Αφηρημένο

Η αυξημένη έκφραση των Bcl-XL στην καρκίνου έχει αποδειχθεί ότι προσδίδουν ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσμα των αποπτωτικών ερεθισμάτων και να διαμορφώνει μια σειρά από άλλες πτυχές της κυτταρικής φυσιολογίας, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού της ενέργειας, του κυτταρικού κύκλου, αυτοφαγία, μιτοχονδριακή σχάση /σύντηξη και την κυτταρική προσκόλληση. Ωστόσο, λίγες μόνο από αυτές τις δραστηριότητες έχουν μια μηχανιστική εξήγηση. Εδώ χρησιμοποιήσαμε διαδοχικού καθαρισμού συγγένειας για την ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν Bcl-xL που θα μπορούσε να εξηγήσει τις πλειοτροπικές επιδράσεις της Bcl-xL υπερέκφραση. Μεταξύ των πολλών πρωτεϊνών συν-καθαρισμό με Bcl-xL, εστιάσαμε στην Praf2, μια πρωτεΐνη με μια προβλεπόμενη ρόλο στην διακίνηση. Η αλληλεπίδραση των Praf2 με Bcl-xL βρέθηκε να εξαρτάται από τον διαμεμβρανικό τομέα του Bcl-XL. Βρήκαμε ότι η Bcl-2 αλληλεπιδρά επίσης με Praf2 και ότι Bcl-xL και Bcl-2 μπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει με Arl6IP5, ένα ομόλογο της Praf2. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του Praf2 έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση του Bax στα μιτοχόνδρια και την επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου. Praf2 εξαρτώμενη κυτταρικός θάνατος εμποδίζεται από την συν-επιμόλυνση των Bcl-xL, αλλά όχι από διαμεμβρανική περιοχή διαγράφεται μεταλλαγμένο του. Κατά συνέπεια, knock-down της Praf2 αυξάνει ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων U2OS παρακάτω ετοποσίδη θεραπεία μειώνοντας τον κυτταρικό θάνατο. Εν κατακλείδι μια οθόνη για Bcl-XL-πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με μεμβράνη ας προσδιορίσει μια νέα προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών των οποίων η δραστηριότητα είναι έντονα εξουδετερώνεται αποκλειστικά από μεμβράνη στοχευμένες Bcl-xL

Παράθεση:. Vento MT, Zazzu V, Loffreda Α, Σταυρός JR, προς τα κάτω J, Stoppelli MP, et al. (2010) Praf2 Υπάρχει πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης Novel Bcl-xL /Bcl-2 με την ικανότητα να ρυθμίζουν την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10.1371 /journal.pone.0015636

Επιμέλεια: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Βραζιλία

Ελήφθη: 9 Σεπτεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 18 Νοεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 20 Δεκέμβρη 2010

