Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ποσοτικοποίηση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) είναι πολύτιμη για την αξιολόγηση του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Η ευαισθησία των σημερινών μεθόδων περιορίζει τη χρήση τους για την ανίχνευση σπάνιων CTCs σε πρώιμο στάδιο. Εδώ έχουμε αξιολογήσει μια νέα μέθοδο, συνδετήρα-στοχευόμενο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (LT-PCR), που μπορεί να ανιχνεύσει σπάνια κέντρα θεραπείας χολέρας σε ασθενείς με NSCLC.

Μέθοδοι

ΚΜΑ εμπλουτίστηκαν με ανοσομαγνητικά εξάντληση των λευκοκυττάρων και τότε επισημασμένο με ένα συζυγές ενός όγκου-ειδικού συνδετήρα και ένα ολιγονουκλεοτίδιο. Μετά την έκπλυση δωρεάν προϊόντα σύζευξης, τα δεσμευμένα συζεύγματα απογυμνώθηκαν από ΚΜΑ και στη συνέχεια αναλύθηκαν με qPCR. Για να αξιολογηθεί η κλινική χρησιμότητα, τα δείγματα αίματος ελήφθησαν από 72 ασθενείς με ΜΜΚΠ (33 αρχικά διαγνωστεί και 39 σε χημειοθεραπεία), 20 καλοήθεις ασθενείς και 24 υγιείς δότες.

Αποτελέσματα

Πειράματα με υγιές αίμα εμπλουτίστηκε με καρκινικά κύτταρα έδειξε το LT-PCR επιτρέπει ειδική ανίχνευση της CTC. Η κλινική μελέτη έδειξε ότι τα αρχικά διαγνωστεί ασθενείς έχουν κατά μέσο όρο 20,8 μονάδες CTC με μεταστατικό ασθένειες, 11,8 μονάδες CTC με εντοπισμένες διαταραχές, και 6,0 μονάδες CTC με καλοήθεις παθήσεις. Με το όριο των 8,5 μονάδων CTC, η δοκιμασία μπορεί να ανιχνεύσει το 80% του σταδίου Ι /ΙΙ, το 67% του σταδίου ΙΙΙ, και το 93% του καρκίνου του σταδίου IV. Με τις καλοήθεις ασθενείς και υγιείς δότες ως ομάδα ελέγχου, η μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσει τον καρκίνο με ευαισθησία 81,8% και ειδικότητα 93,2%.

Συμπέρασμα

Η ΕΤ-PCR θα επιτρέπει την ποσοτικοποίηση των CTC σε ασθενείς με NSCLC σε μια πιο ευαίσθητη επίπεδο, παρέχοντας ένα δυναμικό εργαλείο για την στρωματοποίηση κακοήθεις παθήσεις των πνευμόνων, ειδικά σε αρχικό στάδιο

Παράθεση:. Lou J, Ben S, Yang G, Liang Χ, Wang Χ, Ni S , et al. (2013) Ποσοτικοποίηση των σπάνιων κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα από το συνδετήρα-στοχευόμενο PCR. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10.1371 /journal.pone.0080458

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 2 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Δεκ 2013

Copyright: © 2013 Lou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από βασικό έργο της Σαγκάης Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής (τμήμα μείζονος No: 10411950600). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι Dr.Guohua Yang απασχολείται από Genosaber Biotech. Την ίδια στιγμή, ο ίδιος κατέχει ανήλικος δικαιωμάτων προαίρεσης αγοράς μετοχών (& lt? 5%). Κατά την περίοδο της έρευνας, Δρ Γιανγκ παρέχει μόνο τεχνική υποστήριξη σε μας για την ολοκλήρωση της κλινικής έρευνας. Αυτή η τεχνική υποστήριξη περιλαμβάνει την ανάλυση των δεδομένων και την τεχνική περιγραφή της μεθόδου στο χειρόγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC), που είναι γνωστή ως «υγρή βιοψία», είναι ένα εύκολα προσβάσιμο δείκτη για την εξέλιξη του καρκίνου παρακολούθηση, την ανταπόκριση στη θεραπεία και την επανάληψη των κακοήθων νόσων. Ειδικά, η CTC γίνεται ακόμα πιο σημαντικό όταν βιοψία ιστού δεν είναι κατάλληλο για ορισμένα πληθυσμό ασθενών. Κλινική σημασία της CTC, σε NSCLC έχει αναφερθεί ευρέως σε πρόσφατες μελέτες. Υψηλοί αριθμοί των εντοπισμένων CTC αναφέρθηκαν να συνδέσει με κακή πρόγνωση σε μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα [1] – [5]. Ανίχνευση ορισμένων mRNA ή πολυ-γονιδίου στο CTC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόγνωση του αποτελέσματος των debulking χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία σε ασθενείς με NSCLC [6] – [10]. Πιο πρόσφατα, το μοριακό χαρακτηρισμό της CTC στην NCSLC έχει αποδειχθεί ότι δυνητικά καθοδηγήσει τη θεραπεία [1], [11]

