Αφηρημένο

REV3L, την καταλυτική υπομονάδα της DNA πολυμεράσης ζ (Polζ), διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό του DNA ανοχής σε βλάβη του σύνθεση translesion (TLS). Ο ρόλος του

REV3L

σε χημειοευαισθησία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας χρειάζεται διερεύνηση. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης Polζ σε παραφίνη-ενσωματωμένες ιστούς χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και διαπίστωσε ότι η έκφραση του Polζ στην τραχηλική καρκινικούς ιστούς ήταν υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς. Στη συνέχεια ιδρύθηκε κάποιες καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές με

REV3L

καταστολή ή υπερέκφραση. Η εξάντληση του

REV3L

καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα μέσω G

1 σύλληψης, και

REV3L

προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό αποικιών του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων με την προώθηση G

1 φάση για την μεταβατική φάση S. Η καταστολή του

REV3L

έκφραση αυξημένη την ευαισθησία του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων στη σισπλατίνη, και η υπερέκφραση του

REV3L

ανατίθενται αντοχή στη σισπλατίνη, όπως αποδεικνύεται από τη μεταβολή των ποσοστών απόπτωσης, και σημαντικά αλλαγές επιπέδου έκφρασης των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Β-κυττάρου λέμφωμα 2 (Bcl-2), μυελοειδή αλληλουχία λευχαιμία κυττάρων 1 (Mcl-1) και Β-κυττάρου λέμφωμα-πολύ μεγάλο (Bcl-XL) και προαποπτωτική Bcl-2 σχετίζεται x πρωτεΐνη (Βαχ ). Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι

REV3L

παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του τραχήλου του καρκίνου κυτταρική ανταπόκριση στη σισπλατίνη και έτσι στόχευσης

REV3L

μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος τρόπος για να αλλάξει χημειοευαισθησία σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Παράθεση: Yang L, Shi Τ, Liu F, Ren C, Wang Ζ, Li Υ, et al. (2015)

REV3L

, ένα πολλά υποσχόμενο στόχο για τη ρύθμιση της χημειοευαισθησία των καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 10 (3): e0120334. doi: 10.1371 /journal.pone.0120334

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 28 του Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 29, Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Υποστήριξη παρέχεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. (δεν χορηγούν 81.202.050? https://www.nsfc.gov.cn/.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου είναι το πέμπτο κοινό και η τέταρτη πιο θανατηφόρα μορφή καρκίνου στις γυναίκες παγκοσμίως, με σχεδόν 528.000 νέες περιπτώσεις και 266.000 θανάτους το 2012 [1]. Η χημειοθεραπεία είναι ένα από τα πιο χρήσιμα στρατηγικές συστηματική θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Σισπλατίνη μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα παρέμεινε η κυρίαρχη συστημική θεραπευτική τροπικότητα για τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας για αρκετές δεκαετίες. Ωστόσο, η ανάπτυξη της αντίστασης στην χημειοθεραπευτικών παραγόντων θέτει ένα σημαντικό εμπόδιο που συμβάλλει στην επανεμφάνιση του όγκου, της προόδου, και βέβαιο θάνατο [2].

Αν και οι ακριβείς υποκείμενοι μηχανισμοί δεν είναι πλήρως κατανοητοί, μελέτες έχουν δείξει ότι κάποια DNA βλάβη διαφεύγει επισκευή και μπορούν να μπλοκάρουν τα μηχανήματα αντιγραφής, παρά την ύπαρξη μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA. Για παράδειγμα, η σύνθεση translesion DNA (TLS) επιτρέπει τα κατεστραμμένα κύτταρα να ολοκληρώσει την αντιγραφή του γονιδιώματος με πρόσληψη εξειδικευμένου DNA πολυμεράσες να σταματήσει πιρούνια αναπαραγωγή [3,4]. TLS πολυμεράσες συμβάλλουν στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας, και αλλιώς στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή του DNA μπορεί να καταρρεύσει σε δομές και να προκαλέσει μια DNA διπλό σπάσιμο κλώνου (DSB), με τον τρόπο αυτό να αυξηθεί η γενωμική αστάθεια [3]. Εν τω μεταξύ, οι DNA πολυμεράσες χαμηλής πιστότητας που εμπλέκονται στην αυθόρμητη και DNA βλάβη που προκαλείται από μεταλλαξογένεση, συμβάλλοντας έτσι στην κακοήθη μετασχηματισμό [5,6,7]. Η ενεργοποίηση του TLS μπορεί επίσης να συμβάλει στην επίκτητη αντοχή φαρμάκου σε κύτταρα όγκου αγωγή με αντικαρκινικούς παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA, και αυτό οφείλεται στο γεγονός Polζ ανήκουν στη λειτουργική ομάδα των DNA πολυμερασών TLS παίζει σημαντικό ρόλο στην παράκαμψη πολλών τύπων βλάβης του DNA [8,9,10,11]. Η

REV3L

γονίδιο, το ορθόλογο θηλαστικού της Saccharomyces cerevisiae

Αναθ.3

γονίδιο, κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της Polζ [12,13], ενώ REV7L (επίσης γνωστή ως MAD2L2) αλληλεπιδρά με REV3L μέσω μια ειδική περιοχή δέσμευσης [14,15,16,17].

