Αφηρημένο

Η perihydroxylated υπερικίνη περυλενίου κινόνης έχει αναφερθεί ότι διαθέτουν ισχυρή αντι-μεταστατικό και αντιαγγειογενετικές δραστηριότητες, που παράγεται από τη στόχευση διαφορετικές σταυροδρόμι των διαδικασιών καρκίνο προώθηση μέσω μοναδική μηχανισμούς. Η υπερικίνη είναι ο μόνος γνωστός εξωγενές αντιδραστήριο το οποίο μπορεί να προκαλέσει αναγκαστική πολυ-ουβικουϊτινίωση και επιταχυνόμενη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 90 (Hsp90) σε καρκινικά κύτταρα. πρωτεΐνες πελάτη Hsp90 είναι έτσι αποσταθεροποιούνται και αποδομείται γρήγορα. πρωτεΐνες πελάτη Hsp70 μπορεί δυνητικά να επηρεαστεί επίσης μέσω πρόληψη του σχηματισμού του ενδιάμεσου συγκροτήματα hsp90-hsp70. Δείχνουμε εδώ ότι υπερικίνη επάγει επίσης ενισχυμένη αποικοδόμηση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα 1α (HIF-1α) σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου, U87-MG γλοιοβλαστώματος και RCC-C2VHL – /- καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και στο αμφιβληστροειδούς χρωστική μη-κακοήθη ARPE19 επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. Η υπερικίνη-επιταχυνόμενη κύκλου εργασιών του HIF-1α, η ρυθμιστική πρόδρομος του παράγοντα μεταγραφής HIF-1, η οποία προάγει υποξικό στρες και αγγειογόνες αποκρίσεις, υπερνικά το φυσιολογικό HIF-1α σταθεροποίηση πρωτεΐνη η οποία λαμβάνει χώρα σε υποξικά κύτταρα. Η επίδραση υπερικίνη καταργεί επίσης τα υψηλά HIF-1α επίπεδα εκφράζονται μόνιμα στην πρωτεΐνη von Hippel-Lindau (pVHL) ελλιπή ως RCC-C2VHL – /- νεφροκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρική σειρά. Σε αντίθεση με την κανονική μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος εξαρτώμενη από τον κύκλο εργασιών του HIF-α πρωτεΐνες που εμφανίζεται σε φυσιολογική οξυγόνωση, η υπερικίνη επαγόμενη HIF-1α καταβολισμό μπορεί να συμβεί ανεξάρτητα από κυτταρικά επίπεδα οξυγόνου ή pVHL-προωθείται ουβικιτίνης απολίνωση του HIF-1α. Είναι διαμεσολαβείται από λυσοσωματικές ένζυμα καθεψίνης-Β με δραστικότητα καθεψίνης-Β από τη βελτιστοποίηση στα κύτταρα μέσω υπερικίνη διαμεσολαβούμενη μείωση στο ενδοκυτταρικό ρΗ. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι υπερικίνη μπορεί ενδεχομένως να είναι χρήσιμη στην πρόληψη της ανάπτυξης των όγκων στα οποία HIF-1α παίζει καθοριστικό ρόλο, και pVHL εκτέμνονται κύτταρα όγκου όπως καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων μέσω της εξάλειψης των αυξημένων περιεχόμενα HIF-1α σε αυτά τα κύτταρα, κλιμάκωση προς τα κάτω του υπερβολικού αγγειογένεση που χαρακτηρίζει αυτούς τους όγκους

Παράθεση:. Barliya T, Mandel Μ, Livnat Τ, Weinberger D, η υποβάθμιση του HIF-1 κάτω από υποξία συνδυασμό με την επαγωγή του Hsp90 Polyubiquitination στα καρκινικά κύτταρα από Hypericin Lavie G (2011): μια μοναδική θεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10.1371 /journal.pone.0022849

Επιμέλεια: Anil Kumar Tyagi, Πανεπιστήμιο του Δελχί, Ινδία

Ελήφθη: 30 Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 30 Ιουνίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 Σεπτέμβρη του 2011

Copyright: © 2011 Barliya et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Ισραήλ Καρκίνου, Grant 20090033 (https://ica.cancer.org.il/english/) χάρη στη συνεισφορά από τον Rick και η Ρίτα Weinstein, και δύο ανταγωνιστικές επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ: το Ίδρυμα Maratier και η Έλσα και ο Λέων Abramson Ιδρύματος, Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Γ Lavie έχει οικονομικό συμφέρον στην Hy Biopharma Corporation, η οποία αναπτύσσεται η υπερικίνη φάρμακο (που περιγράφεται εδώ) ως ένα αντικαρκινικό παράγοντα. Ωστόσο, η εταιρεία βρίσκεται σε προχωρημένες κλινικές δοκιμές και είναι απίθανο να κερδίσει τίποτα από αυτή την έκδοση. Η έρευνα δεν χρηματοδοτήθηκε από την εν λόγω εταιρεία και δεν υπάρχουν άλλες αμοιβές σε οποιοδήποτε από τους συγγραφείς. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σχηματισμός των μεταστάσεων του όγκου με τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων και την εκρηκτική ανάπτυξή τους παραμένει η πιο διαδεδομένη αιτία για την αποτυχία της θεραπείας του καρκίνου και θανάτου. Τα καρκινικά κύτταρα αναδιαμορφώσει την εξωκυτταρική μήτρα, την τροποποίηση των ιδιοτήτων της κυτταρικής προσκόλλησης, εισβάλλουν στους περιβάλλοντες ιστούς και να μεταναστεύσουν άπω όργανα για να σχηματίσουν μεταστατικές εστίες. Ανάπτυξη εστίες δημιουργούν υποξία και την ανάγκη για νεοαγγειογένεσης για την υποστήριξη της ανάπτυξης. Η υποξία σταθεροποιεί το πρόδρομο απόκριση στρες HIF-1α [1], που οδηγεί σε μετατόπιση του προς τον πυρήνα με μια διαδικασία που εξαρτάται hsp90 [2], [3] και ετεροδιμερισμό με HIF-1β, δημιουργώντας το λειτουργικό παράγοντα μεταγραφής HIF-1. HIF-1 προάγει την μεταγραφή του -100 πρωτεϊνών στόχων αντίδραση στο στρες συμπεριλαμβανομένου του VEGF. Ο VEGF διεγείρει αυξημένη έκφραση του υποδοχέα της πρωτογενούς VEGFR2. Τα συμπλέγματα VEGF-VEGFR2 η οποία μορφή απαιτούν σύνδεση με hsp90 να ενεργοποιήσετε την κατάντη σηματοδότησης που εκκινεί τη neoangiogenic καταρράκτη, [4] και ενεργοποιεί την ιντεγκρίνη-κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) -SRc σηματοδότησης συγκρότημα. Τόσο FAK και Src είναι επίσης hsp90 πρωτεΐνες πελάτη, απαιτώντας σύνδεσης με αυτήν συνοδού για τη διατήρηση της λειτουργικής διαμορφώσεις τους [5], [6]. Αυτές οι λειτουργίες περιλαμβάνουν το σχηματισμό εστιακών συμφύσεων σχετίζεται με μία συσκευή συσταλτικής F-ακτίνης που συνδέονται με την κυτταρική μεμβράνη και να ενεργοποιήσει τον μηχανισμό μετανάστευση μέσω αλληλεπίδρασης με την εξωκυττάρια μήτρα [7]. Έτσι, η αναστολή Hsp90 μπορεί να διαταράξει διάφορες τοποθεσίες σε καταρράκτες σηματοδότησης αγγειογόνες και κυττάρων διασπορά και να παρεμβαίνει με την εξέλιξη του όγκου.

