Αφηρημένο

Για να διευκολυνθεί η απεικόνιση του καρκίνου του προστάτη με τη χρήση στοχευμένων μόρια, κατασκευάσαμε υπερήχων nanobubbles σε συνδυασμό με ειδικά αντι-PSMA ( το ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης) nanobodies, και αξιολογήθηκαν

in vitro

ικανότητα δέσμευσης τους και

in vivo

αποτελεσματικότητα της απεικόνισης. Οι «στοχευμένη» nanobubbles, τα οποία κατασκευάστηκαν μέσω βιοτίνης-στρεπταβιδίνης σύστημα, είχαν μέση διάμετρο 487.60 ± 33.55 nm και έφεραν το nanobody αντι-PSMA όπως αποδεικνύεται με ανοσοφθορισμό. Μικροσκοπία αποκάλυψε στοχευμένη δέσμευσης της nanobubbles

in vitro

να PSMA-θετικά κύτταρα. Επιπλέον, οι δείκτες υπερηχογράφημα απεικόνισης nanobubble (συμπεριλαμβανομένου του χρόνου άφιξης, ώρα αιχμής, ένταση κορυφής και βελτιωμένη διάρκεια) εκτιμήθηκαν για την απεικόνιση υπερήχων σε τρία είδη ξενομοσχευμάτων ζώων (LNCaP, C4-2 και ΜΚΝ45), και έδειξε ότι αυτές οι τέσσερις δείκτες στοχευμένη nanobubbles παρουσίασαν σημαντικές διαφορές από το κενό nanobubbles. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη όχι μόνο παρουσιάζει μια νέα προσέγγιση για τη στόχευση του προστάτη υπερηχογράφημα του καρκίνου, αλλά και παρέχει τη βάση και τις μεθόδους για την κατασκευή μικρού μεγέθους και υψηλής απόδοσης στοχευμένες nanobubbles υπερήχων

Παράθεση:. Fan Χ, Wang L, Guo Υ, Ζ Tu, Li L, Tong H, et al. (2015) Υπερήχων nanobubbles μεταφοράς Anti-PSMA Nanobody: Κατασκευή και εφαρμογή του καρκίνου του προστάτη-Στοχευμένες απεικόνισης. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10.1371 /journal.pone.0127419

Επιμέλεια: Serge Muyldermans, Vrije Universiteit Brussel, BELGIUM

Ελήφθη: 5 του Νοεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 14 του Απριλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Fan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή έχει υποστηριχθεί οικονομικά από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (αριθμός επιχορήγησης: 30.970.830), το Ίδρυμα Chongqing Επιστήμης (αριθμός επιχορήγησης: cstc2012jjB0072) και το Ίδρυμα Νεολαίας Επιστημών του Τμήματος Jiangxi Παιδείας (αριθμός επιχορήγησης: GJJ12142).

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συγκεκριμένη αναγνώριση του καρκίνου του προστάτη είναι μια κλινικά. επείγον καθήκον [1]. Από την άποψη αυτή, η ανάπτυξη της μοριακής απεικόνισης υπερήχων έχει παράσχει ένα νέο δρόμο για την έγκαιρη διάγνωση του προστάτη του καρκίνου. Αυτή η τεχνική περιλαμβάνει ενώσεις απεικόνισης επισήμανσης με ειδικά αντισώματα ή συνδέτες για να δημιουργήσει στοχευμένη παράγοντες αντίθεσης υπερήχων ικανό σύνδεσης σε συγκεκριμένους ιστούς ή αλλοιώσεις. Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, αυτές οι μοριακοί ανιχνευτές συσσωματώνονται ειδικά στους ιστούς στόχους μέσω της κυκλοφορίας του αίματος, επιτρέποντας έτσι υπερηχογραφία με βάση ειδική απεικόνιση των παθογόνων αλλαγές σε μοριακό ή κυτταρικό επίπεδο. [2]. Ωστόσο, οι παράγοντες αντίθεσης micron κλίμακας υπερήχων (μικροφυσαλίδων) που χρησιμοποιούνται σήμερα στις περισσότερες σχετικές μελέτες απεικόνισης έχουν διαμέτρους από 1-10 μπι [3,4]. Όγκου νεοαγγειακές δομές είναι συχνά ατελής, επειδή τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου διαθέτουν ελλιπή μεμβράνες, στερούνται λεία στρώματα μυών και εμφανίζουν κακή λεμφική κυκλοφορία? συνεπώς, αυτά τα σκάφη εμφανίζουν αυξημένη διαπερατότητα σε σχέση με την κανονική αιμοφόρων αγγείων, μια επίδραση που έχει ονομαστεί την ενισχυμένη διαπερατότητα και κατακράτηση επίδραση (EPR). Παρά την διαπερατότητα, η μέγιστη διάμετρος αγγειακή πόρου κυμαίνεται από περίπου, ήτοι 380-780 nm, και θεωρητικά μόνο σωματίδια & lt? 700 nm σε διάμετρο μπορούν να περάσουν μέσα από την νεοαγγείωση όγκου? Ως εκ τούτου, οι παράγοντες αντίθεσης υπερήχων τακτική συχνά δεν μπορούν να περάσουν μέσα από το αγγειακό σύστημα για την έρευνα των καρκινικών κυττάρων και να διευκολύνουν συγκεκριμένες απεικόνισης όγκου [5,6]. Μετά από αυτές τις EPR ευρήματα, κάποιες ομάδες έχουν κατασκευαστεί πρόσφατα nanobubbles και εξέτασε τη διαπερατότητα τους. Οι nanobubbles παρασκευάζονται με Yin

et al

. είχαν μέση διάμετρο 436,8 ± 5,7 nm και εμφανίζεται στόχευση παθητική όγκου [7]. Σε προκαταρκτικές μελέτες μας, έχουμε επίσης αναπτύξει στοχευμένες nanobubbles με μέση διάμετρο 644.30 ± 55.85 nm που πραγματοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα έναντι προστατικό αντιγόνο μεμβράνης ειδικό (PSMA) και διερευνήθηκαν οι δυνατότητες απεικόνισης αυτών nanobubbles σε προστάτη ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε ότι αυτές οι στοχευμένες nanobubbles θα μπορούσε να αυξήσει το χρόνο και την ένταση μέγιστες τιμές ξένου μοσχεύματος σε σύγκριση με κενό nanobubbles και επομένως ευνοεί την στοχευμένη απεικόνισης όγκου-ειδική [8].

