Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα ειδικά γονίδια μεθυλιώνονται με υψηλή συχνότητα σε παχέος νεοπλασία, και μπορεί να διαρρεύσει στο αίμα. Ανίχνευση πολλαπλών μεθυλιωμένου βιοδείκτες DNA στο αίμα μπορεί να βελτιώσει την ευαισθησία ποσοτικού προσδιορισμού για τον ορθοκολικό καρκίνο (CRC) σε σχέση με ένα και μόνο δείκτη. Πραγματοποιήσαμε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων αξιολόγηση της παρουσίας των δύο δεικτών μεθυλίωσης του DNA,

BCAT1

και

IKZF1

, σε κυκλοφορία για να καθοριστεί εάν ήταν συμπληρωματικά για την ανίχνευση της CRC.

Μέθοδοι

PCR δοκιμασίες μεθυλίωσης-ειδικά αναπτύχθηκαν για τη μέτρηση του επιπέδου της μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

στο DNA που εξάγεται από το πλάσμα που λαμβάνεται από την κολονοσκόπηση επιβεβαιωμένα 144 υγιείς μάρτυρες και 74 CRC περιπτώσεις

Αποτελέσματα

αποδόσεις DNA κυμαινόταν 2-730 ng /mL πλάσματος. (μέση 18.6ng /mL? 95% CI 11-26 ng /ml) και δεν σχετίζεται με την το φύλο, την ηλικία ή την κατάσταση CRC. Μεθυλιωμένα

BCAT1

και

IKZF1

DNA εντοπίστηκαν σε αντίστοιχα 48 (65%) και 50 (68%) από τις 74 καρκίνους. Αντίθετα, μόνο το 5 (4%) και 7 (5%) μάρτυρες ήταν θετικοί για

BCAT1

και

IKZF1

μεθυλίωσης του DNA, αντίστοιχα. Ένα μοντέλο ταξινομητή δύο γονιδίων ( «είτε ή» κανόνα) βελτίωσε το διαχωρισμό των CRC από τους ελέγχους, με 57 από 74 καρκίνους (77%) σε σύγκριση με μόνο 11 από 144 (7,6%) των ελέγχων είναι θετικό για

BCAT1

και /ή

IKZF1

μεθυλίωσης του DNA. Η αύξηση των επιπέδων της μετουσιωμένο DNA παρατηρήθηκαν ως στάδιο CRC προχωρήσει.

Συμπεράσματα

Ανίχνευση μεθυλιωμένο

BCAT1

και /ή

IKZF1

DNA στο πλάσμα μπορεί να έχουν κλινική εφαρμογή ως νέο τεστ αίματος για CRC. Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα από τις δύο δοκιμασίες PCR μεθυλίωσης-ειδική βελτιωμένη ανίχνευση CRC με ελάχιστη αλλαγή στην εξειδίκευση. Περαιτέρω επικύρωση αυτής της δοκιμής δύο γονιδίων του αίματος, με σκοπό την εφαρμογή προσυμπτωματικού ελέγχου είναι τώρα αναφέρεται

Παράθεση:. Pedersen SK, Baker RT, McEvoy Α, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) Μια εξέταση αίματος Δύο Gene για μεθυλιωμένο DNA ευαίσθητα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10.1371 /journal.pone.0125041

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Alejandro H. Corvalán, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Ιατρική Σχολή, ΧΙΛΗ

Ελήφθη: 13 Νοεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Μαρ 2015? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2015

