανασυνδυασμένη λυοφιλισμένο rPVL διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM Tris /HCl, ρΗ 7,5, NaCl 150 mM, 100 μΜ CaCl

2) και απαεριωμένο. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ελέγχθηκε με μέτρηση Α280 με τη χρήση ενός θεωρητικού συντελεστή μοριακής απόσβεσης του 65.890 Μ

-1 cm

-1. Υδατάνθρακες συνδέτες διαλύθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό, απαεριώθηκε και φορτώθηκε σε σύριγγα για ένεση. ITC πραγματοποιήθηκε με ITC200 μικροκαλορίμετρο (GE Healthcare). Το διάλυμα rPVL τοποθετήθηκε σε ένα κελί δείγματος 200 μΙ στους 25 ° C. Η τιτλοδότηση εκτελέστηκε με 20 εγχύσεις 2 συνδετήρες μΙ υδατάνθρακα ανά 120 s. Τα πειραματικά δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μια θεωρητική καμπύλη τιτλοδότησης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Origin παρέχονται από την GE Healthcare, με ΔΗ (ενθαλπίας αλλαγή), Ka (σταθερά συνδυασμού) και Ν (αριθμός θέσεων ανά μονομερές δέσμευσης) όπως ρυθμιζόμενες παράμετροι. μεταβολή ελεύθερης ενέργειας (ΔG) και εντροπίας εισφορές (TΔS) προήλθαν από την εξίσωση ΔG = ΔΗ – TΔS = -RT ln Ka (με Τ ως απόλυτη θερμοκρασία και R = 8.314 J mol

-1 K

– 1). Δύο ανεξάρτητοι τιτλοδοτήσεις διεξήχθησαν για κάθε ελεγχόμενο πρόσδεμα.

συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων

Όλα SPR τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα όργανο Biacore X100 (GE Healthcare) στους 25 ° C σε HBS (10 mM Hepes /NaOH, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) συμπληρωμένου με 100 μΜ CaCl

2 σε ένα ρυθμό ροής 30 μΐ min

-1. Η πρόσδεση μετρήθηκε ως μονάδες συντονισμού πάροδο του χρόνου μετά κενό αφαίρεση, και τα δεδομένα αξιολογήθηκαν στη συνέχεια με τη χρήση του λογισμικού αξιολόγησης Biacore X100, έκδοση 2.0. σταθερές διάστασης προσδιορίζονται με γραφική παράσταση απόκριση σε κατάσταση ισορροπίας (Req, 10 s πριν από το τέλος της έγχυσης) έναντι συγκέντρωσης αναλύτη. Για πρωτεΐνη επικαλυμμένη τσιπ, 3500 μονάδες συντονισμού του rPVL (100 μg ml

-1, 10 mM ρυθμιστικό οξικού ρΗ 6.2) έχουν ακινητοποιηθεί στο κανάλι ροής 2 ενός ερευνητικού βαθμού CM5 τσιπ με χρήση τυπικών διαδικασιών σύζευξης αμίνης. κανάλι ροής 1 έχει ενεργοποιηθεί /απενεργοποιηθεί. Πειράματα αποτελούνται από ένεση (ένωση 360 s, διαστάσεως 400 s) διαφόρων συγκεντρώσεων ολιγοσακχαρίτες (2 διπλές αραιώσεις καταρράκτη, από 0 έως 10 μΜ) και στα δύο κανάλια.

κρυσταλλογραφία πρωτεϊνών

Κρύσταλλοι rPVL συμπλεγμένο με GlcNAcβ1-3Gal ελήφθησαν με την κρεμάμενη σταγόνα στους 20 ° C. Λυοφιλιωμένη πρωτεΐνη διαλύθηκε σε 2,5 mg ml

