Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

Ashwagandha είναι ένα δημοφιλές Ayurvedic βότανο που χρησιμοποιείται στην ινδική παραδοσιακή ιατρική στο σπίτι . Έχει ανατεθεί μια ποικιλία επιδράσεων προαγωγής της υγείας των οποίων οι μηχανισμοί παραμένουν άγνωστα. Αναφέραμε προηγουμένως την εκλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων με εκχύλισμα φύλλων του Ashwagandha (i-Απόσπασμα) και καθαρίστηκε Withanone συνιστώσα της. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο μηχανισμός του από την απώλεια-του-λειτουργία ελέγχου (κατάργηση της επαγόμενης i-Απόσπασμα καρκινικών κυττάρων δολοφονία) των κυτταρικών στόχων και μονοπατιών γονιδίου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Οι τυχαιοποιημένες βιβλιοθήκη ριβοενζύμου εισήχθη σε καρκινικά κύτταρα πριν από την κατεργασία με i-Extract. Τα ριβοένζυμα ανακτήθηκαν από τα κύτταρα που επιβίωσαν της θεραπείας i-Extract. στόχοι Gene των επιλεγμένων ριβοενζύμων (όπως προβλέπεται από έρευνα βάσης δεδομένων) αναλύθηκαν με βιοπληροφορική και αναλύσεις οδό. Οι στόχοι επικυρώθηκαν για το ρόλο τους στην i-Extract προκαλούμενη επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων με βιοχημικές και μοριακές αναλύσεις. Δεκαπέντε γονίδιο-στόχους εντοπίστηκαν και διερευνήθηκαν για το ρόλο τους στη συγκεκριμένη δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων δολοφονία του i-Extract και δύο κύρια συστατικά του (Withaferin Α και Withanone) αναλαμβάνοντας την shRNA μεσολάβηση προσέγγιση γονιδιακή σίγηση. Βιοπληροφορική στις επιλεγμένο γονίδιο-στόχους αποκάλυψε την εμπλοκή της ρ53, η απόπτωση και η ινσουλίνη /IGF οδοί συνδέονται με την σηματοδότηση ROS σηματοδότησης. Εξετάσαμε τη συμμετοχή των συστατικών ROS σηματοδότησης (επίπεδα ROS, βλάβη του DNA, μιτοχονδριακό δομή και το δυναμικό μεμβράνης) και αποδεικνύουν ότι η επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων διαμεσολαβείται από επαγωγή του οξειδωτικού στρες.

Συμπέρασμα

Ashwagandha εκχύλισμα φύλλων και Withanone προκαλέσει επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από επαγωγή ROS-σηματοδότησης και ως εκ τούτου οι πιθανές αντιδραστήρια τα οποία θα μπορούσαν να προσληφθούν για ROS μεσολάβηση χημειοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Widodo Ν, Priyandoko D, Shah Ν, Wadhwa R, Kaul SC (2010) επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από Ashwagandha Leaf Extract και Component Withanone του συνεπάγεται ROS Σηματοδοσίας. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10.1371 /journal.pone.0013536

Συντάκτης: Vladimir Ν Uversky, Πανεπιστήμιο της Ιντιάνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Ιούλη 2010? Αποδεκτές: 23 Σεπτεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτ, 2010

Copyright: © 2010 Widodo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από την Νέα Ενέργεια και Βιομηχανικής Τεχνολογίας Οργανισμός Ανάπτυξης (Ιαπωνία). Ν Σ είναι αποδέκτης MEXT Υποτροφιών, Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ινδική παραδοσιακή σύστημα home ιατρικής, Αγιουρβέδα είναι γνωστή για παλαιότερη ιστορία της στον κόσμο. Ashwagandha (

βιθάνια

? Solanaceae) χορτάρι, περήφανα που ονομάζεται βασίλισσα της Ayurveda, είναι ένα από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα φυτά στην Αγιουρβέδα για μια ποικιλία των επιπτώσεων που κυμαίνονται από αναλγητικό, στυπτικό, προσαρμογόνο, αντι-φλεγμονώδη, αντι -stress, αντισπασμωδικό, κατά του διαβήτη, ανοσο-διεγερτικό και καρδιοπροστατευτική [1] – [4]. Αποσπάσματα από διάφορα μέρη του φυτού, συμπεριλαμβανομένων ρίζα, βλαστός, σπόροι και καρποί έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες συνταγές σπίτι-θεραπεία? ρίζα είναι ιδιαίτερα μια κοινή πηγή για την προαγωγή της υγείας αλκαλοειδή, withanolides και αντιοξειδωτικά. Τα κύρια ενεργά συστατικά του Ashwagandha φύλλα είναι αλκαλοειδή και στεροειδή λακτόνες (κοινώς γνωστό ως Withanolides) [5] – [7]. Είχαμε προηγουμένως ερευνήσαμε την βιολογική δράση σε αλκοολικό εκχύλισμα του εκχυλίσματος φύλλου Ashwagandha (i-Απόσπασμα) και απέδειξε ότι έχει μια ισχυρή αντικαρκινική δράση. Με χημική κλασματοποίηση, η δραστηριότητα ανατέθηκε στο συστατικό Withanone του (i-Factor) που φάνηκε να προκαλεί την ενεργοποίηση της ρ53 πρωτεΐνης καταστολέα όγκου σε καρκινικά κύτταρα μόνο [8], [9]. Φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών παρουσίασαν τα κάτω ρύθμιση της λειτουργίας ρ53 και καθυστερημένη γήρανση [10].