Ο

REV3L

γονίδιο φαίνεται να εκφράζεται πανταχού τόσο σε φυσιολογικά όσο και κακοήθεις ανθρώπινους ιστούς, ενώ το επίπεδο έκφρασης της ποικίλλει σε διαφορετικές κανονικές και καρκινικών κυττάρων [18,19,20]. Η μοναδική λειτουργία του

REV3L

είναι ασυνήθιστο ενδιαφέρον λόγω της κρίσιμο ρόλο της στην πρόληψη σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα. Για παράδειγμα, τα κύτταρα DT40 κοτόπουλο ανεπαρκή σε

Αναθ.3

έδειξαν μεγαλύτερη ευαισθησία στη σισπλατίνη, σε σύγκριση με άλλες μεταλλάξεις επιδιόρθωσης του DNA ή check-σημείο [21].

REV3

εξάντληση αυξάνει επίσης την ευαισθησία και μειώνει μεταλλαξογένεση που προκαλείται από τη σισπλατίνη σε λεμφώματα Β-κυττάρων ποντικού και καρκίνου του πνεύμονα, κύτταρα ανθρώπου και ποντικού ινοβλάστες και κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος κόλου [22,23,24,25]. Η καταστολή της έκφρασης του

REV1L

, ένα μέλος της οικογένειας πολυμεράσης τύπου Υ που υποστηρίζει την δραστικότητα του ζ DNA πολυμεράσης [13,26], μπορεί να μειώσει σημαντικά το ρυθμό ανάπτυξης της αντίστασης στα φάρμακα σε ανθρώπινο καρκίνωμα ωοθήκης κύτταρα [27]. Επιπλέον, μια μελέτη διαπίστωσε ότι η αναστολή του

REV3

έκφραση per se μπορεί να προκαλέσει επίμονη βλάβη του DNA και αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες πνεύμονα, του μαστού, μεσοθηλίωμα, και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου [28]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η

REV3L

γονίδιο επηρεάζει σημαντικά την κυτταρική αντίσταση στην σισπλατίνη. Ως εκ τούτου, είναι δυνατόν να ξεπεράσει την αντίσταση σισπλατίνη μέσω της αναστολής της

REV3L

.

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση Polζ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικό για φτωχή πρόγνωση, η οποία μπορεί να προκληθεί από την δυναμικό αντίσταση chemoradiation σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [29]. Οι ρόλοι των Polζ στη ρύθμιση της αντίστασης chemoradiation και την πρόβλεψη της πρόγνωσης παραμένουν κακώς χαρακτηρίζεται από το καρκίνωμα του τραχήλου, η οποία αξίζει περαιτέρω διερεύνηση. Ως εκ τούτου, ιδρύσαμε τραχήλου καρκινικών κυτταρικών γραμμών με τα κάτω ρύθμιση ή ανοδική ρύθμιση του

REV3L

και αξιολογήθηκαν την ευαισθησία τους σε σισπλατίνη κυτταροτοξικό παράγοντα και που σχετίζονται με την απόπτωση εκδηλώσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλες οι έρευνες που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες είχαν εγκριθεί από επιτροπή δεοντολογίας Fudan Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Cancer Center (FUSCC). Μια γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους προσλαμβάνονται άτομα, και κάθε κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη της συναίνεσης του Ελσίνκι.

Τα δείγματα ιστών και κυτταρικών γραμμών

Κάναμε μικροσυστοιχίες ιστού χρησιμοποιώντας δείγματα πλακώδες καρκίνωμα από 123 διαδοχικούς ασθενείς καρκίνο του τραχήλου με ΦΥΓΩ (Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής, 2009) στάδια ΙΒ, ΙΙΑ ή ΙΙΒ και 17 ασθενείς με φυσιολογική αυχενική αντιμετωπίζονται μεταξύ του Μαρτίου 2008 και του Μαρτίου 2009 και ώρα FUSCC. Οι ιστοί ιστοπαθολογικά επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους γυναικολογικών (TXY και YG). Η λεπτομερής κλινική σχηματισμός εξήχθη από ηλεκτρονική βάση δεδομένων των ασθενών σε FUSCC, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29].