-1 σε 10 mM ρυθμιστικό Hepes /NaOH, ρΗ 7,5, NaCl 150 mM, 100 μΜ CaCl

2 και επωάστηκαν με 1 mM GlcNAcβ1-3Gal κατά τη διάρκεια 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την συν-κρυστάλλωση. Ένα μεγάλο ορθογώνιο σαν κρύσταλλος ελήφθη από 20% PEG3350, 0,2Μ μυρμηκικό νάτριο και 0,1 Μ φωσφορικό διαμμώνιο μετά από αρκετούς μήνες. Ένα κομμάτι τοποθετήθηκε άμεσα σε ένα cryoloop και φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. δεδομένα περίθλασης συλλέχθηκαν σε 100 K στο Ευρωπαϊκό Μηχανισμό Synchrotron Radiation (Grenoble, Γαλλία) στο σταθμό BM30A χρησιμοποιώντας ανιχνευτή ADSC Q315r CCD [17]. Τα δεδομένα υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας XDS [18]. Όλα τα επιπλέον υπολογιστική διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη σουίτα CCP4 είναι [19] ποιοτικών στατιστικών δεδομένων συνοψίζονται στον Πίνακα S1. Η τεχνική μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιούνται για την επίλυση της δομής με PHASER [20] και τις συντεταγμένες του φυσικού ΠΛ (Protein Data Bank κωδικός 2C4D) [13]. Η δομή εξευγενισμένα με συγκρατημένη μέγιστη βελτίωση πιθανότητα χρησιμοποιώντας REFMAC 5.8 [21] επαναλαμβάνεται με χειροκίνητο ανοικοδόμηση στο Αστράγαλο [22]. Ενσωμάτωση του συνδετήρα διεξήχθη μετά την επιθεώρηση των σταθμισμένων χάρτες MFO-DFC. τα μόρια του νερού, εισάγονται αυτόματα χρησιμοποιώντας Αστράγαλο, επιθεωρήθηκαν το χέρι. Η στερεοχημική ποιότητα των μοντέλων αξιολογήθηκε με το πρόγραμμα Molprobity [23], και οι συντεταγμένες έχουν κατατεθεί στην Τράπεζα Δεδομένων Πρωτείνης στους κωδικούς 4UP4.

Cells γραμμές

Ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) (Η358, Α549, Η441 και H322), βρογχικών επιθηλιακών (HBEC-3KT), ο καρκίνος του μαστού (MCF-7, MDA-MB-231), ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCAR3), ο καρκίνος του προστάτη (DU-145), το δέρμα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (Α431), μελάνωμα (Α375, Colo829 και SKMel28), και καρκίνο του παχέος εντέρου (ΗΤ-29) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Η κυτταρική γραμμή μελανώματος M119 ήταν ένα δώρο από τον Δρ Nathalie Labarrière (Inserm U892, Νάντη, Γαλλία). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Cergy Pontoise, France), εκτός MDA-MB-231 και ΗΤ-29, τα οποία αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ 4,5 gl

-1 γλυκόζης (Gibco), και HBEC-3KT , οι οποίες διατηρήθηκαν σε μέσο κερατινοκυττάρων-SFM (Gibco). Όλα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα (5% για ΜϋΑ-ΜΒ-231) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2, στους 37 ° C.

Ροή κυτταρομετρία θρυψινοποιήθηκαν

Cells, δειγματίστηκε, στη συνέχεια πλένονται δύο φορές σε PBS (με Ca

2 + και Mg

2+). Μετά την επώαση με rPVL-Alexa488 (5 και 10 μg ml

-1), τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε μία ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο χρησιμοποιώντας το Λογισμικό CFlow-Plus (BD Biosciences). Εναλλακτικά, βιοτινυλιωμένο rPVL ή ΚΑΚ χρησιμοποιήθηκαν, ακολουθούμενο από στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη (BD) και ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε FACSCalibur με το λογισμικό Cellquest (BD). Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα προ-υπέστη επεξεργασία με σιαλιδάση (Sigma) ή β-DN-ακετυλο-εξοζαμινιδάσης για 4 ώρες στους 37 ° C.

Αναστολή της γλυκοζυλίωσης

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 καλά πλάκες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές αναστολείς γλυκοζυλίωσης: έναν αναστολέα φουκοσυλ τρανσφεράσης, 2-φθορο-υπερακετυλ φουκόζη (2FF) και ενός αναστολέα σιαλυλο-τρανσφεράσης, 3-φθορο-υπερακετυλ-νευραμινικό οξύ (3F-Neu5Ac) που έχουν περιγραφεί πρόσφατα [24] . Η θεραπεία διεξήχθη για 4 ημέρες με 400 μΜ και 100 μΜ 2FF και 3F-Neu5Ac αντίστοιχα. Το μέσο αντικαταστάθηκε και οι αναστολείς προστέθηκαν πάλι μετά από 2 ημέρες.

