Αφηρημένο

Παρά μονοστρωματικές καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται ευρέως για την ανάπτυξη του καρκίνου του φαρμάκου και δοκιμών, 2D κουλτούρες τείνουν να είναι υπερευαίσθητοι στην χημειοθεραπεία και είναι σχετικά φτωχή προγνωστικοί από το αν ένα φάρμακο θα παρέχει κλινικό όφελος. Ενώ γενικά πιο περίπλοκη, τρία συστήματα διαστάσεων (3D) πολιτισμός συχνά καλύτερα Ανακεφαλαιώνοντας αληθινή αρχιτεκτονική του καρκίνου και παρέχει μια πιο ακριβή απάντηση ναρκωτικών. Ως ένα βήμα προς την κατεύθυνση λήψης 3D πολιτισμών καρκίνο πιο προσιτό, έχουμε αναπτύξει μια πλατφόρμα μικροπλάκα και το πρωτόκολλο τροποποίησης επιφάνειας για να επιτρέψει υψηλή παραγωγή απόδοση του 3D αδρανών καρκίνου. Εδώ έχουμε χρησιμοποιήσει αυτό το νέο σύστημα για τον χαρακτηρισμό μικροσυσσωματώματα καρκίνου του προστάτη κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και κινητική ανάπτυξη και την ευαισθησία των ναρκωτικών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι βιώσιμα σε αυτό το σύστημα, ωστόσο, ορισμένα μη καρκινικό κύτταρο προστάτη γραμμές δεν είναι. Το σύστημα αυτό μας επιτρέπει να ελέγχουμε συνεχώς για την παρουσία ή απουσία ενός αποπτωτικού πυρήνα στα καρκινικά μικροσυσσωματώματα 3D. Παρόμοια με ιστούς όγκου, τα 3D μικροσυσσωματώματα εμφανίζουν φτωχή πολικότητα. Κριτικά η απάντηση του 3D μικροσυσσωματώματα με το χημειοθεραπευτικό φάρμακο, docetaxel, είναι πιο συνεπής με το

in vivo

αποτελέσματα από τις αντίστοιχες 2D ελέγχους. Σωρευτικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτά τα μικροσυσσωματώματα καρκίνο του προστάτη ανακεφαλαίωση καλύτερα τη μορφολογία των όγκων του προστάτη σε σύγκριση με 2D και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των ναρκωτικών υψηλής απόδοσης

Παράθεση:. Επιμελητήρια KF, Mosaad EMO, Russell PJ, Clements JA , Doran MR (2014) 3D καλλιέργειες των κυττάρων καρκίνου του προστάτη καλλιεργηθούν σε Novel High-Throughput Culture πλατφόρμα είναι πιο ανθεκτικά σε χημειοθεραπευτικά σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργούνται σε μονόφυλλο. PLoS ONE 9 (11): e111029. doi: 10.1371 /journal.pone.0111029

Συντάκτης: Wendy J. Χους, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 26 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Chambers et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. MRD χρηματοδοτείται από Movember New Concept Grant (NCG 3212) που χορηγούνται μέσω του προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου του Προγράμματος Έρευνας της Αυστραλίας (http: //www. prostate.org.au). JAC υποστηρίζεται από ένα Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας Principal Research Fellowship (https://www.nhmrc.gov.au). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τρισδιάστατο (3D) κυτταρικής καλλιέργειας υπαγορεύεται από την ανάγκη για τη διεξαγωγή πειραμάτων που ανακεφαλαιώνουν καλύτερα το φυσιολογικό μικροπεριβάλλον. Συμβατικά δύο διαστάσεων καλλιέργειες (2D) κύτταρο συχνά αποτυγχάνουν να μιμούνται τις κυτταρικές λειτουργίες και μονοπάτια σηματοδότησης που υπάρχουν στο ιστό. Συνεπώς κυτταρικές καλλιέργειες 2D μπορεί να οδηγήσει σε λοξή και περιορισμένα δεδομένα [1], [2]. Microarray προφίλ του 2D έναντι 3D καλλιέργειες έδειξε ότι το 50% των γονιδίων μεταβολή στην έκφραση κατόπιν 3D καλλιέργεια [3]. Ορισμένες από αυτές τις διαφορές μπορούν να αποδοθούν σε διαφορές στη μηχανική ένταση της μήτρας. Για παράδειγμα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 2D σε ιστοκαλλιέργεια πλαστικό εμπειρία αυξημένα τάση εφελκυσμού, ένα εκατομμύριο φορές μεγαλύτερη από εκείνη του μαλακού ιστού [4], και αυτό είναι γνωστό να μεταβάλει κυτταρική φυσιολογία [5]. Τεχνητά τάσεις υψηλής αντοχής μπορεί να επηρεάσει βαθιά κυτταρική μορφολογία, διευθέτηση κυτταροσκελετού, προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και μετανάστευση. 3D-καλλιέργειες καλύτερα μιμούνται φυσικό ιστό μηχανικές καταπονήσεις και έτσι παρέχουν ένα πιο αντιπροσωπευτικό παθοφυσιολογική κατάσταση από τη χρήση συμβατικών πλακιδίων καλλιέργειας ιστού [6], [7]. Αυτή η σχετική επίδραση είναι εμφανής κατά τη διάρκεια του

in vitro

δοκιμές χημειοθεραπεία, όπου 2D πολιτισμοί είναι συνήθως υπερευαισθησίας σε φάρμακα, ενώ 3D ευαισθησία κουλτούρα των ναρκωτικών πιο συχνά παραλληλίζεται με το αντίστοιχο

in vivo

σενάριο [8], [9 ].

