Αφηρημένο

Μοριακή ανάλυση των δειγμάτων ιστού ασθενών είναι ουσιώδης για το χαρακτηρισμό του

in vivo

μεταβλητότητα σε ανθρώπινους καρκίνους που δεν είναι προσπελάσιμα σε κυτταρικές σειρές ή ζωικά μοντέλα. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τις μελέτες του μεταβολισμού του όγκου. Η πρόκληση είναι, ωστόσο, το σύμπλεγμα μίγμα διαφόρων τύπων ιστού μέσα σε κάθε δείγμα, όπως καλοήθεις επιθήλιο, στρώμα και καρκινικό ιστό, η οποία μπορεί να εισαγάγει συστηματικών τάσεων όταν οι καρκίνοι σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα. Σε αυτή τη μελέτη εφαρμόζουμε μια απλή στρατηγική για την άρση των εν λόγω προκαταλήψεις, χρησιμοποιώντας δείγμα επιλογές, όπου η μέση περιεκτικότητα του στρώματος ιστού είναι ισορροπημένη μεταξύ των ομάδων του δείγματος. Η στρατηγική εφαρμόζεται σε μια κοόρτη ασθενών με καρκίνο του προστάτη όπου τα στοιχεία από φασματοσκοπία MR και γονιδιακή έκφραση έχει συλλεχθεί από και ενσωματώθηκε στα ίδια ακριβώς δείγματα ιστών. Αποκαλύπτουμε

in vivo

αλλαγές στον καρκίνο-σχετικές μεταβολικές οδούς που κατά τα άλλα κρυμμένα στα δεδομένα λόγω της ιστό σύγχυσης. Συγκεκριμένα, μείωσε τα επίπεδα πουτρεσκίνης συνδέεται με αυξημένη έκφραση του

SRM

, τα μειωμένα επίπεδα κιτρικού αποδίδεται στην προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων προώθηση σύνθεση λιπαρών οξέων, και αυξημένα επίπεδα ηλεκτρικό συμπίπτουν με μειωμένη έκφραση του

SUCLA2

και

SDHD

. Επιπλέον, η στρατηγική τονίζει επίσης σημαντικές διαφορές μεταξύ του μεταβολισμού του στρώματος, επιθήλιο και καρκίνο του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σημαντικό

in vivo

χαρακτηριστικά του μεταβολισμού του καρκίνου μπορεί να αποκαλυφθεί από τα δεδομένα του ασθενούς μόνο εάν η σύνθεση ετερογενών ιστός υπολογισθεί κατάλληλα στην ανάλυση

Παράθεση:. Tessem MB, Bertilsson Η , Angelsen Α, Bathen TF, Drabløs F, Σίκαλη MB (2016) Μια ισορροπημένη ιστών Σύνθεση αποκαλύπτει Νέα Μεταβολικές και γονιδιακής έκφρασης δείκτες στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 11 (4): e0153727. doi: 10.1371 /journal.pone.0153727

Συντάκτης: Craig Ν Robson, Βόρεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ

Ελήφθη: 26 Ιαν 2016? Δεκτές: 1, Απρίλη 2016? Δημοσιεύθηκε: 21 Απριλίου του 2016

Copyright: © 2016 Tessem et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Δεδομένων μικροσυστοιχιών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από Array Express, η ένταξη E-mtab-1041 και Gene Expression Omnibus, την ένταξη GSE8218. Πρόσθετες σχετικές δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις έρευνας για την MBR και MBT από την επιτροπή συνδέσμου μεταξύ της Κεντρικής Νορβηγίας Αρχή Περιφερειακά Συστήματα Υγείας (RHA) και το Πανεπιστήμιο νορβηγική Επιστήμης και Τεχνολογίας (NTNU). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: Tone Bathen είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας για PLoS One. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια ετερογενής νόσος, όπου η κατανόηση των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών χαρακτηριστικό για κάθε τύπο θα μπορούσε να είναι σημαντικό να παρέχουν αποτελεσματική εξατομικευμένη και στοχευμένη θεραπεία ή επιλογή θεραπείας. Δείγματα ανθρώπινου ιστού παράγει ένα μοριακό στιγμιότυπο καταστάσεων όγκου η οποία είναι απαραίτητη για τον χαρακτηρισμό του

in vivo

καρκίνο ετερογένεια που χάνεται σε ζωικά μοντέλα και κυτταρικές σειρές [1]. Αυτό ισχύει για τις μελέτες του μεταβολισμού του όγκου ιδίως [2]. Ένα κοινό αλλά παράγοντας που περιπλέκει κατά την ανάλυση δειγμάτων ανθρώπινου ιστού είναι το ετερογενές μίγμα διαφόρων κυττάρων και τύπων ιστού που μπορεί συγχύσει αποτελέσματα από μοριακή ανάλυση. Ο κίνδυνος της σύγχυσης δεν ισχύει μόνο για τον καρκίνο του προστάτη (PCA) ιστών, αλλά για τους περισσότερους τύπους καρκίνων ιστού