Προκειμένου να διερευνηθεί ο τύπος της γλυκοζυλιωμένης συνδέτες που αναγνωρίζονται από rPVL, χρησιμοποιήσαμε Kifunensin (Sigma) που μπλοκάρει ER α-μαννοσιδάση Ι και, κατά συνέπεια, την επεξεργασία Ν-γλυκανών? βενζυλο-2 ακεταμιδο-2 δεοξυ-αλφα-D-γαλακτοπυρανοσίδη (βενζυλ-ΟαΙΝΑο? Sigma) το οποίο αποκλείει την διαδικασία Ο-γλυκοζυλίωση και 1R, 2R – (+) – 1-φαινυλ-2-παλμιτοϋλαμινο-3-Ν-morpholine- 1-προπανόλη (PPMP? Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) το οποίο αναστέλλει τη σύνθεση γλυκολιπιδίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ Kifunensin για 4 ημέρες, όπως παραπάνω. Για Βενζυλ-ΟαΙΝΑο και PPMP, τα κύτταρα αφέθηκαν σε επαφή με τους αναστολείς, σε 6 mM και 10 μΜ, αντίστοιχα, σε μία περίοδο 24 ωρών, τότε το μέσο άλλαξε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ακόμη ημέρα πριν από την ανάλυση. Όπως 2FF, 3F-Neu5Ac και PPMP αραιώνονται σε DMSO, καθαρού DMSO προστέθηκε στο μέσο των φρεατίων ελέγχου, ώστε να έχει την ίδια συγκέντρωση DMSO σε κάθε φρεάτιο.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

Cells σπάρθηκαν σε διαφάνειες κουλτούρα 4-θάλαμο (4×10

4 κύτταρα ανά θάλαμο). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 4 ° C. Πριν και μετά από επώαση με 1% BSA /PBS (β /ο), τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού με rPVL-Alexa488 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλύθηκε με ψυχρό PBS τρεις φορές για 3 λεπτά η κάθε μία. Τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο BX41 εξοπλισμένο με ένα ψηφιακό σύστημα DP-70 κάμερα (Olympus, Tokyo, Japan) και ένα ψευδο-ομοεστιακό μικροσκόπιο ApoTome εξοπλισμένο με AxioCam MRM (Ν /Β).

Τομές ιστού

μονιμοποιημένα με αιθανόλη ανθρώπινα τραχεία, οισοφάγος, δωδεκαδακτυλικό διασταύρωση, νήστιδα, το κόλον, του παγκρέατος, του ήπατος, των ωοθηκών, της μήτρας και του κόλπου δείγματα λήφθηκαν από δότες οργάνων. 18 δείγματα ιστού από 10 διαφορετικά άτομα χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή μιας μικροσειράς ιστού (ΤΜΑ) από υγιείς ιστούς. ορθοκολικού τομές όγκων μονιμοποιημένα με αιθανόλη ελήφθησαν μετά από χειρουργική επέμβαση καρκίνου. Φορμαλίνη σταθερού εμπεδωθεί με παραφίνη ανθρώπινα δείγματα NSCLC (n = 3 καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, η = 3 αδενοκαρκινώματα) ελήφθησαν επίσης. Ένας όγκος του μαστού και του πνεύμονα όγκου TMA (φορμόλη σταθερό? 40 όγκους, 10 ζεύγη μετάσταση και 10 ζεύγη γειτονικών «κανονική» ιστός) αγοράστηκαν από SuperBiochip (Σεούλ, Νότια Κορέα). Φορμόλη σταθερό σκύλου όγκων του μαστού ελήφθησαν από το «εργαστήριο του ζώου ιστοπαθολογία της Νάντης Κτηνιατρικής Σχολής, ONIRIS) Ανοσοκηλίδωση ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε τμήματα 3-μm πάχους του ιστού.