Copyright: © 2015 Pedersen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από την Κλινική Genomics Pty Ltd, και της Κοινοπολιτείας Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας Οργάνωσης (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM, DHM και ΜΤ απασχολούνται από Clinical Genomics Pty Ltd. PLM, SM και TL απασχολούνται από CSIRO. GPY είναι αμειβόμενη σύμβουλος της Κλινικής Γονιδιωματική Pty Ltd. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι ακόλουθοι συγγραφείς δηλώνουν δυναμικό ανταγωνιστικά συμφέροντα, με την έννοια ότι είχαν προσληφθεί από, ή έλαβε συμβουλευτικές αμοιβές από Κλινικός Genomics Technologies Pty. Ltd .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, και GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL είναι εφευρέτες σε μία ή περισσότερες αιτήσεις διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που καλύπτουν τους βιοδείκτες μεθυλίωσης του DNA που περιγράφονται στο παρόν έγγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια σημαντική πρόκληση για τη δημόσια υγεία και προσυμπτωματικού ελέγχου είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τον καρκίνο ελέγχου σε χώρες με σημαντική επιβάρυνση CRC. Ωστόσο, τα ποσοστά συμμετοχής με διαλογή βασίζεται σε επεμβατικές κολονοσκόπηση ή κοπράνων δειγματοληψίας είναι χαμηλές [1]. Μια πρόσφατη έρευνα των θεμάτων ελέγχου σε ηλικία υποστηρίζει την πιθανή αποδοχή ενός τεστ αίματος για CRC με το 78% των συμμετεχόντων προτιμώντας μια εξέταση αίματος για ένα τεστ κοπράνων [2].

Οι πρόσφατες βελτιώσεις στη μοριακή τεχνολογίες έχουν αποδείξει ότι που προέρχονται από όγκους νουκλεϊκών οξέων στο αίμα μπορεί να ανιχνευθεί σε μια εύρωστη και αναπαραγώγιμο τρόπο [3]. Ειδικότερα, υπάρχει συσσώρευση λογοτεχνία τεκμηρίωση που κυκλοφορούν όγκου-ειδικά μεταλλαγμένα ή /και μεθυλιωμένων DNA και RNA [4-8].

Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως την ανακάλυψη και την επικύρωση μιας σειράς νέων υπερμεθυλίωση γονιδίων χαρακτηριστικό του παχέος εντέρου νεοπλασματικό ιστό [9]. Η μεθυλίωση ειδικές δοκιμασίες σχεδιασμένες για την ανίχνευση αυτών των γονιδίων έδειξε υπερμεθυλιωμένο ελάχιστο σήμα στο DNA που εξάγεται από συγκεντρωμένα αίμα υγιών δοτών για ένα υποσύνολο των δεικτών [9]. Με βάση την σχετική επίπεδα των πιθανών φόντο επιλέξαμε δύο γονίδια, διακλαδισμένης αλυσίδας τρανσαμινάση αμινοξέος 1,

BCAT1

, και Ίκαρος οικογένεια δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη 1,

IKZF1

[9,10] ως μολύβδου υποψήφιοι για αξιολόγηση ως βάση μια εξέταση αίματος για CRC.

Έχουμε αναφέρει την αξιολόγηση των δύο δοκιμασιών PCR μεθυλίωσης-ειδικά για την ανίχνευση του μεθυλιωμένου

BCAT1

και

IKZF1

DNA από δείγματα πλάσματος από 218 κολονοσκόπηση εξεταστεί άτομα (144 υγιείς μάρτυρες και 74 περιπτώσεις CRC) για να καθοριστεί εάν οι βιοδείκτες μεθυλίωση ήταν συμπληρωματικά για την ανίχνευση της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Θήκες και ελέγχους

το αίμα λήφθηκε από τον εθελοντισμό και ενημέρωσε θέματα προγραμματιστεί για κολονοσκόπηση σε Flinders Medical Centre (ΚΠΑ) ή Γενικό Νοσοκομείο Επαναπατρισμός (Αδελαΐδα, SA, Αυστραλία), οι οποίοι έδωσαν γραπτή συγκατάθεση σε συμφωνία με το πρωτόκολλο της μελέτης εξετάζονται και εγκρίνονται από η Επιτροπή Έρευνας και Δεοντολογίας του επαναπατρισμού Γενικό Νοσοκομείο επιτροπή δεοντολογίας και του Flinders Medical Centre. Το αίμα συλλέχθηκε με φλεβοτομή μετά την παρασκευή του εντέρου αλλά πριν από την κολονοσκόπηση. Η κλινική διάγνωση καθορίστηκε με βάση κολονοσκοπικής ευρήματα και ιστολογική αξιολόγηση. Καρκίνοι οργανώθηκαν σύμφωνα με Καρκίνο AJCC στάσης 7