Μια απλοϊκή μοντέλο χωρίζει το ανθρώπινο ιστό του προστάτη σε τρεις διαφορετικές συνιστώσες.? καλοήθης επιθήλιο, στρώμα και καρκινικό ιστό. Με βάση αυτό το μοντέλο, μια διαφορική μοριακή ανάλυση μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά δείγματα θα πρέπει ιδανικά να τονίσει τις διαφορές μεταξύ της καλοήθους επιθηλίου και του ιστού του προστάτη. Ωστόσο, σε τέτοιες απόκλιση μελέτες, οι φυσιολογικά δείγματα αποτελούνται από δύο τύπους ιστού (καλοήθης επιθήλιο και στρώμα), ενώ τα δείγματα προστάτη αποτελείται από τρεις τύπους ιστού (καλοήθης επιθήλιο, στρώμα και PCA), όλα σε διάφορες αναλογίες. Αυτό εισάγει ένα συστηματικό δείγμα προκατάληψη της αυξημένης περιεκτικότητας του στρώματος στα φυσιολογικά δείγματα που συγχέει τις μοριακές διαφορές μεταξύ επιθηλίου και του καρκίνου. Αυτό το πρόβλημα είναι γενικά παραδεκτό [3,4]. Ωστόσο, ενδελεχή αξιολόγηση της σύνθεσης αυτών των τριών τύπων ιστών δεν είναι συνήθως λογίζονται κατά τη διάρκεια του δείγματος συγκομιδή, την προετοιμασία και την ανάλυση δειγμάτων ιστών προστάτη. Επιπλέον, το περιβάλλον του όγκου εισάγει αλλαγές στον περιβάλλοντα ιστό στρώμα, που ονομάζεται stromogenic καρκίνο [5,6], οι οποίες αντιπροσωπεύουν ένα τέταρτο συστατικό ιστού σε δείγματα καρκίνου του προστάτη, αλλά δεν εξετάζονται στην παρούσα μελέτη.

Προηγουμένως παρουσιάζονται στρατηγικές να χειριστεί δείγμα ετερογένεια ιστού έχουν χρησιμοποιηθεί γενικά υπολογιστικά μοντέλα για την προσαρμογή κάθε δείγμα για την επιρροή των διαφόρων τύπων ιστού σε διαφορική ανάλυση [7,8]. Τέτοιες υπολογιστικές στρατηγικές μπορούν είτε να απαιτήσει εκ των προτέρων πληροφορίες σχετικά με τη σύνθεση του ιστού [9-11], προκαθορισμένες υπογραφές γονίδιο [12,13], ή είναι καθαρά με γνώμονα τα δεδομένα [14,15]. Υπολογιστικά μοντέλα συνήθως χειρίζονται ετερογένεια ιστού, κάνοντας προσαρμογή στις αρχικές τιμές έκφρασης πριν από την διαφορική ανάλυση. Αυτό αυξάνει τον κίνδυνο εισαγωγής ενός μοντέλου προκατάληψη, ιδιαίτερα όταν το σήμα από κάθε συνιστώσα ιστός δεν είναι ομοιογενής. Αυτή είναι η περίπτωση για τα δείγματα ιστού από πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [16-19].

Σε αυτή τη μελέτη εφαρμόζουμε μια εναλλακτική και πιο απλή προσέγγιση να λογοδοτήσουν για τη σύγχυση επίδραση του στρώματος κατά τη σύγκριση δειγμάτων ΣΕΣΣ με το κανονικό δείγμα ιστολογία για διαφορική ανάλυση. Η στρατηγική είναι να κατασκευάσει σύνολα δεδομένων του καρκίνου και φυσιολογικά δείγματα όπου η μέση περιεκτικότητα του στρώματος είναι ισορροπημένη μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων. Η πρόθεση είναι να μετριάσει το διαφορικό σήμα οφείλεται σε διάφορες ποσότητες του στρώματος στην ανάλυση, και τονίζουν τις πραγματικές μοριακές διαφορές μεταξύ του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού. Αντίθετα με τις περισσότερες υπολογιστικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την προσαρμογή ετερογένεια ιστού, η στρατηγική δεν εκτελεί διορθώσεις στις αρχικές τιμές μοριακών έκφρασης. Ωστόσο, απαιτείται παθολογική χαρακτηρισμό σύνθεση ιστού (καλοήθης επιθήλιο, στρώμα και PCA) για όλα τα δείγματα.

Σε αυτή τη μελέτη, φρέσκο ​​φέτες ιστού κατεψυγμένο προστάτη συλλέχθηκαν μετά από ριζική προστατεκτομή και κάθε δείγμα πυρήνα ιστού αξιολογήθηκε για ιστοπαθολογικά σύνθεση του ιστού πριν από την ανάλυση [20]. Ο ιστός στη συνέχεια αναλύθηκε με HR-MAS (υψηλή ανάλυση νηματοποίηση μαγικής γωνίας) MRS (φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού), που επιτρέπει 23 ποσοτικοποιημένη μεταβολίτες, ακολουθούμενη από μετρήσεις έκφρασης γονιδίου από μικροσυστοιχίας. HR-MAS είναι μια μη-καταστρεπτική μέθοδος, η οποία επιτρέπει την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης που πρέπει να εκτελεστούν στην ίδια ακριβώς δείγμα ιστού [21]. Αυτή η ενσωμάτωση του γονιδίου και δεδομένων μεταβολίτης προσφέρει μια μοναδική ευκαιρία για να διερευνήσει την κεντρική μοριακών οδών στην ΣΕΣΣ.

Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι μεταβολές στη σύνθεση στρωματικά ιστού μπορεί να είναι μια συστηματική σύγχυση παράγοντας για μοριακή ανάλυση, όταν προστάτη και φυσιολογικά δείγματα ιστού είναι σύγκριση. Αυτή η προκατάληψη μπορεί να αφαιρεθεί με την εξισορρόπηση της σύνθεσης στρωματικά μεταξύ των σετ δειγμάτων. Μόνο όταν αυτές οι προκαταλήψεις ιστού αντιπροσώπευαν, ολοκληρωμένη διαφορική αλλαγές στα γονίδια και των μεταβολιτών στο κέντρο μεταβολικές οδούς μπορεί να αποκαλυφθεί ταυτόχρονα.