Ιστοχημείας

Ο ιστός τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν, τότε ενδογενών υπεροξειδασών μπλοκαρίστηκαν με επώαση των τομών με PBS που περιέχει 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου (ν /ν), για 5 εκ. Οι τομές στη συνέχεια αποκλείστηκαν με BSA 5% (w /v) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου , που ακολουθείται από επώαση με 0,7-1 μg ml

-1 βιοτινυλιωμένο rPVL 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (τμήματα αιθανόλη-σταθερό) ή 2 μg ml

-1 βιοτινυλιωμένου rPVL σε PBS στους 4 ° C για 18 ώρες ( για σταθεροποιημένα με φορμαλίνη τομές). Μετά την έκπλυση των τομών δύο φορές με PBS, έμμεση σύστημα βιοτίνης-στρεπταβιδίνης και DAB (Ventana Medical Systems) ή AEC (Vector Laboratories) κιτ ανίχνευσης χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ανεπτυγμένες πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με PBS και με αιματοξυλίνη. Μετά από έκπλυση με νερό, οι τομές αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν. Οι τομές παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο BX41 εξοπλισμένο με ψηφιακό σύστημα κάμερας DP-70 (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία) ή απεικονίστηκαν με NanoZoomer slide-σαρωτή (Hamamatsu, Hamamatsu Πόλη).

Για την επεξεργασία με γλυκοσιδάσες, τμήματα επωάστηκαν (μετά αποπαραφίνωση και υπεροξείδιο του υδρογόνου μπλοκαρίσματος) με 50 U του σιαλιδάσης (New England Biolabs) ή 25 U των β-DN-ακετυλο-εξοζαμινιδάσης για 2 ώρες στους 37 ° C. Φρέσκα ένζυμα προστέθηκαν στη συνέχεια και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω όλη τη νύκτα στους 37 ° C. πλάκες ελέγχου παρασκευάστηκαν παράλληλα με τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα ενζύμου (κιτρικού νατρίου ρΗ 6 και 4,5 αντίστοιχα). Μετά από ολονύκτια επώαση, τα πλακίδια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, αποκλείστηκαν με PBS-5% BSA (β /ο), χρωματίστηκαν με rPVL και απεικονίζεται όπως περιγράφεται παραπάνω.

καταστάσεων Ηθική

Όλη η ανθρώπινο αιθανόλη σταθερό ιστών ιστοί συλλέγονται και αποθηκεύονται ενώπιον του νόμου 88-138 της 20 Δεκεμβρίου, 1988, σχετικά με εκτομή των ανθρώπινων ιστών μετά θάνατον για επιστημονικών ερευνών. Για το λόγο αυτό, δεν ισχύει η έγκριση από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας. Τα δείγματα ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Νάντης Νοσοκομείο Κέντρο Βιολογικών Πόρων (https://relib.fr), στο πλαίσιο του προγράμματος θέματα καρκίνου που εγκρίθηκε από το Υπουργείο Έρευνας (έγκριση DC-2011-1399). Ιστό των τραπεζών και των ερευνητικών συμπεριφορά των φορμόλη-σταθερό ανθρώπινους ιστούς εγκρίθηκαν από το Υπουργείο Έρευνας (έγκριση AC-2010-1129) και από τις περιφερειακές Institutional Review Board Comité de Προστασίας de Άτομα (CPP) 5-Sud Est (περιφερειακό συμβούλιο) . Όλοι οι ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Αυτά τα ειδικά δείγματα χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία [25, 26]. Όσον αφορά τις ιστικές μικροσυστοιχίες που λαμβάνονται από Superbiochips Laboratories Ltd (Σεούλ, Κορέα), η εταιρεία πιστοποιεί ότι το «ανθρώπινο υλικό έχουν αφαιρεθεί ή συλλέγονται με την προηγούμενη συγκατάθεση του δότη και ότι καμία πληρωμή δεν έχει γίνει οποιαδήποτε στην τελευταία». Φορμόλη σταθερό ιστών από σκύλου όγκων του μαστού ελήφθησαν από το «εργαστήριο ιστοπαθολογίας ζώο» της Ναντ Κτηνιατρικής Σχολής (ONIRIS). Περιπτώσεις που προέρχονται από το Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής της Κτηνιατρικής Διδασκαλία Νοσοκομείο Oniris χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Έγγραφη συναίνεση των ιδιοκτητών και έγκριση από την Oniris Κολέγιο κτηνιατρικής Επιτροπής Ευημερίας των ζώων τοπικές ελήφθησαν πριν από την ένταξη. η φροντίδα των ζώων και να χρησιμοποιηθεί το πρωτόκολλο τηρείται στον ευρωπαϊκό αριθμό οδηγίας 2010/063 και με το εθνικό γαλλικό κανονισμό (Décret n ° 2013 – 118 du 1er février 2013 relatif à la προστασία des animaux Χρησιμοποιεί à des πτερύγια Scientifiques).