Οι καθιερωμένες ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές SiHa, HeLa, ΜΕ180 και MS751 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection ( ATCC). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ, HyClone, Thermo Scientific, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Life Technologies, USA), 100 U /ml πενικιλίνη (Biowest, Nuaillé, Γαλλία) και 100 U /ml στρεπτομυκίνη (Biowest, Nuaillé, Γαλλία) και επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με

2.

Ανοσοϊστοχημεία Δοκιμασία

ανοσοϊστοχημεία (IHC) δοκιμασίες 5% CO ήταν διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Το 10 × 12 μικροσυστοιχίες ιστού (TMA) έγινε από FUSCC Tissue Bank, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. IHC διεξήχθη σε 5-μm πάχους τομές TMA χρησιμοποιώντας το αντίσωμα έναντι Polζ (SC-48814, πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, αραίωση 1: 100) και ChemMate

TM EnVision

TM /HRP (υπεροξειδάση horseradish),

Κουνέλι /ποντίκι

, κιτ ανίχνευσης (DAKO, Glostrup, Δανία). Ένα γνωστό δείγμα θετική περίπτωση συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος, και το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με μη άνοσο ορό ποντικού /κουνελιού για αρνητικό έλεγχο. Η χρώση IHC βαθμολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους γυναικολογικών (TXY και YG), οι οποίοι δεν γνώριζαν την ασθενή κλινικά αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης με βάση τόσο ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου και ένταση χρώσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Τέλος, η εκτίμηση της έκφρασης πρωτεΐνης ορίσθηκε ως αρνητικός (≤2 +) και θετικά (& gt? 2 + προς & lt? 6+), και για βαθμολογίες που ήταν μη ερμηνεύσιμη, λόγω της απώλειας του ιστού ή την έλλειψη των καρκινικών κυττάρων, ένα σκορ δεν ισχύει (Ν /Α) ανατέθηκε.

Κατασκευή πλασμιδίου και κυττάρων η επιμόλυνση

Όλα τα εναύσματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είχαν σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας Primer Premier 5 λογισμικού. Για να δοκιμαστεί για πιθανές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, αστάρια ευθυγραμμίστηκαν με τη βάση δεδομένων GeneBank χρησιμοποιώντας το BLAST online εργαλείο. AutoDimer λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των πιθανών δομών φουρκέτας και πιθανούς συνδυασμούς διμερούς αρχικού τεμαχίου. Όλοι οι εκκινητές συντέθηκαν από Sangon Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Τρεις σύντομες φουρκέτα παρεμβολής RNA (shRNA) στόχευσης

REV3L

σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν χημικά και εισήχθη σε ρΒΑΒΕ /U6 /φορέα Puro σύμφωνα με την προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο [32,33]. Έχουμε επιλέξει ένα shRNA με υψηλότερη αποδοτικότητα αναστολής χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές γραμμές με υψηλή έκφραση του

REV3L

(Forward εκκινητής: 5′-GGAGAATAGAACTATGG TGCAAGCCTACGTAGCGTCTGCACCATAGTTCTATTCT CCCTTTTTG-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή: 5’-AATTCAAA AAGGGAGAATAGAACTATGGTG CAGACGCTACGTAGGCTTGCACCATAG TTCTATTCTCC-3 »). Ο φορέας /U6 /Puro ρΒΑΒΕ περιέχουν αρνητικό έλεγχο (NC) shRNA (shGFP) παρομοίως κατασκευάστηκε με απευθείας εισαγωγή ολιγονουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν μικρή φουρκέτα RNA κατά πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη mRNA (shGFP) σε pBabe /U6 /πουρομυκίνης [32,34]. Οι ρετροϊοί που εκφράζουν

REV3L

shRNA ή GFP shRNA παρήχθησαν με επιμόλυνση pBabe /U6 /sh

REV3L

ή pBabe /U6 /shGFP σε κύτταρα αμφοτροπική φοίνικα και χρησιμοποιείται για να μολύνει κύτταρα-στόχους με χρήση μιας μεθόδου περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, τα κύτταρα μολύνθηκαν με τον ιό υπερκείμενα, και μετά από μια ανάκτηση 24 ωρών, τα κύτταρα επελέγησαν με πουρομυκίνη (200 ng /mL) για 10-14 ημέρες για να καθιερωθούν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν shREV3L ή shGFP. Τα προκύπτοντα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς πουρομυκίνη και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Κυτταρικές γραμμές με χαμηλή έκφραση του