Ωστόσο, το μονοκλωνικό αντίσωμα nanobubbles στοχευμένες έχουν δύο εμφανείς περιορισμούς. Πρώτον, μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού είναι ανοσογόνες στον άνθρωπο. Δεύτερον, τα μεγάλα μοριακά βάρη των συμπλοκών αντισώματος-σωματίδιο έχει ως αποτέλεσμα χαμηλό αριθμό στόχευσης συμπλοκών επιτευχθούν τα επιδιωκόμενα στόχων [9], διακυβεύοντας έτσι τα αποτελέσματα απεικόνισης. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός ενός μικρού μεγέθους αντίσωμα που είναι βολικό, υψηλής απόδοσης και διεισδυτική είναι ζωτικής σημασίας για τη μοριακή απεικόνιση όγκου με στόχευση. Η ανακάλυψη του nanobodies [10] παρείχε μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την ανάπτυξη ενός νέου τύπου υπερήχων στόχευσης nanobubble επειδή αυτές nanobodies είναι μικρότερα σε μέγεθος. Συγκεκριμένα, IgG2 και IgG3 (αντισώματα βαρείας αλύσου) από ζώα της οικογένειας των Καμηλιδών στερούνται φυσικά ελαφριές αλυσίδες και τον τομέα CH1? αυτά είναι τα μικρότερα λειτουργικά σήμερα γνωστά τεμάχια συνδέσεως αντιγονικές και χαρακτηρίζονται από χαμηλά μοριακά βάρη, βολική έκφραση, τη σταθερότητα και χαμηλή ανοσογονικότητα

in vivo

. Ως εκ τούτου, nanobodies είναι μια πολλά υποσχόμενη προοπτική όσον αφορά την ακριβή διάγνωση και στοχευμένες θεραπείες [11-16]. Ωστόσο, πολύ λίγοι nanobubbles υπερηχογράφημα όγκου με στόχευση σε συνδυασμό με συγκεκριμένες nanobodies περιγράφηκαν. Στην παρούσα εργασία, θα αναπτύξει το μικρού μεγέθους και υψηλής απόδοσης διαμόρφωση στοχευμένων nanobubble, η οποία πραγματοποιήθηκε την nanobody αντι-PSMA, για να ελέγξει την υπόθεση ότι nanobody επικαλυμμένα nanobubbles μπορεί να ενισχύσει τη διαγνωστική αξία των υπερήχων για τον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και ζώα

LNCaP, το οποίο είναι το τυπικό άνθρωπο εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κυττάρων, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, το οποίο είναι ένα υποτύπου του LNCaP κυτταρικής γραμμής και ενός ανθρώπινου ανδρογόνου ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή, αποκτήθηκε από ViroMed Laboratories στο Johns Hopkins, ΗΠΑ. ΜΚΝ45, μια ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, όπως τον έλεγχο, λήφθηκε από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών Ινστιτούτου για τον Καρκίνο (Πεκίνο, Κίνα). Τέσσερα έως 5-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c-nu γυμνοί ποντικοί (Πειραματικό Κέντρο Ζώων, Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο) διατηρούνται σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο περιβάλλον χωρίς χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του τρίτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

κηλίδωση Western σε τρεις κυτταρικές σειρές

LNCaP, C4-2 και ΜΚΝ45 κύτταρα αναπτύχθηκαν στη λογαριθμική φάση, ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), τοποθετήθηκε σε πάγο, και αιωρήθηκε σε 400 μΙ δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης ρυθμιστικού λύσης (RIPA) πρωτεΐνη. Στη συνέχεια, όλα τα προϊόντα λύσης των καρκινικών κυττάρων μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα 1,5-mL και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 rpm και 4 ° C για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο που προέκυψε μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα φυγοκέντρησης 1,5 mL. Ένα κιτ δικιγχονινικού οξέος (BCA) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Επιπροσθέτως, τα δείγματα συμπληρώθηκαν με δωδεκυλο θειικό ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) ρυθμιστικό φόρτωσης 5Χ νατρίου, αναμίχθηκαν και έβρασαν για 5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως τις πρωτεΐνες. Τριάντα μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκε μέσω SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε ένα φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μέσω της μεθόδου ημίξηρη στύπωση. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% ρυθμιστικό αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στη συνέχεια διερευνήθηκε διαδοχικώς με 1: 400 αραίωση (2.5 μg /mL) ενός μονοκλωνικού αντισώματος αντι-hPSMA στους 4 ° C όλη τη νύκτα και 1: 2000 αραίωση ενός υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες? η μεμβράνη πλύθηκε τρεις φορές με PBST (PBS με 0.1% Tween-20) μετά από κάθε επώαση αντίσωμα.