Αποτελέσματα

Παραγωγή και χαρακτηρισμός rPVL

PVL έχει παραχθεί με ανασυνδυασμό (rPVL) στο

Ε

.

coli

και καθαρισμένο σε ένα στάδιο σε στήλη ΟΙοΝΑο-αγαρόζη με τελική απόδοση του 1 mg l

-1 του πολιτισμού. Όταν αναλύθηκε επί ερυθροκυττάρων κουνελιού, η λεκτίνη που εμφανίζεται ισχυρή αιμοσυγκόλλησης δραστηριοτήτων σε συγκέντρωση 2,3 nM. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη είναι σταθερή και επιδεικνύει μια θερμοκρασία μετουσίωσης 56 ° C με ανάλυση θερμικής μετατόπισης (S2 Εικ). Περαιτέρω σταθεροποίηση της rPVL μπορεί να ληφθεί με την παρουσία ΟΙοΝΑο που περιέχουν συνδετήρες όπως GlcNAcβ1-3Gal ή χιτοβιόζη, με Tm 60 ° C για δύο, αλλά όχι με την παρουσία του μη δεσμευτικού υδατάνθρακα όπως γαλακτόζη και σακχαρόζη, επιβεβαιώνοντας το δραστικότητα σύνδεσης ΟΙοΝΑο.

rPVL είναι ειδικό για ολιγοσακχαρίτες με τον τερματισμό υπολείμματα ΟΙοΝΑο

Η ιδιαιτερότητα της ανασυνδυασμένης ΠΛ αναλύθηκε στο θηλαστικών Printed Array έκδοση 5.1 με 610 γλυκάνες, ως επί το πλείστον από την καταγωγή των θηλαστικών. Η συγκέντρωση rPVL είχε κυμαίνεται από 0,2 mg ml

-1 έως 0,2 μg ml

-1 και τα τέσσερα σύνολα δεδομένων είναι διαθέσιμα από την ιστοσελίδα CFG με primscreen_codes 5693, 5695, 5696 και 4697 (http: //www.functionalglycomics .org). Το σήμα φθορισμού ήταν εξαιρετική και η χαμηλότερη συγκέντρωση ήταν επαρκής για τον καθορισμό της ισχυρή προτίμηση για ολιγοσακχαρίτες που μεταφέρουν ένα ΟΙοΝΑο στο μη αναγωγικό τους άκρο (Σχήμα 2).

Κάθε χτύπημα έχει χρωματιστεί σύμφωνα με το τερματικό δισακχαρίτη . έχουν Εκπρόσωπος ολιγοσακχαρίτες έχουν σχηματικά εμφανίζεται. Κορυφές υποδεικνύεται από ένα * αντιστοιχούν σε μικρές επισήμανση των σιαλικού οξέος τερματίζεται ολιγοσακχαρίτες. Ο πλήρης κατάλογος των ολιγοσακχαριτών με εντάσεις φθορισμού είναι διαθέσιμα από την ιστοσελίδα CFG (https://www.functionalglycomics.org).