Στην παρούσα μελέτη, αναμένεται ότι ο επιλεκτικός καρκινικό κύτταρο-θανάτωση επίδραση του i-εκχυλίσματος ή Withanone είναι πιθανό να διαμεσολαβείται από περισσότερα από ένα γονίδια /μονοπάτια και ως εκ τούτου ανέλαβε μια αμερόληπτη απώλεια-του-λειτουργία προσέγγισης όπου γονιδίου νοκ ντάουν επιτεύχθηκε με ριβοένζυμα σφύρα. πληθυσμός ριβοζύμης διασώθηκε από τυχαιοποιημένες ριβοένζυμο βιβλιοθήκη μολυσμένα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού που επιβίωσαν η θεραπεία i-εκχύλισμα χαρακτηρίστηκε. Βιοπληροφορική, βιοχημική και οπτικές δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται για τη διερεύνηση των προσδιορισμένων στόχων του γονιδίου και να αποκαλύψει τη συμμετοχή τους στο i-Απόσπασμα που προκαλείται από τον καρκίνο θανάτωση κυττάρων. Έχουμε αποδείξει ότι η επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από το i-Extract και Withanone που το απαρτίζουν περιλαμβάνει ROS σηματοδότησης.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Hammerhead ριβόζυμα (HH-Rz) είναι οι μικρές καταλυτικό RNA που κατέχουν συντηρημένη hammerhead σαν δευτερεύουσα δομή. Μπορούν φορές στην δραστική διαμόρφωση με σύνδεση προς τα ιόντα μετάλλου και υδρολύουν δεσμούς φωσφοδιεστέρα του RNA κλώνων σε ειδικές θέσεις (NUX, όπου το Ν μπορεί να είναι οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο και το Χ μπορεί να είναι Α, C ή U) και ως εκ τούτου είναι γνωστά ως «RNA ψαλίδι» [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz έχουν χρησιμοποιηθεί ως εργαλεία γονίδιο- σίγησης λόγω των χαρακτηριστικών τους, όπως η ειδικότητα, δέσμευση υψηλής υπόστρωμα, αυτοκαταλυτική δραστηριότητα που δεν απαιτεί άλλα ένζυμα, εύκαμπτη δομή που επιτρέπει χειρισμούς και έλλειψη ανταπόκρισης ιντερφερόνης σε κύτταρα θηλαστικών [13], [ ,,,0],14]. Προκειμένου να δημιουργηθεί ένα γονίδιο ειδικό ριβοένζυμο, οι βραχίονες αναγνώριση της (7-9 νουκλεοτίδια που πλευρίζουν την θέση στόχο) που έχουν σχεδιαστεί για να συμπεριλάβει αλληλουχία συμπληρωματική με το mRNA στόχο. Η τυχαιοποίηση αυτών των 7-9 νουκλεοτιδίων σε κάθε βραχίονα αποδίδει μεγάλη ποικιλία ριβοενζύμου ικανά να στοχεύουν πολλαπλούς υποστρωμάτων mRNA [11]. Τέτοια πισίνα εκφυλισμένων ριβοενζύμων που εκφράζεται από ένα εξωγενές υποκινητής έχει χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την ταυτοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, μετανάστευση, εισβολή, τη διαφοροποίηση και ασθένειες [15] – [20]. Για τον εντοπισμό των κυτταρικών στόχων που εμπλέκονται στον καρκίνο κύτταρο κυτταροτοξικότητα του εκχυλίσματος φύλλων Ashwagandha (i-Extract), μπορούμε μολυσμένα τα κύτταρα MCF7 με ρετροϊό οδηγείται τυχαιοποιημένη βιβλιοθήκη ριβοένζυμο πριν από την θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, όταν τα κύτταρα μολύνονται φορέα (έλεγχος) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με i-Extract οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο, ριβοένζυμο βιβλιοθήκη μολυσμένα καλλιέργεια έδειξε την επιβίωση των κυττάρων. Τα ριβοένζυμα διασώθηκαν από αυτά επιβιώνουν κυτταρικό πληθυσμό και χαρακτηρίζεται από κλωνοποίηση και ανάλυση αλληλουχίας. στόχοι γονίδιο για τις απομονωμένες αλληλουχίες ριβοενζύμου προσδιορίστηκαν με βάση δεδομένων αναζήτησης (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Οι δυνητικοί στόχοι γονίδιο των αλληλουχιών ριβοενζύμου που απομονώθηκαν πολλές φορές αναφέρονται στο Σχήμα 1Γ. Προκειμένου να επικυρωθεί η συμμετοχή αυτών των γονιδίων σε επαγόμενη από i-Απόσπασμα καρκινικών κυττάρων θανάτωσης, αναλάβαμε αμφίδρομη αναλύσεις (i) το γονίδιο συγκεκριμένες shRNA μεσολάβηση αποσιώπηση και (ii) η βιοπληροφορική και τη συστημική βιολογία κατευθύνονται έρευνα οδού. Είμαστε προετοιμασμένοι 7 γονιδίου (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 και ING1) συγκεκριμένες Τα siRNAs και να διερευνηθεί η συμμετοχή τους στο i-Extract και τα συστατικά του (Withanone και Withaferin Α) που προκαλείται θανάτωση κυττάρων MCF7. Ακόμη και κάτω από την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης που κυμαίνονται από 40-60%, όπως προσδιορίζεται με επιμόλυνση ενός πλασμιδίου που εκφράζουν GFP, αποσιώπηση των τεσσάρων γονιδίων (Ομάδα 1 – TPX2, ING1, TFAP2A και LHX3) συσχετίστηκε με σημαντική (20-40%) αυξάνουν σε κύτταρο επιβίωσης μετά την αγωγή ί-Extract (Σχήμα 2). Τα άλλα τρία γονίδια (Ομάδα 2 – IGF2R, SREBF2 και AKAP11) έδειξε μόνο μικρή αύξηση (2-8%) στην επιβίωση. Περαιτέρω, τα κύτταρα σε κίνδυνο για την έκφραση των τεσσάρων γονιδίων Ομάδα 1 διέφυγε την κυτταροτοξική δράση τόσο του Withanone και Withaferin Α πρότεινε Αυτά τα δεδομένα ότι αυτά τα τέσσερα γονίδια μεσολαβούν την κυτταροτοξικότητα του i-Extract. Ωστόσο, μπορεί να μην είναι κρίσιμο ρόλο στην επιλεκτική τοξικότητα του i-Extract και Withanone σε καρκινικά κύτταρα, όπως περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες μας αποδεικνύουν την εμπλοκή του ρ53 καταστολέα του όγκου μονοπάτι σε αυτό το φαινόμενο [8]. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι ο καρκίνος θανάτωση των κυττάρων από το i-Απόσπασμα επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση, τουλάχιστον εν μέρει, από TPX2, ING1, TFAP2A και LHX3. TPX2 είναι μια σχετιζόμενη με μικροσωληνάριο πρωτείνη που λειτουργεί ως ρυθμιστής αλλοστερικός του Aurora-Α, ενός ογκογονιδίου με ουσιαστικό ρόλο στην ωρίμανση του κεντροσώματος και το χρωμόσωμα του διαχωρισμού κατά τη διάρκεια της μίτωσης που απαιτεί τη συναρμολόγηση και τη συντήρηση μιας διπολικής ατράκτου [21] – [23]. Είναι υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους και έχει προταθεί ως ένα ελκυστικό στόχο αντικαρκινικό [24]. TFAP2A παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου με ρύθμιση της Ε-καδερίνης, ΜΜΡ-2, c-kit, ρ21