Παρά το γεγονός ότι το 3D-κουλτούρες λειτουργούν ως πιο ισχυρή

in vitro

μοντέλα δοκιμή φάρμακο για τον καρκίνο, τα περισσότερα εργαστήρια εξακολουθούν να βασίζονται σε 2D πολιτισμούς ως κύριο εργαλείο τους. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην αύξηση της εργασίας και του κόστους που συνδέεται με την ίδρυση 3D μοντέλα και επειδή δεν υπάρχει συμφωνία σχετικά με ένα ενιαίο πρότυπο μοντέλο που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε όλο το πεδίο. Διάφοροι τύποι συστημάτων καλλιέργειας 3D, με διαφορετικά πλεονεκτήματα και τις παγίδες, απασχολούνται σήμερα. Φυσικό εξωκυττάρια μήτρα (ECM) πηκτώματα όπως τύπου Ι κολλαγόνου και λαμινίνη πλούσια σε Matrigel μπορεί να παρέχει τις μηχανικές και χημικές συνθήματα για μορφογένεση ιστού, ωστόσο, περιέχουν μια σειρά από απροσδιόριστους παράγοντες ανάπτυξης και τις πρωτεΐνες ECM που διαφέρουν μεταξύ των παρτίδων την αλλαγή του μηχανικές ιδιότητες του πηκτώματος. Τα συνθετικά γέλες αποτελούνται από συνθετικά πολυμερή πεπτιδίου-functionalized προσαρμοσμένα ώστε να μιμείται συγκεκριμένες ιδιότητες ECM και ως εκ τούτου να προσφέρει μια εναλλακτική λύση [10]. Ωστόσο, τα συστήματα που βασίζονται ικρίωμα και τζελ μπορεί να είναι ακριβό για να αναβαθμίσουν σε μεγάλες μελέτες υψηλής απόδοσης και είναι δύσκολο να αναλυθούν. Τεχνικές όπως η υγρή-άγαρ επικάλυψης και polyHEMA προσφέρουν μια φθηνότερη εναλλακτική λύση, ωστόσο, το μέγεθος και την ομοιομορφία των μεγεθών δεν μπορεί να είναι αυστηρά οργανωμένη και αυτό θα μεταφραστεί σε διαφορετικά ποσοστά διείσδυσης του φαρμάκου [11], [12]. Έχουμε προσαρμοστεί ένα σύστημα μικροπλάκα υψηλής απόδοσης για την καλλιέργεια κυττάρων του προστάτη ως μικροσυσσωματώματα ενός ελεγχόμενου μεγέθους. Το σύστημα αυτό προσφέρει ένα πλεονέκτημα σε σχέση με άλλα συστήματα 3D πολιτισμού στο ότι οι διαστάσεις των μικροσυσσωματωμάτων μπορεί να ρυθμίζεται αυστηρά και συσσωματώματα ενός ορισμένου μεγέθους που παράγεται από μια κλιμακούμενη φύση για τον έλεγχο των ναρκωτικών υψηλής απόδοσης. Στο παρόν δείχνουμε ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα αυτο-συναρμολόγηση σε αδρανή υλικά που ανταποκρίνονται σε φαρμακευτική αγωγή κατά τρόπο σύμφωνο με την αναμενόμενη

in vivo

ευαισθησία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κατασκευή και πολυ-διαστρωμάτωση των μικροκυψελίδες

Η κατασκευή των συστοιχιών μικροπλάκα πολυδιμεθυλοσιλοξανίου (PDMS) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Σε αυτήν την περίπτωση χρησιμοποιήσαμε μαλακά λιθογραφίας για να σχηματίσουν συστοιχίες 360 × 360 × 180 μm μικροφρεάτια ή 800 × 800 × 800 μm επί PDMS δίσκους, τα οποία στη συνέχεια τοποθετηθεί στα φρεάτια μιας πλάκας ιστοκαλλιέργειας 48 φρεατίων. Εν συντομία, μια γκοφρέτα σίλικα χρησιμοποιήθηκε για να σχηματίσει ένα καλούπι PDMS, από το οποίο δημιουργήθηκε ένας αντίστροφος καλούπι πολυστυρένιο. Η επιφάνεια μικροφρεατίων PDMS δημιουργήθηκε σε φύλλα χρησιμοποιώντας την τελευταία καλούπι και το φύλλο τρυπήθηκαν σε δίσκους (Σχήμα 1Α). Διατρήσεις διαφορετικών μεγεθών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ένθετα για κάθε μεγέθους πλαστικό δοχείο καλλιέργειας ιστού. Χρησιμοποιώντας την τεχνική αυτή χιλιάδες μικροβυθίσματα μπορεί να παραχθεί

μαζικά

(600 μικροσυσσωματώματα /cm

2 ή 150 μικροσυσσωματώματα /cm

2 για τα μικρότερα και μεγαλύτερα μικροφρεάτια, αντίστοιχα). Η επιφάνεια PDMS ήταν είτε επικαλυμμένα με διάλυμα 5% pluronic /φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) ή πολυστρωματικό με χιτοζάνη (CHI) και υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), οι οποίες εμποδίζουν την προσκόλληση των κυττάρων στην επιφάνεια του PDMS. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13] πολλαπλών στρωμάτων ξεκινάει με ένα ηλεκτροθετικό πολυ-λυσίνη στρώμα για να βοηθήσουν περαιτέρω την προσκόλληση στρώμα και πέντε στρώματα του CHI και ΗΑ επωάζονται διαδοχικά για διαστήματα 15 λεπτών. Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι το ανώτερο προσκόλληση μπλοκ κυτταρικό στρώμα ΗΑ επί PDMS μικροκυψελίδες και ότι αυτή προάγει τη συσσωμάτωση των κυττάρων [14]. Μετά την επικάλυψη τα ένθετα αποστειρώθηκαν σε 70% αιθανόλη και πλύθηκε όλη νύκτα με PBS έτοιμο προς χρήση.

(α) ένα καλούπι πολυστυρολίου [13], χρησιμοποιήθηκε για χύτευση φύλλων PDMS με ένα μικρο-διαμορφωμένη επιφάνεια. Οι δίσκοι αποκόπηκαν του φύλλου PDMS να σχηματίσει ένθετα για πλάκες με πολλές εκβαθύνσεις, και αυτές οι επιφάνειες επικαλύφθηκαν είτε με 5% pluronic ή πολυστρωματικό με CHI και ΗΑ. LNCaP κύτταρα (50.000) σπάρθηκαν επί είτε (Β) pluronic επικαλυμμένου (3D pluronic) ή (Γ) πολυεπίπεδη (3D multi) μικροκυψελίδες και το μπλε δοκιμασία Alamar χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του μεταβολισμού σε 3D έναντι κυττάρων 2D. Και οι δύο επικαλύψεις που παράγονται βιώσιμα συσσωματώματα που αυξήθηκαν στο μεταβολισμό επί 7 ημέρες σε ένα συγκρίσιμο ποσοστό σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια 2D. Τρεις τεχνικές επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν ανά χρονικό σημείο.