Οι σημαντικές αυξήσεις στην HIF-1α περιεχόμενο που συμβαίνουν σε πολλούς τύπους όγκων εμπλέξει HIF-1 για την προώθηση της ογκογένεσης. Η πρόοδος του όγκου επιταχύνεται μέσω ετερογενής μηχανισμών συμπεριλαμβανομένων δυσλειτουργική /αφαιρεθέν γονίδιο VHL σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και αιμαγγειοβλάστωμα [8], αδρανοποιημένο γονίδιο IDH1 σε γλοιοβλάστωμα [9], μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό ηλεκτρικό αφυδρογονάσες σε παραγαγγλίωμα, και άλλοι [10]. Πράγματι, αυξημένα εντός του όγκου HIF-1α (ή HIF-2α) σχετίζονται με την επιτάχυνση της θνησιμότητας των ασθενών, προκύπτει από ανοσοϊστοχημικές αναδρομικές αναλύσεις παραφίνης ενσωματωμένα τμήματα βιοψίας από διάφορους όγκους [11]. Είναι σήμερα αποδεκτό ότι η μείωση των όγκων HIF-1α επίπεδα μπορεί να περιλαμβάνει σημαντικά κλινικά οφέλη, παρακινώντας εντατικές έρευνες για τα μικρά μόρια αναστολείς της HIF-1α.

Αντιδραστήρια με ποικίλες δραστηριότητες ικανό να παρεμβαίνει με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και neoangiogenic σηματοδότηση είναι πιθανό να αναστέλλουν πιο αποτελεσματικά τον σχηματισμό μεταστάσεων και να ωφελήσει τους ασθενείς με καρκίνο. Ένα τέτοιο ελπιδοφόρων αντιδραστήριο είναι η perihydroxylated κινόνης περυλενίου – υπερικίνη. Βρήκαμε ότι υπερικίνη αναστέλλει αποτελεσματικά το σχηματισμό μεταστάσεων με μαστού ποντικού και όγκους πλακώδες καρκίνωμα

in vivo

[12], προφανώς με αλληλεπίδραση με οδούς που προάγουν την αγγειογένεση [13] και πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [14] σηματοδότησης. Ο κοινός παρονομαστής που συνδέει αυτές τις διαφορετικές δραστηριότητες είναι μια μοναδική ικανότητα της υπερικίνης να ενεργεί ως εξωγενή επαγωγέα της αναγκαστικής πολυ-ουβικουϊτινίωση της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 90 (Hsp90), αποσταθεροποιητικές και υποβαθμίζεται γρήγορα μια πληθώρα πρωτεϊνών HSP90-πελάτη [14].

Εδώ αναφέρουμε ότι υπερικίνη μπορεί να υποβαθμίσει HIF-1α σε κύτταρα μέσω ενός μοναδικού υποξία και πρωτεασώματος ανεξάρτητο μηχανισμό. Αν και HIF-1α είναι μία πρωτεΐνη πελάτης hsp90 [15] αποικοδομείται από άλλους αναστολείς της HSP90 [16], η υπερικίνη επαγόμενη HIF-1α καταβολισμού φαίνεται ότι περιλαμβάνει μια μοναδική λυσοσωμικής καθεψίνης-Β εξαρτώμενο μηχανισμό, ενεργοποιείται σε μειωμένη περιβάλλον ενδοκυτταρικό ρΗ. Δείχνουμε επίσης ότι η αγγειογενετική καταρράκτη σηματοδότησης μπορεί να επηρεαστεί από υπερικίνη σε πολλαπλές θέσεις, καθιστώντας αυτό το μόριο ελπιδοφόρων σε αντι θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

καταναγκαστικής αποικοδόμηση HIF-1α υπό υποξία με επεξεργασία κύτταρο με υπερικίνη

με στόχο να αποκρυπτογραφήσουν τον μηχανισμό για την αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα του υπερικίνηε [13], εξετάσαμε αν υπερικίνη επηρεάζει HIF-1α προσαρμοστική σταθεροποίηση, η οποία λαμβάνει χώρα κάτω από υποξία απουσία προλίνης και ασπαραγίνη υδροξυλίωση [1 ] σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές: U87-MG κύτταρα γλοιοβλαστώματος, RCC-C2

VHL – /- (C2

VHL – /-) κύτταρα νεφρικού καρκινώματος ανεπαρκή σε pVHL, και ARPE-19 επιθηλιακών κυττάρων χρωστικής του αμφιβληστροειδούς. Τα κύτταρα πρώτα εκτέθηκαν σε υπερικίνη για 72 ώρες, ο χρόνος που απαιτείται για βέλτιστα αποτελέσματα υπερικίνη να αναπτύξουν και υποξία παράγεται χημικώς με CoCl

2 και με χαμηλή ατμόσφαιρα οξυγόνου (0,5% O

2, 5% CO

2 και 94,5% N

2) για τις τελευταίες 6 ώρες της θεραπείας για την πρόληψη υποξικής κυτταροτοξικότητας. επίπεδα HIF-1α αναλύθηκαν σε κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα με Western blots. Τα αποτελέσματα, Σχ. 1 δείχνουν ότι η έκθεση σε 10 μΜ και 30 μΜ υπερικίνηε μειώνεται αποτελεσματικά τα υποξία προκαλούμενη αυξήσεις HIF-1α επίπεδα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο υπερικίνηε σε ARPE-19 κύτταρα (Εικ. 1Α) και σε κύτταρα U87-MG (Σχ. 1Β ). Οι μειώσεις των HIF-1α ήταν πιο έντονη στα πυρηνικά κλάσματα των δύο κυτταρικές σειρές, ιδιαίτερα όταν υποξία προκλήθηκε χημικά με CoCl

2.