δημιουργία ειδικών και βιοτινυλιωμένου nanobody

Η εξωκυτταρική περιοχή του PSMA για πρώτη φορά εκφράζεται σε ευκαρυωτικά ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά (ΗΕΚ) -293 κύτταρα, μετά το οποίο η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως υλικό επικάλυψης για τη διαλογή μίας προηγουμένως καθοριστεί φυσική βιβλιοθήκη nanobody ορίζεται NA-PDL. Αντίστοιχα, nanobody φάγοι ικανό για ειδική πρόσδεση σε PSMA σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο λήφθηκαν [17]. Αυτές οι φάγοι ακολούθως αλληλουχία, και οι ακόλουθοι εκκινητές σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τα αποτελέσματα αλληλούχισης: πρόσθιος εκκινητής, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (που περιέχει

BamHI Ιστοσελίδα) και αντίστροφο εκκινητή, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (που περιέχει

HindⅢ Ιστοσελίδα ). Μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας το θετικό κλώνο φάγου ως ένα εκμαγείο για την ενίσχυση του γονιδίου στόχου? το προϊόν της αντίδρασης στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός του

BamHI

και

HindIII

θέσεις του φορέα έκφρασης ρΕΤ28α (Novagen /EMD Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), το οποίο περιέχει μια έξι-ιστιδίνη tag. Ο ανασυνδυασμένος φορέας μετασχηματίστηκε στην

E

.

coli

ϋΗ5α στέλεχος. Οι προκύπτοντες θετικοί κλώνοι αλληλουχήθηκαν για να ταυτοποιηθούν αυτές με τη σωστή σειρά? οι σωστές κλώνοι μετασχηματίζεται στο

E

.

coli

Rosseta στέλεχος έκφρασης (DE3? Novagen /EMD Millipore) για να δώσει ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης. Ni-αγαρόζης (Qiagen, Venlo, Ολλανδία) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να καθαρίσει το ιστιδίνη-tagged nanobody. Στη συνέχεια, επισημασμένα το nanobody με το διάλυμα βιοτίνης. Λεπτομερώς, δύο χιλιοστόγραμμα Σουλφο-ΝΗδ-ΕΟ-βιοτίνη (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) πλήρως διαλυτοποιήθηκαν σε 360 μί στείρου DDH

2O. Αυτό το διάλυμα επωάστηκε με το nanobody στους 4 ° C για 72 ώρες, ακολουθούμενη από διαπίδυση στους 4 ° C όλη τη νύκτα. UV φασματοσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του αντισώματος. Συγκεκριμένα, η θεωρητική συντελεστής απόσβεσης από την αλληλουχία του nanobody ήταν 21.555 Μ

-1 · cm

-1, και η απορρόφηση στα 280 nm μετρήθηκε για να υπολογιστεί η συγκέντρωση αντισώματος σύμφωνα με τον τύπο «Απορρόφηση = ε ( συντελεστή απόσβεσης, Μ

-1 · cm

-1) Χ μήκος διαδρομής (cm) Χ συγκέντρωση (Μ) «. Ένα κιτ βιοτίνης ποσοτικοποίηση (Pierce /Thermo Scientific) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των συγκεντρώσεων βιοτίνης στα δείγματα και παράγει την αναλογία σύζευξη βιοτίνης /αντίσωμα

Επικύρωση της συγγένειας nanobody μέσω ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Για να ληφθεί η συγγένεια του βιοτινυλιωμένου nanobody, ένα πρότυπο ανταγωνιστικής ELISA χρησιμοποιήθηκε. Κάθε φρεάτιο μιας πλάκας μικροτίτλου επικαλύφθηκε με 1 mM ανασυνδυασμένο αντιγόνο PSMA, αποκλείσθηκαν με λευκωματίνη 3% βόειου ορού (BSA) -PBST σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στη συνέχεια ξεπλένεται τρεις φορές με PBST. Στη συνέχεια, 1 ηΜ βιοτινυλιωμένου nanobody επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις αντιγόνου σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 0,1 ηΜ έως 100 μΜ σε παράλληλους σωλήνες eppendorf. Μετά από 30 λεπτά επώασης, 90 μL από τα μίγματα αντίδρασης εφαρμόστηκαν σε φρεάτια της πλάκας μικροτιτλοδότησης επικαλυμμένα με αντιγόνο. Μετά από 10 λεπτά επώαση, τα μίγματα απορρίφθηκε, και τα φρεάτια ξεπλύθηκαν με PBST. Στη συνέχεια, 100 μL ΗΚΡ-στρεπταβιδίνη συζευγμένη με-βιοτίνη (Kangwei Century, Πεκίνο, Κίνα) σε αραίωση 1: 2000 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και ακολούθησε επώαση στους 37 ° C για 1 ώρα. Κάθε καλά κατόπιν ξεπλύθηκε 5 φορές με PBST πριν από την προσθήκη 100 μL /πηγάδι ενός 3,3 ‘, 5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ) διαλύματος εργασίας (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) και επώαση της πλάκας σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά . Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με την προσθήκη 50 μL του διαλύματος θειικού οξέος 2 Μ σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση στα 450 nm στη συνέχεια προσδιορίζεται για κάθε φρεάτιο. Ως εκ τούτου, η υψηλότερη οπτική πυκνότητα (OD)

450nm έπρεπε να παρατηρηθεί σε χαμηλές συγκεντρώσεις αντιγόνου. Η συγκέντρωση του αντιγόνου στην οποία η ημι-μέγιστο σήμα ELISA ανιχνεύεται αντιστοιχεί στη σταθερά διάστασης Κ

D.