Η

Cells και τον πολιτισμό μικροσυσσωματώσεων προστάτη

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, RWPE-2 [15] και LNCaP [16], και μη καρκινικά κύτταρα γραμμής RWPE-1 [15], ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640, 5% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Gibco) συν 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (P /S) (Gibco) σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Για τα μεσαία μελέτες βελτιστοποίησης, κερατινοκυττάρων-SFM, 2% εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς (ΒΡΕ), καθώς και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) συμπλήρωμα (Gibco) χρησιμοποιήθηκε επίσης. Είτε 50.000 ή 100.000 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας. Μικροσυσσωματώματα σχηματίστηκαν μέσω αναγκάστηκαν συνάθροιση? οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά για να διευκολύνει σύμπηξη των κυττάρων μέσα στις μικροκυψελίδες. Στην αναγκαστική διαδικασία συσσωμάτωσης, τα κύτταρα εναιωρούνται στο μέσο είναι ομοιόμορφα σε σφαιρίδια εντός της συστοιχίας των μικροφρεάτια στη βάση του πηγαδιού. Μέσο που ανταλλάσσονται κατά τις ημέρες 3, 6, 8, 10, και 13. Κατά τη διάρκεια του μέσου ανταλλαγής, λήφθηκε μέριμνα να μην αναρρόφηση τα μικροσυσσωματώματα. Μέσο προστέθηκε και αφαιρείται από το ίδιο σημείο στο πηγάδι κατά την διάρκεια κάθε ανταλλαγής. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. εικόνες αντίθεσης φάσης ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse-Ti ανεστραμμένο μικροσκόπιο και η κεντρική διάμετρος της κάθε μικροσυσσωματώσεων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image-J (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Ένα ελάχιστο 50 μικροσυσσωματωμάτων μετρήθηκαν ανά χρονικό σημείο.

Τομές, ανοσοφθορισμό και συνεστιακή απεικόνιση

μικροσυσσωματώματα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 30 λεπτά και είτε ενσωματωμένα σε Tissue-Tek βέλτιστη ένωση θερμοκρασίας κοπής (OCT) (VWR International) για την κοπή ή ανοσοχρωματίστηκε άμεσα. Τα δείγματα διαπερατά με 0,5% Triton-X 100 για 20 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για Ε-καδερίνης (Invitrogen, AB_86564), β-κατενίνης (Santa Cruz-, AB_626807) (αραιωμένο 1:200), α6-ιντεγκρίνης (Millipore , AB_10834933), η λαμινίνη-5 (Abcam, AB_2133782), διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Σηματοδότηση Technology, AB_331440) (αραιωμένο 1:100) και Ki67 (Abcam, AB_443209) (1:400) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Το αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με Alexa-488 (Invitrogen) προστέθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου? 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων και ροδαμίνη Φαλλοϊδίνη (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση για Ρ-ακτίνη. Τα μικροσυσσωματώματα ήταν τοποθετημένα χρησιμοποιώντας Παρατείνει χρυσό (Invitrogen) και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας μια Leica TCS SP5 ομοεστιακό μικροσκόπιο ή μια Nikon Eclipse-Ti ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

Live /νεκρά χρώση

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μg /mL διοξεική φλουορεσκεϊνη (FDA) (Sigma-Aldrich) για 15 λεπτά και 20 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma-Aldrich) για 2 λεπτά στους 37 ° C για τη χρώση ζώντων και νεκρών κυττάρων, αντίστοιχα. FDA είναι ένα κύτταρο-διαπερατό υπόστρωμα εστεράσης που μετρά τόσο ενζυματική δραστηριότητα και την ακεραιότητα των κυττάρων-μεμβράνης. ιωδιούχο προπίδιο δεσμεύεται με DNA, αλλά είναι μόνο σε θέση να διεισδύσουν στην παραβιαστεί μεμβράνες των νεκρών ή θνήσκοντα κύτταρα. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Leica TCS SP5 συνεστιακό μικροσκόπιο και το ποσοστό εμβαδού των νεκρών κυττάρων ανά μικροσυσσωματώσεων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image-J (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Ένα ελάχιστο των 10 μικροσυσσωματωμάτων αναλύθηκαν ανά χρονικό σημείο.

Alamar μπλε και WST-1 προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

Για να διαπιστωθεί το μεταβολισμό των κυττάρων πάνω από 14 ημέρες ανάπτυξης μικροσυσσωματώσεων, το μπλε Alamar (Invitrogen) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τις ημέρες 1, 3, 7 και 14 προστέθηκε ένας όγκος του 3% του Alamar blue ανά φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα και 100 μΙ μέσου μεταφέρθηκαν σε ένα 96-φρεατίων μαύρη πλάκα. Φθορισμού (διέγερση 544 nm, εκπομπή 590 nm) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός (BMG Omega, BMG LABTECH). WST-1 (Roche) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας των κυττάρων RWPE-1 και RWPE-2 καλλιεργούνται σε διαφορετικούς τύπους μέσου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες ακολουθούμενη από την προσθήκη 10% WST-1 για 1 ώρα πριν από την ανάγνωση της απορρόφησης στα 450 nm σε ένα Benchmark Plus πλάκα αναγνώστη Bio-Rad.

δοκιμασία PicoGreen.

Η δοκιμασία PicoGreen (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο των βιώσιμων κυττάρων με ανίχνευση σύνολο δίκλωνο DNA, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, το DNA εκχυλίζεται με 0,5 mg /mL πρωτεϊνάσης Κ (Roche) φωσφορικού ρυθμιστικού EDTA (ΡΒΕ). Τα δείγματα αραιώθηκαν (1:10) σε διάλυμα RNaseA (Invitrogen) και επωάζονται με το αντιδραστήριο δοκιμασίας PicoGreen πριν αναγνώστηκαν σε αναγνώστη πλάκας φθορισμού (BMG Omega, BMG LABTECH? Διέγερσης 485 nm εκπομπή 520 nm).