ου έκδοση. Πρόσθετες δείγματα πλάσματος από την κολονοσκόπηση, εξέτασε θέματα που προέρχονταν από Proteogenex Inc. CA, USA (PGX) που συλλέγεται αίμα από εθελοντές 3-10 ημέρες μετά την διερευνητική κολονοσκόπηση τους. επιλέχθηκαν δείγματα για ανάλυση αναδρομικά σε κολονοσκόπηση με βάση τη διάγνωση. περιπτώσεις Καρκίνος (FMC: n = 25, PGX: n = 49) επιλέχθηκε με βάση τη διαθεσιμότητα όγκο, ενώ οι έλεγχοι (FMC: n = 85, PGX: n = 84) επιλέχθηκαν με βάση την μη εμφάνιση των υπερπλαστικών και αδενωματώδεις πολύποδες (αλλά επιτρέποντας καλοήθεις παθήσεις όπως αιμορροΐδες και εκκολπωματική νόσος), με μια προσπάθεια για να ταιριάζει με το φύλο την ηλικία οι περιπτώσεις CRC διαθέσιμα για τη δοκιμή.

προετοιμασία Plasma

Το συστατικό του πλάσματος από το πλήρες αίμα που συλλέγεται στο Κ

3EDTA Vacuette σωλήνες (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) απομονώθηκε με φυγοκέντρηση στα 1,500g επί 10 λεπτά στους 4 ° C (φρένα απενεργοποιηθεί σε φυγόκεντρο). Το κλάσμα του πλάσματος πάνω-στρώμα ανακτήθηκε και φυγοκέντρηση επαναλήφθηκε. Το προκύπτον πλάσμα «δύο-spin» αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Ο συνολικός χρόνος από την κλήρωση του αίματος προς δέσμευση στο πλάσμα δεν ήταν περισσότερο από τέσσερις ώρες σε όλους τους χώρους των προσλήψεων.

ελέγχων της διαδικασίας

δεξαμενή πλάσματος από το φύλο και την ηλικία-συμβατούς δότες κάτω των 30 ετών ήταν εμπορικά προέρχονται (Bioreclamation, ΝΥ, USA) και χρησιμοποιήθηκε σκέτο ως αρνητικός έλεγχος ή ενισχυμένο με επεξεργασία με υπερήχους πλήρως μεθυλιωμένο ϋΝΑ ανθρωπίνου γονιδιώματος (Millipore, ΜΑ, ΗΠΑ), 1250pg /mL, ως θετικός έλεγχος. Οι έλεγχοι έγιναν διαδικασία ως 2 παρτίδες λίτρων και στη συνέχεια αποθηκεύεται ως υποπολλαπλάσια 4mL στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Μελέτη

δείγματα πλάσματος χωρίστηκαν τυχαία σε επεξεργασία σε παρτίδες των 24 δείγματα των οποίων το ένα θετικός έλεγχος της διαδικασίας, ένα αρνητικό έλεγχο της διαδικασίας και 22 κλινικά δείγματα (φαινότυποι τυφλωμένοι από τη δοκιμασία φορείς).