[Α] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] RCC-C2

VHL – /- και [D]. RCC-C2

(γονίδιο VHL ανασυσταθέν) VHL + κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε 10 και 30 μΜ υπερικίνηε για 72 ώρες. Οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε υποξικές συνθήκες με 150 μΜ CoCl

2 (Α & amp? Β, άνω δυάδες πάνελ) και με χαμηλή ατμόσφαιρα οξυγόνου (0,5% O

2, 94,5% Ν

2 και 5% CO

2) (amp A &? Β, κάτω διπλές πάνελ) για τις τελευταίες 6 ώρες της θεραπείας. Η υπερικίνη προκαλείται αποικοδόμηση του HIF-1α. Ο μεσολαβητής του HIF-1α πρωτεολυτική διάσπαση χαρακτηρίζεται από την αναστολή της αποικοδόμησης HIF-1α με τον αναστολέα CA-074 καθεψίνης Β, με MG-132 και με αναστολείς του πρωτεασώματος καλπαΐνης ΑΙΧΝ, χορηγείται στις καλλιέργειες για τις τελευταίες 6 ώρες επώασης με τις κύτταρα. Εκχυλίσματα κυτταρολύματος και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν, διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και κηλίδες Western αναπτύχθηκε με αντι-HIF-1α. Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με β-ακτίνη. [ΜΙ]. Επιδράσεις της υπερικίνης στο ενδοκυτταρικό pH των U87-MG και C2

VHL – /- κύτταρα. Ποσοτική BCECF, εξαρτώμενη από το ρΗ φθορισμός μετρήθηκε spectrofluorimetrically (FRU υποδηλώνει Fluorescence Σχετική Μονάδες). [ΦΆ]. Ανάλυση του ρόλου του ενδοκυτταρικού μείωση του ρΗ υπερικίνηε μεσολάβηση για την προώθηση της HIF-1α κύκλου εργασιών σύμφωνα CoCl

2 υποξία, προσδιορίζεται παρακάτω κυτταροπλασματική αλκαλοποίηση με 20 mM ΝΗ

4Cl εφαρμόζονται κατά τη διάρκεια των τελευταίων 6 ωρών της επώασης. Κυτταροπλασματική αλκαλοποίηση μείωσε την υπερικίνη που προκαλείται HIF-1α του κύκλου εργασιών σύμφωνα CoCl

2 υποξία.

Η

Για να προσδιορίσετε πώς υπερικίνη ενισχύει HIF-1α υποβάθμιση χρησιμοποιήσαμε το VHL γονίδιο διαγράφεται C2

VHL- /- κυτταρική σειρά. pVHL, η αναγνώριση υποστρώματος και της μονάδας σύνδεσης ενός συμπλόκου λιγκάσης Ε-3 ουμπικουϊτίνης δεσμεύει HIF-1α εξής προλυλ υδροξυλίωση στην HIF-1α τομέα προλυλ-υδροξυλάσης πρωτεΐνη-2 [17], με τον τρόπο αυτό ubiquitinating HIF-1α και μεσολαβεί στην αποδόμηση του πρωτεασώματος του αυτός ο πρόδρομος παράγοντα μεταγραφής στρες απόκριση [18]. ανεπάρκεια pVHL διαταράσσει αυτό το οξυγόνο-εξαρτώμενη απόκριση αποικοδόμηση, με αποτέλεσμα την συστατική συσσώρευση του HIF-1α. Εξετάσαμε το περιεχόμενο HIF-1α σε C2

VHL – /- κυττάρων μετά από 72 θεραπείες ώρα με υπερικίνη. Η ιδιοσυστατικά υψηλό περιεχόμενο HIF-1α σε C2

VHL – /- κυττάρων μειώθηκε μετά από έκθεση σε υπερικίνη (Εικ. 1C εκθέματα) με τρόπο παρόμοιο με τις μειώσεις των HIF-1α που παρατηρείται σε U87-MG και ARPE-19 κύτταρα σε επεξεργασία με υπερικίνη υπό υποξία. HIF-1α αποβολή από υπερικίνηε σε C2

VHL – /- κύτταρα σημειώθηκαν ανεξάρτητα από pVHL και βρέθηκε να είναι ευαίσθητη στην αναστολή με αναστολείς MG132 ή ΑΙΧΝ πρωτεασώματος καλπαΐνης (Σχήμα 1C)., Αποκλείοντας έτσι εμπλοκή της μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος σε αυτή τη διαδικασία. αποικοδόμηση HIF-1α από υπερικίνη ήταν, ωστόσο αποτελεσματικά ανασταλεί από τον αναστολέα καθεψίνης-Β CA-074 σε C2

VHL – /- κύτταρα (Σχ 1C.) και δεν επηρεάζεται από CLI-ΙΙΙ, έναν αναστολέα καθεψίνης-L (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η υπερικίνη ενισχυμένη HIF-1α κύκλου εργασιών προκαλείται μέσω καταβολισμού από ένα ένζυμο τύπου καθεψίνης-Β ανεξάρτητα από το μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος

Σταθερή διαμόλυνση VHL σε C2

VHL -. /- κύτταρα που αποκαθίστανται το Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης πολύπλοκες λειτουργίες [19], συμπεριλαμβανομένων των HIF-1α υποβάθμιση του πρωτεασώματος υπό φυσιολογική οξυγόνωση και HIF-1α σταθεροποίησης σε συνθήκες υποξίας (Εικ. 1D). Σε αυτή τη ρύθμιση υπερικίνη επιταχύνθηκε επίσης αποικοδόμηση HIF-1α κάτω από υποξία, για την κατάργηση της υποξία-επαγόμενη HIF-1α σταθεροποίησης στην VHL ανασυσταμένο RCC-C2

VHL + κύτταρα (C2

VHL + κύτταρα) (Σχ. 1D). HIF-1α υποβάθμιση από την υπερικίνη στο C2

VHL + κυττάρων αναστέλλεται επίσης από την CA-074 (Εικ. 1D). Έτσι, η οδός καθεψίνη-B παραμένει η κύρια οδός αποδόμησης HIF-1α από υπερικίνη υπό υποξία παρακάτω pVHL την ανασύσταση.