Drug θεραπείες

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε 48 φρεατίων πλάκες με ή χωρίς ένθετα PDMS και καλλιεργήθηκαν για δύο ημέρες πριν από τη θεραπεία με αραιώσεις 0.01-1000 ηΜ docetaxel (Sigma-Aldrich) για 72 ώρες, οι οποίες σε σύγκριση με ένας έλεγχος όχημα DMSO. Το πρωτόκολλο για Alamar blue προσαρμόστηκε για να διαβάσει εντός της πλάκας μέσα από τις σαφείς PDMS εισαγάγετε χρησιμοποιώντας 10% Alamar blue και επώαση για 2 ώρες. Μία σειριακή αραίωση των κυττάρων έδειξε ότι ο φθορισμός ήταν σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων (R-τετράγωνο τιμή 0,99? Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η IC50 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο CalcuSyn Στατιστικής (Biosoft, UK), όπως έχει ήδη αναφερθεί [17].

3D καλλιέργεια των κυττάρων RWPE-1 σε Matrigel βασικής μεμβράνης

μήτρα

RWPE-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Matrigel (BD Biosciences) για 7 ημέρες για την αξιολόγηση της πολικότητας. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως [18], [19]? Εν συντομία, RWPE-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε είτε 1% ή 8% Matrigel παρουσία μέσου κερατινοκυττάρων-SFM συμπληρωμένο με 2% ΒΡΕ (Gibco). Η πολικότητα των κυττάρων που αναπτύσσονται σε Matrigel συν ή μείον μικροπλάκα συγκρίθηκε ένθετο.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Το σύστημα μικροπλάκα PDMS παράγει καρκίνο του προστάτη μικροσυσσωματώματα της ομοιόμορφης και ελεγχόμενο μέγεθος

Η σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να παραχθεί ένα σύστημα PDMS μικροσυσσωματώσεων υψηλής απόδοσης για τον έλεγχο των θεραπευτικών φαρμάκων για τον καρκίνο του προστάτη. Αρχικά, επιδιώξαμε να χαρακτηρίσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στο σύστημα μικροκοιλότητα και να συγκρίνουν τη μορφολογία, και το ρυθμό ανάπτυξης σε φυσιολογικά αντίστοιχά κύτταρο. PDMS είναι ένα αδρανές πολυμερές που χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο σε εφαρμογές καλλιέργειας ιστού [20]. Είναι κατάλληλο επειδή είναι φθηνή και συμβατό με την ταχεία μέθοδο κατασκευής, όπως μαλακό λιθογραφία [21]. Οι PDMS επιφάνειες έχουν χυτευθεί και να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές καλλιέργειας για τον έλεγχο του σχήματος και του μεγέθους των μεμονωμένων κυττάρων [22], και συγκεκριμένα μικροφρεάτια που σχηματίζονται από PDMS έχουν χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή κυτταρικών συσσωματωμάτων για να ενισχύσει τη διαφοροποίηση των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων σε νευρωνικά κύτταρα [23 ], [24] και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων προς οστεοβλάστες ή χονδροκύτταρα [13], [24], [25]. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που καλλιέργεια κυττάρων του προστάτη σε ένα PDMS επιφάνεια μικροπλάκα να ελέγχεται συνολικό μέγεθος. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως 3D συσσωματώματα αυστηρά ελεγχόμενες διαστάσεις χρησιμοποιώντας ένα PDMS μικρο-επιφάνεια που αποτελείται από 600 μικρο-φρεάτια /cm

2, καθένα από τα οποία 360 μm από 360 μm (Σχήμα 1Α). Η επιφάνεια μικροκοιλότητα τροποποιήθηκε με είτε 5% pluronic ή πολυστρωματική (Σχήματα 1 Β και C). Και οι δύο επικαλύψεις επιφάνειας μπλοκάρει την προσκόλληση στην κυτταρική επιφάνεια και προωθείται σχηματισμό μικροσυσσωματωμάτων. Αδρανή που σχηματίζονται από κύτταρα LNCaP παρέμειναν βιώσιμα και αυξημένο στο μεταβολισμό επί 7 ημέρες σε τιμές συγκρίσιμες με κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια 2D (Σχήματα 1 Β και C). Σε μια μέρα, μετά από 50.000 κύτταρα ήταν σπαρμένα, κύτταρα LNCaP που σχηματίζεται ομοιόμορφη μικροσυσσωματωμάτων διαμέτρου 70 μm (Σχήμα 2Α). Πάνω από μια κουλτούρα 7 ημέρες τα αδρανή υλικά ομοιόμορφα μεγάλωσε για να είναι διαμέτρου 120 μm. Αυτό φαίνεται να είναι μια περιοριστική διάμετρο και το μέγεθος δεν αυξήσει σημαντικά με περαιτέρω καλλιέργεια (Σχήμα 2Α). κύτταρα RWPE-2 σχηματίζονται σημαντικά μικρότερα συσσωματώματα των 60 μm σε μία ημέρα, και οι μικροσυσσωματώματα δεν αυξήθηκε σε διάμετρο πάνω από 14 ημέρες (Εικόνα 2Α). Η διάμετρος των κυττάρων RWPE-1 δεν μετρήθηκε όπως οι συσσωματώσεις ήταν ασταθής, διαχωρίζει σε χαλαρά συσσωματώματα κυττάρων μετά από τρεις ημέρες σε καλλιέργεια. RWPE-1 και RWPE-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 5% FBS + PS αντί των συνιστώμενων μέσου ανάπτυξης τους, κερατινοκυττάρου-SFM, προκειμένου να βελτιστοποιηθεί ο σχηματισμός μικροσυσσωματώσεων. Στην τελευταία μέσον τα κύτταρα RWPE-1 και RWPE-2 σχηματίζονται διεσπαρμένα συστάδες κυττάρων με ένα υψηλό ποσοστό των νεκρών κυττάρων μετά από 7 ημέρες (Σχήμα S1A). Μεταβολή του μέσου ανάπτυξης δεν είχε σημαντικές αρνητικές επιπτώσεις στο μεταβολισμό των κυττάρων σε σύγκριση με τη συνιστώμενη μέσο (Σχήμα S1B). Ως εκ τούτου, RPMI 1640, 5% FBS + P /S χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περαιτέρω πειραματισμό