WAF-1, HER-2, BCL-2, ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα υποδοχέα-1 και σηματοδότηση Smad [25]. LHX3 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής ομοπεδίου και διαδραματίζει θετικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, τον καθορισμό της κυτταρικής τύχης και ογκογένεση [26], [27]. Από την άλλη πλευρά, ING1, ένας ING οικογένεια πρωτεϊνών, εμπλέκεται στην ανθρώπινη κυτταρική γήρανση, καταστολή του όγκου και απόπτωση [28], [29]. ING1 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν δραστικότητα ρ53 και κατάντη επενεργητές του, ρ21

WAF1 και Bax με ακετυλίωση και σταθεροποίηση [30]. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα πρότεινε ότι ο καρκίνος θανάτωση των κυττάρων από το i-Απόσπασμα μπορεί να περιλαμβάνει την καταστολή της TPX2, TFAP2A και LHX3, και ενεργοποίηση των λειτουργιών ING1? ο μηχανισμός και η εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα εξακολουθούν να remian ασαφής.

Σχηματική παρουσίαση της απώλειας λειτουργίας διαλογής χρησιμοποιώντας τυχαιοποιημένη βιβλιοθήκη ριβοενζύμου. κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με το i-Απόσπασμα έδειξε κυτταροτοξικότητα (

Α

). i-Απόσπασμα αντιμετωπίζονται επιζώντα κύτταρα συλλέχθηκαν (

Β

). Τα ριβοένζυμα διασώθηκαν από τα επιβιώσαντα κύτταρα με κλωνοποίηση και χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση αλληλουχίας (

B

). Οι στόχοι υποψήφιο γονίδιο φαίνεται στο (

C

).

Η

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς που εκφράζουν shRNA για υποδεικνύεται γονίδια. Η επίδραση της i-Extract αξιολογήθηκε με δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με ανάλυση διασποράς δοκιμής (ANOVA).