Απομόνωση και όξινο θειώδες μετατροπή του ελεύθερου κυττάρων που κυκλοφορούν DNA

ελεύθερα κυττάρων που κυκλοφορούν DNA (cfDNA) εκχυλίστηκε από 4mL πλάσμα χρησιμοποιώντας το QIAamp δανείζεται Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Η εκχύλιση ημι-αυτόματο σε δύο υγρές χειριστές QIACube (12 δείγματα ανά μέσο ανά επιχείρηση), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Qiagen). Ο όγκος έκλουσης ρυθμίστηκε στα 40 μL και το έκλουσμα χειροκίνητα εφαρμοστεί εκ νέου στην στήλη διοξειδίου του πυριτίου για τη βελτίωση της απόδοσης cfDNA. Το κιτ μετατροπής Fast Bisulfite EpiTect (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για να όξινου θειώδους μετατρέψει απομονωμένο cfDNA. Το όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA καθαρίστηκε σε QIACube όργανα με χρήση του κιτ EpiTect Plus Bisulfite (Qiagen) με δύο τροποποιήσεις: 1) στήλες από την κυκλοφορούσα QIAamp κιτ Nucleic Acid χρησιμοποιήθηκαν στη θέση των στηλών που παρέχεται στο κιτ Epitect Plus Bisulfite? 2) Το ρυθμιστικό Δέσμευσης Epitect Plus παρασκευάστηκε με ισοπροπανόλη στη θέση της αιθανόλης. Ο όγκος έκλουσης ρυθμίστηκε στα 40 μL και το έκλουσμα χειροκίνητα εφαρμοστεί εκ νέου στην στήλη διοξειδίου του πυριτίου για τη βελτίωση της απόδοσης cfDNA. Συνολικά 36μΙ όξινο θειώδες μετατρέπεται cfDNA ανακτήθηκε από κάθε δείγμα πλάσματος 4 ml. Η επιτυχής ανάκαμψη της όξινου θειώδους μετατραπεί cfDNA επιβεβαιώθηκε στις διπλές είσοδο των 5 μL 1: 5 αραιωμένο όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ACTB PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11] με μικρές τροποποιήσεις (βλ S1 πίνακα). Κάθε εκτέλεση PCR περιλαμβάνονται τρία δείγματα ελέγχου χωρίς πρότυπο και μια πρότυπη καμπύλη με βάση ένα 4-φορές σειριακή αραίωση του 5ng όξινου θειώδους-μετατραπεί το ανθρώπινο DNA που απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια (WBC? Roche Applied Science, Basel, Switzerland) που παρασκευάζεται σε ένα υπόβαθρο ύδατος άνευ νουκλεάσης (Promega, WI, USA). Η μάζα των ανακτημένων όξινου θειώδους μετατραπεί cfDNA για κάθε επεξεργασμένο δείγμα υπολογίστηκε από την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση ταιριάζει στο κατώφλι κύκλου (Ct) τιμές (βλέπε S1 σχήμα).

Ανίχνευση μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

DNA

Εμφάνιση του μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

DNA σε κυκλοφορία μετρήθηκε στο τριπλούν είσοδο της 5μL καθαρίζεται όξινου θειώδους μετατραπεί DNA (π.χ. ισοδύναμο για 0,5 ml πλάσματος ανά PCR) χρησιμοποιώντας όξινου θειώδους conversion- και μεθυλίωσης ειδικές δοκιμασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] με μικρές τροποποιήσεις (βλ S1 πίνακα). Εν συντομία, οι δύο προσδιορισμοί PCR πραγματικού χρόνου στοχευμένες μεθυλιωμένες θέσεις CpG στις περιοχές που εκτείνονται 102- ή 95- νουκλεοτίδια, είτε εντός, ή απλά ανάντη του πρώτου εξονίου του

BCAT1

και

IKZF1

γονίδια, αντιστοίχως (βλέπε Εικ S2). ενίσχυσης στόχου DNA εκτελέστηκε για 50 κύκλους σε ένα LightCycler LC480, Model II (Roche). τιμές Ct υπολογίστηκαν με τη χρήση

ου αλγόριθμο παράγωγο 2 παρέχονται με το λογισμικό LC480. Η

BCAT1

δοκιμασία PCR (ανιχνευτή υδρόλυσης) και

IKZF1

δοκιμασία PCR (SYBR πράσινο /τήξη) ήταν ποιοτικά ονομάζεται «θετικά» για το

BCAT1

μεθυλίωση αν μια συνολική μεταβολή ένταση φθορισμού πάνω από τα επίπεδα υποβάθρου μετρήθηκε μέσα σε 50 κύκλους ενίσχυσης PCR. Περαιτέρω, για

IKZF1

θετική κλήσεις, η συνιστώσα ανάλυση προφίλ τήξης του

IKZF1

PCR δοκιμασία έπρεπε να δώσει μια θερμοκρασία τήξης μεγαλύτερο από 80 ° C (βλέπε S1 πίνακα). PCR δοκιμασίες χωρίς σήμα είχαν ανατεθεί μία αυθαίρετη τιμή Ct 50 για γραφική χρήση. Κάθε εκτέλεση PCR περιλαμβάνονται τρία δείγματα χωρίς εκμαγείο ελέγχου, τρία 5ng δις-μετατραπέν DNA WBC (Roche) δείγματα αρνητικού ελέγχου, και μια πρότυπη καμπύλη με βάση 4-φορές σειριακή αραίωση του 5ng όξινου θειώδους-μετατρέπεται πλήρως μεθυλιωμένο ϋΝΑ ανθρωπίνου γονιδιώματος (Millipore) παρασκευάστηκε σε ένα περιβάλλον όξινου θειώδους-μετατρέπονται WBC DNA (Roche) (βλέπε Σχ S2). Κάθε τυπική συγκέντρωση σημείο περιείχε συνολικά 5 ng DNA. Οι ειδικές δοκιμασίες μεθυλίωσης ήταν ποσοτική από 20 ρ§ (0,4%) για να 5ng (100%) του μεθυλιωμένου DNA στόχου σε ένα φόντο του WBC DNA (R

2 τετραγωνικά τιμές:

BCAT1

, 0,9370?