Copyright: © 2010 Vento et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ένωση Διεθνών Ερευνών Καρκίνου, Grant Ref .: 05-0416 (https://www.aicr.org.uk/index.stm), και του Ευρωπαϊκού Ιδρύματος Επιστημών (ESF), Eurocore Δίκτυο για Αρχιτεκτονικής μεμβρανών και δυναμική, Συμβόλαιο n.LSHC-CT-2003-503297, για MPS Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αποκτήσει την ικανότητα να ξεφύγει από απόπτωση είναι απαραίτητη σε διάφορα στάδια κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου. Υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-xL είναι γνωστό ότι προσδίδουν αντίσταση σε ένα ευρύ φάσμα πιθανών αποπτωτικών ερεθισμάτων που προκύπτουν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου, όπως η ενεργοποίηση ογκογονιδίων, υποξία και μήτρα αποκόλληση [1] – [3]. Διαταραγμένη απόπτωση λόγω της υπερ-έκφραση του γονιδίου Bcl-XL είναι επομένως κρίσιμο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Μειωμένη απόπτωση είναι επίσης ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου, επειδή κυτταροτοξική θεραπείες για τον καρκίνο του βασίζονται σε μεγάλο βαθμό από την επαγωγή της απόπτωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, Bcl-xL έχει προταθεί να διαδραματίσει ένα μοναδικό ρόλο στη γενική αντίσταση σε κυτταροτοξικούς παράγοντες, εξαιτίας ενός εντυπωσιακή συσχέτιση μεταξύ ενός αυξημένου επιπέδου έκφρασης Bcl-xL και αντίσταση σε ένα ευρύ πάνελ πρότυπους παράγοντες χημειοθεραπείας. μηχανισμός Bcl-xL της δράσης είναι επομένως ένα σημαντικό συστατικό της χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα [4]. Bcl-xL ανήκει στην οικογένεια Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών των οποίων τα μέλη μπορούν να έχουν είτε αντι-αποπτωτική ή προ-αποπτωτικά λειτουργίες. Τα προ-αποπτωτικών μέλη της οικογένειας Bcl-2 εμπίπτουν σε δύο υποσύνολα. Τα λεγόμενα πολλών τομέων παραγόντων (Βαχ και Bak) είναι πρωτεΐνες που μοιράζονται περισσότερα από ένα ομολογίας Bcl-2 περιοχής (BH). Η άλλη υποοικογένεια περιλαμβάνει πρωτεΐνες μοιράζονται μόνο την περιοχή ΒΗ3. Μια εικόνα έχει προκύψει γεγονός που υποδηλώνει ότι «μόνο ΒΗ3» πρωτεΐνες έχουν ποικίλους μηχανισμούς ρύθμισης και στοχεύουν αισθητήρες διαφορετικών πηγών κυττάρων στρες. Η κύρια λειτουργία τους φαίνεται να είναι η δέσμευση και η εξουδετέρωση των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια Membres [5], αν και μερικά από αυτά έχουν επίσης αναφερθεί να είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν άμεσα πολλών τομέων προ-αποπτωτικών μελών της οικογένειας [6], [7]. Ως εκ τούτου, ευρέως αποδεκτό ότι αυξημένα Bcl-xL επίπεδο πρωτεΐνης μειώνεται επιδεκτικότητα σε απόπτωση επειδή αυξάνει την κυτταρική δυνατότητα να αδρανοποιήσουν προ-αποπτωτικών «ΒΗ3 μόνο» πρωτεΐνες [8].

Εκτός από την ικανότητά της να αναστέλλει τον πυρήνα αποπτωτικό μηχανήματα, Bcl-xL έχει δειχθεί να ρυθμίζει μια σειρά από άλλες πτυχές της κυτταρικής φυσιολογίας. υπερέκφραση της, για παράδειγμα, έχει συσχετισθεί με την υψηλής ποιότητας όγκου και αυξημένη ικανότητα να εισβάλλουν και να κάνουν μετάσταση, ανεξάρτητα από την ικανότητά της να διατηρεί την επιβίωση εν απουσία προσκόλλησης μήτρας [9] – [11]. Bcl-xL έχει βρεθεί για να συμπληρώσει

S.cerevisiae

γονίδια που διευκολύνουν την μετάβαση από γλυκολυτικά σε οξειδωτικό μεταβολισμό [12]. Bcl-XL είναι επίσης σε θέση να ρυθμίζουν την ομοιόσταση του ασβεστίου [13], διεγείρει τον σχηματισμό συνάψεων [14], βραδείας προόδου του κυτταρικού κύκλου [15], να διαμορφώνει autophagy [16], [17], να αυξήσει την μιτοχονδριακή σχάση /σύντηξης [18] και ρυθμίζουν μεταβολίτη ανταλλαγή δια μέσου της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης [19]. Μερικά από αυτά τα «μη συμβατικών» δραστηριότητες Bcl-xL θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ικανότητά της να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες, εκτός από τα προ-αποπτωτικά «μόνο ΒΗ3» παράγοντες. Bcl-xL έχει πράγματι αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με VDAC1 [20], με το ΙΡ3 Υποδοχέα [21], με Beclin1 [22] και μια σειρά άλλων πρωτεϊνών.

