Αφηρημένο

Η διαμεμβρανική και εκκρίνεται πρωτεΐνη δέλτα-όπως 1 ομόλογο (

DLK1

) ανήκει η EGF-σαν οικογένεια. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι

DLK1

παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των κυττάρων, όπως λιπογένεσης και οστεογένεση. Η ανώμαλη έκφραση του

DLK1

έχει βρεθεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Μια προηγούμενη μελέτη σε αυτό το εργαστήριο έχει αποκαλύψει ότι

DLK1

σχετίζεται με προσβολή όγκου, αν και ο μηχανισμός είναι ακόμη άγνωστη. Να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις που

θα μπορούσε να έχει DLK1

στην εισβολή,

DLK1

ήταν υπερεκφράζεται ή γκρέμισε τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. επιρροές της πρωτεΐνης στην κυτταρική εισβολή στη συνέχεια αξιολογήθηκαν. Μια δοκιμασία φρεατίων έδειξε ότι

DLK1

υπερέκφραση προώθησε σημαντικά καρκινικών κυττάρων εισβολής. Ανάλυση κηλίδωσης και ζυμογραφία ζελατίνης Western έδειξε ότι

DLK1

θα μπορούσαν να επηρεάσουν τόσο τη μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (

ΜΜΡ9

) έκφρασης και εξωκυττάριο δραστηριότητά της. Μια ανάλυση του

Notch1

και

HES1

γονιδιακής έκφρασης και Notch ενδοκυττάρια περιοχή (NICD) πυρηνική μετατόπιση κατά τη διάρκεια

DLK1

διέγερση ή εξάντληση έδειξε ότι

DLK1

μπορούσε ενεργοποιούν σηματοδότηση Notch σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση του

ΜΜΡ9

προκαλείται από

DLK1

διέγερση θα μπορούσε να μειωθεί σημαντικά με την αναστολή της Notch σηματοδότηση χρησιμοποιώντας αναστολέα της γ-σεκρετάσης (GSI). Τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι

DLK1

μπορεί να προωθήσει την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με προς τα πάνω ρύθμιση

ΜΜΡ9

έκφρασης, η οποία εξαρτάται από Notch σηματοδότηση

Παράθεση:. Λι L , Tan J, Zhang Υ, Han Ν, Di Χ, Xiao T, et al. (2014)

DLK1

Προωθεί τον Καρκίνο του Πνεύμονα εισβολή κυττάρων μέσω Προς τα πάνω ρύθμιση

ΜΜΡ9

Έκφραση Ανάλογα με Notch σηματοδότηση. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10.1371 /journal.pone.0091509

Επιμέλεια: Yunli Zhou, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Νοέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 11η Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Μαρ του 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30930042 και 81301852) και το Ταμείο εξειδικευμένη έρευνα για το Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (20111106110017). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και μετάσταση όγκου συνδέεται στενά με την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο [1], [2]. προηγούμενες μελέτες μας σχετικά με διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα (SCC), με ή χωρίς λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA βρήκε ένα σύνολο γονιδίων που σχετίζονται με μετάσταση (fdr & lt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταξύ αυτών των γονιδίων,

DLK1

έδειξε περισσότερο από δύο φορές υψηλότερη έκφραση σε πρωτογενείς όγκους με μετάσταση λεμφαδένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι

DLK1

μπορεί να παίζουν ρόλους στη μετάσταση του καρκίνου. Ωστόσο, τόσο η σχέση μεταξύ των

DLK1

και τη μετάσταση των όγκων και ο μηχανισμός του είναι κακώς χαρακτηρίζεται.