Η υπερικίνη προκαλεί μειώσεις στο ενδοκυτταρικό pH

Η μετατόπιση της HIF-1α του κύκλου εργασιών από η φυσιολογική pVHL μεσολάβηση του πρωτεασώματος υποβάθμιση σε ένα μηχανισμό που εξαρτάται καθεψίνη-Β που προκαλείται από υπερικίνη μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσον οι αλλαγές στην ενδοκυτταρική συνθήκες συνέβαλαν σε αυτή την μετατόπιση. Δεδομένου ότι το φως που προκαλείται από φωτοδυναμική δραστηριότητες του υπερικίνηε εκμαιεύσει μειώσεις στο ενδοκυτταρικό ρΗ (ρΗ

i) του κυττάρου όγκου [20], υποθέσαμε ότι υπερικίνη μπορεί επίσης να προκαλέσει ενδοκυτταρικό μείωση του ρΗ στο σκοτάδι μέσω δραστηριότητες οξειδοαναγωγής, βελτιστοποιώντας τις συνθήκες για λυσοσωμικού ενζύμου δραστηριότητα. pH

i μετρήθηκε σε U87-MG και C2

VHL – /- κύτταρα κατεργασμένα με 10, και 30 μΜ υπερικίνηε για 72 ώρες στο σκοτάδι, την παρακολούθηση εξαρτώμενη από το ρΗ εστερολυτική διάσπαση του παραγώγου ακετοξυμεθυλ-εστέρα του BCECF ( ανατρέξτε Μέθοδοι για λεπτομέρειες). Παρά την αυστηρή τήρηση των σκοτεινές συνθήκες, καταγράψαμε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση υπερικίνη μειώσεις στο ενδοκυτταρικό pH σε U87-MG και C2

VHL – /- κύτταρα (Σχήμα 1 Ε.). Το κυτοσολικό ρΗ

i μειώθηκε σε κύτταρα U87-MG από αρχική τιμή 7,12 ± 0,08 για 6,75 ± 0,06 με 10 μΜ του υπερικίνηε (p ≤ 0,05), και να 6.45 ± 0.20 με 30 μΜ υπερικίνηε (p≤0.03). Σε C2

VHL – /- κύτταρα το pH

i μειώθηκε από 7,18 ± 0,04 έως 6,85 ± 0,28 (p≤0.08) με 10 μΜ υπερικίνη και σε 6,42 ± 0,2 με 30 μΜ υπερικίνης (p ≤ 0,05). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η υπερικίνη εκμαιεύει επίσης εξαρτάται από τη συγκέντρωση μείωση της κυτταρικής pH

i στο σκοτάδι.

Για να καθοριστεί εάν μειωμένο ρΗ

i είναι απαραίτητη για την καθεψίνη-Β προκαλούμενα αποικοδόμηση HIF-1α από υπερικίνη, επίδραση της κυτταροπλασματικής αλκαλοποίηση με NH

4Cl επί HIF-1α κυτοσολικού περιεχομένου εξετάσθηκε σε κύτταρα υπερικίνη φάρμακο. κύτταρα U87-MG εκτέθηκαν σε υπερικίνη για 72 ώρες στο σκοτάδι και 150 μΜ CoCl

2 υποξία προκαλούμενη κατά την διάρκεια των τελευταίων 6 ωρών επώασης σε μέσα συμπληρωμένα με 20 mM χλωριούχο αμμώνιο για να εκμαιεύσει κυτταροπλασματική αλκαλοποίηση. Κυτοσολίου εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και κηλίδες Western αναπτύχθηκε με αντίσωμα προς HIF-1α. Σύκο. 1F δείχνει ότι η πρόληψη της ενδοκυτταρικής μείωση του ρΗ ελαττώνεται αποικοδόμηση HIF-1α από υπερικίνη, ωστόσο στην υψηλότερη συγκέντρωση 30 μΜ υπερικίνη μερικοί HIF-1α αποικοδόμηση υπό υποξία έλαβε χώρα. Αυτή η υποβάθμιση φάνηκε να είναι λιγότερο ευαίσθητα στον αναστολέα καθεψίνης-Β CA-074 και μπορεί να αντανακλά τη συμμετοχή ενός πρωτεασώματος μηχανισμός εξαρτάται.

Η υπερικίνη παρεμβαίνει με HIF-1α πρόσδεσης στον VEGF και το γονίδιο υποκινητή GLUT1 αλληλουχίες HRE

Η υποβάθμιση υπερικίνη ενισχυμένη HIF-1α και την επακόλουθη HIF-1 πυρηνική ανεπάρκεια περιεχόμενο, ήταν υποτίθεται ότι μειώνει HIF-1 αλληλεπιδράσεις με στοιχεία απόκρισης υποξίας (HREs) για τους δικαιούχους του γονιδίου αντίδραση στο στρες, όπως VEGF και GLUT1. HIF-1 σύνδεση με το γονίδιο VEGF υποστηρικτής των ανθρωπίνων HRE ήταν, ως εκ τούτου, αναλύεται σε υπερικίνη που έλαβαν U87-MG, C2

VHL – /- και ARPE-19 κύτταρα χρησιμοποιώντας φθορισμού ηλεκτροκίνηση Shift Αναλύσεις (F-EMSA). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερικίνη για 72 ώρες, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και σχηματισμού συμπλόκου DNA-πρωτεΐνης με VEGF υποκινητή HRE ανιχνευτές φθορισμού των στοιχείων που περιέχουν αναλύθηκαν για SYPRO Ruby φθορισμού. Σε C2

VHL – /- κύτταρα που φέρουν υψηλή αρχική περιεκτικότητα HIF-1, HIF-1 σχηματίζονται συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης με τον ανιχνευτή HRE (Σχήμα 2Α).. Δεν προβλέπεται δωρεάν ανιχνευτή ανιχνεύθηκε (Syber πράσινη χρώση, αριστερό πάνελ), αντανακλώντας κυρίως συνδεδεμένου ανιχνευτή DNA. Κατά την επεξεργασία με 30 μΜ υπερικίνη, HIF-1-HRE σχηματισμός συμπλόκου ήταν σημαντικά μειωμένη με τα περισσότερα DNA ανιχνευτή παραμένει ασύνδετος (λωρίδα 2)