Bcl-xL είναι τόσο ένα κυτοσολικό και συναφή με μεμβράνη πρωτείνη [23]. Ενώ κυτοσολικό Bcl-xL φαίνεται να είναι ένα ομοδιμερές [24], η τεταρτοταγής δομή του συνδεδεμένου με μεμβράνη Bcl-xL δεν έχει διερευνηθεί σε λεπτομέρειες, αν και έχει αναφερθεί ότι θα μπορούσε να εμπλέκεται σε σύμπλοκα υψηλού μοριακού βάρους [25] ( Borner προσωπική επικοινωνία). Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε αποδείξεις που Bcl-XL είναι πράγματι μέρος των συμπλεγμάτων υψηλού μοριακού βάρους και προσπαθούμε να πραγματοποιήσει μια ολοκληρωμένη ανάλυση των πρωτεϊνών που μπορούν να δεσμεύσουν Bcl-XL με την χρησιμοποίηση Tandem Καθαρισμός συγγένειας. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι Bcl-xL αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες. Μεταξύ αυτών, η εκκριτική οδό ήταν μια από τις πιο εκπροσωπούνται οδούς. Με σκοπό την επικύρωση του καταλόγου των πρωτεϊνών που βρίσκονται να αλληλεπιδρούν με Bcl-xL, αποφασίσαμε να εστιάσουμε την ανάλυσή μας σχετικά με την αλληλεπίδραση μεταξύ Bcl-xL και Praf2, ένα μικρό πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια Πρενυλιωμένο Rab δέκτη, με ένα προβλεπόμενο ρόλο στην ER να Golgi μεταφορών [26]. Δείχνουμε ότι Praf2 επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο κατά την έκφραση και ότι Bcl-xL εξουδετερώνει αποπτωτική δραστηριότητα Praf2 του. Τέλος, δείχνουμε ότι Praf2 σίγηση σε κύτταρα U2OS καθιστά πιο ανθεκτικά στην απόπτωση που επάγεται από την ετοποσίδη κυτοτοξικό φάρμακο.

Αποτελέσματα

Για να διερευνηθεί η πιθανότητα η Bcl-xL σχετίζεται με πρωτεΐνες μεμβράνης σε σύμπλοκα υψηλού μοριακού βάρους, έχουμε χρησιμοποιήσει σακχαρόζη κλασματώσεις βαθμίδα διαλυτοποιημένες με CHAPS ολόκληρα κύτταρα εκχυλίσματα. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της κυτταρικής γραμμής U2OS διότι εκφράζει υψηλά επίπεδα των Bcl-xL και φαίνεται να «εθισμένοι» για έκφραση Bcl-xL για την επιβίωση (δεν φαίνεται). Προ-εκκαθαρίζονται κυτταρικά εκχυλίσματα φορτώθηκαν επί βαθμίδων σακχαρόζης και υποβάλλεται σε υπερφυγοκέντρηση όπως καθορίζεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα κλάσματα συλλέχθηκαν, επιλύονται με SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα. Το Σχήμα 1 δείχνει ότι η χαμηλή πρωτεΐνες μοριακού βάρους όπως κυτόχρωμα c (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) ή Βαχ (20 kDa) είναι παρόντα σε κλάσματα της διαβάθμισης, όπου οι πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους αναμένεται να καθιζάνουν. Bcl-xL, αντ ‘αυτού, έχει εξαπλωθεί σε κλάσματα που κυμαίνονται από χαμηλό σε υψηλό μοριακά βάρη. Αυτό το αποτέλεσμα προτείνει ότι υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες Bcl-xL μπορούσε να εμπλακεί σε έναν αριθμό διαφορετικών μοριακών συμπλόκων.

σακχαρόζης κλασματοποίηση βαθμίδωσης εκχυλίσματα συνολικών κυττάρων U2OS. U2OS (60 × 10

6 κύτταρα) λύθηκαν σε ρυθμιστικό εκχύλισης CHAPS και καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση. Τα εκχυλίσματα κλασματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία διαβάθμιση σακχαρόζης 10-40% και ίσοι όγκοι των κλασμάτων αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα για την παρουσία Bcl-xL, Bax, Rab4 και κυτόχρωμα c.