Μέθοδοι

συλλογή δειγμάτων, μικροσυστοιχιών και HR-MAS ανάλυση

δείγματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μία τυποποιημένη διαδικασία συγκομιδής περιγράφεται προηγουμένως από Bertilsson

κ.ά.

. [20]. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την κοπή και το χειρισμό των κατεψυγμένων φετών ιστού αφαιρείται από τον αδένα του προστάτη κατά τη διάρκεια προστατεκτομή. πυρήνες δείγμα ιστού επιλέχθηκαν προσεκτικά από τις φέτες με βάση την κλινική ιστοπαθολογία. Επιπλέον, ιστοπαθολογική εκτίμηση του ποσού του καρκίνου, στρώματος και καλοήθεις επιθήλιο διεξήχθη σε κάθε δείγμα πριν από την HR-MAS και αναλύσεις μικροσυστοιχιών (S1 File). Οι μικροσυστοιχιών και HR-MAS πρωτόκολλα και την ανάλυση που περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως σε Bertilsson

et al

. και Giskeødegård

et al

., αντίστοιχα [21,22]. Η

πλήρες

σύνολο δεδομένων (95 δείγματα προστάτη και 34 φυσιολογικά δείγματα) που περιέχονται μετρήσεις έκφρασης μικροσυστοιχιών για 16.381 γονίδια, και οι συγκεντρώσεις μεταβολίτη HR MAS για 23 διαφορετικούς μεταβολίτες που μετράται στα ίδια ακριβώς δείγματα ιστού. Η χρήση του υλικού ανθρώπινου ιστού εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή για την Ιατρική και την έγκριση Ερευνών Υγείας Ηθική δεν 4-2007-1890. έντυπα συγκατάθεσης ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς. Οι άλλες ηθικές πτυχές που αφορούν τα συγκεκριμένα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [20-22]. Το πείραμα γονίδιο μικροσυστοιχιών δημοσιεύεται Array Express με την ένταξη E-mtab-1041. Μεταβολίτης συγκεντρώσεις που μετρήθηκαν σε κάθε δειγμάτων δίνεται στο S2 αρχείου.

Ο έλεγχος της επιρροής της στρώμα ιστού από τη διαλογή των αρχικών

πλήρη στοιχεία

σε,

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων

το

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων δημιουργήθηκαν με την ακόλουθη διαδικασία: Καρκίνος και κανονικά δείγματα ταξινομήθηκαν ανεξάρτητα σύμφωνα με ιστοπαθολογικά αποφασιστική περιεκτικότητά τους σε στρώμα. Η

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων δημιουργήθηκε από τη διάσπαση του ταξινομημένο καρκίνο και φυσιολογικό δείγματα σε δύο μισά, και στη συνέχεια την επιλογή των 47 δειγμάτων του προστάτη με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε στρώμα (άνω ήμισυ) και τα 17 φυσιολογικά δείγματα με τη χαμηλότερη περιεκτικότητα στρώμα ( κάτω μισό) από τα ταξινομημένα τους καταλόγους του δείγματος. Αυτή η διαδικασία ελαχιστοποιεί τη διαφορά στην μέση περιεκτικότητα σε στρώμα μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα για το

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων (Εικόνα 1Α). Ομοίως, η

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων δημιουργήθηκε από την επιλογή των 48 δειγμάτων του προστάτη με τη χαμηλότερη περιεκτικότητα σε στρώμα και τα 17 φυσιολογικά δείγματα με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε στρώμα. Στην

ασύμμετρη

συνόλου δεδομένων, η διαφορά στο μέσο περιεχόμενο στρώμα μεταξύ του καρκίνου και φυσιολογικά δείγματα μεγιστοποιείται (Σχήμα 1Α). Ο διαχωρισμός των δειγμάτων σε

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων δίνεται στο S1 αρχείου. Για να δημιουργήσετε μια

unstratified

σύνολο δεδομένων με την ίδια στατιστική ισχύ ως το

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων, 50 τυχαίες επιλογές της 47 καρκίνου και 17 φυσιολογικά δείγματα προέρχονται από το

πλήρη

σύνολο δεδομένων.

(Α) με την ακύρωση τους ίδιους τύπους ιστών σε προστάτη και φυσιολογικά δείγματα, η

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων συγκρίνει το μέσο όρο του καρκίνου 51% σε 43% καλοήθεις επιθήλιο και 8% στρώμα. Ομοίως, η

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων συγκρίνει τον καρκίνο του 75% έως 58% στρώμα και 17% καλοήθεις επιθήλιο, ενώ η

πλήρη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων συγκρίνει τον καρκίνο του 63% έως 33% στρώμα και το 30% της καλοήθους επιθηλίου. Η

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

unstratified

σύνολο δεδομένων έχουν την ίδια στατιστική ισχύ. Η στρατηγική μας προβλέπει ότι διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων που εντοπίζονται στην ισορροπημένο σύνολο δέσμη στοιχείων θα πρέπει να αντικατοπτρίζει τις αλλαγές στο προστάτη παρά τις διαφορές στη σύνθεση των ιστών. (Β) Ιστόγραμμα του ποσοστού ιστού διανομές για τον καρκίνο, το στρώμα και καλοήθεις επιθηλίου στο