Το δέλτα-όπως 1 ομόλογο (

DLK1

) γονίδιο, με τα ψευδώνυμα

FA1

,

ZOG

και

Νομός-1

, κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική και εκκρίνεται πρωτεΐνη (DLK1) περιέχει έξι επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) πεδία που είναι μέλος της ΕΤΠ -όπως οικογένεια. Αυτή η πρωτεΐνη είναι εξαιρετικά ομόλογη με την DLL1 συνδέτη Notch αλλά στερείται το μοτίβο Delta /Serrate /Lag (DSL) η οποία είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση με τους υποδοχείς Notch [3], [4]. Μελέτες για

DLK1

έχουν αποκαλύψει το ρόλο της στην κυτταρική διαφοροποίηση. Για παράδειγμα,

DLK1

μπορεί να λειτουργεί στη ρύθμιση αδιπογένεσης [5], [6], [7], που ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών [8], [9] και την αναστολή της διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού των αιμοποιητικών κυττάρων [10]. Η μη-κλασσική συνδέτης

DLK1

βρέθηκε να εκφράζεται με παρεκκλίνοντα σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του νευροβλαστώματος [11], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [12], [13], τα γλοιώματα [14] και του καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο [15]. προηγούμενη εργασία μας διαπίστωσε επίσης ότι

DLK1

εκφράζεται έντονα σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και λειτουργεί ως ένα ογκογονίδιο [16]. Προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση του

DLK1

σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα, αλλά ο μηχανισμός είναι ακόμη άγνωστη.

Το μονοπάτι Notch είναι ένα πολύ γνωστό μονοπάτι μεταγωγής σήματος κατά τη διάρκεια της αναπτυξιακή διαδικασία και την αποφασιστικότητα της κυτταρικής τύχης. Παρά το γεγονός ότι λείπει το μοτίβο DSL,

DLK1

έχει αποδειχθεί ότι δρα ως αναστολέας της σηματοδότησης Notch in vitro [17], [18]. Τόσο δεσμευμένη σε μεμβράνη και εκκρίνεται DLK1 μπορούν να αλληλεπιδρούν με Notch 1 [17], που οδηγεί σε αλλοιωμένη κυτταρική κατανομή της Notch 1 και η αναστολή της γονιδιακής έκφρασης Notch ρυθμίζεται [4], [5], [19]. Έχει αναφερθεί ότι

Notch 1

μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (

ΜΜΡ9

) σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία παίζει βασικό ρόλο στην εισβολή του καρκίνου [20]. Λαμβάνοντας αυτά τα ευρήματα μαζί, υποθέτουμε ότι η σηματοδότηση Notch μπορεί να εμπλέκεται σε

DLK1

επαγόμενη καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Η μελέτη που παρουσιάζουμε εδώ παρέχει ενδείξεις ότι

DLK1

ενισχύσει την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα να εισβάλουν στο εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM), που επικύρωσε προηγούμενη γονιδιακής έκφρασης μας προφίλ αποτελέσματα προκύπτουν από την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το

DLK1

προωθείται καρκινικών κυττάρων εισβολή μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του

ΜΜΡ9

έκφραση και ενίσχυση της εξωκυτταρικής δραστηριότητας της, οι οποίες εξαρτώνται από την οδό σηματοδότησης Notch.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργειες και θεραπεία

Ο καρκίνος του πνεύμονα ανθρώπινη κυτταρική σειρά H520, Η1299 και Α549 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C . Ο αναστολέας Notch L-685,458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας 12 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση με το

DLK1

πλασμίδιο έκφρασης ή το μηδενικό διάνυσμα (pcDNA3.1), με τελική αποτελεσματική συγκέντρωση 5 μΜ σε RPMI 1640 που περιέχει 1% FBS.

DLK1

πλασμίδιο έκφρασης και μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Το

DLK1

ευκαρυωτικό πλασμίδιο έκφρασης δομήθηκε και στη συνέχεια σταθερώς επιμολυσμένα σε κύτταρα H520, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Η

DLK1

πλασμίδιο έκφρασης επίσης παροδικά επιμολυσμένα σε κύτταρα H520 και Η1299 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine-2000 διαμόλυνση (Invitrogen, Carlsbad, CA)? και ένα duplex Invitrogen Stealth siRNA (Carlsbad, CA) έναντι

DLK1

χρησιμοποιήθηκε για γονιδιακή σίγηση χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών.