Για να προχωρήσετε ανίχνευσης CTC στο επόμενο επίπεδο, προέκυψε υπάρχουν διάφορες πολλά υποσχόμενες τεχνολογίες για τον εμπλουτισμό CTC:. 1) CTC ήταν θετικά, ανοσομαγνητικά συλλαμβάνεται από αντι-ΕρΟΑΜ (επιθηλιακό μόριο κυτταρικής προσκόλλησης) αντίσωμα επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια [7], [12], 2) CTC εμπλουτίστηκε με ανοσομαγνητικά εξάντληση των λευκοκυττάρων με αντι-CD45 αντίσωμα μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα [5], [13]. 3) CTC εμπλουτίστηκε με συσκευές μέγεθος που βασίζεται διήθηση [14], 4) CTC εμπλουτίστηκε από μια διάταξη τσιπ που βασίζεται με υπογραφή μικροδομή [15], και 5) CTC εμπλουτίστηκε με ταυτόχρονη εξάντληση των ερυθροκυττάρων και λευκοκυττάρων χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας [16], [17]. Για τις επόμενες, ποσοτική ανάλυση της CTC, το εμπλουτισμένο κλάσμα χρησιμοποιώντας τις προαναφερθείσες μεθόδους ήταν ανοσοφθορισμό επισημασμένο και στη συνέχεια εξετάστηκαν μικροσκοπικά ή μέσω κυτταρομετρίας ροής [12], [18] – [21]. Αν και οι μέθοδοι ανοσοφθορισμού με βάση παρουσίασαν υψηλή ειδικότητα, η ευαισθησία μπορεί να μην είναι επαρκής για την ανίχνευση σπάνιων κυττάρων σε πρώιμο στάδιο του καρκίνου [4], [12], [22]. Αντίστροφη μεταγραφάση αντίδραση αλύσου πολυμεράσης (RT-PCR) χρησιμοποιήθηκε επίσης για CTC απαρίθμηση με υψηλή ευαισθησία [8], [23], [24]. Ωστόσο, η ρύθμιση στο μετα-μεταγραφικό που απορρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση βρέθηκε σε πολυάριθμα κύτταρα καρκίνου [25] – [27]. Ο κανονισμός αυτός μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων μέσω τροποποιήσεων της σταθερότητας του mRNA και /ή μεταγραφικής αποτελεσματικότητας, και κάνει περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες δεν συσχετίζονται με το επίπεδο του mRNA. LT-PCR, που αναπτύχθηκε από GenoSaber Biotech, έδειξε υπόσχεση στην ανίχνευση CTC μέσω επιφανειακές πρωτεΐνες. Εδώ έχουμε την πρόθεση να αξιολογήσει την ικανότητα του ΕΤ-PCR για να εξετάσει CTC σε ασθενείς με NSCLC. Σε αυτή τη μέθοδο, CTC σημάνθηκε με ένα συζυγές ενός όγκου-ειδικό συνδετήρα φολικού οξέος, επιλεκτικά συνδέεται προς μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα υπερεκφράζουν φυλλικό οξύ υποδοχέα [28] – [31], και ένα συνθεμένο ολιγονουκλεοτίδιο (Σχήμα 1) . Το συζυγές χρησιμεύει ως μόριο προσαρμογέας για να μετατρέψει ένα CTC σε ανιχνευτή μόρια «ολιγονουκλεοτίδια» που μπορεί να ενισχυθεί για την ποσοτική ανάλυση. Αυτή η μελέτη προτείνεται να αξιολογήσει την κλινική αξία της ανίχνευσης του υποδοχέα φολικού θετική CTC σε ασθενείς με NSCLC.

Μετά την αρνητική εμπλουτισμός με ανοσομαγνητικά εξάντληση των λευκοκυττάρων, CTCs σημάνθηκαν με ένα συζυγές ενός όγκου-ειδικού συνδετήρα και ένα ολιγονουκλεοτίδιο. Τα σημασμένα ΚΜΑ πλένονται σχολαστικά για να αφαιρέσετε δωρεάν συζυγών. Στη συνέχεια, τα δεσμευμένα προϊόντα σύζευξης απογυμνωθεί από τη CTC και αναλύθηκαν με qPCR.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντιδραστήρια

Το κυκλοφορούν κιτ καρκίνου του πνεύμονα CytoploRare® παρέχεται από GenoSaber Biotech ΣΙΑ Ε.Π.Ε. (Σαγκάη, Κίνα). Το κιτ περιλαμβάνει δύο συνιστώσες: η μία είναι για τον εμπλουτισμό CTC και η άλλη είναι για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό CTC. Το συστατικό εμπλουτισμός περιλαμβάνει ρυθμιστικό ερυθροκυττάρων λύσης, ρυθμιστικό διάλυμα επώασης, απομακρύνσεως λευκοκυττάρων αντι-CD45 μαγνητικών σφαιριδίων, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, ρυθμιστικό επισήμανση, ρυθμιστικό και το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης απογύμνωση. Το συστατικό ανίχνευση και ποσοτικοποίηση περιλαμβάνει ρυθμιστικό διάλυμα PCR αντίδραση, αστάρια, απιονισμένο νερό, θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες κυττάρων, τους ελέγχους PCR και πρότυπα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών εισήχθησαν ως εξής. RT εκκινητή, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 ‘? Εμπρός εκκινητή, 5’-TATGATTATGAGGCATGA-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή, 5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘? TaqMan Probe, 5’-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 ‘.

Μετά το εγχειρίδιο οδηγιών του κατασκευαστή, CTC εμπλουτίστηκε με λύση των ερυθροκυττάρων και ανοσομαγνητική εξάντληση των λευκοκυττάρων από 3 mL δείγμα αίματος. Το εμπλουτισμένο CTC σημάνθηκε με ένα συζυγές ενός όγκου-ειδικού συνδετήρα φολικού οξέος και συντίθεται ολιγονουκλεοτιδίου. Μετά την επισήμανση, το εμπλουτισμένο CTC πλύθηκε επιμελώς για την απομάκρυνση των μη δεσμευμένων συζυγών. Στη συνέχεια, τα δεσμευμένα προϊόντα σύζευξης ειδικώς απογυμνώνεται από την επιφάνεια CTC και συλλέγονται για την ποσοτική ανάλυση PCR (Εικόνα 1). Πριν από την ενίσχυση, το συζυγές ανόπτηση πρώτη και επεκτάθηκε στον εκκινητή RT. Μετά από αυτό το εκτεταμένο συζυγές ενισχύθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή Taqman ποσοτική μέθοδο PCR με βάση. Στην παραπάνω μέθοδο, τα κυκλοφορούντα κύτταρα όγκου προσδιορίστηκαν ως θετικά κύτταρα υποδοχέα φολικού όπως σημασμένο με φολικού-συνδεδεμένη ολιγονουκλεοτιδίων.