Η

Για τον εντοπισμό κρίσιμο κυτταρικούς στόχους, είμαστε δίπλα ανέλαβε βιοπληροφορική και τη συστημική προσέγγιση της βιολογίας και εξέτασε το δίκτυο /μονοπάτια των καθορισμένων στόχων γονίδιο που περιγράφεται παραπάνω (Σχήμα 3). Οι αναλύσεις αποκάλυψαν την εμπλοκή των απομονωμένων στόχων γονιδίου σε διάφορα είδη βιολογικών διαδικασιών όπως, η ογκογένεση, τον κυτταρικό κύκλο, την επιδιόρθωση του DNA και του μεταβολισμού νουκλεϊνικών οξέων (Σχήμα 3Α). Οι κορυφαίοι δύο πανομοιότυπες οδούς ήταν καταστολέα όγκου ρ53 (στόχοι γονίδιο – DDB2, CDKN1A, CDKN2B) και την απόπτωση (γονίδιο στόχους – IGF2R και HSPA9). Αξίζει να σημειωθεί, οι αναλύσεις έδειξαν ότι το 33% των γονιδίων που εμπλέκονται στην ρ53 μονοπάτι και η ρύθμισή της, και 7% των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση ταυτοποιήθηκαν υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική θανάτωση από i-Extract περιλαμβάνει διακοπή αύξησης ή απόπτωση, που διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικό ρ53 οδού. Επιπλέον, Ras, μονοπάτια ινσουλίνη /IGF, την αγγειογένεση και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού που συνδέονται στενά με την απόπτωση και την ανάπτυξη όγκων εντοπίστηκαν επίσης. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η αποσιώπηση γονιδίων στόχων καταργήσει τη μεσολάβηση i-Extract θανάτωση κυττάρων, προστατεύοντας τα κύτταρα από βλάβη του DNA, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. ανάλυση της αλληλεπίδρασης του δικτύου των γονιδίων στόχων συνέλαβε τέσσερις συστάδες γονιδίων – CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 και ING1 συνδέονται με ρ53 και PCNA. Συμμετοχή αυτών των συστάδων γονιδίων κατά τη διάρκεια που προκαλείται από i-Απόσπασμα κυτταροτοξικότητα υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως κυτταρικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένων αντίδραση στο στρες (HSPA9, CDKN1A) και βλάβες στο DNA και την ανταπόκριση επισκευής (ING1, DDB2 και TFAP2A), πιστοποιείται σε κάθε διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση (Σχήμα 3D). Με βάση αυτές τις παραμέτρους που προσδιορίζονται από την ανάλυση βιοπληροφορικής, προβλέψαμε ότι το i-Extract θα μπορούσε να προκαλέσει μια ενεργοποίηση του κυτταρικού στρες σηματοδότηση από ROS μεσολάβηση μονοπατιών κινηθεί σε δύο επίπεδα (i) μιτοχονδριακή στρες που οδηγεί σε αλλαγή στο δυναμικό της μεμβράνης και (ii) βλάβη του DNA στρες που οδηγεί στην ενεργοποίηση της βλάβης του DNA και μηχανήματα επιδιόρθωση (Σχήμα 3Ε). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα περισσότερα από τα προσδιορισθέντα στόχων γονίδιο φάνηκε να χωρέσουν στις προβλεπόμενες οδούς σηματοδότησης (Σχήμα 3Ε). Προκειμένου να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, ερευνήσαμε αν CDKNIA-p21 είναι η κρίσιμη ρυθμιστής του μεσολάβηση i-Extract θανάτωσης καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, με τη μεσολάβηση i-Extract διακοπή της ανάπτυξης σε κύτταρα MCF7 (Εικόνα 4Α) συσχετίστηκε με μια ενεργοποίηση του CDKN1A-p21 (Σχήμα 4Β). Ερευνήσαμε επίσης να εξετάσει κατά πόσον CDKN1A-p21 ήταν ένας κρίσιμος μεσολαβητής της επαγόμενης i-Απόσπασμα επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Β και 4C, ενώ CDKN1A-p21 ήταν αυξημένη σε κύτταρα MCF7, παρέμεινε αναλλοίωτη σε φυσιολογικά κύτταρα (TIG-3) σε απόκριση είτε i-εκχύλισμα ή θεραπεία Withanone. Σε αντίθεση, Withaferin Α προκάλεσε κυτταροτοξικότητα τόσο καρκίνο και φυσιολογικό κύτταρο και θεωρήθηκε να ενεργοποιήσει CDKN1A-ρ21 (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ενεργοποίηση του CDKN1A-p21 στον έλεγχο και i-Extract επεξεργασμένα κύτταρα MCF7 μετά τις επιμολύνσεις των τεσσάρων Τα siRNAs που ακύρωσε i-Extract θανάτωση που προκαλείται MCF7 κυττάρων, τουλάχιστον εν μέρει (Σχήμα 2). Όπως φαίνεται στις Εικόνες 4D και 4Ε, βρήκαμε ότι η επαγόμενη i-Extract αύξηση στην έκφραση CDKN1A-ρ21 καταργήθηκε από knockdown του καθενός από αυτά τα τέσσερα γονίδια-στόχους. Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η CDKN1A-ρ21 είναι ένας κρίσιμος μεσολαβητής της επαγόμενης i-Extract επιλεκτική διακοπή της ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα. Τελικά δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση με τη χρησιμοποίηση ισογονιδιακές p53

+ /+, p53

– /-, ρ21

+ /+ και p21

– /- HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι ενώ το ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα έδειξαν συγκρίσιμη ευαισθησία στο i-Extract (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το ρ21

– /- κύτταρα ήταν δύο έως τρεις φορές πιο ανθεκτικά σε i-Extract θεραπεία σε σύγκριση με την ρ21

+ /+ κύτταρα (Σχήμα 4F) προωθεί τη συγκεκριμένη CDKN1A-p21 είναι πράγματι ένα ζωτικό μεσολαβητής της διακοπής της ανάπτυξης που επάγεται από i-Extract σε καρκινικά κύτταρα. Τα στοιχεία ήταν σύμφωνα με το μοντέλο μας πρότεινε στο σχήμα 3Ε.