In vitro ECM εισβολή δοκιμασία

Τα κύτταρα είτε σταθερά (H520) ή παροδικά (Η1299) επιμολυσμένα με

DLK1

ή null φορέα καλλιεργήθηκαν ξεχωριστά μέχρι 80% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό επί μία νύκτα πριν να υποβληθεί στην μια δοκιμασία ECM εισβολή in vitro. Η ανίχνευση χημικής διεξήχθη χρησιμοποιώντας Biocoat Matrigel εισβολής Chambers με 8 μm πόρους (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2.5 χ 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό και σπείρονται εντός του άνω θαλάμου των 24 φρεατίων Transwell πλάκα, ενώ ο κάτω θάλαμος περιείχε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας με 20% FBS ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 22 ώρες (37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα), και οι θάλαμοι στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS. Αυτά τα κύτταρα που δεν εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης αφαιρέθηκαν. Τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες και εξετάστηκαν. Τα κύτταρα σε κάθε μεμβράνη μετρήθηκαν σε όχι λιγότερο από πέντε πεδία υπό μικροσκόπιο φωτός.

εκχύλιση RNA και ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-ΡΟΡ

Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen , Carlsbad, CA) και 1 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή με ένα κιτ αντίστροφης μεταγραφής SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση του

ΜΜΡ9

και

HES1

έκφραση διεξήχθη με τους ακόλουθους εκκινητές: ΜΜΡ9-F 5′-TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3 ‘, ΜΜΡ9-R 5′-CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3′ , HES1-F 5’-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 ‘και HES1-R 5′-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3’. Το γονίδιο housekeeping

18S

ριβοσωμικού RNA επιλέχθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος σε αυτή τη μελέτη, με τους εκκινητές όπως 18S-F 5′-GAAACGGCTACCACATCC-3 ‘και 18S-R 5′-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3’. Ένα κιτ SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Shiga, Japan) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR με ένα πρότυπο πρωτόκολλο ενίσχυσης: 95 ° C για 10 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 3 λεπτά. Μετά την ενίσχυση, μια τυπική διαδικασία τήξης καμπύλη εκτελέστηκε για κάθε γονίδιο να εξετάσει την ειδικότητα της ενίσχυσης.

κηλίδωση Western ανάλυση

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από περίπου 2 × 10

6 καλλιεργήθηκαν κυττάρων με ρυθμιστικό RIPA και πυρηνική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας NE-PER αντιδραστήρια πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχύλισης (Pierce, Rockford, IL) ακολουθώντας το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Συνολικά, 40-80 μg των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι DLK1 (Ομάδα Proteintech, Chicago, IL), Notch 1 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), που διασπάται Notch 1 (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) ή ΜΜΡ9 (Aviva Systems Biology, San Diego, CA). Το αντι-Notch ενδοκυττάρια περιοχή (NICD) αντίσωμα που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη μπορεί μόνο να αναγνωρίζουν διασπαστεί και να ενεργοποιηθεί Notch 1 αλλά όχι πλήρους μήκους Notch 1. Μετά από έκπλυση με PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 (PBST), η μεμβράνη επωάστηκε με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Dako, Glostrup, Denmark), και η αφθονία των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε με αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας. Η μεμβράνη ανιχνεύθηκαν και πάλι με ένα αντίσωμα έναντι GAPDH (KangChen Bio-Tech, Σαγκάη, Κίνα) ή ΤΒΡ (Abcam, Cambridge, ΜΑ) ως εσωτερικοί έλεγχοι για ισοδύναμο φορτίο πρωτεΐνης.