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων. (C) Ποσοστό βαθμούς με κοινόχρηστο μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων σε σύγκριση με το μέσο ποσοστό βαθμούς με κατανέμονται μεταξύ των 50 τυχαία υποσύνολα στο

unstratified

σύνολο δεδομένων. Τα ποσοστά των κοινών γονιδίων υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την αύξηση του αριθμού των σημαντικότερων βαθμούς με κάθε σύνολο δεδομένων. Οι τυχαίοι αριθμοί υπολογίστηκαν ως ο μέσος αριθμός των γονιδίων από κοινού σε όλους τους 1.225 πιθανές συγκρίσεις μεταξύ των 50 τυχαία υποσύνολα. Για τις 200 πιο σημαντικές βαθμούς με 20% μοιράστηκαν μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων, και 39% μοιράστηκαν για τις 2000 πιο σημαντικές βαθμούς με. Τα αντίστοιχα ποσοστά για το σύνολο δεδομένων εκπλαγήκαμε ήταν 65% και 73% αντίστοιχα. (D) ανιχνευτές μικροσυστοιχιών με p-value αλλάζει σε διάφορες τάξεις μεγέθους μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων υπερβαίνει κατά πολύ τις αλλαγές p-value που αναμένεται από την τύχη στο

unstratified

σύνολο δεδομένων. Από όλους τους ανιχνευτές, 2830 έδειξε μια αλλαγή φορές p-value περισσότερες από τέσσερις τάξεις μεγέθους, και 1460 άλλαξε p-τιμές τους κατά περισσότερο από έξι τάξεις μεγέθους μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων σε σύγκριση με το 42 και 1 ανιχνευτές για το

unstratified

σύνολο δεδομένων αντίστοιχα.

η

διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και των μεταβολιτών

Πρώτες τιμές έκφρασης διηθούνται, log2 μεταμορφωθεί και quantile κανονικοποιημένη χρησιμοποιώντας το πακέτο limma R [23] όπως περιγράφεται στο Bertilsson

κ.ά.

. [21]. Όλες οι εργασίες πραγματοποιήθηκαν πριν δοκιμάσετε διαχωρισμούς σε

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων. Διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων προσδιορίστηκαν για το

πλήρη

,

unstratified

,

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων, όπως περιγράφεται στο Bertilsson

et al

. [21]. P-τιμές διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας Benjamini-Hochberg ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη [24]. Για το

unstratified

σύνολο δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε η μέση τιμή p πάνω από τα 50 σύνολα δεδομένων. Ρ-τιμές για διαφορικά εκφράζονται μεταβολίτες υπολογίστηκαν από το

t

.

δοκιμή

λειτουργία στο R. Η

t

.

δοκιμαστική

λειτουργία δίνει αρχικά μια εκτίμηση του κατά πόσον οι δύο ομάδες δειγμάτων εμφανίζουν ίση διακύμανση, η οποία χρησιμοποιείται για να αποφασίσει το βέλτιστο τεστ σημαντικότητας. Χρησιμοποιώντας την αρχική αξιολόγηση της ισότητας διακύμανσης, χρησιμοποιήσαμε το

t

.

δοκιμαστική

συνάρτηση με την ίδια διακύμανση αν η p-τιμή της αρχικής δοκιμής ήταν κάτω από 0,05, και το τεστ για άνιση διακύμανση διαφορετικά.

Εκκαθάριση δεδομένων

Για την επικύρωση της στρατηγικής της εξισορρόπησης των ιστών, μια ανεξάρτητη σύνολο δεδομένων [11] είχαν κατεβάσει από γονιδιακής έκφρασης Omnibus (ένταξη GEO ID, GSE8218). Αυτό το σύνολο δεδομένων αποτελείται από γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών από 65 δείγματα προστάτη και 71 φυσιολογικά δείγματα μαζί με ιστοπαθολογική αξιολόγηση των τεσσάρων διαφορετικών συστατικών ιστού (

καρκίνο του προστάτη

,

στρώμα

,

επιθηλίου από καλοήθη υπερπλασία του προστάτη

και

ατροφική

αδένα). Για να συγκρίνετε σύνθεση των ιστών στην επικύρωση που με το κύριο σύνολο δεδομένων (το σύνολο δεδομένων που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη), τα ποσοστά των

επιθηλίου από καλοήθη υπερπλασία του προστάτη

και

ατροφική αδένα

συνδυάστηκαν σε ένα ενιαίο εξάρτημα που αντιστοιχεί στο καλοήθους επιθηλίου στο κύριο σύνολο δεδομένων. Σύνολο δεδομένων εξισορρόπηση και την ταυτοποίηση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως και για τα βασικά δεδομένα. Να συγκρίνουν την ομοιότητα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που επισημαίνονται στην

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων μεταξύ της επικύρωσης και των κύριων στοιχείων, έχουμε αναπτύξει μια

Λόγος Σημασία (SR)

βαθμολογία υπολογίζεται για κάθε γονίδιο: (1) για το

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων και (2) για το

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων, όπου

σ

Β

και

σ

S

είναι η p-τιμή στο

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων, αντίστοιχα. Η βαθμολογία εισάγεται στη σύγκριση των p-τιμές για κάθε γονίδιο, και υπολογίζεται ανεξάρτητα για την επικύρωση και την κύρια δεδομένα. Τα γονίδια κατατάσσονται σε αύξουσα σειρά με βάση τη βαθμολογία SR για το

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων τόσο στην επικύρωση και των κύριων στοιχείων. Ένας μεγάλος αριθμός των κοινών γονιδίων μεταξύ των κορυφαία γονίδια στην κύρια και την επικύρωση στοιχεία δείχνουν ότι τα συγκριτικά κατάλογοι έχουν παρόμοια σχετική μεταβολές στην p-τιμές μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Εξισορρόπηση το περιεχόμενο του στρώματος ιστού όταν τα δείγματα ιστών ανθρώπινου προστάτη σε σύγκριση με δείγματα από φυσιολογικά