Οι βιολογικές διαδικασίες που εμπλέκονται στην μεσολάβηση i-Απόσπασμα κυτταρικό θάνατο είχαν προβλεφθεί να περιλαμβάνουν την ογκογένεση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου (

A

) και συμμετέχουν p53, απόπτωση, και η ινσουλίνη /IGF οδών σηματοδότησης (

Β

). Πιο κυρίαρχη μεταξύ αυτών των οδών ήταν ρ53 και την απόπτωση (

C

). Τα γονίδια-στόχους εμφανίστηκε ως τέσσερις συστάδες (CDK4, ρ21, ING1 και TFAP2A) που συνδέονται με ρ53 και PCNA, εμπλέκονται σε κυτταρικό κύκλο, η απάντηση βλάβες στο DNA και γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA (

D

). Με βάση τα επιλεγμένα γονίδια στόχοι, είχε προβλέψει ότι το i-Απόσπασμα μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων δολοφονία εμπλέκονται με τη μεσολάβηση ROS- βλάβη στο DNA και μιτοχονδριακό επίπεδο με CDKN1A ως κρίσιμο μεσολαβητή (

E

).

προκαλείται από i-Απόσπασμα ανάπτυξης σύλληψη των κυττάρων MCF7 οφειλόταν στη σύλληψή τους σε φάση G2 του κυτταρικού κύκλου (

Α

). Μια αύξηση στην έκφραση CDKN1A-ρ21 παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 όταν θεραπεύτηκαν με i-Extract και Withanone. Καμία αύξηση στην έκφραση CDKN1A-p21 παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα παρουσία είτε i-Απόσπασμα ή Withanone (

Β

και

C

). Knockdown καθενός από τα τέσσερα γονίδια που υποδεικνύονται παραβιαστεί επάγεται i-Extract κυτταροτοξικότητα επανήλθε επίσης το i-Extract επαγόμενη CDKN1A-p21 αυξητική ρύθμιση (

D

και

E

). HCT116 p21

– /- κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε i-Απόσπασμα σε σύγκριση με ισογονιδιακές p21 τους

+ /+ κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση προς τα σειριακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις Ι-Extract (

F

).

Η

Όπως προβλέπεται από ανάλυση οδού (Σχήμα 3Ε), έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η εμπλοκή της βλάβης του DNA και την επισκευή-μονοπάτι σηματοδότησης στην επαγόμενη από το i-Απόσπασμα καρκινικών κυττάρων θανάτωσης. Όπως φαίνεται, τα κύτταρα MCF7 έδειξε επαγωγή του γH2AX (πρώιμο δείκτη της ανταπόκρισης βλάβη του DNA) σε απόκριση στη θεραπεία με i-Extract, Withaferin Α και Withanone (Σχήματα 5Α και 5Β). Εξετάσαμε επίσης την φωσφορυλίωση του γH2AX με ανοσοχρώση με ένα ειδικό αντίσωμα φωσφορυλίωση και διαπίστωσε ότι ο αριθμός των κυττάρων που περιέχουν φωσφορυλιωμένα γH2AX ήταν 70% υψηλότερη σε i-Extract κύτταρα που κατεργάζονται σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 5Β). Ότι η Withaferin Μια θεραπεία που προκαλείται γH2AX σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα, i-Extract και Withanone επάγεται γH2AX μόνο σε καρκινικά κύτταρα (Σχήματα 5Α και 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η επιλεκτική καρκινικών κυττάρων θανάτωση από i-Extract και Withanone επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση επαγωγή της βλάβης του DNA και CDKN1A-ρ21, όπως προβλέπεται στο σχήμα 3Ε.

εστιών βλάβης του DNA (

A

), επαγωγή και φωσφορυλίωση γH2AX (

Β

) -assessed με χρώση με φωσφο-ειδικό αντίσωμα (100-200 κύτταρα ανά διαφάνεια μετρήθηκαν) ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα MCF7 σε επεξεργασία με i-Extract, Withaferin Α και Withanone. Φυσιολογικά κύτταρα έδειξαν DNA απάντηση βλάβη κατά τη θεραπεία μόνο με Withaferin Α (

Μια

και

C

).