Η ζελατίνη zymography

σταθερά

dLK1

εκφράζοντα H520-dlk1 κύτταρα, μαζί με H520-pcDB και τη γονική H520 κύτταρα null-έλεγχο, καλλιεργήθηκαν ξεχωριστά σε 10 εκατοστά πιάτα μέχρι 80% συρροή. Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο Amicon (Millipore, Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συνολικά, 20 μα συμπυκνώματα πρωτεϊνών ηλεκτροφορήθηκε υπό μη αναγωγικές συνθήκες, και η ζελατινολυτική δραστηριότητα του ΜΜΡ9 αναλύθηκε έπειτα χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ζυμογραφία (Bio-Rad, Hercules, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

οι διαφορές μεταξύ των μετρήσεων εισβάλλοντα κύτταρα σε κάθε ομάδα στη δοκιμασία εισβολής και διαφορές στην σχετική έκφραση στην ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Όλες οι δοκιμασίες ήταν διπλής όψης, και μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με το πακέτο λογισμικού SPSS, έκδοση 13.0 (SPSS, Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του

DLK1

ενισχυμένη εισβολή ECM από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων

Για την αντιμετώπιση εάν

DLK1

έχει δυναμικό ρόλο στη μετάσταση στους πνεύμονες του καρκίνου, οι γραμμές cancercell πνεύμονα H520 και Η1299 απασχολούνταν ως in vitro μοντέλο στο οποίο ενδογενή έκφραση του

DLK1

WAS λείπει. κύτταρα H520 με σταθερή έκφραση εξωγενών

DLK1

(H520-dlk1) δημιουργήθηκαν προηγουμένως, μαζί με τα κύτταρα H520-pcDB, σταθερά επιμολυσμένα με τον φορέα (pcDNA3.1) ως μηδενικής ελέγχου [16]. κύτταρα H520-dlk1 υποβλήθηκαν σε δοκιμασία εισβολής, με H520-pcDB και γονικών H520 κύτταρα ως έλεγχοι. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 πάνελ Α και Β, μετά από μια περίοδο 22 ωρών από την εισβολή, υπήρχαν σημαντικά περισσότερα κύτταρα H520-dlk1 εισέβαλαν μέσα από τη μεμβράνη θαλάμου επικαλυμμένα με Matrigel, σε σύγκριση με H520 και τα κύτταρα H520-pcDB (τιμή-ρ & lt? 0.05). Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σε Η1299 κύτταρα. Περισσότερα

DLK1

παροδικά επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα (Η1299-dlk1) βρέθηκαν εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα Η1299 με το μηδενικό διάνυσμα (Η1299-pcDB), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C και D. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση του

DLK1

μπορούσε αξιοσημείωτα να ενισχύσει την ικανότητα των κυττάρων να εισβάλουν στο ECM.

Α, αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες των εισβάλλοντα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μέσα από την Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη του transwell, που λαμβάνονται από τρία ομάδες: H520, τα μητρικά κύτταρα, H520-pcDB, τα μηδενικά κύτταρα φορέα ελέγχου και H520-dlk1, τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά DLK1. Β, ένα ιστόγραμμα για τις μετρήσεις των μεταναστευτικών κυττάρων από το H520, H520-pcDB και ομάδες H520-dlk1. C, αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες που δείχνουν Η1299 κύτταρα, τα οποία επιμολύνθηκαν παροδικά με

DLK1

(Η1299-dlk1) ή null φορέα (Η1299-pcDB), που εισέβαλαν μέσω του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη του transwell. D, ένα ιστόγραμμα για τις μετρήσεις των μεταναστευτικών κυττάρων από τις ομάδες Η1299-dlk1 και Η1299-pcDB. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (* t-test, p-value & lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του

DLK1

υπερέκφραση MMP9 και τη δραστηριότητα

Με βάση σχετικά με την υπόθεση ότι

DLK1

επαγόμενη καρκινικών κυττάρων εισβολή επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση

ΜΜΡ9

, η έκφραση του

ΜΜΡ9

κατόπιν

DLK1

διέγερση αναλύθηκε τόσο από PCR πραγματικού χρόνου και κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

ΜΜΡ9

έκφραση ενισχύθηκε σε κύτταρα H520-dlk1 σύγκριση με H520 και τα κύτταρα H520-pcDB τόσο του mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α και Β). Ένα ίδια τάση παρατηρήθηκε επίσης όταν

DLK1

ήταν υπερεκφράζεται σε άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299. Μετά από παροδικά επιμολυσμένα με