Η

Καθιέρωση κύτταρα HeLa που εκφράζουν μια βρύση-Bcl-xL πρωτεΐνη χίμαιρα

για να προσδιορίσει το σύνολο των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με Bcl-xL στο προϋποθέσεις που αναλύθηκαν, κάναμε χρήση του Tandem Καθαρισμός συγγένειας [27], [28]. Bcl-xL είναι μια ουρά σταθεροποιημένες πρωτεΐνη που αποκτά εντοπισμός μεμβράνη εισάγοντας Οτελική υδρόφοβη ουρά του στη λιπιδική διπλοστοιβάδα της μεμβράνης πολλών διαμερισμάτων. Για να αποφευχθεί η παρεμβολή με εισαγωγή μεμβράνης Bcl-XL, δημιουργήσαμε ένα φορέα έκφρασης τοποθετώντας μια ετικέτα ΤΑΡ στο Ν-τελικό άκρο της Bcl-XL. Λάβαμε επίσης έναν φορέα ελέγχου, όπου ένα κωδικώνιο διακοπής προστέθηκε καθοδικά της αλληλουχίας ΤΑΡ. Και τα δύο κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa για να ληφθούν κλώνοι που εκφράζουν σταθερά είτε ΤΑΠ-Bcl-xL ή TAP σταματήσει μόνο. Επιλέξαμε κύτταρα HeLa, επειδή μπορεί εύκολα να προσαρμοστεί για ανάπτυξη σε καλλιέργειες εναιωρήματος, με σκοπό την παραγωγή αρχικό υλικό κατάλληλο για βιοχημικές καθαρισμούς. Σε αντίθεση με U2OS, κύτταρα HeLa, επιπλέον, έχουν ένα σχετικά χαμηλό επίπεδο έκφρασης του ενδογενούς Bcl-xL (Σχήμα S1), που μπορεί να ανταγωνιστεί με ΤΑΡ-Bcl-xL για δέσμευση εταίρων. Για να ελέγξετε αν η προσθήκη της ετικέτας ΤΑΡ για την Bcl-xL θα μπορούσε να επηρεάσει την ικανότητά της να προστατεύει από την απόπτωση, θα αμφισβητηθεί κύτταρα που εκφράζουν ΤΑΡ-Bcl-xL (HeLa /ΤΑΠ-Bcl-XL) ή ΤΑΠ-stop (HeLa /TAP) με UV ακτινοβολία και ανέλυσε την κατάσταση διάσπαση PARP, ως μέτρο της δραστικότητας της κυτταρικής κασπάσης 3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, σε σύγκριση με ΤΑΡ-stop, HeLa που εκφράζουν ΤΑΡ Bcl-xL εμφανίζεται ένα μειωμένο επίπεδο του προϊόντος διάσπασης PARP. Ως εκ τούτου, η προσθήκη της ετικέτας ΤΑΡ προς το Ν-τελικό άκρο της Bcl-xL δεν εμποδίζει την ικανότητα του Bcl-xL να προστατεύουν τα κύτταρα από την υπεριώδη επαγόμενη απόπτωση. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η προσθήκη της ετικέτας ΤΑΡ να Bcl-xL θα μπορούσε να μεταβάλλει υποκυτταρική κατανομή της. κύτταρα HeLa /ΤΑΠ-Bcl-xL κλασματοποιήθηκαν σε κυτοσολική (S100), των πυρηνικών (πυρήνες), βαριά μεμβράνες (HMM) και το φως μεμβράνες (ΙΜΜ) κλάσματα με διαφορική φυγοκέντρηση. Υποκυτταρικός εντοπισμός της ΤΑΡ-Bcl-xL σε σύγκριση με ενδογενείς Bcl-xL αναλύθηκε με ανοσοκηλίδα. Η ανάλυση έχει εκτελεστεί χρησιμοποιώντας ισοδύναμες ποσότητες πρωτεϊνών για κάθε δεδομένο κλάσμα και δεν είναι κατατοπιστική για σχετική κατανομή των πρωτεϊνών αναλύονται στα διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα. Η ποιότητα της κλασματοποίησης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι γνωστών σημειωτών των υποκυτταρικά διαμερίσματα: PARP για το πυρηνικό κλάσμα, Sec23 για το κλάσμα LMM (μικροσώματα) και κυτόχρωμα c για το κλάσμα ΗΜΜ (μιτοχόνδρια). Αναλύσαμε επίσης τον εντοπισμό του Βαχ, ένα άλλο μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-xL, που είναι γνωστό ότι εντοπίζεται τόσο στο ένα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα. Το Σχήμα 2Β δείχνει ότι, ομοίως σε ενδογενή Bcl-xL, ΤΑΡ-Bcl-xL εντοπίζεται στο κλάσμα ΗΜΜ, στην LMM και στα κλάσματα S100. Ως εκ τούτου, η προσθήκη της ετικέτας ΤΑΡ δεν παρεμβαίνει με την ικανότητα των Bcl-xL να αποκτήσει εντοπισμό μεμβράνης.