REV3L

είχαν επιμολυνθεί με τον pcDNA3.1 /νεο-REV3L πλασμίδιο (που παρέχεται από τον Dr. Yoshiki Murakumo, Nagoya University Graduate School of Medicine, Ναγκόγια, Ιαπωνία) ή το pcDNA3.1 /neo πλασμίδιο αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες και μέσα σε 120 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

RT-PCR και Real-Time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Life Technologies , USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας PrimeScript

Kit TM αντιδραστήριο RT (Takara Biotechnology, Shiga, Japan). Τα προϊόντα PCR ενισχύθηκαν με TaKaRa Taq ΤΜ με αντιδράσεις 30 κύκλους (94 ° C, 30 s? 58 ° C, 30 s? και 72 ° C, 1 λεπτό) χρησιμοποιώντας το Mastercycler® eprealplex (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) . Πέντε μικρολίτρα των προϊόντων PCR αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο και κατέστησαν ορατά υπό φωτισμό UV. Real-time PCR διεξήχθη στο σύστημα Prism 7900 Applied Biosystems (Applied Biosystems, Life Technologies, USA) χρησιμοποιώντας ExScipt Syber πράσινο κιτ QPCR (Takara Biotechnology, Shiga, Japan) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, ένας κύκλος? 95 ° C για 5 s? 55 ° C για 30 s? και 72 ° C για 30 s, 40 κύκλοι? που ακολουθείται από μια ανάλυση καμπύλης τήξης για να ελέγξει την ειδικότητα της ενίσχυσης. Κάθε δείγμα εξετάστηκε εις τριπλούν, και εκκινητές να Γλυκεραλδεΰδη 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκαν σε παράλληλες αντιδράσεις ως εσωτερικός έλεγχος. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν για την τελική αναλύσεις χρησιμοποιώντας το

-ΔΔCT σχετική μέθοδο 2 ποσοτικοποίησης. Τα ζεύγη εκκινητών του

REV3L

που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3 ‘(προς τα εμπρός εκκινητής) και 5′-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3’ (αντίστροφος εκκινητής). Τα ζεύγη εκκινητών του

GAPDH

ήταν 5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3 ‘(προς τα εμπρός εκκινητής) και 5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3’ (αντίστροφος εκκινητής). Τα ζεύγη εκκινητών του

REV7L

ήταν 5′-CTGGAGAAGAATGATGTGGAG-3 ‘(προς τα εμπρός εκκινητής) και 5′-GTGGAGGCTGGGTGATCTCA-3’ (αντίστροφος εκκινητής).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων και Βιωσιμότητας Δοκιμασία Κυττάρων

Για την αξιολόγηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εμείς επιστρώθηκαν 1×10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων με 100 μΐ μέσου συντήρησης. Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε 0-7 ημέρες και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm με Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Ο δείκτης πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε ως πειραματική τιμή OD /έλεγχος τιμής OD. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε επίσης με CCK-8. Εμείς επιμεταλλωμένα 5×10

3 τραχήλου καρκινικά κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις των αντικαρκινικών φαρμάκων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε στη συνέχεια όπως περιγράφεται παραπάνω. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν σε φρεάτια εις τετραπλούν.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα 500 σε μια έξι-φρεατίων εις τριπλούν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 εβδομάδες πριν να στερεωθεί με παγωμένη μεθανόλη και χρωματίστηκαν με βιολετί κρύσταλλο. Τα πειράματα έγιναν τουλάχιστον τρεις φορές για τελικές αναλύσεις.

Western Blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 0,05 Μ EDTA, 1% Triton Χ-100, 0.1% SDS και 0.005 αναστολέα πρωτεάσης × κοκτέιλ). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν σε 10% -15% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% άπαχο γάλα σε PBS-Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επιλέγονται με β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε μετά από επώαση με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., ΡΑ, USA, αραίωση 1: 2000) με τη χρήση της ενισχυμένης μεθόδου χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific, USA). Αντισώματα έναντι Bcl-2, Β-κυτταρικό λέμφωμα-πολύ μεγάλο (Bcl-XL), μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων-1 (Mcl-1), Bcl-2 σχετίζεται x πρωτεΐνη (Βαχ), κυτόχρωμα c, β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, αραίωση 1: 1000) και διασπασμένη κασπάση 3 p17-ειδικό αντίσωμα (Proteintech, IL, USA, αραίωση 1: 1000) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση Western blotting. Western blot πυκνότητα μπάντα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή, και η αναλογία της πυκνότητας ζώνη του κάθε πρωτεΐνη σε β-ακτίνη υπολογίστηκαν ανάλογα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν για τελικές αναλύσεις.