Βρέθηκε προαγωγοί:. [Α]. Το γονίδιο VEGF, αναλύθηκαν με φθορισμό ηλεκτροκίνηση Shift Δοκιμασία (F-EMSA). Πυρηνικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 6% SDS-PAGE, χρωματισμένο με Syber Πράσινο σημασμένο ανιχνευτή DNA και μη δεσμευμένη πρωτεΐνη ανιχνεύεται με την σύνδεση SYPRO Ruby πρωτεΐνη φθοριοχρωμίου. Οι γέλες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας FL-5000 λέιζερ με βάση σαρωτή. [ΣΙ]. Το γονίδιο GLUT1 αναλύονται από χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας). Ψαλιδισμένα χρωματίνη ανοσοκατακρημνίσθηκε με αντι αντίσωμα HIF-1α και DNA που απομονώθηκε από αυτό χρωματίνη ενισχύθηκε με εκκινητές ειδικούς για την περιοχή υποκινητή του γονιδίου GLUT1. [ΝΤΟ]. Παρεμβολές από υπερικίνη με την ενεργοποίηση του VEGF υποκινητή σε κυτταρικές σειρές όγκου. Σχήμα αριστερά – C2

VHL – /- κύτταρα. Διαδρομή 1 – μη επεξεργασμένων κυττάρων, λωρίδα κύτταρα 2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 30 μΜ υπερικίνη για 72 ώρες. Δεξιά εικόνα – κύτταρα U87-MG. Διαδρομή 1 – μη επεξεργασμένων κυττάρων, λωρίδα 2 – κύτταρα υποβάλλονται σε υποξία (150 μΜ CoCl

2 για τα τελευταία 6 ώρες), η λωρίδα 3 – CoCl

2-υποξία για 6 τελευταίες ώρες και υπερικίνηε 30 μΜ για 72 ώρες, και λωρίδα 4 -. υπερικίνη, 30 μΜ για 72 ώρες

Η

Σε ορθοξικές κύτταρα U87-MG, HIF-1-HRE συγκρότημα επίπεδα ήταν χαμηλά και η αυξημένη κάτω από υποξία δεν αφήνει καμία ανιχνεύσιμη ελεύθερη ανιχνευτή DNA. Η υποξία προκαλούμενη, σχηματισμός συμπλόκου HIF-1-HRE καταργήθηκε με υπερικίνηε κατεργασία των κυττάρων (Σχ. 2Α, μεσαίο πλαίσιο) που εξέρχονται από το ανιχνευτή DNA ως επί το πλείστον μη δεσμευμένο. Σε υποξική ARPE-19 κύτταρα πρωτεΐνη-HRE συγκρότημα επίπεδα ήταν υψηλότερα σε σύγκριση με ορθοξικές γραμμές βάσης και υπερικίνη αποτελεσματικά μειωμένη HIF-1 – ανίχνευση πρόσδεσης. Ομοίως, τα επίπεδα της ελεύθερης ανιχνευτή χαμηλής περιεκτικότητας σε υποξικά κύτταρα, αυξήθηκε μετά από έκθεση σε υπερικίνη (Εικ. 2Α, δεξί πάνελ). Η θεραπεία με υπερικίνη των κυτταρικών σειρών με υψηλή HIF-1 επίπεδα λόγω υποξίας ή ελαττωματικό pVHL (C2

VHL – /- κύτταρα) οδήγησε σε μειωμένη αλληλεπίδραση με στοιχεία απόκρισης υποξίας

HIF-1 αλληλεπιδράσεις με άλλα. αντίδραση στο στρες HREs γονίδιο-υποκινητή, όπως το γονίδιο GLUT1 επηρεάστηκαν επίσης από την υπερικίνη, όπως φαίνεται από χρωματίνης αναλύσεις ανοσοκαταβύθισης. Χρωματίνης που παρασκευάζεται από πυρήνες υπερικίνηε επεξεργασμένου και ελέγχου κυττάρων ψαλιδισμένα και HIF-1 που περιέχουν θραύσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-HIF-1 αντίσωμα. HRE δεσμευμένο επίπεδα HIF-1 προσδιορίσθηκαν από ενίσχυση του DNA εκχυλίζεται με PCR χρησιμοποιώντας GLUT1 υποκινητή ειδικούς ανιχνευτές. Σε U87-MG κύτταρα έκθεση σε υποξία οδήγησε σε αυξημένη HIF 1-αλληλεπιδράσεις με HRE GLUT1 προαγωγό (Σχ. 2Β μεσαίο πλαίσιο), ενώ η ταυτόχρονη έκθεση σε υπερικίνη μείωσε τα ποσά των προαγωγού δεσμεύεται HIF-1 (λωρίδα 3). Παρόμοιες μειώσεις σημειώθηκαν στα κύτταρα ARPE19 (Εικ. 2Β, αριστερό πάνελ). Σε C2

VHL – /- κύτταρα, υπερικίνη προκάλεσε δραματική πτώση στην GLUT1 υποστηρικτής δεσμεύεται HIF-1 (Σχήμα 2Β, δεξιά πάνελ.). Συνολικά, οι μειώσεις στην κυτταροπλασματική περιεχόμενα HIF-1α σε υποξικά κύτταρα υπερικίνη επεξεργασμένα οδήγησε επίσης σε μειωμένη ώριμο HIF 1-δραστηριότητες προώθησης της μεταγραφής στους πυρήνες των κυττάρων, μειώνοντας HIF-1 αλληλεπιδράσεις με τις VEGF και το γονίδιο GLUT1 προαγωγούς.