Παρασκευή και την επικύρωση των στοχευμένων nanobubbles

Μείγματα που περιέχουν συγκεκριμένες αναλογίες διπαλμιτοϋλο φωσφατιδύλο χολίνη (DPPC? Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Σουηδία), βιοτινυλιωμένο διστεαροϋλ φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (Bio-DSPE? Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA) και διφαινυλφωσφορυλαζίδιο (ϋΡΡΑ? Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) ζυγίστηκαν και λυοφιλίζεται χρησιμοποιώντας ένα πιστολάκι για πάγωμα (Shanghai Pudong ξήρανση με κατάψυξη Equipment Co., Σαγκάη, Κίνα). Δείγματα αυτών των μιγμάτων τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια? οκταφθοροπροπάνιο (C

3F

8) αερίου ενίεται αργά για να αντικαταστήσει τις επικαλύψεις αέρα στα φιαλίδια. Πριν από τη χρήση, ένα μεικτό διάλυμα 1 μέρος γλυκερόλη: 9 μέρη PBS προστέθηκε στο φιαλίδιο που ακολουθείται από θέρμανση στους 37 ° C για να διευκολυνθεί η διαλυτοποίηση. Τα παρασκευάσματα οριζόντια αναμιγνύονται σε ένα αντίστροφο τρόπο, χρησιμοποιώντας μια σειρά ST αμαλγάματος (AT & amp? Μ Βιοϋλικά Co, LTD, Πεκίνο, Κίνα) με τις ακόλουθες συγκεκριμένες παραμέτρους λειτουργίας: η συχνότητα δόνησης, ≥4500 /min? πλάτος ταλάντωσης, 15 ± 1 mm και η διάρκεια δόνησης, 60 s [8]. Αυτά τα παρασκευάσματα στη συνέχεια αφήνεται να ηρεμήσει στους 4 ° C για να διευκολυνθεί ο διαχωρισμός φάσεων. Το γαλακτώδες εναιώρημα κατώτερη φάση υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 300 rpm για 3 λεπτά για να διαχωριστούν τα βιοτινυλιωμένα nanobubbles στο κάτω μέρος από τις μικροφυσαλίδες στο επάνω μέρος. Στη συνέχεια, 3 μg αβιδίνης προστέθηκαν ανά 10

7 nanobubbles, ακολουθούμενη από επώαση στους 4 ° C για 1 ώρα. Τα παρασκευάσματα αφέθηκαν να ξεκουραστούν για να διευκολυνθεί ο διαχωρισμός φάσης? το ανώτερο στρώμα στη συνέχεια συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 300 rpm για 3 λεπτά. Το δείγμα ξεπλένεται τρεις φορές για να απομακρυνθεί η περίσσεια αβιδίνη. Στη συνέχεια, 1 μΙ βιοτινυλιωμένου nanobody προστέθηκαν ανά 10

7 nanobubbles, που ακολουθείται από επώαση, φυγοκέντρηση και έκπλυση για να απομακρυνθεί η περίσσεια βιοτινυλιωμένης nanobody. Οι προκύπτουσες nanobubbles ορίστηκαν τα Στοχευμένες ΚΟ, ενώ nanobubbles χωρίς συμπλήρωση αντισώματος ορίστηκαν τα Λευκά ΚΟ. Τα μεγέθη σωματιδίων των 2 προϊόντα αναλύθηκαν σε Malvern Zetasizer αναλυτή νανο ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK), και ένα θάλαμο καταμέτρησης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των 2 προϊόντα. τους

in vitro

αποτελέσματα απεικόνισης στις διαφορετικές συγκεντρώσεις ερευνήθηκαν με ένα μοντέλο αγαρόζης υπό την προϋπόθεση ενός δείκτη μηχανισμού του 0,12 και ένα κέρδος 60%.

Για να διερευνηθεί αν η μέθοδος αυτή θα μπορούσε να είναι χρησιμοποιούνται για τη συγκράτηση βιοτινυλιωμένη nanobody στους nanobubbles, Λευκά ή Targeted NBs επωάστηκαν με ένα αντι-Ηίδ αντίσωμα ποντικού για 1 ώρα, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση, ξέπλυμα και επώαση στο σκοτάδι με μια ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας για 3 ώρες στους 4 ° C. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και εκπλύθηκαν για την απομάκρυνση μη δεσμευμένου δευτερεύοντος αντισώματος. Τα δείγματα στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) για την αξιολόγηση της δέσμευσης φθορισμού.

nanobubbles και το

in vitro

κύτταρο δοκιμασία δέσμευσης

LNCaP , C4-2 και ΜΚΝ45 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε λογαριθμική φάση φυγοκεντρήθηκαν και σπάρθηκαν πάνω καλυπτρίδες σε φρεάτια ενός 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για όλη τη νύχτα, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και εκπλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Δύο ομάδες καλυπτρίδες παρασκευάστηκαν ανά κυτταρικό τύπο? 1 ομάδα συμπληρώθηκε με 30 μΐ Targeted NBS (1.0 x10

8 /mL) και το άλλο με Blank ΚΟ, μετά την οποία τα μείγματα επωάστηκαν στους 4 ° C για 3 ώρες. Ακολούθως, οι καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS, τοποθετήθηκαν όψη προς τα κάτω επάνω σε διαφάνειες και παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Olympus Corporation) για να εξετάσει τα nanobubbles. Το ποσοστό πρόσφυσης, ορίζεται ως το ποσοστό των κυττάρων που σημάνθηκαν με ≥4 στοχευμένη nanobubbles σε ένα δεδομένο τυχαίο τομέα, υπολογίστηκε για να δείξει δεσμευτική. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε 4 φορές.

Nanobubble απεικόνισης σε διάφορες ξενομοσχεύματα

Λογαριθμική φάση LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη και τα κύτταρα C4-2 χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή αιωρημάτων κυττάρων σε πυκνότητα 5 χ 10

7 κύτταρα /mL? ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα σε ανάπτυξη λογαριθμικής φάσης χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία κυτταρικών αιωρημάτων από 1 × 10

7 κύτταρα /mL. Διακόσια μικρολίτρα από κάθε κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκαν στη συνέχεια με 200 μι BD Matrigel (BD Biosciences, USA)? Τα μίγματα που προέκυψαν υποδορίως εμβολιάσθηκαν εντός 4-5 εβδομάδων αρσενικούς BALB /c-nu γυμνοί ποντικοί με σωματικό βάρος 18-20 g. Πέντε ζώα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τύπο ξενομοσχεύματος όγκου. Τα ξενομοσχεύματα παρακολουθήθηκαν καθημερινά με ένα παχύμετρο βερνιέρου έως ότου οι όγκοι έφθασαν μια κατά προσέγγιση διάμετρο 1 cm.