Κύκλου Κυττάρου Η ανάλυση με Κυτταρομετρία Ροής

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο του μονού χρώσης ΡΙ. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε διάλυμα 1 mL ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης σε 3 mL απόλυτης αιθανόλης. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε αιθανόλη όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Στη συνέχεια, η αιθανόλη-αιωρούμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 2000 rpm. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 5 ml PBS για περίπου 30 s και φυγοκεντρείται στις 2000 rpm για 5 λεπτά. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 500 μL χρώσης ΡΙ solutionand διατηρούνται στο σκοτάδι στους 37 ° C για 10 λεπτά. Το δείγμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μία FACScan κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Η απόπτωση Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

Τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν στις ακόλουθες δοκιμασίες απόπτωσης. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης V και ΡΙ χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC (ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με FACScan κυτταρομετρίας ροής.

δοκιμασία ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2000 σε διαφάνειες θάλαμο 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με MeOH και διαπερατά με Triton Χ-100. Στη συνέχεια, τα κύτταρα δεσμεύτηκαν με 1% BSA σε PBS για 2 ώρες, και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι γ-H

2AX (Biolegend, San Diego, CA, USA, αραίωση 1: 200) όλη τη νύκτα. Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν με AlexaFluor-488 δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας-αντι-ποντικού (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., ΡΑ, USA, 1: 200 αραίωση) και τοποθετείται με DAPI. γ-H

εστίες 2AX αξιολογήθηκαν με πράσινο fluroscence. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

Cisplatin θεραπεία

Cisplatin αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). συγκέντρωση στοκ σισπλατίνης ήταν 5 mg /ml. Διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία της αυχενικής σειρές καρκίνου για προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας για διαφορετικό χρόνο. Και σε ανάλυση απόπτωσης, σισπλατίνη χρησιμοποιήθηκαν από τον, ανασταλτική συγκέντρωση 30% 50% υπολογίζεται από τον προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε από φοιτητή

t-test

. Ένα

P

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Polζ σημαντικά εκφράζεται έντονα σε ιστούς του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Για να διερευνήσει τη διαφορά στην έκφραση του

REV3L

μεταξύ ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και φυσιολογικό τράχηλο, ελήφθη η μικροσειρά ιστός από 123 πλακώδες καρκίνωμα των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και 17 ασθενείς με φυσιολογικό τράχηλο και έκφραση Polζ αναλύθηκε χρησιμοποιώντας IHC δοκιμασίας (Εικ. 1Α). τα χαρακτηριστικά των ασθενών και η κατάσταση της έκφρασης Polζ είχαν φαίνεται στο Σχ. 1Β. Μεταξύ των ασθενών 123 τραχηλικό καρκίνο, επτά (6%) ιστοί βαθμολογήθηκαν Ν /Α για την χρώση IHC. Σε γενικές γραμμές, Polζ θετική έκφραση ανιχνεύθηκε σε 21,7% (25/115) στην αυχενική καρκινικούς ιστούς και 5,9% (1/17) στην κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς. Επίσης, η μέση Polζ έκφραση ήταν υψηλότερη στην αυχενική καρκινικούς ιστούς από ότι στις κανονικές του τραχήλου της μήτρας ιστούς (Η βαθμολογία χρώση IHC ήταν 1,72 και 0,82, αντίστοιχα?

P

= 0,034) (Εικ. 1Α, Β).

(Α) Polζ-θετικό (επάνω, αριστερό πάνελ) και Polζ αρνητικά (επάνω, δεξιά πάνελ) έκφραση του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου, Polζ-θετικό (κάτω, αριστερό πάνελ) και Polζ-αρνητικό (κάτω, δεξί πάνελ) έκφραση σε φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς. (Β) Τα κλινικά χαρακτηριστικά και την κατάσταση του Polζ έκφραση των ασθενών καρκίνο του τραχήλου και οι ασθενείς με nomal τράχηλο. Η μέση Polζ έκφραση ήταν υψηλότερη στην αυχενική καρκινικούς ιστούς από ότι στους φυσιολογικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας. (Γ) ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου για το

REV3L

έκφραση mRNA σε τέσσερα τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές.

REV3L

έκφραση ήταν υψηλότερη σε κύτταρα HeLa και SiHa παρά σε κύτταρα MS751 και ΜΕ180. (Δ) Η αντίστροφη μεταγραφή PCR ανάλυση για

REV3L

έκφραση mRNA σε σύντομο φουρκέτα RNA επιμολυσμένα κύτταρα αρνητικού ελέγχου (shGFP), κύτταρα shREV3L,

REV3L

υπερεκφράζουν κύτταρα και κύτταρα ελέγχου φορέα.