DLK1

, εκφράζεται έντονα

ΜΜΡ9

ανιχνεύθηκε σε δύο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Εικόνα 2D και Ε). Όπως πρωτεΐνη ΜΜΡ9 εκπληρώνει τη λειτουργία του σε ενεργοποιημένη μορφή στον εξωκυτταρικό χώρο, προσαρμοσμένα μέσα συλλέχθηκαν, και ζυμογραφία ζελατίνης χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή δραστικότητας ΜΜΡ9. Στην Εικόνα 2C, έχει φανεί ότι το

DLK1

μπορούσε επίσης να ενισχύσει την δραστικότητα ΜΜΡ9 στον εξωκυτταρικό χώρο, ενώ η δραστηριότητα της ΜΜΡ2 παρέμεινε αμετάβλητη. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ των

DLK1

και

ΜΜΡ9

, παρεμβολή RNA χρησιμοποιήθηκε για να καταστρέφουν

DLK1

έκφρασης σε κύτταρα Α549, και

ΜΜΡ9

έκφραση ήταν εξέτασε διαδοχικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση DLK1 κατεστάλη αποτελεσματικά με RNAi στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 2G), και η έκφραση ΜΜΡ9 ανεστάλη σημαντικά τόσο στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2F και G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

DLK1

θα μπορούσε να προωθήσει την κυτταρική διείσδυση μέσω της ρύθμισης της έκφρασης MMP9 και τη δραστηριότητα.

Ένα, ένα ιστόγραμμα για τη σχετική έκφραση του mRNA της

ΜΜΡ9

στα κύτταρα H520 επιμολυσμένα με

DLK1

(H520-dlk1) ή null φορέα (H520-pcDB) που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση. Το επίπεδο έκφρασης του

ΜΜΡ9

στα κενά κελιά H520 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας και να οριστεί σε 1. Β, πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ9 σε H520-dlk1, H520-pcDB και τα κύτταρα H520 αξιολογούνται με ανάλυση Western αποτύπωση. C, ζυμογραφία ζελατίνης που δείχνει τη δραστηριότητα που εκκρίνεται ΜΜΡ9 και ΜΜΡ2 στην H520-dlk1, H520-pcDB και τα κύτταρα H520. D, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της σχετικής έκφρασης του mRNA της

ΜΜΡ9

σε Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με

DLK1

(Η1299-dlk1) ή null φορέα (Η1299-pcDB) εμφανίζεται σε ένα ιστόγραμμα. Ε, κηλίδωση Western που δείχνει την πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ9 σε Η1299-dlk1 και Η1299-pcDB κύτταρα. F, ένα ιστόγραμμα που δείχνει την σχετική έκφραση του mRNA της

ΜΜΡ9

στο

DLK1

siRNA (Α549-σι-dlk1) ή μηδενική ελέγχου siRNA (Α549-NC) επιμολυσμένα κύτταρα Α549 αξιολογήθηκε με πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση. G, η πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ9 σε Α549-σι-dlk1, Α549-NC και κενό Α549 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

18S

ριβοσωμικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος στην ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου, ενώ GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος στην κηλίδωση Western ανάλυση (* t-test, ρ-τιμή & lt? 0,05).

η

η υπερέκφραση του

DLK1

ενεργοποιηθεί σηματοδοτικό μονοπάτι Notch

Για να επιβεβαιώσετε τη συσχέτιση μεταξύ

DLK1

και

Notch1

, εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά η έκφραση του Notch1 σε λύματα ολόκληρων κυττάρων με κηλίδωση Western. Διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του

DLK1

μπορούσε ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση Notch 1 σε τόσο H520 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 3Α και D). Επειδή η ενεργοποίηση Notch 1 ακολουθείται από τον διαχωρισμό του σε NICD και μετατόπιση του NICD εντός του πυρήνα για την περαιτέρω μεταγραφική ρύθμιση, η ποσότητα του NICD σε πυρήνες θα μπορούσε να αντανακλά δραστικότητα μονοπατιού Notch. Εμείς εξάγεται πυρηνικών πρωτεϊνών από H520 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με