έφεραν όγκο γυμνοί ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν μέσω ενδοπεριτοναϊκώς 1% πεντοβαρβιτάλη νατρίου. Για την απεικόνιση, οι επιφάνειες και των δύο του ανιχνευτή και του όγκου καλύπτεται με ένα παχύ παράγοντα σύζευξης 5-mm. Μια 50-mm L12-5 ευρυζωνικών αισθητήρα γραμμική υπερήχων συνδέεται με ένα σύστημα υπερήχων iU22 (Philips, Άμστερνταμ, Ολλανδία) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει B-mode υπερηχογράφημα απεικόνισης των ξενομοσχευμάτων. Μόλις η διατομή ενός ξενομοσχεύματος αποκαλύφθηκε πλήρως, ο ανιχνευτής ακινητοποιήθηκε για να επιτρέψει στήσιμο του τρόπου υπερηχογραφία (μηχανικό δείκτη, 0,12? Κέρδος, 90%). Υπερηχογραφία ξεκίνησε όταν το εστιακό κέντρο ήταν τοποθετημένο στο κέντρο του όγκου. Κάθε ζώο δοκιμής έλαβε 200 μL Blank ή Targeted NBS (3 × 10

7 σωματίδια) μέσω ένεσης φλέβας της ουράς, μετά την οποία ο αγωγός ξεπλύθηκε με 100 μL αλατούχου διαλύματος. Δυναμικές εικόνες συλλέχθηκαν μέχρι η περιοχή του όγκου ήταν εντελώς ελεύθερο από ΚΟ. Επιπλέον, 200 μι μια ισοδύναμη ποσότητα ενός άλλου τύπου nanobubbles και 100 μλ αλατόνερου χορηγήθηκαν με παρόμοιο τρόπο για να διευκολυνθεί υπερηχογραφία υπό ταυτόσημες συνθήκες? τα δεδομένα απεικόνισης που συλλέγονται από τα ίδια γυμνά ποντίκια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Qlab8.1 (Philips) να συγκρίνει τις 4 παραμέτρους απεικόνισης (ώρα άφιξης, ώρα αιχμής, ένταση κορυφής και ενισχυμένη διάρκεια) στην περιοχή ξενομόσχευμα με τους παράγοντες αντίθεσης 2. Ο χρόνος άφιξης ορίστηκε ως το διάστημα από την ολοκλήρωση της ένεσης και το πρώτο χρονικό σημείο κατά το οποίο επιτεύχθηκε 10% κορυφή έντασης. Ενισχυμένη διάρκεια ορίστηκε ως το διάστημα μεταξύ των 2 χρονικών σημείων κατά την οποία επιτεύχθηκε 10% κορυφή έντασης. Ώρα αιχμής ορίστηκε ως το διάστημα μεταξύ του χρόνου έγχυσης και την ώρα της αιχμής της έντασης [18].

Στατιστικές αναλύσεις

Στατιστική Πακέτο για τις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS) 16.0 λογισμικού (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση των στατιστικές αναλύσεις. Όλα τα ποσοτικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπικές αποκλίσεις. Η στοχευμένη Λευκά δεδομένων δείκτης υπερήχων ΚΟ ΚΟ και το

in vitro

και

λήφθηκαν in vivo

imagings και αναλύθηκαν με χρήση ενός αντίστοιχου δείγματος T-test. Οι δείκτες υπερηχογράφημα των nanobubbles που στοχεύουν τους 3 τύπους ξενομοσχεύματος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Μια τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Ιστογράμματα και η καμπύλη με μη-γραμμική παλινδρόμηση σχεδιάσθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Αποτελέσματα

έκφραση PSMA σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και παρασκευή του PSMA-ειδική nanobody

κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η έκφραση PSMA σε κύτταρα LNCaP, C4-2 και ΜΚΝ45. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών, κύτταρα LNCaP εξέφρασαν το υψηλότερο επίπεδο του PSMA, που ακολουθείται από C4-2 κύτταρα? ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν καμία εμφανή έκφραση PSMA (σχήμα 1).

LNCaP κύτταρα εξέφρασαν ένα υψηλότερο επίπεδο από ό, τι PSMA κυττάρων C4-2, ενώ ΜΚΝ45 κύτταρα δεν παρουσίασαν έκφραση.

Η

ο κλώνος φάγου που επιλέγονται μέσω προκαρυωτικών panning χρησιμοποιήθηκε για ανασυνδυασμένη έκφραση και διευκόλυνε την απόκτηση επισύναψη His PSMA-ειδική nanobody (μοριακό βάρος, 18 kD). Μετά βιοτινυλίωση της nanobody, φασματομετρία UV πραγματοποιήθηκε για να αποκαλύψει ότι η συγκέντρωση αντισώματος ήταν 0,59 mg /ml και η αναλογία σύζευξη βιοτίνης /nanobody ήταν περίπου 3,6: 1 σύμφωνα με ένα κιτ βιοτίνη ποσοτικοποίηση. Με βάση την αρχή της ανταγωνιστικής δέσμευσης, η σταθερά διαστάσεως είναι ίση με την συγκέντρωση στο μισό της μέγιστης τιμής σε ELISA. Ως εκ τούτου, η K

D βιοτινυλιωμένου nanobody έναντι ανασυνδυασμένης PSMA ήταν 519 ηΜ, ενώ η μη-γραμμική παλινδρόμηση είχε μια καλή προσαρμογή με R

2 = 0,978 (Σχήμα 2).