REV3L

έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα shREV3L και αυξήθηκε στο

REV3L

κύτταρα που υπερεκφράζουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Η

Ίδρυση του καρκίνου του τραχήλου κυτταρικές σειρές με

REV3L

νοκ ντάουν ή υπερέκφραση

Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του

REV3L

σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, ανιχνεύσαμε το

REV3L

έκφραση του mRNA σε αρκετές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές γραμμές. Και τότε έχουμε δημιουργήσει μοντέλα κυτταρικής σειράς γενετικά τροποποιημένα για

REV3L

έκφρασης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C,

REV3L

έκφραση ήταν υψηλότερη σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές HeLa και SiHa από ΜΕ180 και MS751. Έτσι, κατέστειλε

REV3L

έκφραση σε κυτταρικές σειρές HeLa και SiHa με σταθερή επιμόλυνση shREV3L (Σχ. 1D). Σε αντίθεση,

REV3L

έκφραση υπερεκφράζεται σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές ΜΕ180 και MS751 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα (Σχ. 1D). Έτσι, ενισχύεται η έκφραση

REV3L

σε ΜΕ180 και MS751 κύτταρα. Κανονισμός του

REV3L

γονιδιακής έκφρασης σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές δεν έχουν σημαντική επίδραση στα επίπεδα έκφρασης του mRNA REV7L (S1 Σχήμα).

REV3L

ελέγχει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου

Εμείς ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά την επίδραση του

REV3L

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου και διαπίστωσε ότι

REV3L

εξάντληση κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, όπως εξετάζεται από τη δοκιμασία CCK8 (Εικ. 2Α) και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2Ε). Το κλάσμα των κυττάρων HeLa σε G

1 φάση αυξήθηκε στο 63% μετά την αναστολή της

REV3L

έκφραση σε σύγκριση με 54% σε κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2C). Έτσι, η αναστολή της

REV3L

προκαλεί G

1 σύλληψης του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Η υπερέκφραση του

REV3L

προωθούνται τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 2Β) και αποικία σχηματισμό του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα (Σχ. 2F). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι μία σημαντική μείωση στο κλάσμα των G

1 φάση παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΜΕ180 μετά

REV3L

υπερέκφραση (80%) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (66%) (Σχ. 2D) . Έτσι, η υπερέκφραση του

REV3L

προωθεί G

1 φάση για την μετάβαση S φάση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

(Α) Μείωση του

REV3L

κατέστειλε κυτταρικό πολλαπλασιασμό των HeLa κύτταρα shREV3L και τα κύτταρα SiHa shREV3L. (Β) Ενίσχυση της

REV3L

προωθείται κυτταρικό πολλαπλασιασμό των MS751

REV3L

και ΜΕ180

REV3L

κύτταρα. (C) Μείωση του

REV3L

που προκαλείται G

1 σύλληψης σε κύτταρα HeLa shREV3L. (Δ) Ενίσχυση της

REV3L

προωθείται G

1 φάση για την μεταβατική φάση S σε ΜΕ180

REV3L

κύτταρα. (Ε) Μείωση του

REV3L

κατέστειλε το σχηματισμό αποικιών των HeLa shREV3L και SiHa shREV3L κύτταρα. (F) Ενίσχυση του

REV3L

προώθησε το σχηματισμό αποικιών των MS751

REV3L

και ΜΕ180

REV3L

κύτταρα. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. *

P

& lt? 0.05.

Η

REV3L-

εξάντληση ευαισθητοποιεί καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές με σισπλατίνη

REV3L

RNAi χρησιμοποιήθηκε για να καταστείλει την έκφραση em

REV3L

για να δούμε αν η αναστολή της

REV3L

έκφραση θα μπορούσε να ενισχύσει την χημειοευαισθησία του ανθρώπινου τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα να σισπλατίνη. Τα αποτελέσματα από προσδιορισμούς CCK8 έδειξε ότι μετά από καταστολή του

REV3L

, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης (Εικ. 3Α). Κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε με χρήση χρώσης αννεξίνης V-FITC. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η πρώιμη αποπτωτική ποσοστά σε κύτταρα HeLa shREV3L και SiHa ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι σε κύτταρα HeLa shGFP και shGFP SiHa σε απόκριση σε διαφορετικές δόσεις σισπλατίνης για 24 ώρες (Σχ. 3Β, C). Το 30%, 50%, ανασταλτικές συγκεντρώσεις 70% της σισπλατίνης σε HeLa, SiHa

REV3L

κύτταρα καταστολής και κύτταρα ελέγχου φαίνονται στον Πίνακα 1.

(Α) Καταστολή

REV3L

confered τραχήλου καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης. (Β) Καταστολή

REV3L

έδειξαν υπερευαισθησία στην σισπλατίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες, ακολουθούμενη από χρώση με Annexin V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και propidiumiodide (PI) για πρόωρη αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V + ΡΙ-). Πρώιμων αποπτωτικών ποσοστά του

REV3L

-suppression κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές των κυττάρων ελέγχου φορέα υπό τον ίδιο όρο. (Γ) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από σισπλατίνη. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01.