προστατικό ιστό

τα δείγματα από την αρχική

πλήρη

σύνολο δεδομένων παρουσιάζονται ως τρία τοποθετημένα διαφορετικά υποσύνολα,

ισορροπημένη

,

στρώμα

και

unstratified

, με βάση τη διαφορά της μέσης περιεκτικότητας σε στρώμα μεταξύ του προστάτη και ιστοπαθολογικά κανονικά δείγματα (Εικ 1Α, Methods). Η

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων έχει σχεδιαστεί για να έχουν μια μέση περιεκτικότητα σε στρώμα δυνατόν ίσοι μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα (37% έναντι 45% αντίστοιχα). Αυτό έγινε για να τονίσει τις μοριακές μετασχηματισμοί μεταξύ καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού, χωρίς την σύγχυση επίδραση λόγω των διαφορετικών ποσοτήτων του στρώματος. Σε αντίθεση, η

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων δημιουργήθηκε με μεγιστοποιηθεί η διαφορά της μέσης περιεκτικότητας σε στρώμα (14% έναντι 72% για προστάτη και φυσιολογικά δείγματα, αντίστοιχα) για να τονίσει τις μοριακές μεταβολές που παρατηρούνται όταν το ποσό του στρώματος δεν λογίζεται . Ένα

unstratified

σύνολο δεδομένων δημιουργήθηκε με τις ίδιες ιδιότητες ιστού, όπως το

πλήρη

σύνολο δεδομένων, αλλά με μειωμένο αριθμό των δειγμάτων που επιτρέπει την άμεση σύγκριση των π-αξιών με το

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων. Η

unstratified

σύνολο δεδομένων είχε ένα ενδιάμεσο διαφορά στην μέση περιεκτικότητα σε στρώμα (26% έναντι 59% για προστάτη και φυσιολογικά δείγματα, αντίστοιχα), που αντιπροσωπεύει τη σύνθεση των ιστών σε δείγματα από μια τυπική ομάδα ασθενών. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέσο όρο βαθμολογίας Gleason μεταξύ των δειγμάτων του προστάτη στο

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων (7,17, 7,27 και 7,22 αντίστοιχα). Για να απλοποιηθεί η ερμηνεία των αποτελεσμάτων, υποθέτουμε ότι η μοριακή σήματα από ίσες ποσότητες του ίδιου τύπου ιστού στον προστάτη και φυσιολογικά δείγματα αλληλοεξουδετερώνονται σε μια διαφορική ανάλυση. Η ανάλυση αυτή δεν λαμβάνει υπόψη τις αλλαγές μεταξύ υγιών στρώματος και του καρκίνου stromogenic. Ωστόσο, θα χρησιμεύσει ως μια καλή προσέγγιση για τη μελέτη σύγχυση σημάτων από στρώμα λόγω των διαφορετικών μέση σύνθεση του ιστού στον καρκίνο και φυσιολογικά δείγματα. Αν αφαιρέσετε τις συνεισφορές από ίσες ποσότητες ιστού, η ανάλυση του

πλήρη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων συγκρίνει την μοριακή σήμα από το 63% των ιστών του καρκίνου στα δείγματα προστάτη στο 33% του στρώματος και το 30% καλοήθους επιθηλίου στα φυσιολογικά δείγματα, που αντιπροσωπεύει σχεδόν πλήρη σύγχυση μεταξύ του στρώματος και της καλοήθους επιθηλίου. Σε αυτή τη ρύθμιση, είναι αδύνατο να συμπεράνει κατά πόσον οι παρατηρούμενες διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (βαθμούς με) και των μεταβολιτών οφείλονται σε αλλαγές μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικού ιστού, ή οφείλεται σε διαφορετικές ποσότητες στρώματος σε προστάτη και φυσιολογικό ομάδων του δείγματος. Σε αντίθεση, οι παρατηρούμενες βαθμούς με και οι μεταβολίτες είναι άμεσα με μοριακές αλλαγές μεταξύ του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού για το

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων, και ο καρκίνος και το στρώμα του ιστού στο

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων. Τα διαφορετικά σήματα σε αυτές τις δύο συγκρίσεις σύνολο δεδομένων υπογραμμίζουν έτσι γονιδίων και των μεταβολιτών, καθώς και τις σχέσεις μεταξύ τους, η οποία κατά τα άλλα κρυμμένα στο

πλήρη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων.

Δύο κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για τη διαίρεση δείγματα μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων: i) το μέσο ποσοστό του στρώματος πρέπει να είναι δυνατόν ίσοι μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά δείγματα, και ii) κάθε το σύνολο δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει όσο το δυνατόν περισσότερα δείγματα για να εξασφαλίζεται η μέγιστη δυνατή στατιστική ισχύς. Για να βελτιωθεί η ανάλυση περαιτέρω, ένα τρίτο κριτήριο μπορεί να εισαχθεί, το οποίο εξασφαλίζει ότι τα μεμονωμένα δείγματα σε κάθε σύνολο δεδομένων είναι ομοιογενείς σε σχέση με το ποσοστό του στρώματος. Το κριτήριο αυτό θα πρέπει, θεωρητικά, να μειώσει τη διακύμανση αξίας έκφρασης σε κάθε ομάδα να βελτιώσει διαφορικό στατιστικές. Λόγω του περιορισμένου αριθμού των διαθέσιμων δειγμάτων με παρόμοια σύνθεση ιστό, εξήχθη το συμπέρασμα ότι μια επιλογή που περιλαμβάνει επίσης το τρίτο κριτήριο θα έθετε σε κίνδυνο τη στατιστική ισχύ της ανάλυσης. Παρ ‘όλα αυτά, τα δύο πρώτα κριτήρια αποδείχθηκε αρκετή για να αναδείξει σημαντικές διαφορές μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων.