Η

Η λεκτίνη δεσμεύεται αποτελεσματικά σε GlcNAc παρούσα σε δύο διαφορετικές θέσεις στο περικομμένο Ν- γλυκάνες: GlcNAcβ1-2Man στις βασικές πεντασακχαριδίων και ακόμη πιο έντονα στις GlcNAcβ1-3Gal στην κεραία που εκτείνονται από μοτίβα πολυλακτοζαμίνης. Λόγω της επίδρασης πολλαπλό σθένος, το σήμα ήταν μέγιστη για multiantennary δομές (2 έως 5 κεραία) με επαναλήψεις λακτοζαμίνη, η εμφάνιση των οποίων σχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου [27]. Πολυλακτοζαμίνη δι- ή πολυ-κεραίες Ν-γλυκανών με τερματικό GlcNAcβ1-3Gal συνδέθηκαν με τα σήματα φθορισμού υψηλότερες από 1500 RU, ενώ εκείνοι με τερματικό Galβ1-4GlcNAc είναι στο θόρυβο του περιβάλλοντος, κάτω από 150 RU. Δεν παρατηρείται καμία σύνδεση με το GlcNAcβ1-4Man μοτίβο που υπάρχει στο διχοτομημένα Ν-γλυκάνες, αλλά η παρουσία αυτού του διχοτομημένου GlcNAc δεν παρεμποδίζει την πρόσδεση του ΠΛ σε γειτονικές ΟΙοΝΑο-τερματίζεται κεραία. Η λεκτίνη δεσμεύεται επίσης να βλεννίνης μοτίβα που φέρουν βGlcNAc σχετικά με τη θέση 3 και 6 του υπολείμματος ΟαΙΝΑο (τύπος 4). Είναι δεσμεύεται μόνο ασθενώς με την χιτοβιόζης μοτίβο (GlcNAcβ1-4GlcNAc) της χιτίνης. Η λεκτίνη δεν είναι επιλεκτική για την διαμόρφωση ανωμερική της ΟΙοΝΑο και αρκετοί ολιγοσακχαρίτες με τερματικά υπολείμματα αGlcNAc σημάνθηκαν επίσης. Τέτοιοι επίτοποι υπάρχουν σε ανθρώπινη θειικής ηπαράνης (ΟΙοΝΑο α1-4IdoA) και σε βλεννίνες του γαστρικού αδένες (ΟΙοΝΑο α1-4Gal) [5], αλλά επίσης και στην κατηγορία III βλεννίνης ιστών καρκινώματος που εκφράζουν ένα φαινότυπο γαστρικού [28]. Η γλυκάνη συστοιχία περιλαμβάνει μια ποικιλία ολιγοσακχαριτών με τερματική ΟαΙΝΑο αλλά πρόσδεσης παρατηρήθηκε μόνο στην δισακχαρίτη GalNAcβ1-3GalNAc (# 97) με μικρές ένταση ΠΛ.

Από ακινητοποιημένο άγριου-τύπου ΠΛ αναφέρθηκε ότι δεσμεύεται με σιαλυλιωμένες γλυκοπρωτεΐνες [29], η σύνδεση προς ολιγοσακχαρίτες με σιαλυλιωμένες δομές ελέγχθηκε. Πράγματι, μια ασθενής σύνδεση, μπορεί να παρατηρηθεί για διπλής κεραίας Ν-γλυκανών με την περάτωση Neu5Acα2-3Gal επιτόπια (# 603 σε Σχήμα 2). Το επίπεδο φθορισμού ήταν κοντά στο επίπεδο θορύβου (12% των maxium). Παρ ‘όλα αυτά, κατά τον έλεγχο των γλυκάνης δεδομένων σειρά που λαμβάνονται με υψηλότερη συγκέντρωση ΠΛ (0,1 mg ml

-1), η σύνδεση με σιαλυλο-ολιγοσακχαρίτες έγινε σαφώς ορατά.

Η συγγένεια των rPVL για διάφορες ΟΙοΝΑο που περιέχουν ολιγοσακχαρίτες δοκιμάστηκε για δύο δωρεάν και επιφάνεια δεσμευμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας τιτλοδότηση μικροθερμιδομετρία και συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων, αντίστοιχα (Πίνακας 1 και Σχ S3). Η συγγένεια για ΟΙοΝΑο είναι στο ίδιο εύρος με εκείνη που μετριέται στο παρελθόν από την ITC με μητρική ΠΛ απομονωθεί από μανιτάρι (Kd ≈200 μΜ) [13]. Ποσοτικές μετρήσεις επιβεβαίωσαν μια ισχυρότερη συγγένεια για GlcNAcβ1-3Gal-τερματίζεται δομές απ ‘ότι για ΟΙοΝΑο και chitooligosaccharides, με σταθερά διαστάσεως περίπου 70 μΜ για την τρισακχαρίτη λακτο-Ν-τριόζης. Παρατηρήθηκε μία καλή συμφωνία μεταξύ τιμές που μετρούνται από τις δύο μεθόδους. Μόνο η Ν-γλυκάνη επτασακχαρίτης παρουσιάζοντας δύο τερματικών GlcNAcβ1-2Man επιτόπων έδειξαν ισχυρότερη συγγένεια για rPVL σε διάλυμα (Kd του 34 μΜ) από ό, τι σε SPR τσιπ. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην δισθενή χαρακτήρα της συγκεκριμένης αλληλεπίδρασης που μπορεί πιο εύκολα να αποδειχθεί με την πρωτεΐνη σε διάλυμα από το σταθερό σε ένα τσιπ. Η σύνδεση των δύο τερματικών υπολειμμάτων ΟΙοΝΑο της διπλής κεραίας επτασακχαρίτη επιβεβαιώθηκε με σύγκριση της στοιχειομετρίας του γραμμικού GlcNAcβ1-3Gal (πέντε συνδετήρες ανά rPVL) και του διπλής κεραίας επτασακχαρίτη (δύο συνδέτες ανά rPVL). Οι θερμοδυναμική της πρόσδεσης ήταν επίσης διαφορετική, δεδομένου ότι η διπλής κεραίας γλυκάνη είναι η μόνη που παρουσιάζει μια ευνοϊκή εντροπία του δέσμευσης (Πίνακας 1), που θα μπορούσε να εξηγηθεί από την preorientation των δύο υπολειμμάτων ΟΙοΝΑο στο χώρο.