Η γραμμή κυττάρων

Χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινο ρινοφαρυγγικό κυτταρική σειρά καρκίνου KB, η οποία εκφράζει το φυλλικό οξύ υποδοχέα 1 (FR) στην επιφάνεια των κυττάρων, για να αξιολογήσει την αναλογία ανάκαμψη στη δοκιμασία εμβολιασμένο κύτταρο. ΚΒ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φυλλικό οξύ ανεπάρκεια RPMI-1640 (τεχνολογίες Life) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (τεχνολογίες ζωής) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Ασθενείς

Εβδομήντα δύο ασθενείς με ΜΜΚΠ, 20 με καλοήθεις παθήσεις του πνεύμονα, και 24 το φύλο και την ηλικία ταιριαστό υγιείς δότες είχαν εγγραφεί στη μελέτη. Στους ασθενείς με ΜΜΚΠ, 33 ασθενείς είχαν αρχικά διαγνωστεί, και 39 ασθενείς ήταν σε χημειοθεραπεία. Καρκίνος χαρακτηριστικά των ασθενών είναι παρόντες στον Πίνακα 1. Τα χαρακτηριστικά του κοόρτης καλοήθεις παθήσεις ασθενών παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο S1 αρχείου. Τρία χιλιοστόλιτρα του περιφερικού αίματος αποσύρθηκαν σε αντιπηκτικό σωλήνες που περιέχουν EDTA από υποκείμενα που συμμετέχουν αυτή τη μελέτη. Όλα ασθενών και υγιών εθελοντών που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη υπογράψει γραπτή συγκατάθεση πριν από την αιμοδοσία. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Νοσοκομείο Επιτροπή Δεοντολογίας της Σαγκάης Στήθος Νοσοκομείο και την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ενταγμένο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Ναντόνγκ.

Η

Η προετοιμασία των δειγμάτων

Για την προετοιμασία των δειγμάτων αίματος για ανάλυση PCR, ΚΜΑ ήταν εμπλουτισμένο με λύση των ερυθροκυττάρων και η επακόλουθη μείωση των λευκοκυττάρων που αφορούν το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα αντιπηκτική δείγματα ολικού αίματος υποβλήθηκαν πρώτα σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ερυθροκυττάρων (v:v, 1:04) για 15 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μί αντι-CD45 μαγνητικών σφαιριδίων επικαλυμμένων για 30 λεπτά για να καταστρέφουν λευκοκύτταρα. Μετά από αυτό, CTC επωάστηκε με ρυθμιστικό 10 μL σήμανσης (φολικό-συνδεδεμένο ολιγονουκλεοτίδιο) για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσεως στα 500 g. Τέλος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 120 μι ρυθμιστικό απογύμνωσης για την απομάκρυνση των συζυγών ρίζας συνδέσεως-ολιγονουκλεοτιδίου. Το υπερκείμενο συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και εξουδετερώθηκε με 24 μL ρυθμιστικού διαλύματος εξουδετέρωσης για περαιτέρω ανάλυση PCR.

ανάλυση PCR

σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ποσοτική πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ CytoploRare® κυκλοφορούντων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε σύστημα ΑΒΙ StepOne ™ (τεχνολογίες ζωής). Δύο και μισό μικρολίτρα των παρασκευασμένων δειγμάτων προστέθηκαν σε ένα σύστημα αντίδρασης μL PCR 25 παρακάτω εγχειρίδιο οδηγιών του κατασκευαστή. Οι συνθήκες PCR αντίδρασης ήταν ως ακολούθως: μετουσίωση στους 95 ° C για 2 λεπτά, επανατήξη στους 40 ° C για 30 s, επέκταση στους 72 ° C για 30 s, έπειτα από ψύξη στους 8 ° C για 5 λεπτά? 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 s, ανόπτηση στους 35 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 10 s. Μια σειριακή προτύπων που περιέχουν ολιγονουκλεοτίδια (10

-14 έως 10

-9 Μ, που αντιστοιχεί σε 2-2 × 10

5 μονάδες CTC /3 ml αίματος) χρησιμοποιούνται για τη CTC ποσοτικοποίηση. Όλα τα δείγματα ασθενών αναλύθηκαν εις διπλούν με 6 πρότυπα και 3 ελέγχους ποιότητας. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, η μέση διακύμανση ενδο-δοκιμασίας (η μέγιστη διαφορά μεταξύ των δύο) θα πρέπει να είναι & lt? Κύκλο 0,5 όριο για τα πρότυπα και τους ελέγχους ποιότητας, και & lt?. Κύκλου 1 κατώτατο όριο για δειγμάτων που ελέγχθηκαν

Recovery, γραμμικότητα και όριο ποσοτικού προσδιορισμού των μελετών

καθιέρωση νόμιμο σύστημα για την αξιολόγηση της ακρίβειας και τη γραμμικότητα του προσδιορισμού αυτού, τα δείγματα αίματος από υγιείς δότες συνενώθηκαν και υποπολλαπλάσιο σε δείγματα 3 ml, τα οποία εμπλουτίστηκαν με 5, 10, 20 , 40, και 200 ​​καλλιεργημένα κύτταρα ΚΒ. Το αμιγές, συνενώθηκαν αίμα χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος (NC). Διακόσιες χιλιάδες καλλιεργημένα κύτταρα ΚΒ χρησίμευσε ως θετικός αναφοράς (PR). Τα παραπάνω πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές. Οι παρατηρούμενες μετρήσεις κυττάρων υπολογίζεται από την παρακάτω εξίσωση:. Ο λόγος ανάκτησης προσδιορίστηκε διαιρώντας την ποσότητα της παρατηρούμενης κυττάρων από την ποσότητα των αιχμηρών κυττάρων

Για να προσδιοριστεί η γραμμικότητα της δοκιμασίας, έχουμε αναλύσει το παρατηρούμενες και εμπλουτίστηκε CTC μετράει σε όλα τα σημεία δεδομένων με γραμμική παλινδρόμηση. Καταργήσαμε την σύγχυση μεταβλητή της ανάκαμψης τοις εκατό χρησιμοποιώντας την παρατηρούμενη τιμή του αρχικού δείγματος διαιρούνται με τους συντελεστές αραίωσης για τον προσδιορισμό των αναμενόμενων τιμών για τη σειρά αραίωσης για κάθε εξεταζόμενο δείγμα.