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του

ισορροπημένη

και τα

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων είναι ότι έμμεσα αξιολογεί επίσης τη διαφορά μεταξύ καλοήθους επιθηλίου και στρώματος ιστού. Γονίδια και οι μεταβολίτες εμφανίζουν απόκλιση αλλαγή μόνο στο

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων, και όχι στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων, δεν είναι δείκτες για το μετασχηματισμό του προστάτη. Αυτοί μάλλον θα είναι δείκτες του στρώματος που αλλάζει στο

πλήρη

και

unstratified

σύνολα δεδομένων μόνο λόγω των διαφορών στο ποσό των στρώμα ιστού. Περαιτέρω, τα γονίδια και των μεταβολιτών που εμφανίζουν παρόμοιες αλλαγές τόσο στο

ισορροπημένη

και το

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων είναι δείκτες για την PCA που δεν επηρεάζεται από την παρουσία του στρώματος. Τέλος, τα γονίδια και οι μεταβολίτες εμφανίζουν απόκλιση αλλάζει μόνο στο

ισορροπημένο

σύνολο δεδομένων, αλλά όχι στο

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων, αποτελούν δείκτες για την PCA οποία διαταράσσεται από την παρουσία του στρώματος. Αυτές οι εκτιμήσεις είναι σημαντικές όταν χωρίζει παρατηρούμενες αλλαγές που σχετίζονται άμεσα με το μετασχηματισμό του προστάτη από τις μεταβολές που προκύπτουν μόνο από την μεροληπτική ποσότητες στρώμα ιστού. Τέτοιες ερμηνείες θα πραγματοποιηθεί στην επόμενη ανάλυση.

Ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε παγκόσμιο επίπεδο

Οι σημαντικές διαφορές στο γονίδιο παρατηρήθηκαν πρότυπα έκφρασης κατά τη σύγκριση βαθμούς με μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων. Μια πολύ χαμηλότερο ποσοστό βαθμούς με μοιράστηκαν μεταξύ του

ισορροπημένη

και το

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων σε σύγκριση με το ποσοστό του βαθμούς με αναμένεται να συμβεί κατά τύχη (Σχήμα 1Β), όπου η αναμενόμενη ποσοστό εκτιμήθηκε ως ο μέσος αριθμός των κοινών γονιδίων μεταξύ των 50 τυχαία υποσύνολα στο

unstratified

σύνολο δεδομένων. Το γεγονός ότι το

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων συλλάβει σημαντικές βιολογικές διαφορές οι οποίες είναι απίθανο να παρατηρηθεί κατά τύχη επιβεβαιώθηκε από τον μεγάλο αριθμό των γονιδίων ανιχνευτών με p-value αλλάζουν κατά πολλές τάξεις μεγέθους μεταξύ του

ισορροπημένη

και τις

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων σε σύγκριση με το

unstratified

σύνολο δεδομένων (σχήμα 1Γ). Και τα τρία σύνολα δεδομένων που αναγράφεται αναμένεται μέχρι και την προς τα κάτω ρύθμιση των επτά και επικυρώνονται τα γονίδια στο προστάτη (Σχήμα C σε S3 αρχείου). Εν κατακλείδι, οι παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ αυτών των συνόλων δεδομένων μπορούν να αποδοθούν σε διαφορές στο ποσό των στρώμα ιστού. Η εφαρμοζόμενη στρατηγική της εξισορρόπησης των ιστών είναι σε θέση να αναδείξει τις διαφορές αυτές.

Η

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων αναδεικνύει μεταβολίτες που σχετίζονται με προστάτη αλλαγή

Στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων 17 από τα 23 μεταβολιτών μετρήθηκαν με HR-MAS βρέθηκαν να εμφανίζουν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα συγκέντρωσης μεταξύ ΠΑΠ και φυσιολογικού ιστού (Σχήμα 2). Αυτό είναι ένα σημαντικά υψηλότερο αριθμό σε σύγκριση με τα 8 σημαντικά μεταβολίτες που προσδιορίζονται στο

unstratified

και 13 που προσδιορίζονται στο

πλήρη

σύνολο δεδομένων. Αυτό δείχνει υψηλό βαθμό συγχητικές από τον ιστό στρώμα σε αυτές τις σειρές δεδομένων, η οποία εφαρμόζεται ειδικά στα εννέα μεταβολίτες πουτρεσκίνη, σπερμίνη, γλυκίνη, γλουταμίνη, αλανίνη, βαλίνη, ηλεκτρικό, ισολευκίνη και κιτρικό που ήταν σημαντικές στο

εξισορροπείται

αλλά όχι το

unstratified

σύνολο δεδομένων. Αυτά τα εννέα μεταβολίτες είναι έτσι αλλαγές που είναι χαρακτηριστικές για την PCA, αλλά είναι δύσκολο να εντοπιστούν λόγω της συγχέοντας από ασύμμετρες ποσότητες στρώμα ιστού. Ο προσδιορισμός του κιτρικού χρησιμεύει ως απόδειξη της αρχής για την εφαρμοζόμενη στρατηγική ανάλυση, λόγω της απουσίας του κιτρικού στο στρώμα και μειωμένα επίπεδα που παρατηρούνται σε PCa ιστό [22,25]. Επιπλέον, οι αλλαγές στο μεταβολιτών ηλεκτρικό, βαλίνη και γλυκίνη δεν ήταν ανιχνεύσιμα στο

πλήρη

σύνολο δεδομένων, παρά την υψηλότερη στατιστική ισχύ σε σύγκριση με το

ισορροπημένο

σύνολο. Δεν μεταβολίτες ήταν ειδικά για την

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων, ενδεχομένως με εξαίρεση της ταυρίνης με οριακή στατιστική σημαντικότητα (p = 0,053). Άλλοι βιολογικοί δείκτες τυπικό μεταβολίτη για την PCA, όπως η γλυκόζη, γαλακτικό και οι τρεις μεταβολίτες χολίνης που περιέχει [22,26] παρατηρήθηκαν σε όλα τα σύνολα δεδομένων, δείχνοντας έτσι τη σταθερότητα ως βιοδείκτες, ανεξάρτητα από τη σύνθεση των ιστών.