IKZF1

, 0,9387, S2 σχήμα), αλλά είναι σε θέση να ανιχνεύσει τα κάτω για να 5PG (ισοδύναμο με 1-2 γονιδιωματική αντίγραφα) του μεθυλιωμένου

BCAT1

και

IKZF1

DNA. Η μάζα των μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IZKF1

DNA για κάθε επεξεργασμένο δείγμα υπολογίστηκε από την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση ταιριάζει με τις τιμές Ct. Η μάζα των μεθυλιωμένο

BCAT1

ή

IKZF1

DNA εκφράστηκε ως η μέση μάζα (picogram? Pg) της μεθυλιωμένης

BCAT1

ή

IKZF1

DNA ανά δοκιμασία τριπλούν PCR ή ανά ml πλάσματος (βλέπε S2 πίνακα).

Δείγμα Αποτέλεσμα Ερμηνεία

Ανάκτηση όξινου θειώδους μετατραπεί DNA επιβεβαιώθηκε εάν τουλάχιστον ένα αντίγραφο ήταν θετική στο

ACTB

δοκιμασία qPCR. Το υπόλοιπο όξινο θειώδες μετατροπή του DNA στη συνέχεια αναλύεται ως τριπλούν εισόδους των 5μL είτε το

BCAT1

ή

IKZF1

αναλύσεις qPCR. Τα ακόλουθα δεδομένα συλλέχθηκαν για κάθε επεξεργασία του δείγματος: δύο

ACTB

μετρήσεις qPCR Ct, μάζα του όξινου θειώδους μετατραπεί DNA, τρεις

BCAT1

μετρήσεις qPCR Ct, τρεις μεθυλιωμένο

BCAT1

μάζα μετρήσεις, τρεις

IKZF1

qPCR Ct μετρήσεις και τρία μεθυλιωμένο

IKZF1

μετρήσεις (S2 Πίνακας). Όλες οι καμπύλες ενίσχυσης PCR επιθεωρούνται οπτικά. Πριν αποκαλύπτοντας φαινότυποι δείγμα, ένα δείγμα ποιοτικά ορίζεται ως κλινικά θετικά για CRC σκοπούς αναφοράς, εάν οποιοδήποτε από τα τρία αντίτυπα στην

BCAT1

ή

IKZF1

PCR δοκιμασίες ήταν θετικές.

Η στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism v5.0d για Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, CA). Για οικόπεδα πυκνότητα των ποσών των μεθυλιωμένο

BCAT1

ή

IKZF1

DNA, τα δείγματα με τα αποτελέσματα «δεν υπάρχει σήμα» είχαν παραλειφθεί. Κάθε ένα από τα εις τριπλούν προσδιορισμούς περιέχονται DNA που απομονώθηκε από το ισοδύναμο των 0,5 ml πλάσματος. Η εμπειρική πυκνότητα του ln (μεθυλιωμένο

BCAT1

, pg) ή ln (μεθυλιωμένο

IKZF1

, pg

)

υπολογίζεται χωριστά για υγιείς μάρτυρες, πρώιμο στάδιο (στάδιο Ι + ΙΙ) και προχωρημένο στάδιο (στάδιο III + IV) καρκίνο. Υποθέτοντας μια Gaussian κατανομή για τις τιμές μάζας μεθυλίωσης (PG), για να δώσει τη μέγιστη εντροπία (η χειρότερη περίπτωση) με την παρατηρηθείσα μέση και διακύμανση, οι πυκνότητες και πάλι εκτιμηθεί. Χρησιμοποιώντας αυτές τις πυκνότητες, υπολογίσαμε την αθροιστική συνάρτηση κατανομής (F (x) = P (X≤x)) και την έκθεση 1-F (x) για ln (PG) μετουσιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

αξίες των 3, 3.9 και 4.6. Μπορούμε επίσης να αναφέρει το λόγο πιθανότητας σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες.