η υπερικίνη παρεμβάλλεται στην ενεργοποίηση υποκινητή του VEGF στον όγκο κυτταρικών σειρών

Οι μειώσεις στον HIF-1 σύνδεση σε VEGF και υποκινητές GLUT1 προκαλούνται από υπερικίνη, ώθησε αναλύσεις των αποτελεσμάτων της υπερικίνης στην ενεργοποίηση VEGF υποκινητή. U87-MG και C2

VHL – /- κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει το στοιχείο HRE του VEGF-A γονίδιο (pGL3P-1100). Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε ομάδα 30 μΜ υπερικίνηε αγωγή (για 72 ώρες) και ομάδα ελέγχου χωρίς αγωγή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε έναντι τον φορέα ελέγχου του οχήματος pGL3P επιμολυσμένα κύτταρα στερούνται του κατασκευάσματος ανταποκριτή. Σύκο. 2C (αριστερά έκθεμα) δείχνει την έκφραση της υψηλής δραστικότητας της λουσιφεράσης σε μη επεξεργασμένο έλεγχο C2

VHL – κύτταρα επιμόλυνσης, η οποία έδειξε μια τάση προς καταστέλλεται δραστηριότητα λουσιφεράσης σε υπερικίνη που έλαβαν C2

VHL – – //- κυττάρων κατά περίπου 40% , γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερικίνη τείνει να παρεμβαίνει με την ενεργοποίηση του VEGF υποκινητή σε C2

VHL – /- κύτταρα, όμως οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,06, Mann Whitney test). Λουσιφεράσης επίπεδα του πλασμιδίου οχήματος pGL3P ήταν χαμηλά και παρόμοια και στις δύο ομάδες (δεν φαίνεται).

Σε κύτταρα U87-MG, ο υποκινητής VEGF ήταν επίσης έντονα ενεργοποιείται σε απόκριση σε υποξία (σχ. 2C), ενώ η αγωγή των κυττάρων με 30 μΜ υπερικίνη κατάργησε εντελώς την ενεργοποίηση υποκινητή υποξία που προκαλείται από (

P

= 0,05) (3

στήλη Γ). Η υπερικίνη μόνος χωρίς υποξία δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση προωθητή (4

ου στήλη). pGL3P ελέγχου του οχήματος μορφομετατροπείς φορέα ήταν χαμηλές σε όλες τις ομάδες (δεν φαίνεται). Έτσι, υπερικίνη μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση του VEGF-υποκινητή υπό συνθήκες υποξίας μέσω αποικοδόμησης HIF-1α σε κύτταρα U87-MG.

Η υπερικίνη διαμορφώνει γονίδιο VEGF μεταγραφή σε κυτταρικές γραμμές όγκου

Η ρύθμιση προς τα κάτω της ενεργοποίησης υποκινητή VEGF λόγω υπερικίνη επαγόμενη HIF-1α καταβολισμού σε υποξικά κύτταρα ζητηθεί διερεύνηση των αποτελεσμάτων της υπερικίνη-προκάλεσε, HIF-1α καταβολισμό επί γονίδιο VEGF μεταγραφής. U87-MG και ARPE-19 κύτταρα που εκτέθηκαν σε υπερικίνη (72 ώρες στο σκοτάδι) υποβλήθηκαν σε CoCl

2 υποξία για τις τελευταίες 6 ώρες της θεραπείας. RNA παρασκευάστηκε και μεταγραφή VEGF αναλύθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που εκτείνονται exon1 και exon8 του VEGF-A γονίδιο. Αυτά τα εναύσματα ενισχύουν τις έξι παραλλαγές του VEGF ματίσματος και οι ημιποσοτική αναλύσεις επιτρέπουν διαφορική προφίλ αναλύσεις των επιπέδων της κάθε μεταγραφής VEGF συναρμογής. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε ARPE-19 κύτταρα, υποξία προκαλούμενη διαμορφώσεις σε παραλλαγή ματίσματος του VEGF μεταγραφικό προφίλ. Όταν υποξία συνδυάστηκε με την έκθεση σε υπερικίνη, η μεταγραφή του VEGF

189 και VEGF

165 ισομορφές οι οποίες αυξήθηκαν δραματικά κάτω από υποξία μειώθηκε (Σχ. 3Α), ιδίως με τη δόση των 30 μΜ (Σχ. 3Α, λωρίδα 4). VEGF

145 εκφράζεται σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου και καταστέλλεται υπό υποξία επανεξελέγη εκφράζεται μετά τη θεραπεία υπερικίνη (Εικ. 3Α, λωρίδα 4).

Α. Σε ARPE-19 κύτταρα, Β σε U87-MG κύτταρα και Γ στο C2

VHL – /-. Κύτταρα

Η

Στα κύτταρα U87-MG αρχικά επίπεδα κάποιων ισομορφών του VEGF υπό φυσιολογική οξυγόνωση, κυρίως VEGF

189 ήταν υψηλές λόγω μηχανισμοί υποξία-ανεξάρτητος ως αντιδραστικά είδη οξυγόνου [21], ΝΟ [22], φωσφατιδυλινοσιτόλη-3-κινάση και ενεργοποίηση ΜΑΡ κινάσης μέσω της δράσης του mTOR [23], ή απώλεια του γονιδίου IDH1 λειτουργία σε γλοιοβλάστωμα [9]. Παρ ‘όλα αυτά η μεταγραφή του VEGF ισομορφών κυρίως VEGF

206, VEGF

165 και VEGF

121 αυξήθηκε μετά από έκθεση των κυττάρων στην υποξία. μεταγραφή τους μειώθηκε μετά από έκθεση των κυττάρων σε 30 μΜ υπερικίνη (Σχ. 3Β, στήλη 3). Σε C2

VHL – /- κύτταρα που εκφράζουν συντακτικά HIF-1α, μεταγραφής VEGF ήταν, συνεπώς, πολύ υψηλή κατά την έναρξη. Η έκθεση σε υπερικίνη (72 ώρες) που προκαλείται από μειώσεις VEGF

206, VEGF

189 και οριακά, επίσης, VEGF

165 (Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν τα κύτταρα υπερικίνηε επεξεργασμένα εκτέθηκαν επίσης σε CA-074 (100 μg /ml), ο αναστολέας καθεψίνης-Β η οποία εμπόδισε την υπερικίνη με ενισχυμένη HIF-1α αποικοδόμηση, γονίδιο VEGF μεταγραφή διεγείρεται επίσης σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με υπερισίνη μόνο (Σχ. 3C). Εν ολίγοις, υπερικίνη διεγείρονται αλλαγές στα πρότυπα έκφρασης παραλλαγή ματίσματος του VEGF κυρίως στην ARPE-19 κύτταρα (Σχήμα 3Α.) Και επίσης ανιχνεύσιμη σε U87-MG και C2

VHL – /-. Κύτταρα

Πρόληψη έκφραση VEGFR2 /KDR σε υπερικίνη επεξεργασμένα κύτταρα

Οι διαμορφώσεις στη μορφή μεταγραφής γονιδίων VEGF που επάγεται από υπερικίνη μεσολάβηση αποικοδόμηση επιταχύνεται HIF-1α, δικαιολογείται αναλύσεις υπερικίνηε αποτελέσματα επί μεσολαβητές της αγγειογένεσης στο πρωτεϊνικό επίπεδο. Πιθανές συσχετίσεις με τις δραστηριότητες Hsp90 αξιολογήθηκαν επίσης λόγω της hsp90 polyubiquitination, αδρανοποίηση και την υποβάθμιση που προκαλούνται επίσης από υπερικίνη [14], και οι ρόλοι Hsp90 παίζει σε βασικά σημεία του αγγειογενετική καταρράκτη [2], [24].