Θετική -λογ10 (p- αξία) δείχνουν αυξημένη συγκέντρωση και αρνητικές -λογ10 (p-value) δείχνουν μειωμένη συγκέντρωση στην ΣΕΣΣ. Η

unstratified

,

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων έχουν όλα την ίδια στατιστική ισχύ.

Η

Ενσωμάτωση δεδομένων μεταβολίτη και γονιδιακή έκφραση εντοπίζει αλλαγές σε γονίδια που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του προστάτη

Εμείς προβλέπουμε ότι εκτελεί ανάλυση διαφορική έκφραση σε ένα σύνολο δεδομένων ισορροπημένο για το περιεχόμενο του στρώματος ιστού μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα τονίζει γονιδίων και των μεταβολιτών που σχετίζονται άμεσα για τις αλλαγές του προστάτη. Επιπλέον, οι ταυτόχρονες δεδομένα γονιδίου και του μεταβολίτη μετρούμενη στα ίδια ακριβώς δείγματα διευκολύνουν την ενσωμάτωση των στοιχείων αυτών σε συγκεκριμένες μεταβολικές οδούς. Σε αυτή τη μελέτη επικεντρώθηκε σε μονοπάτια της σύνθεσης κύκλου TCA, σύνθεση πολυαμίνης και λιπαρού οξέος, και σε βαθμούς με σχετίζονται με την μεταβολίτες πουτρεσκίνη, κιτρικό και ηλεκτρικό, καθώς αυτές οι οδοί ειδικώς τονίζεται στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων. Η διαφορική έκφραση παρουσιάζεται από την άποψη της ρ-τιμές. Αντίστοιχες αλλαγές σε σχέση με το γονίδιο βαθμό και διπλώστε την αλλαγή παρουσιάζονται στα σχήματα Α και Β στο S3 αρχείου και S4 αρχείου.

Μειωμένα επίπεδα πουτρεσκίνης σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του

SRM

στην οδό πολυαμινών .

η αυξημένη παραγωγή πολυαμινών είναι σημαντική για την πρόοδο του καρκίνου μέσω της προώθησης της κυτταρικής ανάπτυξης, αποικοδομούν τον περιβάλλοντα ιστό και μειώνοντας κατά του όγκου λειτουργίες του ανοσοποιητικού [27]. Στο πολυαμίνης οδού (Σχήμα 3Α),

ODC1

μετατρέπει ορνιθίνη να πουτρεσκίνη, η οποία μετατρέπεται περαιτέρω σε σπερμιδίνη με SRM. Η σπερμιδίνη στη συνέχεια μετατρέπεται σε σπερμίνη από

SMS

, όλα σε ένα προς τα εμπρός αντίδραση.

SRM

και

SMS

επικουρούνται από

AMD1

στη διαδικασία μετατροπής, ενώ η

SAT1

και

SMOX

είναι υπεύθυνες για την περαιτέρω προς τα κάτω μοίρα της σπερμιδίνης και σπερμίνης [28]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα γονίδια στο μονοπάτι πολυαμίνης ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο [29,30]. Μια σύμφωνη προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων πολυαμίνης θα αυξήσουν την ροή του συνόλου των πολυαμινών, αλλά όχι κατ ‘ανάγκη να αλλάξει τα σχετικά επίπεδα των επιμέρους μεταβολιτών. Στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων, παρατηρούμε μια σημαντική μείωση επίπεδο για την πουτρεσκίνη μεταβολίτη. Η μείωση αυτή συμπίπτει με μια ειδική ρύθμιση προς τα πάνω του

SRM

γονίδιο (Σχήμα 4Α). Μηχανιστικά, προς τα πάνω ρύθμιση του

SRM

θα καταναλώσει πουτρεσκίνη για την παραγωγή της σπερμιδίνης, και χωρίς την αντικατάσταση πουτρεσκίνης από ornitihine με ρύθμιση προς τα πάνω του

ODC1

, θα πρέπει να μειωθεί η συγκέντρωση των πουτρεσκίνη. Αυτό είναι ακριβώς αυτό που παρατηρείται από τις μετρήσεις MR μεταβολισμού. Προς τα πάνω ρύθμιση των ΕΥΚ χωρίς σύμφωνη προς τα πάνω ρύθμιση άλλων γονιδίων στην οδό πολυαμινών παρατηρείται μόνο στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων, ενώ μια γενική ρύθμιση προς τα άνω των γονιδίων πολυαμινών είναι ένα χαρακτηριστικό που παρατηρείται κυρίως στο

ανισόρροπη

σύνολο δεδομένων. Εφαρμόζοντας την έμμεση σχέση μεταξύ του

ισορροπημένη

και

ασύμμετρη

σύνολο δεδομένων, η γενική αυτή ρύθμιση προς τα άνω είναι πιο πιθανό προκαλούνται από τις διαφορές μεταξύ καλοήθους επιθηλίου και στρώματος, και την ρύθμιση προς τα άνω των ΕΥΚ και συγκλίνουσες μείωση πουτρεσκίνη οφείλεται σε προστάτη μετασχηματισμού. Είναι ενδιαφέρον ότι,