Αποτελέσματα

Απομόνωση κυττάρων χωρίς DNA από δείγματα πλάσματος

Δέκα επιμέρους παρτίδες που έγιναν για να επεξεργάζονται τα δείγματα 218 πλάσματος . Έλεγχοι της διαδικασίας επιβεβαιώνεται καμία σύγχυση μεταβολή στην επεξεργασία παρτίδα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η

ACTB

qPCR δοκιμασία επιβεβαίωσε την επιτυχή ανάκτηση του όξινου θειώδους μετατρέπονται DNA από όλα τα 218 επεξεργασμένα δείγματα πλάσματος (βλέπε Σχ S3 και S2 Πίνακα) και οι μέσες συγκεντρώσεις DNA σε σχέση με φαινότυπο και κλινικών καταστάσεων της συλλογής συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Η πλειοψηφία των ανακτημένων αποδόσεις DNA ήταν εντός μιας διττής περιοχή συγκέντρωσης (95% CI φάσμα: 11.2-26.2ng /mL). Σημαντικά χαμηλότερες αποδόσεις του όξινου θειώδους μετατραπεί DNA ανακτήθηκαν από δείγματα που συλλέγονται από την FMC σε σύγκριση με το μέσο όρο των αποδόσεων που ανακτάται από τα δείγματα που συλλέγονται από PGX (μέσες συγκεντρώσεις: FMC: 7,0 ng /mL, PGX: 17.8ng /mL, t-test τιμή p τα όρια μάζας προσδιορίστηκαν ως η περιοχή κάτω από την καμπύλη (συνεχείς γραμμές στο πάνελ Α και Β) για ln (PG) τιμές μεγαλύτερες από 3, 3,9 και 4,6, αντιστοίχως (βλέπε διακεκομμένες κάθετες γραμμές και βέλη) σε πίνακες Α και Β Πιθανότητα οι αναλογίες σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες σε παρένθεση.

η

Συζήτηση

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν την ανάπτυξη των δύο όξινου θειώδους δοκιμασίες μετατροπής και μεθυλίωσης ειδική PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του παχέος νεοπλασματικών συγκεκριμένες μεθυλίωσης στο γονιδιακούς τόπους

BCAT1

και

IKZF1

[9]. Εμείς βελτιστοποιηθεί η

BCAT1

και

έχουν IKZF1

δοκιμασίες μεθυλίωσης qPCR για ανίχνευση μεθυλίωσης αναλογίες τόσο χαμηλές όσο 0,1%, ως τέτοια χαμηλά επίπεδα που προέρχονται από όγκους DNA έχουν αναφερθεί σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με πρώιμο στάδιο CRC [4,15]. Σε αυτή τη μελέτη ασθενών-μαρτύρων που αποδεικνύουν ότι μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

DNA ανιχνεύεται συχνότερα σε περιπτώσεις CRC (65% και 68%, αντίστοιχα) σε σχέση με την κολονοσκόπηση, επιβεβαίωσε υγιείς μάρτυρες ( 4% και 5%, αντίστοιχα) και ότι οι δύο δείκτες της μεθυλίωσης DNA είναι συμπληρωματικά (συνδυασμένη θετικότητα του 77% και 7,6% το CRC και υγιείς μάρτυρες, αντιστοίχως).

Ένα σύνολο 41/74 περιπτώσεων καρκίνου ήταν θετικά τόσο για μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

DNA σε σύγκριση με μόλις 1/144 του ελέγχου). Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα από τις δύο δοκιμασίες οδήγησε σε διακρίσεις ακρίβεια των 0,8469 που ήταν καλύτερη από ό, τι είτε δοκιμασία μόνο (

BCAT1

δοκιμασία: 0.807,

IKZF1

δοκιμασία: 0,8135), Σχήμα 3. Λαμβάνοντας υπόψη ένα είτε-ή δοκιμασία δύο-γονίδιο, περισσότερες περιπτώσεις CRC ανιχνεύθηκαν, με μια σωστή διαχωρισμό των 57/74 (77%) και μόνο 11/144 (7,6%) υγιείς μάρτυρες έχουν καταταχθεί λανθασμένα. Αυτά τα δεδομένα δύο γονιδίων παρέχουν πειστικές, απλή απόδειξη ότι πολλαπλές βιοδείκτες μπορεί να βελτιώσει την ευαισθησία χωρίς σημαντικές συμβιβασμό των διαγνωστική χρησιμότητα όσον αφορά την χαμηλότερη ειδικότητα.