Ανοσοβαφή εμπλουτισμένου CTC

τρία δείγματα χιλιοστόλιτρο αίματος από δύο μεταστατικό μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα εμπλουτίστηκαν με τη χρήση του προαναφερόμενου πρωτοκόλλου. Τα εμπλουτισμένα δείγματα CTC και καλλιεργήθηκαν ΚΒ κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά στους -20 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σημάνθηκαν με ένα παν-κυτοκερατίνης μονοκλωνικό αντίσωμα συζευγμένο με φυκοερυθρίνη (SC-8018PE, Santa Cruz, αραιωμένο σε 1:100) και ένα φθορίζον συζεύγματα φολικού οξέος [19] (Wuxi AppTec, Κίνα, 10 ηΜ) για 1 ώρα. Μετά από αυτό, το δείγμα πλύθηκε τρεις φορές με PBS, που ακολουθείται από την τοποθέτηση με 4′-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) που περιέχει τοποθέτησης μέσων (τεχνολογίες Life), και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ανάλυση εικόνας χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Γερμανία).

κλινικές αξιολογήσεις

για να αξιολογηθεί η κλινική χρησιμότητα, έχουμε διεξάγει μια διπλή-τυφλή, δύο-κέντρο μελέτης σε ασθενείς με καλοήθεις και κακοήθεις παθήσεις του πνεύμονα. Προκειμένου να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων δοκιμής, χρησιμοποιήσαμε t-test του φοιτητή με διόρθωση Welch για άνισες διακυμάνσεις με διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Για τον προσδιορισμό του κατωφλίου, η ειδικότητα και η ευαισθησία της μεθόδου, τα στοιχεία από ασθενείς με αρχικά διαγνωστεί NSCLC υποβλήθηκαν της χαρακτηριστικής ανάλυση (ROC) με Prism (GraphPad Software). Το κριτήριο για να καθοριστεί η βέλτιστη τιμή αποκοπής στην ανάλυση ROC είναι η μεγιστοποίηση της συνολικής αξίας των ειδικότητα και ευαισθησία.

Αποτελέσματα

βαθμονόμησης PCR και μονάδα CTC

Ως μια εξωτερική καμπύλης βαθμονόμησης, χρησιμοποιήθηκαν έξι πρότυπα που περιέχουν ένα σειριακό των συγκεντρώσεων των συζευγμένων ολιγονουκλεοτιδίων για τον υπολογισμό της ποσότητας του φολικού υποδοχέων επί ΚΜΑ (Σχήμα S1). Για τον υπολογισμό της ποσότητας της CTC από την ποσότητα του φυλλικού οξέος υποδοχέων, χρησιμοποιούμε ένα αυθαίρετα ορίζεται μονάδα, που ονομάζεται μονάδα CTC. Όπως καθορίζεται από την καμπύλη βαθμονόμησης, η ποσότητα φυλλικού οξέος αριθμό υποδοχέων σε 1 × 10

5 ΚΒ κύτταρα είναι 7,5 × 10

-14 mol, η οποία ορίζεται ως 1 × 10

5 μονάδες CTC. Το ανιχνεύσιμο εύρος του προσδιορισμού είναι από 2 έως 2 × 10

5 μονάδα CTC. Για τους ελέγχους ποιότητας, η ενδο-προσδιορισμού συντελεστή μεταβλητότητας (CV) είναι από 2,6% έως 3,8%, και το βιογραφικό δια-δοκιμασίας είναι από 3,3% έως 5,3% (Πίνακας S2 σε S1 αρχείου).

Επικύρωση ο συνδετήρας στοχοθέτησης μέθοδος PCR για ποσοτικοποίηση CTC

ο ΚΒ κυττάρων μετρώντας μελέτη έδειξε ότι & gt? 80% των αιχμηρών κυττάρων θα μπορούσαν να ανακτηθούν σε κάθε συγκέντρωση (5, 10, 20, 40 και 200) (Σχήμα 2Α ). Ο μέσος λόγος ανάκτησης CTC ήταν 81% στα 5 εμβολιάζεται κύτταρα σε 3 mL αίμα, και ακόμη υψηλότερη σε δείγματα εμπλουτίστηκαν με υψηλότερη συγκέντρωση των κυττάρων. Με τα αποτελέσματα από τη μελέτη εμβολιασμού, πραγματοποιήσαμε τα ελαχίστων τετραγώνων κατάλληλα για τη σύγκριση της παρατηρούμενης και εμπλουτίστηκε ποσότητα σε όλα τα σειρά αραίωσης (Σχήμα 2Β). Η εξίσωση παλινδρόμησης ήταν Υ = 0,9455 × -0.831 με R

2 = 0,9946. Η μελέτη έδειξε ότι πάνω από το δοκιμάζονται συγκέντρωση CTC η μέση ανάκτηση, όπως προκύπτει από την ανάλυση παλινδρόμησης, είναι 94,6%.

Μια αναλογία Recovery) της δοκιμασίας αιχμηρών κυττάρων. Β) καμπύλη γραμμικής παλινδρόμησης της δοκιμασίας αιχμηρών κυττάρων. C) Εξειδίκευση δοκιμή του προσδιορισμού. Καρφιά KB κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με (

διαγωνίστηκαν

) ή χωρίς (

έλεγχος

) 10 μΜ φυλλικού οξέος πριν από τη σήμανση. δείγματα αίματος Α) υγιείς δότες »εμπλουτίστηκε με 20 ΚΒ κύτταρα

(20 κύτταρα)

ή χωρίς καρκινικά κύτταρα KB

(έλεγχος)

σημάνθηκαν με 10 nM σε φυλλικό οξύ ολιγονουκλεοτιδίων συζυγούς

(συζευγμένο )

ή μη συζευγμένου-ολιγονουκλεοτίδιο

(ολιγονουκλεοτιδίων)

μετά τον εμπλουτισμό. Τα δεδομένα εμφανίζονται με Μέση τιμή ± SD από τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις.

Η

Για να αξιολογηθεί η διακύμανση ενδο-δοκιμασίας (εντός-run ανακρίβεια), αναλύσαμε ένα δείγμα 100 KB κυττάρων σε 3 mL αίματος με τον ίδιο εις τριπλούν μετά την ανωτέρω πρωτόκολλο. Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την διακύμανση μεταξύ-δοκιμασία (μεταξύ διοικούμενο ανακρίβεια), αναλύοντας ένα ίδιο δείγμα εις τριπλούν σε 6 ξεχωριστές αναλύσεις για 6 διαφορετικές ημέρες. Το βιογραφικό σημείωμα ενδο-ανάλυσης είναι 11,2%, και το βιογραφικό δια-δοκιμασίας είναι 14,2% (Πίνακας S3 στο αρχείο S1).