(Α) Οι διάμετροι των LNCaP και RWPE-2 συσσωματώματα κυττάρων μετρήθηκαν πάνω από 14 ημέρες.? μέση τιμή +/- SD, η = 50 Από * ρ & lt? 0,05, ένα αντιστοιχισμένο φοιτητές t-test χρησιμοποιήθηκε για να δείξει σημαντικές διαφορές σε διάμετρο κατά την ημέρα 7 και 14. (Β) FDA λεκέδων /ΡΙ χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση βιώσιμα κύτταρα πράσινου και νεκρά κύτταρα ερυθρών τις ημέρες φαίνεται και το ποσοστό της έκτασης των νεκρών κυττάρων ανά μικροσυσσωματώσεων έχει ποσοτικοποιηθεί για να δείξει ότι τα κύτταρα του προστάτη μη-καρκίνου (RWPE-1) έχουν θάνατος μεγαλύτερο κυττάρου (ποσοστό κόκκινα εικονοστοιχεία) στα ένθετα μικροφρεατίων σε σύγκριση με τον προστάτη καρκινικά κύτταρα (LNCaP και RWPE-2)? μέση τιμή +/- SD, η = 10. ζεύγη Students t-test χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί σημασία * ρ & lt? 0.05. (Γ) Οι ομοεστιακή εικόνες και εικόνες αντίθεσης φάσης (Ημέρα 14 Φάση) δείχνουν ότι ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές γραμμές (RWPE-2 και LNCaP) αναπτύσσονται ως συμπαγής ομαλή μικροσυσσωματώματα μέχρι την ημέρα 14. Αντιθέτως, οι μη καρκινικά κύτταρα (RWPE-1) μορφή διασκορπισμένα χαλαρά συμπλέγματα που είναι μη βιώσιμο και χωρίς προσδιορίσιμο διάμετρο κατά την ημέρα 14. μπαρ κλίμακας είναι 100 μm.

η

καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι βιώσιμες στο σύστημα μικροκοιλότητα PDMS και έχουν χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σχέση με μονοστιβάδα

Η βιωσιμότητα των μικροσυσσωματωμάτων προστάτη εκτιμήθηκε επί 14 ημέρες, με τον υπολογισμό του ποσοστού των νεκρών κυττάρων σε σχέση με τα ζωντανά κύτταρα (Σχήμα 2Β) από FDA /ΡΙ χρωματίστηκαν μικροσυσσωματώσεων συνεστιακή εικόνες (Σχήμα 2C). Τα αποτελέσματα βαφής FDA δείχνουν ότι οι τύποι κυττάρων καρκίνου του προστάτη, LNCaP και RWPE-2, έχουν μια άθικτη μεμβράνη των κυττάρων κατά 14 ημέρες. Σε αντίθεση, η μη-καρκινικές κυτταρική γραμμή, RWPE-1 δείχνει μια αναλογική αύξηση στην λύθηκαν κυτταρικές μεμβράνες άνω των 14 ημερών και να εμφανίσει χαλαρά οργάνωση (ημέρα 14 φάση). Αντίστοιχα, LNCaP μικροσυσσωματώματα επιδεικνύουν μία αύξηση στο μεταβολισμό επί 14 ημέρες (Σχήμα 3Α) και μια αύξηση στην περιεκτικότητα DNA (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, RWPE-2 μικροσυσσωματώματα δείχνουν μια σαφή μείωση του μεταβολισμού (Εικόνα 3C) και μια μείωση στην περιεκτικότητα DNA (Σχήμα 3D) παρά το ότι έχει ανέπαφες κυτταρικές μεμβράνες σύμφωνα με την χρώση FDA (Σχήμα 2Β). Ως εκ τούτου, τα κύτταρα RWPE-2 είναι πιθανό να είναι σε μια κατάσταση αδρανείς κύτταρο, χωρίς κυτταρική διαίρεση ή τον κυτταρικό θάνατο. Αυτό υποστηρίζεται από τα δεδομένα μικροσυσσωματώσεων μεγέθους, το οποίο δείχνει ότι RWPE-2 μικροσυσσωματώματα δεν αύξησε σημαντικά σε διάμετρο (Σχήμα 2Α). Για τους RWPE-2 δεδομένα κύτταρο 2D, υπήρχε μια ασθενής συσχετισμός μεταξύ των δοκιμασιών, παρά τη σαφή συσχέτιση μεταξύ τους προσδιορισμούς για τα δεδομένα 3D? σε 2D ο μεταβολισμός μειώθηκε μετά την ημέρα 3 (Εικόνα 3C), ωστόσο το περιεχόμενο DNA συνέχισε να αυξάνει μέχρι την ημέρα 14 (Σχήμα 3D). Αυτό δείχνει ότι τα κύτταρα ήταν ακόμη σε θέση να διαιρέσει και ως εκ τούτου δεν ήταν θρεπτικού πεινασμένα, αλλά δείχνει φτωχή συσχέτιση μεταξύ αυτών των δοκιμασιών, η οποία έχει τεκμηριωθεί προηγουμένως [26]. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα LNCaP PicoGreen έκανε συσχετίζονται καλά με τα Alamar blue μεταβολικά δεδομένα (Σχήμα 3Α και Β). Συνολικά, ο μεταβολισμός και ο πολλαπλασιασμός όλων των κυττάρων ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με το 3D μονοστιβάδας (σχήμα 3), η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες [9]. Το 2D επιφάνεια παρέχει ένα μεγάλο εμβαδόν επιφανείας για την προσκόλληση, που είναι ένα προαπαιτούμενο για την διαίρεση των κυττάρων επιτυχής δηλαδή τα εστιακά σημεία αγκύρωσης προσκόλληση παρέχονται για τα διαιρούμενα κύτταρα, τα οποία είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό [27]. Ωστόσο, αυτό δίνει μια ψευδή παράσταση του ρυθμού διαίρεσης σε έναν ιστό και το χαμηλότερο ποσοστό 3D αναπαραγωγής είναι περισσότερο ανάλογη με τα ποσοστά πολλαπλασιασμού σε όγκους.