κύτταρα (Α) HeLa που εκφράζουν σταθερά ΤΑΡ tagged Bcl-xL είναι πιο ανθεκτικά από τον έλεγχο στην ακτινοβολία UV-επαγόμενη απόπτωση. Ανάλυση της διάσπασης PARP σε κύτταρα HeLa που εκφράζουν ΤΑΡ μόνη της ή ΤΑΠ-Bcl-xL και ακτινοβολημένα ή όχι με UV (200 J /m

2). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 2 και 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα για την εμφάνιση του διασπασμένου προϊόντος της PARP. (Β) ΤΑΡ-tagged Bcl-xL εντοπίζεται στην ίδια ενδοκυτταρικό διαμέρισμα του ενδογενούς Bcl-XL. κύτταρα HeLa που εκφράζουν ΤΑΡ Bcl-xL κλασματώθηκαν με διαφορική φυγοκέντρηση για να ληφθεί: λωρίδα 1, πρωτεΐνες κυτοσολίου (S100)? διαδρομή 2, πυρηνικές πρωτεΐνες (πυρήνες)? λωρίδα 3, το κλάσμα βαρέων μεμβράνη (ΗΜΜ)? λωρίδα 4, το ελαφρό κλάσμα μεμβράνης (ΙΜΜ). 20 μg από κάθε κλάσμα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα για την παρουσία του ΤΑΡ BclxL (χρησιμοποιώντας δευτερογενές αντίσωμα μόνο) και ενδογενή Bcl-XL. Η ποιότητα της κλασματοποίησης προσδιορίστηκε με τη χρήση των αντισωμάτων έναντι Sec23 (LMM), το κυτόχρωμα c (ΗΜΜ), Βαχ (S100 και ΗΜΜ) και PARP (πυρήνες). κύτταρα (C) HeLa σταθερά διαμολυσμένα με ΤΑΡ μόνη ή ΤΑΡ Bcl-xL υποβλήθηκαν σε Tandem Καθαρισμός συγγένειας. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό Coomassie χρώση SDS-PAGE διεξάγεται υπό αναγωγικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται για την επίλυση εκλούσματα από καθαρισμούς. Καθαρισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα CHAPS μεμβράνης από HeLa που εκφράζουν ΤΑΡ μόνο (λωρίδα 1) ή HeLa που εκφράζουν ΤΑΡ Bcl-xL (λωρίδα 2).

Η

Ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών Bcl-XL-αλληλεπιδρούν χρησιμοποιώντας Tandem Affinity Καθαρισμός

για να παραχθεί ένα κατάλληλο υλικό εκκίνησης για καθαρισμούς TAP, HeLa /ΤΑΠ-Bcl-xL και HeLa /κύτταρα TAP προσαρμόστηκαν στην ανάπτυξη σε εναιώρημα καλλιέργειας χρησιμοποιώντας γυρίζοντας γυάλινα μπουκάλια. Με δεδομένο το ενδιαφέρον μας για τις αλληλεπιδράσεις με βάση μεμβράνη που επιλέξαμε να εστιάσουμε σε καθαρισμούς που εκτελούνται με τη χρήση μεμβρανών εκχυλίσματα. Τα κυτταρικά ιζήματα λύονται μηχανικά χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή Dounce σε ένα ρυθμιστικό υποτονικό χωρίς απορρυπαντικό. Η φυγοκέντρηση του τελευταίου κυτταρικού λύματος μας επέτρεψε να διαχωριστούν σύνολο μεμβράνες από κυτοσολικές πρωτεΐνες. Σύνολο μεμβράνες εκχυλίζονται χρησιμοποιώντας ένα CHAPS περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, και υποβλήθηκε σε καθαρισμό tandem συγγένειας. Εκλούσματα από το τελευταίο βήμα καθαρισμού συμπυκνώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE. Σύκο. 2C δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες των καθαρισμών ΤΑΡ αναλύθηκαν σε Coomassie χρώση πηκτώματα από ΤΑΡ μόνο κύτταρα που εκφράζουν (λωρίδα 1) ή ΤΑΡ Bcl-xL που εκφράζουν κύτταρα (λωρίδα 2). Μικρή υλικό προέκυψε από τις καθαρισμούς κατασκευασμένο από ΤΑΡ μόνο κύτταρα που εκφράζουν, υποδεικνύοντας ότι το υπόβαθρο δίνεται από μη εξειδικευμένη προσρόφηση στη χρωματογραφική μέσα που χρησιμοποιούνται είναι αμελητέα. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν στα πιο άφθονα είδη πρωτεΐνης αποκόπηκαν από τις πηκτές και την ταυτότητά τους εκτιμήθηκε με LC-MS /MS. Ένας κατάλογος πρωτεΐνης βρέθηκε να συν-εκλούονται με ΤΑΡ-Bcl-xL φαίνεται στον Πίνακα 1.