Για τον προσδιορισμό της ειδικότητας αυτής της μεθόδου πραγματοποιήσαμε μια μελέτη ανταγωνισμού χρησιμοποιώντας 10 μΜ φολικό οξύ ως ανταγωνιστικού συνδετήρα για το φυλλικό οξύ που συνδέονται με ολιγονουκλεοτιδίων. Τα αποτελέσματα του πειράματος έδειξαν ότι 10 μΜ φολικό οξύ μπορεί να εμποδίσει το συζυγές από τη σύνδεση με τα κύτταρα ΚΒ (Σχήμα 2C). Το μπλοκάρισμα παρέχει την απόδειξη της ειδικότητας του σε φυλλικό οξύ συνδεδεμένο ολιγονουκλεοτίδιο συνδεδεμένο με το φολικό οξύ υποδοχέα αιχμηρών κυττάρων ΚΒ.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν «φόντο» τα σήματα για τα δείγματα αίματος υγιών δοτών ». Για να διερευνήσουν την προέλευση του σήματος «φόντο», που επισημαίνονται δείγματα αίματος υγιών δοτών »εμπλουτίστηκε με 20 ΚΒ κύτταρα ή χωρίς κύτταρα του όγκου KB χρησιμοποιώντας 10 nM σε φυλλικό οξύ ολιγονουκλεοτίδιο συζευγμένο ή μη συζευγμένου -oligonucleotide (Σχήμα 2D). Τα δείγματα αίματος εμπλουτίστηκε χωρίς καρκινικά κύτταρα δεσμεύονται με φολικό-συνδεδεμένο ολιγονουκλεοτίδιο ή μη συζευγμένα ολιγονουκλεοτίδια indiscriminatively, όπως προσδιορίζεται με qPCR. Σε αντίθεση, τα δείγματα εμπλουτίστηκαν με καρκινικά κύτταρα μπορούν να σημανθούν προφανώς με φυλλικό συζευγμένο ολιγονουκλεοτίδιο όχι το μη συζευγμένο ολιγονουκλεοτίδιο. Το αποτέλεσμα πρότεινε ότι τα σήματα «φόντο» προκλήθηκαν από την πρόσδεση των ολιγονουκλεοτιδίων στα υπολειμματικά κύτταρα του αίματος στα εμπλουτισμένα δείγματα. Το πιο σημαντικό, το σήμα «φόντο» που προκαλούνται από «ολιγο-δεσμευτικό» δεν θα θέσει σε κίνδυνο την ειδική ανίχνευση των σπάνιων CTC όπως φαίνεται παρακάτω.

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η ειδικότητα της έκφρασης FR στη CTC στο NSCLC, τρεις δείγματα χιλιοστόλιτρο αίματος από δύο μεταστατικό ασθενείς που φέρουν FR θετική CTC εμπλουτίστηκαν με τη χρήση του προαναφερθέντος πρωτοκόλλου. Στη συνέχεια, τα εμπλουτισμένα δείγματα CTC και καλλιεργημένα κύτταρα ΚΒ, καθορίστηκαν με μεθανόλη, και σημάνθηκαν με φθορίζουσα συζυγή του φολικού οξέος, μονοκλωνικό αντίσωμα για κυτοκερατίνες και αντιδραστηρίου πυρηνική χρώση, ϋΑΡΙ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, ΚΒ κύτταρα και τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα σημάνθηκαν με ειδικά συζυγή φθορισμού φυλλικού οξέος (πράσινο) και κυτοκερατίνες αντίσωμα (κόκκινο). Σε αντίθεση, οι μικρές λευκοκύτταρα δεν μπορεί να σημανθεί με τα συζυγή φθορισμού φυλλικό οξύ και αντίσωμα κυτοκερατίνης (Σχήμα 3Η και 3L). Περαιτέρω, σύμφωνα με την παρατήρηση μικροσκόπιο, η ΚΜΑ και καλλιεργημένα κύτταρα ΚΒ έδειξε ένα παρόμοιο επίπεδο έκφρασης του υποδοχέα φολικού (Σχήμα 3).

ΚΒ κύτταρα (Α-Δ) και εμπλουτίζεται ΚΜΑ από δύο μεταστατικό ΜΜΚΠ ασθενείς (CTC sample1 : Ε-η? CTC δείγμα 2: I-L), καθορίστηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν για κυτοκερατίνη (Α, Ε και Ι) και υποδοχέα φολικού (FR) (Β, F και J). Ο πυρήνας των κυττάρων σημάνθηκε με DAPI (C, G και Κ). Οι συγχωνευμένες εικόνες έδειξαν κυτοκερατίνη και φυλλικό οξύ υποδοχέα εκφράζονται μόνο σε ΚΜΑ (H και L) και ΚΒ κύτταρα (D), όχι σε αιματολογικές κύτταρα.

Η

επικράτηση CTC σε κλινικά δείγματα

Όπως φαίνεται στον πίνακα 1, συνολικά 72 ασθενείς με NSCLC εντάχθηκαν στη μελέτη. Όπως ομάδες ελέγχου, λάβαμε περιφερικού αίματος από 20 ασθενείς με καλοήθεις παθήσεις του πνεύμονα και 24 υγιείς δότες.

Κατ ‘αρχάς, σε σύγκριση με τα επίπεδα CTC σε ασθενείς με καρκίνο κατά την αρχική διάγνωση, οι ασθενείς καλοήθη νόσο και υγιή άτομα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τα επίπεδα CTC στο αίμα από ασθενείς με εντοπισμένο (στάδιο Ι, ΙΙ και ΙΙΙ? Σημαίνει 11,9 μονάδας CTC? Εύρος 3,8 – 25,7 μονάδας CTC?