Η καμπύλη με μη-γραμμική παλινδρόμηση για την συγκέντρωση του recombint PSMA που κυμαίνονται από 0,1 ηΜ έως 100 μΜ obbtained.

η

Στοχευμένη NB Χαρακτηρισμός με μικροσκοπία φθορισμού

Οι nanobubbles και βιοτινυλιωμένο nanobody συζεύχθηκαν με στρεπταβιδίνη βιοτίνη. Ένα ελαφρύ μικροσκόπιο και Malvern Zetasizer αναλυτή νανο ZS90 χρησιμοποιήθηκαν για να μελετήσουν τις μορφολογίες και οι διάμετροι των στοχευμένων ΕΤΣ και Λευκά ΚΟ και αποκάλυψε ότι οι δυο εμφάνισαν κανονικό σφαιρικό σχήμα, και η στοχοθετημένη προετοιμασία Σημείωση είχαν μέση διάμετρο 487.60 ± 33.55 nm, ενώ η Blank παρασκεύασμα NB είχαν μέση διάμετρο 445.30 ± 32.96 nm? τους

in vitro

αποτελέσματα απεικόνισης, δηλαδή με υπερήχους σήματα, δεν είχε διαφορές με την ίδια συγκέντρωση (P = 0,06, Σχήμα 3). Ανοσοφθορισμός αργότερα αποκάλυψε ότι οι στοχευμένες NBs εκπέμπονται πράσινο σήματα φθορισμού κάτω από το μικροσκόπιο (Σχήμα 4). Σε αντίθεση, τα Λευκά nanobubbles, τα οποία δεν είχαν επισημανθεί με βιοτινυλιωμένη nanobody, δεν εμφανίζει ένα εμφανές σήμα φθορισμού, υποδεικνύοντας ότι οι nanobubbles δεσμεύεται ειδικά την nanobody μέσω βιοτίνης-αβιδίνης αλληλεπιδράσεις.

Ένα Malvern Zetasizer αναλυτής χρησιμοποιήθηκε για την εξετάσει τα μεγέθη σωματιδίων. Blank NBS (χωρίς βιοτινυλιωμένο nanobody) είχαν μια μέση διάμετρο 445.30 ± 32.96 nm (Α), ενώ Targeted NBS (με βιοτινυλιωμένο nanobody) είχαν μια μέση διάμετρο 487,6 ± 33,55 nm (Β). Και δεν υπάρχει καμία διαφορά στη τους

in vitro

απεικόνισης στις ίδιες συγκεντρώσεις (C).

Η

Η μικροσκοπική παρατήρηση του Στοχευμένες ΚΟ (Α και Β). Οι δακτύλιος δομές που ομοιάζουν με παχιά μεμβράνες είναι NBS (Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η στοχευμένη ΚΟ θα μπορούσε να ενσωματώσει ειδικά nanobody μέσω βιοτίνης-αβιδίνης αλληλεπιδράσεις.

Η

Η σύνδεση των στοχευμένων nanobubbles στα κύτταρα

δεσμευτική εξετάστηκε μέσω μικροσκοπίας κυττάρων-nanobubble (Σχήμα 5). Οι στοχευμένες nanobubbles προσκολλάται καλύτερα στα κύτταρα LNCaP, καθένα από τα οποία προσλαμβάνονται κατά μέσο όρο 7,27 ± 1,70 nanobubbles για να δώσει ένα ποσοστό πρόσφυσης των 98,00 ± 2,31%, ακολουθούμενη από C4-2 κύτταρα, καθένα από τα οποία προσλαμβάνονται 5,67 ± 1,61 nanobubbles για να δώσει ένα ποσοστό πρόσφυσης των 92.00 ± 8.64%. Αντιθέτως, δεν παρατηρείται σημαντική δέσμευση δεν παρατηρήθηκε ανάμεσα στα nanobubbles και ΜΚΝ45 κυττάρων, με ένα δεσμευτικό συχνότητα 0,72 ± 0,87 nanobubbles ανά κύτταρο. Τέλος, καμία εμφανής δεσμευτική ταυτοποιήθηκε μεταξύ του τυφλού NBs και κάθε ένα από τα 3 τύπους κυττάρων, όπως αποδεικνύεται από τους αντίστοιχους αριθμούς πρόσδεσης 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 και 0,68 ± 0,94 ανά κύτταρο, αντίστοιχα.

Κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός, τα δύο κύτταρα LNCaP και κυττάρων C4-2 εμφανώς συνδεδεμένο με Targeted NBS (Α και Β), ενώ ΜΚΝ45 κύτταρα δεν συνδέεται προς Targeted NBS (C). Κανένας από τους 3 τύπους κυττάρων που εμφανίζονται εξέχοντα σύνδεση προς Blank NBS (D, Ε και F). Κλίμακα, 5 μm.