Επιδράσεις της θεραπείας υπερικίνηε στην έκφραση VEGFR2 /KDR εξετάστηκαν στις τρεις κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων ARPE-19 επειδή VEGFR2 εκφράζεται επίσης σε κύτταρα RPE [25]. Η θεραπεία με επαγόμενη υπερικίνη αξιοσημείωτη καταστολή του VEGFR2 κυτταρικό περιεχόμενο σε U87-MG και ARPE-19 κύτταρα, ωστόσο, τα επίπεδα του υποδοχέα δεν επηρεάστηκαν σε νεφρική C2

VHL – /- κύτταρα (Εικ. 4Α). Για να καθοριστεί εάν η μειωμένη έκφραση VEGFR2 προέκυψαν από μειωμένη παραγωγή VEGF συμπληρώσαμε το μέσο ανάπτυξης του U87-MG και ARPE-19 κυττάρων με VEGF (10 ng /ml) με ή χωρίς ηπαρίνη (1 μονάδα /ml για 48 ώρες) μία ημέρα μετά υπερικίνηε χορήγηση και αναλύθηκαν έκφραση VEGFR2 σε αυτά τα κύτταρα. Αυτές οι θεραπείες δεν μετέβαλε την υπερικίνη μειωτικά έκφραση VEGFR2 και δεν αύξησε τα επίπεδα VEGFR2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν υπερικίνη διαμορφωμένα επίπεδα έκφρασης του mRNA VEGFR2 σε αυτά τα κύτταρα. RNA παρασκευάστηκε από κύτταρα κατεργασμένα υπερικίνηε (72 ώρες στο σκοτάδι) και ημι-ποσοτική RT-PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με VEGFR2-ειδικούς εκκινητές, χρησιμοποιώντας VEGFR1 ως συγκριτική αναφορά. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι η μεταγραφή του γονιδίου VEGFR2 ανεστάλη αποτελεσματικά και επιλεκτικά από υπερικίνηε σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, ενώ VEGFR1 μεταγραφή επηρεάστηκε λιγότερο (Σχήμα S1). Αναφέρουν ότι υπερικίνη προκαλεί επιγενετικές επιδράσεις ρύθμιση προς τα κάτω την επιλεκτική έκφραση της VEGFR2 και διάφορα πρόσθετα γονίδια. Ωστόσο, αυτό το μεγάλο θέμα υπερβαίνει το πεδίο εφαρμογής αυτού του χειρογράφου και θα συζητηθούν περαιτέρω αλλού.

[Α]. αναλύσεις Western blot των επιπέδων της πρωτεΐνης VEGFR2 σε εκχυλίσματα κυτταρολύματος από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (C), ή κύτταρα επεξεργασμένα με 30 μΜ υπερικίνη για 72 ώρες (ΗΥΡ). [ΣΙ]. Χρώση των κυττάρων U87 MG-με φαλλοειδίνη-FITC. (1) Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και (2) κύτταρα επεξεργασμένα με υπερικίνη 30 μΜ για 72 ώρες. βέλη πορτοκαλί δείχνουν F-ακτίνη νήματα? κίτρινα βέλη απεικονίζουν κατέρρευσε σφαιρίδια ακτίνης μετά από έκθεση σε υπερικίνη. [ΝΤΟ]. VEGFR2-hsp90 σχηματισμό συμπλόκου μετά από θεραπεία με υπερικίνη 30 μΜ για 72 ώρες. Αποτελέσματα ανοσοκαταβύθιση με αντι-Ηδρ90 αντίσωμα και την ανάπτυξη των κηλίδων Western με αντι-VEGFR2 αντίσωμα. Υπερικίνη μειωθεί ο σχηματισμός συμπλόκου VEGFR2-Hsp90. [ΡΕ]. Επαγωγή της αναγκαστικής hsp90 πολυ-ουβικουϊτινίωση με υπερισίνη (30 μΜ για 72 ώρες) σε ανθρώπινο καρκινικό κύτταρο γραμμές. Το ανώτατο φύλλο – ανοσοκατακρήμνιση με αντι-hsp90 και στύπωμα Western με αντι-hsp90 αντίσωμα (έλεγχος)? μεσαίο πάνελ – ανοσοκατακρήμνιση με αντι-hsp90 και στύπωμα Western με αντι-ουβικιτίνης, και κάτω ανοσοκαταβύθιση πάνελ με αντι-ουβικιτίνης και στύπωμα Western με αντι-hsp90. (Ι.Ρ. – ανοσοκατακρήμνισης? W.B. – Western blots).

Η

VEGFR2 κατάντη σηματοδότησης μετά την ενεργοποίηση από τις αλληλεπιδράσεις VEGF-VEGFR2 απαιτεί επίσης συνεργασία με hsp90 [24]. συμμετοχή Hsp90 είναι σχετικό με τις αναλύσεις μας αντιαγγειογονικών επιπτώσεις, γιατί έχουμε ήδη αναφερθεί στο μητρικό ποντικού και πλακώδη κύτταρα καρκινώματος που υπερικίνη προκαλεί hsp90 polyubiquitination και επιταχυνόμενη υποβάθμιση, αποσταθεροποιητικές και εξευτελιστική πρωτεΐνες hsp90-πελάτη σε αυτά τα κύτταρα [14]. VEGFR2 κατάντη σηματοδότησης ενεργοποιεί alphavbeta3 και κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) για να σχηματίσει κυτταροσκελετικές εστιακές συμφύσεις και F-ακτίνης πολυμερών [24]. FAK και Src είναι επίσης hsp90 πρωτεΐνες πελάτη και μάλιστα υπερικίνηε θεραπεία παρεμβαίνει με F-ακτίνη πολυμερισμού (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, ερεύνησε τις υπερικίνη συνέπειες για τη σύνδεση VEGFR2 με hsp90, αναλύοντας VEGFR2 τραβήξτε προς τα κάτω μετά από ανοσοκατακρήμνιση με αντι-hsp90 αντισωμάτων. Σύκο. 4C δείχνει ότι VEGFR2 συν-ανοσοκαταβυθίσματα με hsp90, ωστόσο αυτό συνανοσοκαθίζηση ακυρώθηκε μετά από επεξεργασία με 30 μΜ υπερικίνηε σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Αυτή η φαινομενικά καθολική εύρημα υποδηλώνει ότι σχηματισμού συμπλέγματος VEGF-VEGFR2-Hsp90 μειώνεται λόγω των ενεργειών της υπερικίνη.