σ

= 0,0011) ή μεταστατικό (σταδίου IV ? σημαίνει 20,9 μονάδας CTC? εύρος 6,8 – 75,0 μονάδας CTC?

σ

= 0,0055) ασθένειες είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι σε υγιείς εθελοντές (μέση τιμή 6.7? εύρος 3,0 – 11,4 μονάδων CTC) και οι ασθενείς καλοήθης ασθένεια των πνευμόνων (μέσος όρος 6,0? κυμαίνεται 1.6 έως 8.7 μονάδα CTC). Οι μεταστατικές ασθενείς έχουν περισσότερο CTC από εντοπισμένη ασθενείς (

σ

= 0.045). Τα ανωτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εντοπισμένες και μεταστατικές ασθενείς έχουν διακριτά επίπεδα CTC. Σε μια πιο προηγμένη ανάλυση, θέλουμε να διερευνήσει την ευαισθησία της μεθόδου έναντι διαφορετικών ιστολογικών υποτύπων του NSCLC. Για τους 16 ασθενείς αδενοκαρκίνωμα, τα επίπεδα CTC (μέση τιμή 18.1, εύρος 3,8 – 75,0) δεν παρουσιάζουν σημαντική διαφορά από τα 11 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) ασθενείς (μέση τιμή 12.4, εύρος 4,3 έως 20,8) και άλλων ιστολογικών υποτύπων (μέση τιμή 15,1, εύρος 10,1 – 25,7) (Εικόνα 4Β). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε η έκφραση του υποδοχέα φολικού μπορεί να είναι παρόμοια σε όλες τις ιστολογικές υποτύπους σε ασθενείς με NSCLC.

Α) επίπεδα CTC σε εντοπισμένες και μεταστατική κακοήθη νόσο των πνευμόνων, καλοήθης νόσος των πνευμόνων και υγιείς δότες. Β) Κατανομή των επιπέδων CTC σε διαφορετικές ιστολογικές υποτύπους. ADC, αδενοκαρκίνωμα? SCC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Γ) λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση (ROC) μεταξύ κακοήθους ομάδα πνευμονοπάθεια και καλοήθη νόσο και υγιή ομάδα.

Η

Για να αναλυθεί περαιτέρω η ευαισθησία και η ειδικότητα της δοκιμασίας για διαφορετικές παθολογικές στάδια και ιστολογικών υποτύπων στον NSCLC, θα πρέπει πρώτα να καθοριστεί το cut-off όριο με ανάλυση ROC. Εικόνα 4C έδειξε ότι το όριο cut-off μεταξύ της ομάδας ελέγχου (καλοήθης ασθενείς και υγιείς εθελοντές) και αρχικά διαγνωστεί ομάδα του καρκίνου ήταν 8,5 μονάδα CTC, η ευαισθησία είναι 81,8% και η ειδικότητα 93,2%. Προφανώς, CTCs ανιχνεύθηκαν σε δείγματα αίματος από 82% (27 από 32) αρχικά διαγνωσθεί ασθενείς με NSCLC, ενώ ψευδή θετικά σε 20 ασθενείς καλοήθη νόσο (5%, 1 20) και 24 υγιείς εθελοντές ήταν αμελητέα (8%, 2 24 ). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, 80% (8 από 10) του σταδίου Ι-ΙΙ, 67% (6 από 9) του σταδίου III, και 93% (13 από 14) του σταδίου IV ασθενείς βρέθηκαν να έχουν περισσότερα από 8,5 CTC μονάδα. Στην ιστολογική υποτύπους, 69% (11 από 16) των ασθενών αδενοκαρκίνωμα ήταν CTC θετικά, και 91% (10 από 11) των ασθενών SCC ήταν CTC θετικά.

Η

Οι δημοσιευμένες μελέτες έδειξε ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να θέσει σε κίνδυνο την παρουσία της CTC σε κυκλοφορία [1], [4], [5]. Πραγματοποιήσαμε μια προκαταρκτική μελέτη για να συγκρίνει τον αριθμό CTC σε ασθενείς με NSCLC κατά την αρχική διάγνωση και στην χημειοθεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, 16 εντοπισμένο ασθενείς σε χημειοθεραπεία (μέση τιμή 5,8, εύρος 0,7 – 11,5) έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα CTC από τα αρχικά διαγνωσθεί ασθενείς (

σ

= 0,0006)? λαμβάνοντας υπόψη ότι η διαφορά στα επίπεδα CTC σε μεταστατικό ασθενείς με ή χωρίς θεραπεία δεν ήταν τόσο σημαντική όσο τα εντοπισμένα ασθενείς. Παρά το γεγονός ότι η μέση στάθμη της CTC, σε μεταστατικούς ασθενείς κατά την αρχική διάγνωση ήταν 20,9 μονάδας CTC, σε σύγκριση με 13,5 μονάδα CTC σε ασθενείς που λαμβάνουν χημειοθεραπεία, η t-test δεν επαληθεύει ότι η διαφορά ήταν σημαντική σε μια

σ

αξία 0,05 . Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι οι εντοπισμένες ασθενείς με NSCLC μπορεί να έχουν καλύτερη πρόγνωση σε σχέση με τους μεταστατικούς ασθενείς, όταν τεθεί σε χημειοθεραπεία

w /o χημειο

, αρχικά διαγνωστεί ασθενείς με NSCLC.?

με χημειο

, οι ασθενείς με NSCLC σε χημειοθεραπεία.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αξιολογηθεί η τεχνική LT-PCR για την ποσοτικοποίηση της CTC σε δείγματα περιφερικού αίματος από ασθενείς με NSCLC. Η τεχνολογία βασίζεται σε αρνητική εξάντληση των λευκοκυττάρων που ακολουθείται από την επισήμανση της CTC με φυλλικό οξύ συνδέεται ολιγονουκλεοτιδίων και μετέπειτα ποσοτικοποίηση με qPCR. Μελέτες με υγιή δείγματα αίματος εμπλουτίστηκε με καρκινικά κύτταρα δείχνουν ότι η δοκιμασία είναι ειδική, ποσοτική και γραμμική από μια σειρά από 5-200 κύτταρα ανά 3 mL αίματος αναλύθηκαν. Αξιολόγηση των δειγμάτων αίματος ασθενών αποδεικνύει ότι η μέθοδος είναι αρκετά ευαίσθητη για την διαστρωμάτωση των ασθενών με διαφορετικό καθεστώς νόσο (καλοήθης, τοπική και μεταστατικό).