Η

REV3L

υπερέκφραση προσδίδει ανθεκτικότητα στην σισπλατίνη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Για να επικυρώσετε περαιτέρω την επίδραση του

REV3L

σχετικά με την χημειοευαισθησία των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, εξετάσαμε την ευαισθησία

REV3L

υπερέκφραση κυττάρων σε σισπλατίνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του

REV3L

κατέστησε τα κύτταρα ανθεκτικά σε διάφορες δόσεις σισπλατίνης (Σχ. 4Α). Οι

REV3L

υπερεκφράζουν ΜΕ180 και MS751 κύτταρα έδειξαν μία μείωση στην επαγόμενη από cisplatin πρώιμη απόπτωση (Σχ. 4Β, C). Το 30%, 50%, ανασταλτικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης σε MS751, ΜΕ180 70%

REV3L

κύτταρα υπερέκφραση και κύτταρα ελέγχου φαίνονται στον Πίνακα 2.

(Α) Η υπερέκφραση του

REV3L

καθίσταται τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε σισπλατίνη. (Β) Ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Η υπερέκφραση του

REV3L

ανέστειλε την απόπτωση που προκαλείται από τη σισπλατίνη. (Γ) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από σισπλατίνη. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. *

P

& lt? 0.05.

Η

REV3L

που προκαλείται χημειοαντίσταση διαμεσολαβείται από τα μιτοχόνδρια που σχετίζονται με αποπτωτικό μονοπάτι

Όπως τα μιτοχόνδρια που σχετίζεται με μονοπάτι αποπτωτικών συμμετέχει στην κυτταρική απόκριση σε όγκοι σε πολλά αντικαρκινικά φάρμακα, για να δούμε αν εμπλέκεται σε

REV3L

που προκαλείται αλλαγή στην ευαισθησία στη σισπλατίνη, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bax, κυτόχρωμα c) και αντι-αποπτωτικά πρωτεΐνες (Bcl-2, Bcl- XL, και Mcl-1) στα κύτταρα ελέγχου φορέα και ο

REV3L

υπερεκφράζουν ή καταστολή κυττάρων με κατεργασία σισπλατίνη (Εικ. 5Α, D). Μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη για 24 ώρες, Bcl-2, Bcl-XL και τα επίπεδα Mcl-1 σημαντικά μειωμένη, και Βαχ και επίπεδα κυτόχρωμα c αυξημένη σε κύτταρα HeLa shREV3L και SiHa, σε σύγκριση με τα κύτταρα HeLa και shGFP SiHa. Σταθερά, μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη,

REV3L

κύτταρα που υπερεκφράζουν MS751 και ΜΕ180 έδειξαν υψηλότερα επίπεδα Bcl-2, Mcl-1 και Bcl-XL και χαμηλότερα επίπεδα Βαχ και κυτόχρωμα c, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα . Επιπλέον, μετά από έκθεση σε σισπλατίνη (1 mmol /L) για 72 ώρες, χρόνο αύξηση εξαρτώμενη στις ποσότητες διασπασμένη κασπάση 3 παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa shREV3L και σε μείωση των ποσών της διασπασμένης κασπάσης-3 παρατηρήθηκε σε MS751

REV3L

κυττάρων μετά από μία μόνο θεραπεία δόση 10 μmol /L σισπλατίνης (Εικ. 5C, D). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

REV3L

προσδίδει χημειοαντίσταση στη σισπλατίνη μέσω του αντίστοιχου mitochondria- μονοπάτι αποπτωτικά.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2, Bcl-XL και Mcl-1 ήταν χαμηλότερα και τα επίπεδα του Βαχ και κυτόχρωμα c ήταν υψηλότερα στα κύτταρα shREV3L σύγκριση με κύτταρα shGFP σε απόκριση προς την ίδια δόση σισπλατίνης.

REV3L

υπερεκφράζουν MS751 και κύτταρα ΜΕ180 έδειξαν υψηλότερα επίπεδα Bcl-2, Mcl-1 και Bcl-XL και χαμηλότερα επίπεδα Βαχ και κυτόχρωμα C σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα. (Β) γ-Η

2AX και ρ-p53 (pS15) πρωτεΐνες αυξήθηκαν σε κύτταρα SiHa shREV3L και μειωμένη σε κύτταρα ΜΕ180 REV3L, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μετά τη θεραπεία cisplatin. (C) Χρόνος που εξαρτώνται από την έκφραση του διασπασμένη κασπάση 3 μετά την έκθεση σε μία μόνο δόση σισπλατίνης (1 mmol /L) σε κύτταρα MS751 και μία μόνο δόση σισπλατίνης (10 μmol /L) σε κύτταρα HeLa. Τα επίπεδα έκφρασης του διασπασμένης κασπάσης-3 ήταν χαμηλότερα σε MS751

REV3L

κύτταρα και υψηλότερα σε κύτταρα HeLa shREV3L σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε απόκριση προς την ίδια δόση σισπλατίνης σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. (D) Κανονικοποιημένη έκφραση φορές κάθε πρωτεΐνης έναντι πρωτεΐνης εσωτερικού ελέγχου. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. * P & lt? 0.05.