Η

Bcl-XL είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες

Αν και ο κατάλογος των Bcl-xL πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν παρουσιάζονται στον πίνακα 1, δεν μπορεί να ληφθεί ως εξαντλητικός, μπορεί να θεωρηθεί ένα υψηλό λίστα εμπιστοσύνη. Έχουμε υποδιαιρούνται όλες τις προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες σε διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες και για κάθε πρωτεΐνη έχουμε καθορίσει τη γνωστή ή υποτιθέμενη υπο-κυτταρικού εντοπισμού. Έχουμε επίσης δηλώσει αν η πρωτεΐνη είχε ήδη βρεθεί προηγουμένως να αλληλεπιδρούν με Bcl-xL. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα περισσότερα από αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2 που έχουν περιγραφεί προηγουμένως για να αλληλεπιδρούν με Bcl-xL είναι παρούσες στο τελικό προϊόν έκλουσης. VDAC1 επίσης ήδη περιγραφεί για να αλληλεπιδρούν με Bcl-xL [20], ενώ VDAC2, μια λιγότερο άφθονη ισομορφή, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με το πολλών τομέων Bcl-2 μέλος της οικογένειας Bak [29]. ATP2A2 /SERCA2 αντ ‘αυτού, έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά με Bcl-2 [30]. Συνολικά, η παρουσία αυτών των πρωτεϊνών στο τελικό προϊόν έκλουσης καθαρισμού μας αποτελεί μια καλή ένδειξη της ειδικότητας των αλληλεπιδράσεων που βρέθηκαν. Εκτός από τα μέλη της οικογένειας Bcl-2, έχουμε βάλει μαζί μια ομάδα πρωτεϊνών που είναι όλα μιτοχονδριακή και είναι λειτουργικά εμπλέκονται στο μεταβολισμό της ενέργειας και των μιτοχονδρίων φυσιολογία. Αυτή η ομάδα περιλαμβάνει 10 από τις 17 υπομονάδες συνθάσης ΑΤΡ πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα, υπομονάδες II και IV του κυτοχρώματος c οξειδάσης και κυτοχρώματος b5 τύπου Β, όλο το μέρος της βιοχημικής αλυσίδας υπεύθυνος για την οξειδωτική φωσφορυλίωση και την παραγωγή ΑΤΡ. Περιλαμβάνει επίσης μιτοχονδριακής συνθετάση καρβαμοϋλο-φωσφορικής 1, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση της περίσσειας της αμμωνίας από το κύτταρο, και VDAC1 και 2, τα κύρια ρυθμιστές της μιτοχονδριακής διαπερατότητας. Σε αυτή την ομάδα συμπεριλάβαμε άλλες δύο μιτοχονδριακών πρωτεϊνών προσδιορίζονται ως Bcl-xL συνδέονται: στοματίνη-σαν πρωτεΐνη 2 (StomL2) και Prohibitin 2. StomL2 έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι μέρος ενός συμπλόκου με Mitofusin 2 [31], ενώ Prohibitin 2 υποτίθεται να παίξει ένα ρόλο στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής αναπνοής.