Η βιωσιμότητα των LNCaP (Α και Β) και RWPE-2 (C και Δ) microaggreagtes έναντι του ίδιου αριθμού κυττάρων που καλλιεργούνται σε 2D αξιολογήθηκε μέσω Alamar blue (Α και C) και δοκιμασία PicoGreen (Β και D). μικροσυσσωματώματα LNCaP δείχνουν αύξηση στο μεταβολισμό πάνω από 14 ημέρες (Α) και μια αύξηση στην περιεκτικότητα DNA (Β). Ωστόσο, RWPE-2 μικροσυσσωματώματα δείχνουν μια μείωση του μεταβολισμού (C) και μια μείωση στην περιεκτικότητα του DNA (D). Η μέση +/- SD? n = 4. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα. * P & lt? 0,05, μια αντιστοιχισμένη μαθητές t-test χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η σημασία μεταξύ 2D και 3D

Η

κυτταρικές σειρές του προστάτη αυξηθεί ως μικροσυσσωματώματα εμφανίζουν κακή πολικότητα παρόμοιες με όγκους

μικροσυσσωματώματα ήταν. καθορίζεται σε ημέρες 7 και ανοσοχρώση για κορυφαίο (Ε-καδερίνης και β-κατενίνης) και βασικά (α6-ιντεγκρίνης και λαμινίνη-5) δείκτες 3D πολικότητας (Σχήμα 4). Αυτοί οι δείκτες επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα προηγούμενα η χρήση τους ως κορυφαία και βασική επιφανειακών δεικτών στα συστήματα 3D μήτρα [18], [28] – [30]. Από αυτά τα δεδομένα, είναι σαφές ότι όλα τα μικροσυσσωματώματα δεν διέθετε ένα κοίλο αυλό και δεν σχηματίζουν πολικές δομές, με λαμινίνη-5 που παρατηρείται μόνο σε μία θέση που αναμένεται για ένα πολικό συσσωμάτωμα, η οποία ήταν στην βασική επιφάνεια στην εξωτερική άκρη του ο μικροσυσσωματώσεων (Σχήμα 4 LM-5). Για να ελέγξετε ότι τα αντισώματα κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα επίσης ανοσοχρωματίστηκε για τους ίδιους δείκτες πολικότητα εργασίας και απεικονίστηκαν με τη χρήση συνεστιακής Ζ-τομή (Εικόνα S2). Όπως ήταν αναμενόμενο, η λαμινίνη 5 και α6-ιντεγκρίνης λεκιάζει την βασική επιφάνεια όλων των τύπων κυττάρων που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα, με κάποια κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα S2B μαύρα βέλη). και Ε-Cad και β-κατενίνης εκφράζονται κυρίως στο κύτταρο σε κύτταρο κόμβους (Σχήμα S2B λευκά βέλη). Οι πολικές 3D μικροσυσσωματώματα ή σφαιροειδή ορίζεται από μία ακραία επιφάνεια που περιβάλλει ένα κοίλο αυλό και βασική επιφάνεια που θα αποδίδουν στην περιβάλλουσα μήτρα [18]. Το σύστημα μικροφρεατίων στερείται μήτρας, πέρα ​​από οποιαδήποτε κυτταρική εκκρινόμενες πρωτεΐνες διαλυτές μήτρα και δεν υπάρχει ικρίωμα για προσκόλληση και ως εκ τούτου δεν υπάρχει σαφής βασική επιφάνεια. Ως εκ τούτου, είναι προβλέψιμο ότι οι μικροσυσσωματώματα στερούνται ένα κοίλο αυλό και έτσι ένα κορυφαία επιφάνεια και την ένταση μήτρα συμβάλλει στην οργάνωση των ιστών [31], ωστόσο κάποιος βαθμός οργάνωσης των κυττάρων exsists. Για παράδειγμα, LNCaP, RWPE-1 και 2 κύτταρα εκφράζουν λαμινίνη 5 στην εξωτερική συνολική επιφάνεια, αλλά δεν εκφράζουν α6-ιντεγκρίνης. Επιπλέον, η Ε-καντερίνη και β-κατενίνης βρέθηκαν εκφράζονται μεταξύ των κυτταρικών συμφύσεις των LNCaP και RWPE-2 μικροσυσσωματώματα (Σχήμα 4), αλλά δεν υπάρχει επιφάνεια του αυλού και ως εκ τούτου δεν υπάρχει καμία έκφραση αυτών των δεικτών σε μία ακραία επιφάνεια. Έτσι, τα κύτταρα είναι σε θέση να εκφράσουν αυτά τα φαινοτυπικών δεικτών αλλά απαιτούν άλλα συνθήματα, πιθανόν από μία εξωκυτταρική μήτρα ή περιβάλλοντα κύτταρα όπως θα είναι παρόντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου, για να σχηματιστεί οργανωμένη acini ιστό [32]. Αν και δεν υπάρχουν σαφείς διαφορές μεταξύ των γραμμών καρκίνου και μη καρκινικά κύτταρα, ο φαινότυπος που παρατηρείται είναι περισσότερο ενδεικτική της καρκινικών κυττάρων de διαχωριζόμενες που παρατηρείται σε καρκίνο του προστάτη υψηλής ποιότητας που δείχνει ότι η δοκιμασία είναι ακόμη κατάλληλη για υψηλής δοκιμή απόδοσης φαρμάκου του καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Ωστόσο, αυτό το σύστημα δεν είναι βιώσιμη για την καλλιέργεια των μη νεοπλασματικών κυτταρικών σειρών, λόγω της απουσίας του πλέγματος. Αλλά με την προσθήκη του Matrigel στο σύστημα μικροοπών PDMS, η κανονική κυτταρική σειρά προστάτη, RWPE-1, σχηματίζονται συσσωματώματα που εμφανίζεται πολικότητα (Σχήμα S3A και S3b). Με την προσθήκη του 8% Matrigel τα συσσωματώματα RWPE-1 εμφανίζεται πολικό οργανισμό με την βασική έκφραση του α6-ιντεγκρίνης (Σχήμα S3b) και αυτό πολικότητα διατηρήθηκε με 1% Matrigel (Σχήμα S3A). Ωστόσο, οι μικροσυσσωματώματα αναπτύχθηκαν σε PDMS ένθετα με Matrigel ήταν μεγαλύτερα σε σύγκριση με εκείνες που καλλιεργούνται σε ένθετα μόνο του (Σχήμα S3C) ή σε 8% Matrigel μόνο του (Σχήμα S3D). Ως εκ τούτου, η προσθήκη του Matrigel παρέχει μια μήτρα για την επαγωγή α6 ιντεγκρίνης πολικότητας, το οποίο χάνεται σε RWPE-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μόνος PDMS. Άλφα-6-ιντεγκρίνης έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικό για το σχηματισμό acinus σε κύτταρα RWPE-1 [33], από εκεί την έλλειψη α6-ιντεγκρίνης μπορεί να συμβάλλει στην κακή σχηματισμό μικροσυσσωματωμάτων που εμφανίζεται από την κανονική RWPE-1 κύτταρα.