Η

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί η συμμετοχή του αντίδραση στο στρες που ξεκίνησε στο μιτοχόνδρια στην επαγόμενη από το i-Απόσπασμα MCF7 θανάτωση κυττάρων. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 6Α και 6Β, η επαγωγή των ROS παρουσία του i-Εκχύλισμα ανιχνεύθηκε, τόσο από ανοσοχρώση και μέθοδοι φθορισμού Probe (HPF). Σε συμφωνία με την κυτταροτοξικότητα των δύο συστατικών (Α και Withaferin Withanone) του i-Extract, επαγωγή ROS ανιχνεύθηκε τόσο από τα συστατικά σε κύτταρα MCF7 και μόνο από Withaferin Α σε TIG-3 κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία με i-Extract και Withanone οδηγούν σε επαγωγή των ROS, επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα, ως εκ τούτου, θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων. Είμαστε δίπλα ανέλυσε τις δυνατότητες της μιτοχονδριακής μεμβράνης που επηρεάζεται πολύ από τα επίπεδα ROS. Όπως φαίνεται στα σχήματα 6C και 6D, υπήρξε μια μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα MCF7, όπως φαίνεται τόσο από JC-1 χρώσης και δοκιμασία αποκλεισμού Rho-123. Κατά την επεξεργασία με i-εκχυλίσματος, κύτταρα MCF7 έδειξε μετατόπιση στη χρώση JC-1 από κόκκινο σε πράσινο (Σχήμα 6C) και αρνητικό για χρώση Rho-123. Αξίζει να σημειωθεί ότι η κανονική (TIG-3) τα κύτταρα ήταν ανθεκτικοί σε αυτές τις αλλαγές, όταν έλαβαν θεραπεία είτε με i-Απόσπασμα ή Withanone (Σχήμα 6C). Αυτά τα στοιχεία μας έκανε να πιστεύουμε ότι το i-Extract που προκαλείται από την επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων που εμπλέκονται ROS στρες και μιτοχονδριακή βλάβη. Για να αποκτήσει πιο σαφή αποδεικτικά στοιχεία, εξετάσαμε την υπερδομή του ελέγχου και της i-Απόσπασμα κατεργασμένων κυττάρων MCF7 σε επίπεδο ενός κυττάρου. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 6Ε, ελέγχουν κύτταρα MCF7 παρουσίασαν τυπικά μιτοχονδριακή μορφολογία, η οποία χαρακτηρίζεται από μια διπλή μεμβράνη που περιέχει ένα ομοιογενές μήτρα και ένα σύστημα παράλληλων ακρολοφίες. κύτταρα κατεργασμένα Withanone έδειξε πρησμένο μιτοχόνδρια με μια αλλαγμένη μορφολογία των οποίων η συντόμευση και μείωση του αριθμού των ακρολοφίες ήταν εμφανείς (Σχήμα 6Ε).

κύτταρα

MCF7 έδειξε την επαγωγή της ROS όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με i-Extract, Withaferin Α ή Withanone (

Μια

και

Β

). Τα φυσιολογικά κύτταρα παρουσίασαν επαγωγή ROS μόνο με την παρουσία του Withaferin Α (

A

). Απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε καρκινικά κύτταρα MCF7, όπως φαίνεται με χρώση JC-1 ανιχνεύθηκε με i-Extract μόνο (

C

). Προνομιακή επαγωγή της απώλειας του μιτοχονδριακού δυναμικό trans-μεμβράνης στα κύτταρα MCF7 ανιχνεύονται με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας RHO-123 αυξήθηκε από 0,2% του πληθυσμού σε έλεγχο στο 44% του πληθυσμού που έλαβαν θεραπεία με το i-Extract (

D

). Μιτοχονδριακή βλάβη ανιχνεύθηκε σε Withanone-επεξεργασμένα κύτταρα MCF7. (

E

), Μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εικόνες ελέγχου και Withanone επεξεργασμένα κύτταρα MCF7. κύτταρα ελέγχου έδειξε φυσιολογική επίμηκες μιτοχονδριακό (Μ) με παράλληλη ακρολοφίες (α) (διευρυμένη κουτί εικόνα,

β

), Withanone επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν πρησμένα μιτοχόνδρια με μειωμένο αριθμό του ακρολοφίες (γ) (διευρυμένη εγκλωβιστούμε εικόνα,

δ

). Ν, Nucleus.