Η

REV3L

περιορίζει την απάντηση βλάβη του DNA μετά από θεραπεία με σισπλατίνη

Για να προσδιοριστεί η ένταση της απόκρισης βλάβης του DNA μετά από τη θεραπεία με σισπλατίνη σε

REV3L

υπερέκφραση ή καταστολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές, ανιχνεύσαμε σχηματισμό εστιών γ-H

2AX (pS139) με τη χρήση ανοσοφθορισμού. HeLa και SiHa κύτταρα ανεπαρκή σε

REV3L

έκφρασης εμφάνισαν έντονη γ-H

χρώση 2AX σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου shGFP μετά από έκθεση σε σισπλατίνη (Σχ. 6Α). Αντιθέτως, MS751 και ΜΕ180 κύτταρα με

REV3L

υπερέκφραση έδειξαν ασθενέστερη χρώση γ-H

2AX σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 6Β). Ανάλυση των πρωτεϊνών έδειξε ότι γ-H

2AX, και ρ-p53 (pS15) πρωτεΐνες αυξήθηκαν σε κύτταρα SiHa shREV3L και μειώθηκε σε ΜΕ180

REV3L

κύτταρα υπερέκφραση, συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου μετά από θεραπεία σισπλατίνης (Εικ . 5Β, D).

(Α) HeLa και SiHa κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία σε μία μόνο δόση σισπλατίνης (3 μmol /L και 25 μmol /L, αντίστοιχα) για 24 ώρες. κύτταρα HeLa και SiHa ανεπάρκεια σε

REV3L

έκφρασης παρουσίασαν intenser γ-H

χρώση 2AX σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου shGFP μετά από έκθεση σε σισπλατίνη. (Β) MS751 και ΜΕ180 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία σε μία μόνο δόση σισπλατίνης (30 μmol /L και 5 μmοl /L, αντίστοιχα) για 24 ώρες. MS751 και ΜΕ180 κύτταρα με

REV3L

υπερέκφραση έδειξαν ασθενέστερη γ-H

χρώση 2AX από κύτταρα ελέγχου. Ποσοτικοποίηση των γ-H

2AX εστίες πραγματοποιήθηκε και αναλύονται ανά κύτταρο. Πάνω από 50 κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Συζήτηση

Polζ είναι επιρρεπής σε λάθη DNA πολυμεράσης που εμπλέκονται στην TLS που χαρακτηρίζεται από την ικανότητά του να παρατείνει ακατάλληλα εκκινητή-προτύπου τέρματα . Από τη μια πλευρά, Polζ μπορεί να διατηρήσει τη σταθερότητα του γονιδιώματος και να επωφεληθούν για την επιβίωση όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε βλάβη του DNA [35,36,37,38,39]. Από την άλλη πλευρά, μέσω της επαγωγής αυθόρμητη και DNA-βλάβη που ενεργοποιούνται μεταλλάξεις προκαλώντας λανθασμένες νουκλεοτίδια στο DNA, Polζ συμβάλλει στη συσσώρευση του γενετικές βλάβες, και έτσι μπορεί να παίζει ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου [40,41,42]. Τα επίπεδα έκφρασης του

REV3L

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της Polζ, ποικίλλουν σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Ορισμένες μελέτες διαπίστωσαν ότι

REV3L

ήταν υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους ιστούς γλοιώματα εκτομή πριν τη θεραπεία σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του εγκεφάλου [19], αναντιστοιχία επισκευή ελαττωματικών, p53 – /- του παχέος αδενοκαρκινώματα σε σύγκριση με τους ιστούς του ελέγχου [43].

REV3L

πολυμορφισμοί έχουν επίσης αναφερθεί να σχετίζεται σημαντικά με τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του μαστού [44,45]. Ενώ άλλες μελέτες διαπιστώθηκε ότι το

REV3L

έκφραση προς τα κάτω σε καρκινώματα του παχέος εντέρου ανεξάρτητα του βαθμού του όγκου [46], γαστρικό καρκίνο [47], και τον καρκίνο του πνεύμονα [47].