DLK1

ή η μηδενική-φορέα και εξέτασε το ποσό των NICD χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι NICD μετατοπίζεται σε πυρήνες πιο έντονα μετά την υπερέκφραση του

DLK1

σύγκριση με τη μηδενική ελέγχου (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η έκφραση του

HES1

, ρητή γονίδιο στόχο Notch μονοπατιού, εξετάστηκε επίσης με πραγματικού χρόνου PCR σε H520 και Η1299 κύτταρα. Υπήρξε μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

HES1

μετά τη διέγερση της

DLK1

έκφραση σε σχέση με τη μηδενική έλεγχο και στα δύο κύτταρα (τιμή-ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3C και Ε). Σε αντίθεση, η μειωμένη έκφραση της Notch 1 και HES1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο PCR, αντίστοιχα, όταν η έκφραση DLK1 είχε εξαντληθεί από RNAi σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3F και G).

Α, Western που δείχνει κηλίδωση έκφραση Notch 1 σε κύτταρα H520 μετά από επιμόλυνση με

DLK1

(H520-dlk1) ή null φορέα (H520-pcDB) εξετάστηκαν σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Β, κηλίδωση Western αξιολόγηση της έκφρασης των πυρηνικών NICD στα κύτταρα H520-dlk1 andH520-pcDB. ΤΒΡ χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. C, ένα ιστόγραμμα για τη σχετική έκφραση του mRNA του γονιδίου-στόχου Notch

HES1

στις H520-dlk1 και H520-pcDB κύτταρα ανιχνεύεται με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. κύτταρα H520-pcDB χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, και το επίπεδο έκφρασης του

HES1

ορίστηκε σε 1.

18S

ριβοσωμικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. D, κηλίδωση Western που δείχνει την έκφραση του Notch 1 σε Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με

DLK1

(Η1299-dlk1) ή null φορέα (Η1299-pcDB). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ε, ένα ιστόγραμμα που παρουσιάζει την σχετική έκφραση του mRNA του

HES1

σε Η1299-Η1299 dlk1 και-pcDB κύτταρα ανιχνεύεται με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. F, η έκφραση της Notch 1 σε κυτόπλασμα αξιολογήθηκαν με κηλίδωση Western σε κύτταρα Α549 παροδικά επιμολυσμένα με

DLK1

siRNA (Α549-σι-dlk1) ή null ελέγχου siRNA (Α549-NC). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. G, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της σχετικής έκφρασης του mRNA της

HES1

στο Α549-σι-dlk1 και τα κύτταρα Α549-NC, και παρουσιάζεται σε ένα ιστόγραμμα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (* t-test, p-value & lt? 0,05).

Η

DLK1

ρυθμίζονται

ΜΜΡ9

έκφρασης εν μέρει μέσω της οδού σηματοδότησης Notch

Για να διαπιστώσετε εάν

DLK1

απορυθμίζεται

ΜΜΡ9

έκφραση σε μια Notch σηματοδότηση-εξαρτώμενο τρόπο, εφαρμόστηκε L-685458, το οποίο είναι ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης (GSI), ότι καταστέλλει Notch1 μεσοκυττάρια διάσπαση τομέα, γ-σεκρετάσης, αναστέλλοντας έτσι τη δράση της σηματοδότησης Notch. Η σχετική έκφραση του

ΜΜΡ9

κατά τη διέγερση του

DLK

1 έκφρασης με ή χωρίς την θεραπεία GSI αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όταν σηματοδότηση Notch παρεμποδίστηκε με κατεργασία με L-685458,

DLK1

διεγερμένων

ΜΜΡ9

αυξορρύθμιση μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 4Α), υποδεικνύοντας την εμπλοκή της σηματοδότησης Notch σε αυτόν τον κανονισμό διαδικασία. Επιπλέον, είχε επίσης παρατηρήσει ότι αν και η δραστηριότητά σηματοδότησης Notch κατεστάλη σε επίπεδο συγκρίσιμο με την έλλειψη