Επίσης, επιβεβαιώνουν εδώ ότι η υπερικίνη προκαλεί hsp90 polyubiquitination σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Ανοσοκαταβύθιση U87-MG και C2

VHL – /- λύματα κυττάρων με αντι-hsp90 γκρέμισαν ουβικιτίνης παρακάτω υπερικίνη έκθεσης και το αντίστροφο: ανοσοκατακρήμνισης με αντι-ουβικιτίνης γκρέμισαν hsp90 (Σχήμα 4D).

. Hsp90 πολυ-ουβικουϊτινίωση παρεμβαίνει με την πυρηνική μεταφορά του HIF-1α πριν από την αποδόμηση του HIF-1α

για να προσδιοριστεί αν η υπερικίνη μεσολάβηση αποσταθεροποίηση του HIF-1α εξαρτάται επίσης από την υπερικίνη επαγόμενη πολυ-ουβικουϊτινίωση της hsp90 πραγματοποιήσαμε εξαρτάται από το χρόνο αξιολογήσεις των αποτελεσμάτων της υπερικίνης σε hsp90 πολυ-ουβικουϊτινίωση και συγχρονικά σε hsp90-σχετίζεται HIF-1α κυτταρικών περιεχομένων σε κύτταρα U87-MG υπό υποξία. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 και 30 μΜ υπερικίνηε επί 48 ώρες κατά τον οποίο χρόνο hsp90 πολυ-ουβικουϊτινίωση έγινε ανιχνεύσιμο και για 72 ώρες, όταν η συνοδός έχει υποβαθμιστεί [14]. Η υποξία προκλήθηκε με CoCl

2 για τις τελευταίες 6 ώρες του πειράματος, τα κύτταρα λύονται και οι δύο κυτοσολίου και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν. Hsp90 ανοσοκαταβυθίστηκε με το αντίστοιχο αντίσωμα του και κηλίδες Western αναπτύχθηκε με αντι-HIF-1α αντισωμάτων για την παρακολούθηση για HSP-90 δεσμευμένη HIF-1α και με αντι-hsp90 ως έλεγχος (Σχ. 5Α). επίπεδα HIF-1α συνδεδεμένο με hsp90 συγκρίθηκαν με συνολικό HIF-1α αναλύθηκαν σε κηλιδώσεις Western απευθείας από ολόκληρο κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μετά από έκθεση σε υπερικίνη για 48 ώρες hsp90 έγινε πολυ-ουβικιτινιωμένες, ακόμη αποδόμηση συνοδού πρώτιστα σημειώθηκε στην υψηλότερη δόση των 30 μΜ υπερικίνηε (Σχ. 5Α, αριστερή εικόνα). Κυτοσολίου HIF-1α άρχισε να υποβαθμίζεται στο χρονικό σημείο 48 hr, μόνο μετά από επεξεργασία με 30 μΜ υπερικίνη (Εικ. 5Β, άνω αριστερό πλαίσιο). Ωστόσο, HIF-1α πυρηνικής μεταφοράς ήταν πιο έντονα καταργήθηκε από δύο επίπεδα υπερικίνη δόση (Εικ. 5Β, 48 ώρες χρονικό σημείο 2

ου πίνακα, πυρηνικό κλάσμα). Αυτό οφείλεται στην υψηλή εξάρτηση της HIF-1α πυρηνικής μεταφοράς σε ακέραια δραστηριότητα hsp90 συνοδού [26]. Hsp90 πολυ-ουβικουϊτινίωση με υπερικίνη προκάλεσε απώλεια της δραστικότητας συνοδού και εμπόδισε την φυσιολογική HIF-1α trans-μετανάστευση μέσα στον πυρήνα όπου διίσταται κανονικά από hsp90 [27]. HIF-1α συνδεδεμένο με hsp90 και συν-ανοσοκαταβυθίζεται με αντίσωμα HSP90 επίσης αποδομείται περισσότερο έντονα λόγω hsp90 ουβικιτινίωση μετά από 48 ώρες (Σχ. 5Β, κάτω αριστερά πλαίσιο). Στις 72 ώρες κυτοσολικό hsp90 ήταν πολύ υποβαθμισμένη σε κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης (Σχ. 5Α, δεξιά εικόνα) και επηρέασε τόσο την συν-ανοσοκαταβυθίστηκε HIF-1α και HIF-1α μεταφέρονται στον πυρήνα (Εικ. 5Β, τρίτο και τέταρτο εικόνες). Το σύνολο του κυτταροπλάσματος HIF-1α περιεκτικότητα σε 72 ώρες χρονικό σημείο επίσης υποβαθμιστεί σε μεγάλο βαθμό, αλλά κάποια πρωτεΐνη HIF-1α παρέμεινε ανιχνεύσιμη. Έτσι, κυτοσολική HIF-1α που συνδέεται με hsp90 μειώθηκε πολυ-ουβικουϊτινίωση της hsp90 αυξήθηκε (Σχήμα 5Α & amp?. 5Β), αλλά συσχετίζεται λιγότερο με την πραγματική αποδόμηση hsp90

κύτταρα U87-MG εκτέθηκαν σε 10 & amp.? 30 μΜ υπερικίνη για 48 ώρες (αριστερά πάνελ) και 72 ώρες (δεξιά πάνελ) υπό συνθήκες υποξίας (150 μΜ CoCl

2) και η έκφραση hsp90 και δραστηριότητες chaperone αναλύθηκαν. Εκχυλίσματα κυτταρολύματος ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-hsp90 και κηλίδες Western αναπτύχθηκε με: [Α] αντι-hsp90 αντισωμάτων. [B] αντι HIF-1α. Σύκο. Σύκο.