Η

ROS είναι χημικά αντιδραστικά μόρια που έχουν ουσιαστικό ρόλο στη μεταγωγή σήματος, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων, τη ρύθμιση των δραστηριοτήτων ενζύμου και ανοσολογική απόκριση συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής και της παραγωγής κυτοκινών. Ότι μια μέτρια αύξηση σε ROS προάγει πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, η υπερβολική ποσότητα του προκαλεί μη αναστρέψιμη οξειδωτική βλάβη στο DNA, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Τα καρκινικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν υψηλή οξειδωτικό στρες και την αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε σύγκριση με τις κανονικές τους ομολόγους. Το υψηλότερο επίπεδο ROS χρησιμεύει ως εκλεκτικός θεραπευτικό στόχο, καθιστώντας τα καρκινικά κύτταρα ευάλωτα σε ROS παραγωγής αντιδραστηρίων, που προτείνεται ως χημειοθεραπευτικά αντιδραστήρια [31]. Ένας μικρός αριθμός μελετών έχουν παρουσιάσει στοιχεία για την ROS- μεσολάβηση επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Αυτές περιλαμβάνουν, επιλεκτική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα με εκχύλισμα αβοκάντο [32], βήτα-φαινυλαιθυλ ισοθειοκυανικό (PEITC) [33], η θαλιδομίδη ανάλογα [34] και MKT077 [35] – [36]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περισσότερα από αυτά τα αντιδραστήρια έχουν δειχθεί ότι προκαλούν μιτοχονδριακή δυσλειτουργία [31] – [39]. Έχουμε αποδείξει, για πρώτη φορά, ότι το εκχύλισμα Ashwagandha φύλλο (i-Extract) και το συστατικό της, Withanone δρουν ως παράγοντες ROS παραγωγής προκαλώντας DNA και μιτοχονδριακή βλάβη discriminately σε καρκινικά κύτταρα, και ως εκ τούτου είναι καλοί υποψήφιοι για την ασφαλή θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και τυχαιοποιήθηκαν βιβλιοθήκη hammerhead ριβοένζυμο διαλογής

Ανθρώπινο φυσιολογικούς ινοβλάστες (TIG-3), καρκίνωμα μαστού (MCF7), καρκίνωμα παχέος εντέρου (HCT116- ρ53

+ /+, p53

– /-, ρ21

+ /+ και p21

– /-) και τη συσκευασία κύτταρα ποντικού, PLAT-Ε ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB) κυττάρων Τράπεζα και καλλιεργούνται σε ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8] – [10]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με i-Extract, Withanone και Withaferin Α για 48-72 h για βιωσιμότητα, βιοχημικές και οπτική αναλύσεις. Οι τυχαιοποιημένες βιβλιοθήκη ριβοένζυμο (ρΜΧ-puro /Rz) παρασκευάστηκε και μολύνθηκαν σε κύτταρα MCF7 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε πουρομυκίνη (2 μg /ml) με συμπλήρωμα μέσου για 24-48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με i-Extract. RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας Isogen (Invitrogen), από επιβιώσαντα κύτταρα μετά από 4-5 ημέρες, όταν όλα τα κύτταρα σε τρυβλίο ελέγχου είχαν πεθάνει. Ολικό RNA (2 μα) χρησιμοποιήθηκε για RT-PCR. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με κατώτερο εκκινητή (5′-ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ TTG GTA C-3 ‘) και MMLV μεταγραφάσης (42 ° C, 90 λεπτά) και το RT-προϊόν υποβλήθηκε σε PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας άνω (5’ -TCC CCG GTT AAC CGA CGG GCA-3 ‘) και κατώτερων πριμοδοτών (94 ° -52 ° -72 ° /30 sec το καθένα, 20 κύκλοι). Το ενισχυμένο προϊόν PCR (-150 bp) κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα ΤΑ κλωνοποίησης (Promega) και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητή Τ7.

Gene ειδικό shRNA-φορέα κλωνοποίησης

shRNA φορείς έκφρασης για τα γονίδια 7 (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 και ING1) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [15]. Δύο θέσεις-στόχοι επιλέχθηκαν για κάθε ένα από το γονίδιο. Οι αλληλουχίες στόχοι που έχουν επιλεγεί για ING1 ήταν ATATGAAGTTTAAATTCTA και GCCAAGACCTCCAAGAAGA, για TPX2 ήταν GCAAGAAGGATGATATTAA και GGGGAAGAATGGAACTGGA, για TFAP2A ήταν GGAGGAAGATCTTTAAGAG και GATCAAACTGTAATTAAGA, για AKAP11 ήταν GAGTGAAGCTTTATCAAAT και GCACAAACATGGAAAGTCA, για SREBF2 ήταν GCCTCAACCTCAAACTCAG και ATGCAAAGGTCAAAGATGA, για LHX3 ήταν GCGACGAGTTCTACCTCAT και GGGAGAGCGTTTACTGCAA, καθώς και για IGF2R ήταν GGCAGAAACCCAAACTGAA και GGAGGAAATACTACATTAA.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (MCF-7) κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ng της ενδεικνυόμενης πλασμιδιακού DNA. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με i-Extract (6 μg /ml), Withaferin Α (1 μΜ), Withanone (25 μg /ml) για 48 ώρες. Κενό φορέα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρακολουθήθηκε με δοκιμασία WST-based κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Roche). Η επιλογή των δόσεων για το i-Extract και Withanone βασίστηκαν στην επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, όπως περιγράφεται προηγουμένως (8-10). Χαμηλότερες δόσεις του i-Extract και Withanone φάνηκαν να επάγουν τη διαφοροποίηση του γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος κύτταρα [40, και τα δεδομένα δεν φαίνεται].