Πιθανά πλεονεκτήματα της ΕΤ-PCR με τους ογκολόγους μπορεί να περιλαμβάνει 1) μη επεμβατική αξιολόγηση του φορτίου όγκου στο περιφερικό αίμα, 2) υπερευαίσθητης ανάλυσης που επιτρέπει προηγμένες διαστρωμάτωση των ασθενειών των πνευμόνων, 3) στο χαμηλότερο σημείο 3 mL δειγματοληπτικό όγκο που δεν θα επιδεινώσει αναιμία των ασθενών που προκαλείται από κυτταροτοξικά παρενέργειες, 4) σε πραγματικό χρόνο διαμήκη παρακολούθηση κατάστασης της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία, και 5) τυποποιημένη πλατφόρμα που καταργεί την τεχνητή πόλωση ανάλυση.

Οι περισσότεροι

in vitro

διαγνωστικές εξετάσεις αίματος για τον καρκίνο του NSCLC πάσχουν από πιθανή ψευδώς αρνητικά ή /και θετικά αποτελέσματα. Η χρήση των επικάλυψη αντι-EpCAM μαγνητικά σφαιρίδια επιχειρήθηκε για τον εμπλουτισμό της CTC, σε δείγματα αίματος NSCLC. Ωστόσο, κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η χαμηλή ευαισθησία του με βάση εμπλουτισμού EpCAM στην ανίχνευση CTC για τους ασθενείς με ΜΜΚΠ [12], [22]. Δημοσιευμένες μελέτες έδειξαν επίσης ότι οι μη-EpCAM κυττάρων που εκφράζουν μπορεί να περιλαμβάνει την πλειοψηφία της CTC, σε NSCLC περιφερικό αίμα, και ως εκ τούτου EpCAM εμπλουτισμού βάση μπορεί να αποτύχει να ανιχνεύσει σπάνια CTC [22]. Ανιχνεύσαμε την έκφραση του υποδοχέα φυλλικού οξέος σε EpCAM θετικές και αρνητικές κέντρα θεραπείας χολέρας σε ασθενείς με NSCLC. Αντι-ΕρΟΑΜ επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν για να διαχωρίσει EpCAM-θετικών και αρνητικών EpCAM-κλάσμα CTCs. Βρήκαμε το FR θετικό αριθμό CTC ήταν πολύ υψηλότερο σε EpCAM-αρνητικό κλάσμα σε σχέση με EpCAM-θετικά κλάσμα σε τρεις ασθενείς με ΜΜΚΠ (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι EpCAM βασίζεται σύλληψης μπορεί να χάσει μεγάλο κλάσμα CTCs στον καρκίνο του πνεύμονα. Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA), μια γλυκοπρωτεΐνη που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, βρίσκεται επίσης σε φυσιολογικά ή καλοήθη νοσούντα κύτταρα απελευθερώνονται στην κυκλοφορία [32]. Η δυνατότητα εφαρμογής της CYFRA21-1, η οποία είναι μια κυτοκερατίνη 19 θραύσματα που απελευθερώνεται στο αίμα, έχει διερευνηθεί σε μελέτες στη διάγνωση του NSCLC [33] – [35]. Παρά το γεγονός ότι CYFRA21-1 μπορεί να είναι ο πιο ευαίσθητος δείκτης όγκου στο προχωρημένο NSCLC, η ευαισθησία του CYFRA21-1 εξακολουθεί να είναι χαμηλό για τη νόσο πρώιμο στάδιο [33], [35].

Τα δημοσιευμένα στοιχεία από βιοψία ιστού έχουν δείξει 72% -83% του καρκίνου του πνεύμονα υπερ-εκφράζουν το FR επί της κυτταρικής επιφανείας [28] – [31]. Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν το FR θετική CTC βρέθηκαν σε καρκίνους των ωοθηκών [19]. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν μελέτες που έχουν αναφερθεί για την επικράτηση του FR θετική CTC στο NSCLC. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την κλινική αξία των υποδοχέων φυλλικού οξέος θετική CTC στον NSCLC. Τα αποτελέσματα έδειξαν το FR είναι ένας πιθανός δείκτης επιφάνειας για τον προσδιορισμό της CTC των ασθενών με NSCLC, ακόμη και σε πρώιμο στάδιο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι, σε πρωτογενείς μάζα του όγκου, η έκφραση FR είναι πολύ χαμηλότερη σε SCC από ό, τι σε αδενοκαρκίνωμα στο μεταστατικό καρκίνο [29]. Ωστόσο, βρήκαμε την έκφραση FR σε ΚΜΑ είναι παρόμοια σε όλες τις ιστολογικές υποτύπους. Αυτή η αντιφατική εύρημα μπορεί να εξηγηθεί από διαφορετική κατανομή των παθολογικών σταδίων για μεμονωμένες ιστολογική υποτύπους. Iwakiri

et al.

Ανέφερε ότι η χαμηλότερη έκφραση του υποδοχέα φολικού βρέθηκε σε προχωρημένο στάδιο σε σύγκριση με το αρχικό στάδιο NSCLC [36]. Στους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη μας, το 48% έχουν αδενοκαρκινώματα (στάδιο IV, 44%), το 33% έχει καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (στάδιο IV, 27%) και το 18% έχουν απροσδιόριστη καρκίνο του πνεύμονα. Το χαμηλότερο FR θετικότητα σε αδενοκαρκινώματα στη μελέτη μας, θα μπορούσε να εξηγηθεί από το υψηλό ποσοστό των ασθενών προχωρημένο στάδιο είναι εγγεγραμμένοι σε σύγκριση με την ομάδα SCC. Επίσης, υπάρχει μια άλλη πιθανότητα ότι CTC μπορεί να εκφράσει FR διαφορετική από την κύρια μάζα του όγκου. Προηγούμενη βιβλιογραφία αναφέρεται διαφορική έκφραση των γονιδίων μεταξύ του πρωτογενούς όγκου και CTC δείγμα [37]. Μια μεγάλης κλίμακας, θα απαιτηθεί καλοσχεδιασμένη κλινική μελέτη για την αντιμετώπιση του παραπάνω ανησυχία.