Η

Υπέρηχοι ξενομόσχευμα απεικόνισης

λογισμικό Qlab8.1 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση και σύγκριση των δεικτών απεικόνισης (ώρα άφιξης, ώρα αιχμής, η μέγιστη ένταση και αυξημένη διάρκεια) της η στοχευμένη ΕΤΣ και Λευκά ΚΟ στις 3 ομάδες ξενομόσχευμα (Σχήμα 6 και Πίνακας 1). Στα ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη (LNCaP και C4-2), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τιμές έντασης κορυφής (τιμές Ρ, 0,003 και 0,002, αντίστοιχα) και αυξημένη διάρκεια (οι τιμές P, 0.001 και 0.004, αντίστοιχα) των Στοχευμένες ΚΟ ήταν σημαντικά υψηλότερες και περισσότερο, αντίστοιχα, από ό, τι το κενό ΚΟ. Ωστόσο, οι χρόνοι άφιξης και ώρες αιχμής ήταν δυσδιάκριτες μεταξύ των 2 τύπων nanobubbles. Στο γαστρικό ομάδα καρκινικά κύτταρα ελέγχου ΜΚΝ45, η στοχευμένη ΕΤΣ και Λευκά ΚΟ δεν εμφάνισαν σαφείς διαφορές σε σχέση με τους 4 δείκτες. Μια σύγκριση των 3 τύπων ξενομοσχευμάτων σε σχέση με τις στοχευμένες ιδιότητες απεικόνισης nanobubble αποκάλυψε ότι τα αλλομοσχεύματα C4-2 εμφάνισαν σημαντικά διαφορετικές μέγιστες τιμές της έντασης, βελτιωμένη διάρκεια, τις ώρες άφιξης και τις ώρες αιχμής σε σύγκριση με τις ξενομοσχευμάτων ΜΚΝ45, με τις αντίστοιχες τιμές Ρ 0,024, 0.007, 0.000 και 0.050. Επιπλέον, οι ξενομοσχεύματα LNCaP εμφανίζονται επίσης σημαντικά διαφορετικούς χρόνους άφιξης και τιμές κορυφής σε σύγκριση με εκείνες των ΜΚΝ45 ξενομοσχευμάτων (τιμές Ρ από 0,000 και για τις δύο), αν και τα υπόλοιπα 2 δείκτες δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές. Ως εκ τούτου, με τη χρήση απεικόνισης υπερηχογράφημα με στοχευμένες ΚΟ, τόσο τις εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη και C4-2 κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα που επιβεβαιώνεται με μεγαλύτερες τιμές αιχμής και μεταγενέστερους χρόνους άφιξης από τον έλεγχο του γαστρικού ξενομοσχεύματα καρκίνου. Επιπλέον, όταν συγκρίθηκαν οι ξενομοσχευμάτων LNCaP και C4-2, η ώρα άφιξης (P = 0,026), ώρα αιχμής (P = 0,005) και η μέγιστη τιμή (P = 0,008) διέφεραν σημαντικά, ενώ η αυξημένη διάρκεια δεν ήταν σημαντικά διαφορετική (P = 0.261). Ωστόσο, οι μικρές διαφορές (μόνο λιγότερο από ένα δευτερόλεπτο) το χρόνο άφιξης και χρόνο για να κορυφωθεί μεταξύ δύο όγκους ή δύο είδη παραγόντων αντίθεσης δεν είναι εύκολο να παρατηρηθεί, έτσι ώστε η μέγιστη τιμή και απεικόνισης διάρκεια θα πρέπει να είναι το επίκεντρο των πιο ανησυχία .

Πάνελ Β, Ε και Ζ δείχνουν τα κλασικά διατομές των 3 τύπων ξενομοσχευμάτων κάτω υπερηχογραφία B-mode. Πάνελ Α, D και Η δείχνουν την πρόσδεση του Blank NBs στα ξενομοσχεύματα σε ένταση κορυφής. Πάνελ C, F και έχω δείξει τη δέσμευση της Στοχευμένης ΚΟ στα ξενομοσχεύματα σε ένταση αιχμής. Οι υπερηχογραφικές εικόνες τόσο στο LNCaP και ξενομοσχευμάτων C4-2 αποκάλυψε ότι η ένταση της απεικόνισης ήταν εμφανώς υψηλότερη από την ένταση απεικόνισης επιτυγχάνεται με τα Λευκά ΚΟ σε επίπεδο κορυφής nanobubble. Στα ΜΚΝ45 ξενομοσχεύματα, τα αποτελέσματα απεικόνισης των στοχευμένων ΕΤΣ και Λευκά ΚΟ ήταν συγκρίσιμες σε επίπεδο κορυφής nanobubble. Απ ‘όλα, μπλε περιοχές αντιπροσωπεύουν τις exnografts, ενώ κόκκινες και κίτρινες περιοχές αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα τις διαφορετικές περιοχές απεικόνισης σε LNCaP και C4-2 exnografts.

Η

Συζήτηση

Επί του παρόντος, του προστάτη καρκίνος είναι κοινή και θέτει σε κίνδυνο σοβαρά την υγεία των ηλικιωμένων ανδρών, που συχνά οδηγεί στο θάνατο [19,20]. Αν και διορθικό υπερηχογράφημα έχει γίνει μια ρουτίνα εργαλείο εξέτασης που παίζει σημαντικό ρόλο στην ασθένεια βιοψίας, παρακολούθηση και θεραπεία, κλινικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι αυτή η διαδικασία περιορίζεται από ανεπαρκή ευαισθησία και ειδικότητα [21-23]. Το αναδυόμενο τομέα της απεικόνισης μοριακών υπερήχων ενσωματώνει υπερηχογράφημα, μοριακή βιολογία και άλλους κλάδους και έτσι εισάγει μια νέα λεωφόρο, με την οποία για τη διάγνωση και τη θεραπεία όγκων? παρέχει επίσης τη δυνατότητα λήψης ειδικών απεικόνισης του καρκίνου του προστάτη σε μοριακό επίπεδο και τα αντίστοιχα έγκαιρη διάγνωση [24]. Επί του παρόντος, η κατασκευή και το σχεδιασμό των καρκίνο του προστάτη στοχευμένες μικροφυσαλίδες έχουν ως επί το πλείστον επικεντρώθηκε σε μόρια στόχους που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένης της στοχοθετημένης μικροφυσαλίδες που μεταφέρουν 2 (VEGFR2) αντισώματος αγγειακού τύπου υποδοχέα ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα. Ωστόσο, αυτό το σχέδιο έχει 2 προφανή μειονεκτήματα: i) οι ως επί το πλείστον micron κλίμακας παράγοντες αντίθεσης έχουν κακή διαπερατότητα και δεν μπορούν να ταξιδέψουν σε όλη αιμοφόρα αγγεία του όγκου να εισέλθουν τα ενδιάμεσα διάκενα και επομένως φυσαλίδες στόχευσης δεν μπορεί να προσκολληθεί απευθείας σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη? ii) Η μέθοδος αυτή έχει χαμηλή ειδικότητα που οδηγεί σε μια ανικανότητα να διεξαγάγουν ειδικές απεικόνισης του καρκίνου του προστάτη ιστό [25]. Η EPR προσπάθεια των όγκων καθιστά θεωρητικά δυνατή η χρήση nanobubbles στη μοριακή απεικόνιση των εξωαγγειακή κύτταρα της μήτρας και του παρεγχύματος του όγκου του όγκου. Προηγουμένως, με τη χρήση φωτός και μικροσκοπία ηλεκτρονίων, αποδείξαμε ότι nanobubbles με μέση διάμετρο 435.20 ± 60.53 nm θα μπορούσε να περάσει διαμέσου του αγγειακού ενδοθηλιακού κενά σε ξενομοσχεύματα, παρέχοντας έτσι μια πειραματική βάση επί της οποίας θα επιτευχθεί στοχευμένη απεικόνιση όγκων εξωαγγειακή δομών [26]. Εν τω μεταξύ, η μέθοδος αυτή λαμβάνει επίσης την πλήρη αξιοποίηση του μερικά από τα χαρακτηριστικά της nanobubbles, όπως η σχετικά μεγάλη περιοχή επιφάνειας, ισχυρή ικανότητα συγκόλλησης και μακράς διαρκείας απεικόνισης