DLK1

υπερέκφραση (συμβολίζεται με

HES1

έκφρασης στην Εικόνα 4Β, dlk1 + /GSI + σε σύγκριση με dlk1 – /GSI +, p-value t-test = 0.078), η έκφραση του

ΜΜΡ9

δεν ακολούθησε την ίδια τάση, γεγονός που υποδηλώνει ότι

DLK1

μπορεί επίσης να ρυθμίσει

MMP9

έκφραση μέσω της μεταγωγής μονοπάτια σηματοδότησης εκτός από Notch. Η έκφραση του

HES1

, το οποίο είναι ένα γονίδιο στόχος του μονοπατιού σηματοδότησης Notch, αξιολογήθηκε σε παράλληλα ως δείκτης της δραστικότητας σηματοδότησης Notch (Εικόνα 4Β).

Α, μια γραφική παράσταση ράβδου του η έκφραση του mRNA της

ΜΜΡ9

που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε H520 κύτταρα με ή χωρίς

DLK1

υπερέκφραση και με ή χωρίς θεραπεία GSI. Η ομάδα με ούτε

DLK1

διέγερση ούτε θεραπεία GSI (dlk- /GSI-) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, και το επίπεδο έκφρασης του

ΜΜΡ9

ορίστηκε σε 1.

18S

ριβοσωμικό RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. B, η έκφραση του

HES1

αξιολογούνται με πραγματικού χρόνου PCR παράλληλα με

ΜΜΡ9

έκφραση εμφανίζεται σε ένα γράφημα μπαρ, υποδεικνύοντας δραστηριότητες σηματοδότηση Notch κατά

DLK1

υπερέκφραση ή θεραπείας GSI. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (* t-test, p-value & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Μελέτες για

DLK1

έχουν αποκαλύψει τις λειτουργίες της στην κυτταρική διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό [5], [6], [10]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι

DLK1

εκφράζεται μη φυσιολογικά σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14], [16], [22], [23]. Αυτές οι μελέτες σε ανθρώπινους καρκίνους επικεντρώθηκε κυρίως στην ανώμαλη έκφραση του

DLK1

αλλά δεν διερευνήσουν τη σχέση της με τη μετάσταση καρκίνου. προηγούμενη εργασία μας για την μετάσταση σχετιζόμενη γονιδίων σε ανθρώπινο πνεύμονα SCC πρότεινε ότι

DLK1

θα μπορούσε να λειτουργήσει σε μετάσταση όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην παρούσα μελέτη, επικυρωμένη ότι η υπερέκφραση του

DLK1

θα μπορούσε να ενισχύσει την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (όπως στο Σχήμα 1 φαίνεται), η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα μας προέρχεται από προφίλ γονιδιακής έκφρασης και εκτείνεται γνώσεις μας για λειτουργία dlk1 σε ανθρώπινο καρκίνο.

Αν και η πρωτεΐνη DLK1 στερείται το μοτίβο DSL, η οποία πιστεύεται ότι παίζει βασικό ρόλο στις αλληλεπιδράσεις συνδετών »με υποδοχείς Notch, μία αλληλεπίδραση μεταξύ DLK1 και του υποδοχέα Notch 1 έχει δειχθεί σε ένα ζυμομυκήτων σύστημα δύο υβριδίων [19]. Ωστόσο, το αποτέλεσμα DLK1 επί της οδού σηματοδότησης Notch είναι ακόμα αμφιλεγόμενη [4], [5], [19]. Baladron et al. πρότεινε ότι η επίδραση του

DLK1

για σηματοδότηση Notch είναι διαφορετική μεταξύ των

DLK1

παραλλαγές. Ότι εκκρίνεται DLK1 μπορεί να λειτουργήσει ως ανταγωνιστής Notch, μεμβράνη DLK1 μπορεί να ενεργοποιήσει Notch. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι ένα μίγμα μεμβράνης και εκκρίνεται DLK1 ίσως ενεργοποιούν σηματοδότηση Notch σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Η χρήση ενός μίγματος του