Αν και φολικού υποδοχέα έχει ταυτοποιηθεί σε φυσιολογικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών, σπλήνα και τον πνεύμονα, κλπ. [28] Ωστόσο, δεν υπάρχουν κύτταρα που εκφράζουν υποδοχείς φολικού σε κυκλοφορικό σύστημα εκτός ΚΜΑ ή ενεργοποιημένα μονοκύτταρα [19], [38]. Προκαταρκτικές μελέτες διαπιστώθηκε ότι αυτό υποπληθυσμός των ενεργοποιημένων μονοκυττάρων είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη στα δείγματα αίματος από υγιείς δότες ή καλοήθη ασθενείς [19], [39]. Στο 9% των περιπτώσεων όπου «CTC» μπορεί να ανιχνευθεί σε υγιή δείγματα, θα μπορούσαν να υπάρχουν δυνατότητα παράνομη έκφρασης των μονοκυττάρων. Όμως, η υπόθεση πρέπει να επαληθεύονται σε περαιτέρω μελέτη. έκφραση υποδοχέα φολικού βρίσκεται επίσης σε ενεργοποιημένα μακροφάγα όγκου [40]. Προκειμένου να εξεταστεί η επίδραση των μακροφάγων σε αυτό το σύστημα ανίχνευσης σε ασθενείς NSCLC, αντι-CD14 μαγνητικών σφαιριδίων επικαλυμμένων χρησιμοποιήθηκε για να καταστρέφουν τα ενεργοποιημένα μακροφάγα σε δείγμα αίματος των ασθενών με NSCLC [41], μετά την εξάντληση των CD45-θετικών λευκοκύτταρα. Βρήκαμε οι μετρήσεις CTC έχουν αλλάξει ελάχιστα κάτω από τη θεραπεία «έξτρα-CD14» σε ασθενείς με ΜΜΚΠ (Σχήμα S3). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε τον μηχανισμό καταστροφής με τη χρήση αντι-CD45 μαγνητικά σφαιρίδια είναι επαρκείς για την εξάλειψη των επιπτώσεων των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους στο CTC μετράει.

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ένα χαμηλό επίπεδο υποβάθρου «CTC» στα υγιή άτομα και οι ασθενείς καλοήθη νόσο. Όπως αποδεικνύεται από τη μελέτη ιδιαιτερότητα, το σήμα υποβάθρου μπορεί να προκύψει από την πρόσδεση του ολιγονουκλεοτιδίου στο υπολειπόμενα κύτταρα του αίματος. Αν και προηγούμενες βιβλιογραφία περιγράφονται διάφοροι μηχανισμοί για την πρόσδεση του ολιγονουκλεοτιδίου σε κύτταρα θηλαστικών [42], δεν υπάρχει συναίνεση για αυτήν βιολογική διαδικασία. Ωστόσο, οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι όλοι οι δεσμευτικές ποσότητα του ολιγονουκλεοτιδίου είναι σημαντικά χαμηλότερο σε σύγκριση με συζυγή μας. Είμαστε σίγουροι ότι η «φόντο CTC» δεν θα παρεμβαίνει με την ανίχνευση του πραγματικού «CTC» σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Τέλος, επειδή οι υψηλότερες μετρήσεις CTC αναφέρθηκαν να συνδέσει με κακή πρόγνωση σε μεταστατικούς καρκίνους [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR θα μπορούσε δυνητικά προσδιορίσει την υποομάδα ασθενών με κακή πρόγνωση σε πρώιμο στάδιο της νόσου και ως εκ τούτου ογκολόγους βοήθεια να συνταγογραφούν πιο αποτελεσματικές θεραπείες. Σε μια πιο προχωρημένη ανάλυση, ο φαινότυπος της CTC θα παρείχε άμεσες αποδείξεις για ογκολόγους να καθοριστεί το βέλτιστο θεραπευτικό σχήμα. Με την κατάλληλη συνδέτη συγγένειας (π.χ. αντίσωμα, πεπτίδιο, μικρά χημικά μόρια, κλπ), η LT-PCR μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω για τη φαινοτυπική σπάνια CTC σε ένα multiplex, υψηλής απόδοσης μόδας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. καμπύλη

Διακρίβωση qPCR και lineality παραμέτρους

doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. έκφραση του υποδοχέα

φυλλικού οξέος σε EpCAM θετικές και αρνητικές κέντρα θεραπείας χολέρας σε ασθενείς με NSCLC. δείγματα CTC εμπλουτίστηκαν από 3 mL αίματος τριών FR θετικούς ασθενείς με NSCLC από λύση των ερυθροκυττάρων και ανοσομαγνητική εξάντληση των λευκοκυττάρων. Στη συνέχεια, τα εμπλουτισμένα δείγματα CTC επωάστηκαν με αντι-EpCAM μαγνητικά σφαιρίδια (τεχνολογίες Life, Cat Νο 16203) για 30 λεπτά. Μετά ανοσομαγνητικά απομόνωση για 10 λεπτά, τα θετικά κύτταρα EpCAM συλλήφθηκαν από τα μαγνητικά σφαιρίδια. Τα αρνητικά κύτταρα EpCAM συνελέγησαν από το υπερκείμενο με φυγοκέντρηση στα 600 g για 15 λεπτά. Μετά από αυτό, οι δύο κλάσματα του δείγματος CTC είχαν επισημανθεί και να ανιχνεύεται ως το προαναφερθέν πρωτόκολλο. Τα δεδομένα εμφανίζονται με Μέση τιμή ± SD από τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις qPCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Η επίδραση των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους στο FR θετικό NSCLC ασθενείς. δείγματα CTC εμπλουτίστηκαν από 3 mL αίματος τριών FR θετικούς ασθενείς με NSCLC από λύση των ερυθροκυττάρων και ανοσομαγνητική εξάντληση των CD45-θετικών λευκοκύτταρα. Πίνακας S1. Πίνακας S2. Πίνακας S3.