in vivo

.

PSMA είναι μια προστάτη καρκίνος βιοδεικτών με υψηλότερη ειδικότητα και ευαισθησία σε σχέση με άλλα παρόμοια μόρια. PSMA είναι ιδιαιτέρως υψηλή έκφραση σε ορμονοάντοχου καρκίνοι του προστάτη και οι μεταστάσεις του καρκίνου του προστάτη [27]. Επιπροσθέτως, η εξωκυτταρική περιοχή του PSMA, η οποία περιλαμβάνει 707 αμινοξέα, μπορεί να φιλοξενήσει πολλαπλά αντιγονικά επιτόπια. Ως εκ τούτου, PSMA έχει γίνει εστίαση της έρευνας σε σχέση με τις θεραπείες του όγκου του ανοσοποιητικού στόχευση και απεικόνιση μοριακών όγκων [28,29]. Sanna

et al

. συζευγμένο την ουρία που βασίζεται αναστολέα PSMA DCL με τη συνιστώσα κελύφους μικροφυσαλίδων πολυ (γαλακτικό-συν-γλυκολικό οξύ-πολυαιθυλενογλυκόλη (PLGA-PEG), δημιουργώντας έτσι ένα παράγοντα στόχο αντίθεσης υπερήχων που θα χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση δέσμευσης του προστάτη καρκινική κυτταρική

σε vitro

[30]. στην προηγούμενη μελέτη μας, το μονοκλωνικό αντίσωμα που εγκρίθηκε ήταν ανοσογόνο, το οποίο, σε συνδυασμό με τα μεγάλα μοριακά βάρη των συμπλοκών αντισώματος-paticle, οδήγησαν σε φτωχή διείσδυση του ιστού. Κατά συνέπεια, μετά από φλεβική χορήγηση, η συγκέντρωση στην στοχευμένη περιοχή ήταν χαμηλή. Αυτό το πρόβλημα περιορίζεται σοβαρά τη μεγαλύτερη κλινική εφαρμογή των μικροφυσαλίδων για στοχευμένες διαγνωστικές και απεικονιστικές λεπτομέρειες. Εναλλακτικά, τα ειδικά πεπτίδια μικρού μορίου που χρησιμοποιείται συχνά σε μελέτες μοριακής απεικόνισης. Αν και αυτές οι ενώσεις συντίθενται εύκολα και διαθέτουν χαμηλού μοριακού βάρους , τα υψηλά επίπεδα της διείσδυσης ιστού και χαμηλή ανοσογονικότητα, μπορούν επίσης να παρουσιάζουν προβλήματα όπως μικρό χρόνο ημίσειας ζωής (πιθανή ευαισθησία στη υδρόλυση και η νεφρική κάθαρση) και πτητικά συγγένειες, οι οποίες βλάπτουν σημαντικά τη σταθερότητα του μικρού πεπτιδίου που φέρουν στοχευμένες nanobubbles. Σε αντίθεση, nanobodies είναι εξαιρετικά σταθερό και παρουσιάζουν υψηλές συγγένειες αντιγόνου. Επιπλέον, έχουν πολύ χαμηλή ανοσογονικότητα, όπως αποδεικνύεται από τα πειραματικά αποτελέσματα σε ζώα στα οποία δεν χυμική ή κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις ανιχνεύθηκαν μετά από επαναλαμβανόμενη χορήγηση [31]. Ως εκ τούτου, οι διάφορες ιδιότητες της nanobodies έδωσαν πειστικά στοιχεία σχετικά με τη σκοπιμότητα της στόχευσης και συγκέντρωση nanobubbles μέσα στους ιστούς-στόχους

in vivo

. Παρά το γεγονός ότι nanobodies έχουν φέρεται να εφαρμοστεί σε μελέτες μοριακής απεικόνισης, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων εφαρμογών μοριακής πυρηνικής ιατρικής [32-34], η εφαρμογή αυτής της τεχνολογίας στον τομέα της υπερηχογραφίας έχει περιοριστεί σε μικροφυσαλίδες υπερήχων [35]? στη γνώση μας, ελάχιστες έρευνες σχετικά με nanobody-επισημασμένο nanobubbles έχουν αναφερθεί σε αυτόν τον τομέα.

Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα βιοτίνης-αβιδίνης να ενσωματώσει τα πλεονεκτήματα της nanobubbles και nanobody με τη δημιουργία nanobubbles που έτρεφε PSMA nanobody.