ΕΥΚ

Πρόσφατα έχει προταθεί ως στόχος φάρμακο για την οδό πολυαμίνης σε ένα μοντέλο λεμφωμάτων Β-κυττάρου [31]. Επιπλέον, μια σημαντική μείωση στα επίπεδα σπερμίνη (p = 0.047) επίσης παρατηρείται, η οποία ταιριάζει με μια σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω του

SAT1

και

SMOX

, χωρίς σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

SMS

. Ωστόσο, αυτή η σχέση είναι πιο λεπτή. Μια σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις σπερμίνης είχε αναφερθεί στο παρελθόν για να διαχωρίσετε επιθετικό (βαθμός Gleason ≥7) από την πιο νωχελικός τύπους προστάτη ιστού (Gleason βαθμού = 6) [22]. Ωστόσο, σε αυτή τη σύγκριση η σύγχυση των στρώμα είναι λιγότερο έντονη δεδομένου ότι μόνο τα δείγματα καρκίνου, σε σύγκριση.

(Α) οδό πολυαμίνης. (Β) κύκλος TCA, σύνθεση λιπαρών οξέων και την κατανάλωση γλουταμίνη. Τα γονίδια επάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων επισημαίνεται με κόκκινο και μπλε αντίστοιχα. ονόματα γονίδιο: ODC1: αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης 1, SRM: σπερμιδίνη συνθάσης, SMS: σπερμίνη συνθάσης, AMD1: αδενοσυλμεθειονίνης αποκαρβοξυλάση 1, SAT1: σπερμιδίνη /σπερμίνη Ν1-ακετυλοτρανσφεράση 1, SMOX: σπερμίνη οξειδάση, ACO 1/2: ακονιτάση 1/2, CS : κιτρικό συνθάσης, ακυλ: ΑΤΡ κιτρική λυάση, ACACA /Β: ακετυλο-CoA καρβοξυλάση άλφα /βήτα, FASN: συνθάσης λιπαρού οξέος, SUCLA2: ηλεκτρικό-CoA λιγκάσης ADP σχηματισμού βήτα υπομονάδα, SUCLG1 /2: ηλεκτρικό-CoA λιγκάσης βήτα υπομονάδα , SDHA /B /C /D:. ηλεκτρική αφυδρογονάση συγκρότημα υπομονάδα Α /Β /C /D

η

(Α) Αρχή:

SRM

και πουτρεσκίνη στην οδό πολυαμινών. Μέση:

SUCLA2

και

SDHD

και ηλεκτρικό στον κύκλο TCA. Κάτω: κιτρικό στη σύνθεση των λιπαρών οξέων. Θετική -λογ10 (p-value) δείχνουν προς τα πάνω ρύθμιση και αρνητικές -λογ10 (p-value) δείχνουν αρνητική ρύθμιση. Οι μεταβολίτες που εμφανίζονται στην αριστερή πλευρά είναι ένα υποσύνολο των μεταβολιτών παρουσιάζεται στο Σχ 2. (Β) Επικύρωση των σημαντικών γονιδίων σε PCa σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα σε σχέση με την οδό πολυαμίνης, ηλεκτρικό στη σύνθεση του κύκλου TCA και λιπαρό οξύ σε έναν ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων. (C) Μέση συνθέσεις ιστό στο

ισορροπημένη

,

ανισόρροπη

και

πλήρη /unstratified

σύνολα δεδομένων από τη μελέτη επικύρωσης. Ιστόγραμμα των διανομών ιστού παρουσιάζονται στο Σχήμα Α στην S3 αρχείου. (Δ) Αριθμός κοινών γονιδίων μεταξύ των πρώτων γονίδια Ν κατατάσσονται σύμφωνα με τη βαθμολογία αναλογία σημασία όταν συγκρίνονται διάφορα σύνολα δεδομένων. Γονίδια με αντίθετες μεταβολές (3 στο

ισορροπημένη

και 116 στα

ασύμμετρη

σύνολα δεδομένων) αφαιρέθηκαν από την ανάλυση. Ο αριθμός μοιράζονται γονίδια είναι πολύ υψηλότερες όταν

ισορροπημένη

και

Οι ασύμμετρες

σύνολα δεδομένων σε σχέση μεταξύ τους, από ό, τι όταν

είναι ισορροπημένη

σε σύγκριση με το

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων. Αυτό δείχνει ότι οι μελέτες επικύρωσης και ελέγχου εμφανίσει μια εξαιρετικά σύμφωνη κατάταξη των γονιδίων τόσο για το

ισορροπημένη

και

ανισόρροπη

σύνολα δεδομένων.

Η

Μειωμένα επίπεδα κιτρικού σχετίζεται με αυξημένο σύνθεση των λιπαρών οξέων.

σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κιτρικού στα φυσιολογικά δείγματα ήταν ανιχνεύσιμα μόνο στο

ισορροπημένη

σύνολο δεδομένων. Στο

πλήρη

σύνολο δεδομένων, όπου διπλασιάζεται η στατιστική ισχύς, κιτρικό επίπεδα δεν ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ του καρκίνου και φυσιολογικά δείγματα. Κιτρικό κανονικά μετατρέπεται σε ισοκιτρικό από

ACO 1

και

ACO2

στον κύκλο TCA (Σχήμα 3Β), η οποία είναι ο προτιμώμενος τρόπος παραγωγής ενέργειας στα περισσότερα κύτταρα.