Ανίχνευση μεθυλιωμένο

BCAT1

και

IKZF1

DNA στο αίμα δεν εξαρτάται από την ηλικία ή το φύλο του υποκειμένου, ή το ποσό των ανακτηθέντων όξινο θειώδες μετατρέπεται cfDNA. Μία σημαντική σχέση παρατηρήθηκε μόνο σε κλινικό φαινότυπο. Τόσο η συχνότητα ανίχνευσης και το ποσό της μεθυλιωμένο

BCAT1

και /ή

IKZF1

DNA απελευθερώνεται στο αίμα αυξάνεται με το στάδιο του καρκίνου. Ο τελευταίος ήταν στατιστικά σημαντική στο στάδιο ΙΙ, ΙΙΙ και IV καρκίνους, με μεγαλύτερη μάζα μεθυλίωση παρατηρήθηκε σε σύγκριση με το επίπεδο που μετρήθηκε στα λίγα θετικά υγιείς μάρτυρες (Σχήμα 4). Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν επίσης σημειωθεί για την άρτια μελετηθεί

SEPT9

δοκιμασία μεθυλίωσης [16,17]. Με την τοποθέτηση μοντέλα της ταξινόμησης του καρκίνου (έλεγχοι, νωρίς ή αργά καρκίνο), δείχνουμε τη δυνατότητα της χρησιμοποίησης του επιπέδου των μεθυλιωμένο

BCAT1

και /ή

IKZF1

DNA στο αίμα για την εκτίμηση της πιθανότητας ένα θετικό αποτέλεσμα να είναι λόγω της παρουσίας του καρκίνου (Σχήμα 5). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα απλό μοντέλο στο οποίο η ικανότητα να ανιχνεύουν δείκτες DNA που προέρχονται από ιστούς στο κυκλοφορικό σύστημα είναι μια συνάρτηση της έκτασης της εισβολής από την βλάβη [18].

BCAT1

και

IKZF1

εμπλέκονται τόσο στην αύξηση του όγκου και της εισβολής [19,20]. Μια υπερμεθυλίωση

BCAT1

τόπος έχει επιδειχθεί για αρκετές παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων CRC [21,22] και παρεκκλίνουσα επιγενετική ρύθμιση προκαλεί μια αναλογία μετατόπιση σε τρεις κύριες

BCAT1

μεταγραφές mRNA που διαφέρουν μόνο στο πρώτο εξόνιο, που φιλοξενεί εναλλακτική αμετάφραστες περιοχές [20]. Πως οι ισομορφές BCAT1 επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι άγνωστη, αλλά πιθανολογείται ότι δυσλειτουργική παραγωγή αμινοξέων διακλαδισμένης αλύσου μπορεί να επηρεάσει την σύνθεση μακρομορίων που απαιτείται για την κυτταρική διαίρεση, ίσως στο σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου G1-to-S [23].

Ο μεταγραφικός παράγοντας,

IKZF1

, ρυθμίζει πολλές βιολογικές εκδηλώσεις και το ρόλο της στην λεμφοποιήσεως και λευχαιμικά νεοπλασία έχει μελετηθεί εκτενώς. Ένα δίκτυο των επιγενετικών και η μεταγραφή παράγοντες ρυθμίζουν

IKZF1

γονίδιο δραστηριότητα [24] και τις αναδυόμενες δεδομένα υποδηλώνουν ότι

IKZF1

είναι επίσης ζωτικής σημασίας για τη σωστή ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων του μη-αιμοποιητικών προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων κόλον [25]. Με το συγκρότημα NuRD ως κύριο αλληλεπιδρούν εταίρους [26], Ίκαρος ελέγχει τη μεταγραφική δραστηριότητα ενός μικρού συνόλου γονιδίων [23,27], συμπεριλαμβανομένων των

Notch1

[28]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Notch είναι κρίσιμη για πολλές κυττάρου-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού invadopodia [29].