DLK1

παραλλαγές εδώ διεξήχθη σε μια προσπάθεια να μιμηθούν καταστάσεις in vivo. Εκτός από Notch ενεργοποίηση σηματοδότησης, παρατηρήσαμε επίσης μία προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 κατά τη διάρκεια της διέγερσης του

DLK1

υπερέκφραση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ενεργοποίηση της σηματοδότησης Notch από

DLK1

μπορεί να είναι ένα συνδυασμένο αποτέλεσμα της αύξηση της έκφρασης Notch 1 και διάσπαση Notch 1 διεγείρεται από δεσμευτικές DLK1. Επιπλέον, ανώμαλη έκφραση του Notch 1 βρίσκεται σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων [24], [25], συμπεριλαμβανομένων των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [26], [27]. Επειδή η μελέτη μας υποδηλώνει μια ρυθμιστική σχέση μεταξύ των

DLK1

και

Notch1

, είναι φυσικό να υποθέσουμε ότι η μη φυσιολογική έκφραση της Notch 1 σε καρκίνους είναι εν μέρει συνέπεια της ανώμαλης έκφρασης των DLK1.

Βρήκαμε ότι το

DLK1

-promoted εισβολή των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα σχετίζεται με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ9 και εξωκυτταρική δραστηριότητα της (Σχήμα 2), οι οποίες εμπλέκονται στην διάσπαση της ECM και σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την εισβολή του όγκου [ ,,,0],20]. Εξετάσαμε περαιτέρω αν σηματοδότηση Notch συμμετείχε στην

DLK1

-regulated έκφραση ΜΜΡ9 χρησιμοποιώντας ένα GSI να μπλοκάρει τη σηματοδότηση Notch και, στη συνέχεια, την αξιολόγηση της ανταπόκρισης της ΜΜΡ9 κατά τη διάρκεια της διέγερσης του

DLK1

έκφρασης. Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην αυξημένη έκφραση ΜΜΡ9 όταν σηματοδότηση Notch μπλοκαρίστηκε (Σχήμα 4). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης ότι το

DLK1

μπορούσε ακόμα μέτρια διεγείρουν την έκφραση ΜΜΡ9 όταν το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch ήταν αποκλεισμένη, πράγμα που σημαίνει ότι

DLK1

μπορεί να λειτουργήσει στην εισβολή του καρκίνου και στα δύο Notch σηματοδότηση εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από συμπεριφορά. Παρά την αλληλεπίδραση του DLK1 και Notch 1, έχει επίσης αναφερθεί ότι DLK1 θα μπορούσε να λειτουργήσει και σε άλλες οδούς σηματοδότησης. Για παράδειγμα, DLK1 μπορούν να αλληλεπιδράσουν με IGFBP1 IGF-1 συγκροτήματα /και ενεργοποιούν τον υποδοχέα IGF σηματοδότηση [6] και θα μπορούσε επίσης να αυξήσει τη φωσφορυλίωση της ΜΕΚ /ERK και να ενεργοποιήσετε MEK /ERK σηματοδότησης [28], [29]. Η εργασία μας πρότεινε επίσης ότι DLK1 μπορούσε ενεργός σηματοδότησης ΝΡ-κΒ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης σε ένα κύτταρο έχει σημαντικές cross-talk και ότι η μεταγραφή του γονιδίου ρυθμίζεται από ένα συνδυασμό διαφορετικών οδών, η οποία πιστεύουμε ότι είναι τόσο λογικό και δοσοεξαρτώμενη, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι

DLK1

θα μπορούσε να ενισχύσει η εισβολή των κυττάρων μέσω πολλαπλών οδών.

Εν κατακλείδι, τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη απέδειξε το ρόλο του

DLK1

στον καρκίνο εισβολή και εξερεύνησε τον μοριακό μηχανισμό πίσω από αυτή τη λειτουργία, καθιστώντας

DLK1

ένα νέο υποψήφιο γονίδιο σε μελέτες μετάστασης του καρκίνου.