Η

κρυσταλλική δομή του rPVL /δισακχαρίτης

rPVL κρυσταλλώνεται σε συγκρότημα με GlcNAcβ1-3Gal, το δισακχαρίτης που caps ακρωτηριασμένη πολυλακτοζαμίνη Ν-γλυκάνες. Η δομή λύθηκε σε 1,95 Ǻ ανάλυση (S1 Πίνακας) και εμφανίζεται το αναμενόμενο επτά λεπίδων β-έλικα φορές (Σχήμα 3). Δύο β-έλικες είναι παρόντες στην ασύμμετρη μονάδα, αλλά δεδομένου ότι είναι πολύ παρόμοια, μόνο αλυσίδα Α περιγράφεται κατωτέρω. Η συνολική δομή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ήταν πολύ παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως για άγριου τύπου ΠΛ [13]. Η κύρια διαφορά ήταν η παρουσία ενός επιπλέον ιόντων ασβεστίου από το rPVL παρουσιάζει ασβέστιο σε τρεις θηλιές. Σαφές πυκνότητα ηλεκτρονίων παρατηρήθηκε για την GlcNAcβ1-3Gal σε πέντε θέσεις πρόσδεσης, ενώ το site 2 είχε καταληφθεί μόνο από ένα κατάλοιπο ΟΙοΝΑο (Σχήμα 3Α και 3Β).

Α. β-έλικα φορές του rPVL με την πεπτιδική αλυσίδα που παριστάνεται ως κορδέλα χρωματισμένο από μπλε (Ν-τερματικό) προς πράσινο (Ο-τερματικό). Οι δισακχαρίτες εκπροσωπήθηκαν ως ραβδί με 2mFo-DFC χάρτες πυκνότητας ηλεκτρονίων περίγραμμα σε 1 σ (0,4 ε a

-3). Τα ιόντα ασβεστίου εκπροσωπήθηκαν ως ροζ σφαίρα. B. Ίδια έλικα με διαλύτη προσιτή επιφάνεια της πρωτεΐνης. Γ και Δ, τα στοιχεία της αλληλεπίδρασης στην περιοχή 1 με δισακχαρίτης και νερό μόρια. Οι δεσμοί υδρογόνου εκπροσωπήθηκαν ως διακεκομμένες γραμμές στο πάνελ D. Όλα τα γραφικά έχουν συνταχθεί με την αλυσίδα Α χρησιμοποιώντας το λογισμικό PyMol (Schrödinger).

Η

Σε κάθε μία από τις έξι θέσεις σύνδεσης, το τερματικό ΟΙοΝΑο ήταν η ίδιο προσανατολισμό όπως στο συγκρότημα PVL /ΟΙοΝΑο, και καθιέρωσε το ίδιο δίκτυο των δεσμών υδρογόνου. Το υπόλειμμα γαλακτόζης αλληλεπιδρούν σε μια ρηχή περιοχή κοντά στην θέση δέσμευσης GlcNAc (Σχήμα 3C). Η αλληλεπίδραση του υπολείμματος γαλακτόζης δεν ήταν πολύ ισχυρή, και κυμαινόταν από μία θέση στην άλλη.