μικροσυσσωματώματα σταθεροποιήθηκαν την ημέρα 7 και ανοσοχρώση για κορυφαίο και βασική δείκτες πολικότητα (πράσινο). Ε-καδερίνη (Ε-Cad) και β-κατενίνης χρησιμοποιήθηκαν ως κορυφαία δείκτες και τα βασικά δείκτες ήταν α6-ιντεγκρίνης (α6-ΙΝΤ) και λαμινίνη 5 (Ι_Μ5). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (ματζέντα) και της ράβδου κλίμακα είναι 100 μm.

Η

Το σύστημα μικροπλάκα PDMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο αποπτωτικά πυρήνα

κύτταρα

LNCaP καλλιεργούνται στο σύστημα μικροοπών ( 360 × 360 μm), τα οποία φθάνουν ένα μέγιστο μέγεθος των 120 μm δεν αποτελούν αποπτωτικό πυρήνα όπως προσδιορίζονται από διασπασμένης χρώση κασπάσης-3 την ημέρα 7 (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, αποπτωτικά πυρήνας μπορεί να ελέγχεται από την αύξηση του μεγέθους του μικρο-φρεατίων έως 800 μm και η αύξηση του αριθμού των κυττάρων σποράς σε 2000 κύτταρα ανά συσσωμάτωμα. Αυτό δημιούργησε συσσωματώματα ~ 300 μm σε διάμετρο επί 7 ημέρες με έναν κεντρικό πυρήνα από διασπασμένη κασπάση 3 χρώση (Σχήμα 5Β). Μια αποπτωτικών πυρήνας συνήθως παρατηρείται σε 3D καλλιέργειες μεγαλύτερα από 500 έως 600 μm διάμετρο [34] – [36], ωστόσο, έχουν αποπτωτική πυρήνες έχουν παρατηρηθεί ακόμα και σε συσσωματώματα κυττάρων LNCaP διαμέτρου 200 μm [37]. Η διακύμανση στις παρατηρήσεις αντανακλούν το γεγονός ότι η αποτελεσματική μεταφορά οξυγόνου είναι μια συνάρτηση πολλών μεταβλητών συμπεριλαμβανομένων συνολικός αριθμός κυτταρικής καλλιέργειας, και το ύψος του μέσου καθώς και αδρανών διάμετρος [38]. Στις μελέτες μας εμβολιάστηκαν τα μεγαλύτερα συσσωματώματα διαμέτρου με 6 φορές μεγαλύτερους αριθμούς κυττάρων από ό, τι τα μικρότερα συσσωματώματα, και λόγω του κυβικού σχέση στην εξίσωση ακτίνα όγκος (V = 4 /3πr

3) αυτό είχε ως αποτέλεσμα σε μόλις λιγότερο από ένα διπλασιασμό της συνολικής διαμέτρου (Σχήμα 5C). Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα έχουν προηγουμένως δειχθεί να συγκεντρωθεί στην περιφέρεια των αδρανών LNCaP 200 μm καλλιεργούνται χρησιμοποιώντας την τεχνική άγαρ υγρό επικάλυψης [36]. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε χρώση Κί67 να αποκαλύψει ότι πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα θα μπορούσε να βρεθεί ομοιόμορφα σε όλο το συσσωμάτωμα και ότι τα κύτταρα αυτά δεν συγκεντρώθηκαν σε μία οποιαδήποτε συγκεκριμένη περιοχή (Σχήμα 5D), ίσως λόγω της απουσίας της βασικής επιφάνειας που παρέχεται από μια επιφάνεια μήτρας . Ως εκ τούτου, έχουμε αποδείξει ότι μπορούμε να ελέγξουμε για αποπτωτική πυρήνα χρησιμοποιώντας διαφορετικού μεγέθους μικροκυψελίδες και ότι ο πολλαπλασιασμός είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη σε όλη την μικροσυσσωματώματα

(Α) Διασπασμένη κασπάση 3. (CASP3? Πράσινο), ένα δείκτη απόπτωσης, ήταν χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση τμημάτων του RWPE-1, RWPE-2 και μικροσυσσωματώματα LNCaP. (Β) Λόγω της απουσίας της διασπασμένης κασπάσης-3 στα μικρά συσσωματώματα LNCaP, μία μεγάλη μικροπλάκα (800 μm × 800 μm × 800 μm) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μεγάλων μικροσυσσωματώματα LNCaP με αποπτωτικό πυρήνα (CASP3 της LGE). (Γ) Η διάμετρος των μικροσυσσωματωμάτων LNCaP (ΟΕΙΜ) συγκρίθηκε με μικροσυσσωματώματα LNCaP που αναπτύσσονται σε μεγάλες μικροβυθίσματα (της LGE). Ένα ελάχιστο των 50 αδρανών υλικών μετρήθηκαν ανά συνθήκη. (D) Ki67 (πράσινο) χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη χρώση πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα εντός της μεγάλης LNCaP συσσωμάτωμα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (ματζέντα)? κλίμακα bar είναι 100 μm.