κηλίδωση Western

Το σύνολο λύμα κυττάρων (10-20 μα) σε ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης που λαμβάνεται με φυγοκέντρηση στις 10.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C χρησιμοποιήθηκε για ανοσο-κηλίδωση όπως περιγράφεται [8]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν p53 (DO-1? Santa Cruz Biotechnology), αντι-mortalin [8], p21 (C-19? Santa Cruz Biotechnology) και αντι-γH2AX-φωσφορυλιωμένη (Ser139) αντίσωμα (Biolegend)

Η ανοσοχρώση

τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη: ακετόνη (1:01), διαπερατά σε 0.2% PBST, αποκλείστηκαν με 2% BSA (αλβουμίνη βόειου ορού) /PBS και επωάστηκαν με πρώτο και δεύτερο αντίσωμα αραιωμένο σε 2% BSA /PBS [8]. Για τη χρώση γH2AX, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με διάλυμα KCM (120 mM ΚΟΙ, 20 mM NaCl, 10 mM Tris ρΗ 7,5, 0,1% Triton). Ο αποκλεισμός και αντίσωμα προετοιμασία έγιναν σε διάλυμα Αμπντίλ (2% BSA, 0,2% ζελατίνη, 150 mM NaCl, 0,1% Triton Χ-100, 20 mM Tris ρΗ 7,5, 0,1% αζίδιο του νατρίου σε νερό ΜίΙΙίΟ).

Ανίχνευση αντιδραστικά είδη οξυγόνου

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου ανιχνεύθηκαν με χρώση φθορισμού χρησιμοποιώντας το Image-iT ™ ΖΩΝΤΑΝΑ Πράσινο δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Ανίχνευση Kit (Molecular Probes Inc, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενδεικνυόμενη αντιδραστήρια για 48 ώρες και χρωματίστηκαν για ROS ακολουθώντας τη διαδικασία που συνιστάται από τους κατασκευαστές. Ποσοτικοποίηση της παραγωγής ROS με ανάλυση FACS βασίστηκε σε HPF (2- [6- (4′-υδροξυ) φαινοξυ-3Η-ξανθεν-3-0n-9-υλ] βενζοϊκό οξύ) φθορισμού. Εν συντομία, MCF-7 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 6-cm τρυβλίου μέχρι 50% συρροή, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με i-Extract για 12 ώρες που ακολουθείται από προσθήκη HPF (10 mM). Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν με ξέστρο κυττάρων. φθορισμός των κυττάρων μετρήθηκε με Coulter Epic XL Κυτταρόμετρο ροής (Beckman).

μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης για τον έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα εξετάστηκε με JC-1 και Rho-123 [35] με βάση προσδιορισμούς κυτταρικής χρώσης. Για JC-1 χρώση, τα κύτταρα MCF7 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων (50-60% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με i-Extract για 48 ώρες που ακολουθείται από επώαση με JC-1 κηλίδα (10 μg /ml) για 15 λεπτά στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και υποβάλλονται σε επεξεργασία για μικροσκοπία. Για δοκιμασία RHO-123, MCF-7 κυττάρων αναπτύχθηκαν σε 6-cm τρυβλίου μέχρι 50% συρροή, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με i-Extract για 48 ώρες. Τα κατεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με rho123 (1 mM) με συμπλήρωμα μέσου για 1 ώρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν με κύτταρο-ξύστρα. Αλλαγές στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης παρακολουθούνταν από Coulter Epic XL Κυτταρόμετρο ροής (Beckman).

Ενιαία κελί λεπτήν ανάλυση

κύτταρα MCF7 απλώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Στα 60% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Withanone για 24 ώρες. Έλεγχος και επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 1,2% glutarldehyde σε 4 ° C για 1 ώρα. Μετά μετα-στερέωσης με 1% ΟΣΟ

4 στους 4 ° C για 1 ώρα, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και αφυδατώθηκαν μέσω βαθμιδωτών συγκεντρώσεων αιθανόλης με τελική επώαση σε n-βουτυλο glycidyel αιθέρα για 15 λεπτά. Δείγματα ενσωματωμένα σε εποξική ρητίνη (TAAB) και κόπηκαν σε εξαιρετικά λεπτές τομές με Reichert υπερμικροτόμου (Leica). Οι τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και εξετάστηκαν με ένα Hitachi Η-7000 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Για την αξιολόγηση των μιτοχονδρίων μεταβολές, περίπου 50 κύτταρα ανά δείγμα παρατηρήθηκαν από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Βιοπληροφορική και στατιστικές αναλύσεις

ανάλυση Pathway και βιολογική ένωση διαδικασία χαρτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση των δεδομένων PANTHER-έκφραση [41] , [42], μια εννοιολογικά απλή διωνυμική δοκιμή για να συγκρίνετε ταξινομήσεις των πολλαπλών συμπλεγμάτων της επιλεγμένης λίστας με μια λίστα αναφοράς (NCBI:

Homo sapiens

γονίδια) για να προσδιοριστεί στατιστικά υπερ- ή υποεκπροσώπηση των κατηγοριών ταξινόμησης πάνθηρα. αποτέλεσμα βιολογική διαδικασία επιλέχθηκε με βάση την υπερ-εκπροσώπηση αξία και την αξία P μικρότερη από 0,5. αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών για τα γονίδια στόχους διεξήχθησαν με Osprey με βάση τη Γενική Respository για Σύνολα Δεδομένων Αλληλεπίδραση (το δίκτυο) και Gene onthology (GO) [43].