SEPT9

είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του σχηματισμού ψευδοπόδια [30], η οποία είναι ένα βασικό γεγονός που κινεί τη διάδοση των κυττάρων και προώσεως σε περιβάλλοντα ιστό και το στρώμα (αναθεωρήθηκε πρόσφατα από [31]). Έτσι, η απώλεια του

SEPT9

έκφραση μπορεί να παίζει ενεργό ρόλο στην εισβολή του όγκου, όπου μεταστατικά κύτταρα όγκου μέσω ελάχιστα κατανοητή μηχανισμών μεταναστεύουν στο αγγειακό σύστημα [32]. Εμείς εικασίες εάν

IKZF1

είναι ίσως μια ανάντη ρυθμιστή της

SEPT9

δραστηριότητα.

Το μονοπάτι Notch παίζει κρίσιμο ρόλο στην αυτο-ανανέωση διαδικασία των βλαστικών κυττάρων κρύπτης του παχέος εντέρου και την παραγωγή τους να πολλαπλασιάζονται και διέλευσης ενισχύει αδιαφοροποίητο προγόνων κυττάρων, τα οποία ανεβάσουμε την κρύπτη και στο λάχνης όπου περαιτέρω, διαφοροποιούν [33,34]. Υποθέτουμε αν η απώλεια του

IKZF1

δραστηριότητας λόγω υπερμεθυλίωσης, οδηγεί σε ουσιαστικά δραστική σηματοδότηση Notch που αναστέλλει τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων κρύπτης και οδηγεί σε μεγάλη αύξηση των μη διαφοροποιημένων παροδική ενίσχυση κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [35-37].

Η αυξημένη θετικότητα που παρατηρούνται σε καρκίνους σταδίου I-IV συνεπάγεται ότι η ανίχνευση του μεθυλιωμένου ιχνηθετών DNA που προέρχονται από όγκους στο αίμα μπορεί να εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την αγγείωση του ορθοκολικού νεοπλαστικού ιστού και αυξημένη εισβολή γενικά [18,38]. Αν αυτό αληθεύει, τότε μια τυποποιημένη ευαισθησία για την ανίχνευση των καρκινικών δεικτών που προέρχονται σε κυκλοφορία θα επηρεαστεί από το κλάσμα των καρκίνων σταδίου Ι, καθώς η πλειοψηφία του σταδίου Ι καρκίνων είναι απίθανο να έχουν οποιαδήποτε λεμφική ή φλεβική εισβολή σκάφος [18]. Ως εκ τούτου, δοκιμασίες με βάση το αίμα είναι απίθανο να ανιχνεύσει ένα σημαντικό κλάσμα των πρώιμων καρκίνων στάδιο που μπορεί να ανιχνευθεί με κολονοσκόπηση. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τη χαμηλή ευαισθησία που παρατηρείται σε μια πρόσφατη προοπτική αξιολόγηση

SEPT9

στο & gt? 7.900 ασυμπτωματική συμμετέχοντες όπου εντοπίστηκαν μόνο το 48% των 53 περιπτώσεων CRC (συμπεριλαμβανομένων των είκοσι δύο καρκίνους Στάδιο Ι) και το 11% των αδενωμάτων [17]. Το δικό μας σύνολο δεδομένων περιλαμβάνονται μόνο τέσσερις καρκίνους σταδίου Ι, και ενώ δύο (50%) από αυτά εντοπίστηκαν, οι αριθμοί του δείγματος είναι σήμερα πολύ χαμηλή για να συμπεράνει κατά πόσον το μεθυλιωμένο

BCAT1

/

IKZF1

δοκιμή θα δώσει καλή διάγνωση των καρκίνων σταδίου Ι. Συμπερίληψη των μεταβλητών που σχετίζονται με αγγείωση (αγγειακή εισβολή, την ικανότητα της αγγειακής επιβίωση και την αγγειογένεση των όγκων) φαίνεται να βελτιώνει τη διαστρωμάτωση των ασθενών με καρκίνο [39].