Η

Πολιτισμός κυττάρων καρκίνου του προστάτη, όπως 3D μικροσυσσωματωμάτων αυξάνει την αντίσταση των ναρκωτικών, η οποία αποδίδεται σε διαφορές στον πολλαπλασιασμό

LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 2D ή τα μικροβυθίσματα PDMS για 2 ημέρες πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Έως 1000 ηΜ docetaxel προστέθηκε και σύγκριση με ένα μάρτυρα DMSO οχήματος. Docetaxel χρησιμοποιήθηκε ως αντιπροσωπευτικό φάρμακο του καρκίνου σε αυτή τη μελέτη λόγω της ρουτίνας χρήση της στην θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [39]. Εμποδίζει μιτωτική συναρμολόγηση ατράκτου και μιτωτική κυτταρική διαίρεση, οδηγώντας σε απόπτωση, μειώνοντας την ποσότητα της ελεύθερης τουμπουλίνης που απαιτείται για τον σχηματισμό μικροσωληνίσκων [39]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D ήταν πιο ανθεκτικά σε όλες τις δόσεις της docetaxel από εκείνες που καλλιεργήθηκαν σε 2D μετά από 48 ώρες (Σχήμα 6Α). Στις 72 ώρες διαφορές παρατηρήθηκαν μόνο σε υψηλές δόσεις φαρμάκου 10 και 100 ηΜ docetaxel (Σχήμα 6Β). Με ένα μεγαλύτερο χρόνο επώασης φαρμάκου η IC50 αυξήθηκαν για 2D και 3D. Για παράδειγμα σε 2D σε 48 ώρες η IC50 ήταν 11 ηΜ και αυτό αυξήθηκε σε 51,3 ηΜ επί 72 ώρες. Σε 3D το IC50 ήταν εξαιρετικά υψηλή υποδεικνύοντας ότι οι 3D μικροσυσσωματώματα είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στη docetaxel, το υπολογιζόμενο IC50 στις 48 ώρες ήταν 4.3 × 10

8 και 426 nM σε 72 ώρες. Με αυξανόμενες δόσεις docetaxel τα κύτταρα σε 3D διατηρούνται συσσωμάτωση τους, αλλά έγινε πιο χαλαρά συνδεδεμένες, αλλά σε 2D τα κύτταρα αποσπώνται (Σχήμα 6C). Έχει αναφερθεί για διάφορους τύπους καρκίνου που 3D καλλιέργειες παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά [9], [40] και ότι σε 3D, τα κύτταρα LNCaP είναι πιο ανθεκτικά στο docetaxel από τους ομολόγους μονοστοιβάδα τους [9]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι τα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται σε 3D έχουν χαμηλότερη σε σύγκριση με την αντιγραφή 2D αντίστοιχά τους (Σχήμα 3Β) και έτσι είναι πιο ανθεκτικά σε docetaxel, το οποίο στοχεύει πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [41]. Έχουμε δείξει ότι αυτά τα αποτελέσματα είναι προσωρινά και ότι όταν οι 7 ημερών μικροσυσσωματώματα επιστραφεί σε 2D πλαστικό υπόστρωμα ως εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων παρουσιάζουν το ίδιο προφίλ ανταποκρίσεως δόσεως ως κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 2D (Σχήμα S4). Αυτή η διείσδυση φαρμάκου σε 3D-συστήματα είναι βραδύτερη σε σύγκριση με μια ενιαία μονοστιβάδα κυττάρων, γεγονός που καθιστά περισσότερο συγκρίσιμο με στερεούς όγκους [42]. Πράγματι διείσδυση φαρμάκου εντός στερεών όγκων είναι τυπικά 5 έως 10 φορές μικρότερη σε σύγκριση με καλλιέργειες μονοστιβάδας [43].

LNCaP κύτταρα (50,000 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε αγωγή με docetaxel πάνω από 48 ώρες (Α) ή 72 ώρες (Β) την ημέρα 2 της ανάπτυξης είτε σε 2D και 3D. Alamar blue χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Η μέση +/- SE, η = 4 βιολογικές επαναλήψεις * Ρ & lt? 0,05? Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) εικόνες αντίθεσης φάσης εμφανίζουν τα αποτελέσματα της docetaxel μετά από 72 ώρες από την μορφολογία των μικροσυσσωματωμάτων (3D) συγκριτικά με κύτταρα που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα (2D).

Η

Σύνοψη

Συνοψίζοντας, το σύστημα PDMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη ρύθμιση των διαστάσεων των καρκινικών κυττάρων να αντιγράφονται μικροσυσσωματωμάτων διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης του όγκου. Το σύστημα μικροπλάκα παράγει καρκίνο του προστάτη μικροσυσσωματωμάτων της αυστηρά ελεγχόμενες διαστάσεις χρησιμοποιώντας ένα PDMS μικρο-επιφάνειας που αποτελείται από 600 μικρο-κοιλότητες /cm

2, καθένα από τα οποία 360 μm από 360 μm. Επιφανειακή τροποποίηση είτε με 5% pluronic ή πολυ-στρωματοποίησης μπλοκ προσρόφηση πρωτεΐνης και προσκόλλησης κυττάρου επί των PDMS, και αυτό προάγει τον σχηματισμό μικροσυσσωματώσεων. συσσωματώματα LNCaP ήταν βιώσιμα και ο αριθμός των κυττάρων στα συσσωματώματα αυξήθηκε με το χρόνο. Τα αποπτωτικά πυρήνα σε κύτταρα LNCaP συσσωματώματα μπορεί να ελέγχεται χρησιμοποιώντας είτε μικρό (360 × 360 μm) ή μεγάλα (800 × 800 μm) μικροφρεάτια διάσταση. Τα μικροσυσσωματώματα καρκίνο, σχηματίζονται από LNCaP και κυττάρων RWPE-2 στερούνται πολικότητας όπως θα παρατηρηθεί σε έναν όγκο, ενώ τα φυσιολογικά κύτταρα RWPE-1 σχηματίζουν μία βασική επιφάνεια, όπως προσδιορίζονται από την έκφραση α6-ιντεγκρίνης μετά την προσθήκη του πλέγματος Matrigel στις πλάκες μικροφρεατίων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.