ένα άλλο σύνολο των πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να ομαδοποιηθούν σε λειτουργική κατηγορία των μεταφορέων. Βρίσκονται σε διαφορετικά διαμερίσματα της μεμβράνης, και είναι τα εξής: το SLC3A2 αμινο μεταφορέα οξύ? η κυτταρική μεμβράνη Na + /K + ATPase μεταφορέα ATP1A1? το ER κάτοικος μεταφορέα ασβεστίου ΑΤΡ ATP2A2 /SERCA2? ο υποδοχέας τρανσφερίνης, που θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια άτυπη μεταφορέα. Μια τέταρτη λειτουργική ομάδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με Bcl-xL αποτελείται από πρωτεΐνες με ένα υποθετικό ή καθιερωμένο ρόλο στην εκκριτική υποκατάστημα της ενδοκυτταρικής διακίνησης. Αυτά είναι τα συστατικά του συμπλόκου μετατόπισης (Sec61 βήτα, Sec11A), chaperones που εμπλέκονται στην πρωτεϊνική αναδίπλωση βοήθεια στο ER (καλνεξίνη), πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε ER ειδικές τροποποιήσεις πρωτεΐνης (Ribophorin Ι, OST48, MPDU1) και πρωτεϊνών με υποθετικό ρόλο στην ER να Golgi Τρόποι αποστολής (Sec22b, Ergić-32, TMP21, TMED5, Praf2), καθώς και κατακράτησης ER (SSR4, KDEL υποδοχέα 1). Άλλες πρωτεΐνες που συνδέονται με την εμπορία Bcl-xL ήταν Rab7, ένα μικρό ΟΤΡάσης με ένα ρόλο στα τέλη ωρίμανση ενδόσωμα και VAMP3, μία πρωτεΐνη με ένα υποθετικό ρόλο σε ενδοσώματα ανακύκλωση. Τέλος προσδιορίζονται ως νέων Bc-xL πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν μια ομάδα παραγόντων είτε με άγνωστο ή πολύ κακώς περιγράφονται λειτουργία (Πίνακας 1).

Επικύρωση της αλληλεπίδρασης μεταξύ Praf2 και Bcl-xL

Η σχέση μεταξύ της εκκριτικό υποκατάστημα της ενδοκυτταρικής διακίνησης και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο είναι μακριά από το να είναι κατανοητή. Μεταξύ των πρόσφατα ταυτοποιημένες πρωτεΐνες, Praf2 έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην ER για Golgi μεταφορών [26]. Praf2 ανήκει στην οικογένεια Πρενυλιωμένο Rab Δέκτη (PRA) των πρωτεϊνών, των οποίων ιδρυτής, PRA1 /Rabac1, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με το ιικό Bcl-2 ομόλογο ΒΗΚΡ1, και ρυθμίζουν τη δράση της [32]. Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ της φυσαλιδώδους μεταφορών και την απόπτωση, αποφασίσαμε να εστιάσουμε την προσοχή μας σε Praf2. Το cDNA που κωδικοποιεί για την ανθρώπινη Praf2 ελήφθη από την κοινοπραξία IMAGE και κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3 με ένα τριπλό ετικέτα ΗΑ συντηγμένη στο Ο-άκρο της. Για να επικυρώσετε την αλληλεπίδραση μεταξύ Praf2 και Bcl-XL, κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα είτε με Praf2

ΗΑ και πλασμίδια έκφρασης

FLAGBcl-Χι μόνοι ή συν-επιμολυσμένα με δύο πλασμίδια. 24 ώρες μετά επιμολύνσεις τα κύτταρα λύθηκαν και Praf2 ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντι-ΗΑ συζευγμένο αγαρόζης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α,

FLAGBcl-xL ήταν ανιχνεύσιμη στο ίζημα μόνο όταν συν-εκφράζεται με Praf2. Ως εκ τούτου, ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει την αλληλεπίδραση των Bcl-xL και Praf2 επίσης σε ένα σύστημα δύο συστατικών, όπου Bcl-xL και Praf2 είναι ταυτόχρονα υπερεκφράζεται.

(Α) κύτταρα ΗΕΚ 293Τ είτε επιμολυσμένα με ΗΑ- tagged Praf2 ή FLAG-tagged BclxL ή συν-επιμολύνθηκαν με τα δύο φορείς έκφρασης. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση, χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ-συζευγμένα αγαρόζης και τόσο η συνολική λύματα (εισροές) και χάντρες εκλούσματα αγαρόζης (IP) αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ και FLAG μονοκλωνικά αντισώματα αντι. (Β) κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με HA-tagged Praf2 ή τον κενό φορέα (Vec) και κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση, χρησιμοποιώντας ΗΑ-συζευγμένο αγαρόζης. Αμφότερα τα προϊόντα λύσης και σφαιρίδια αγαρόζης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ και αντι αντισώματα Bcl-XL.

Η

Το εύρημα ότι Praf2 συν-καθαρίζεται με Bcl-xL με Tandem Καθαρισμός συγγένειας σαφώς καταδεικνύει ότι Bcl-XL είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με ενδογενή Praf2 σε κύτταρα HeLa. Τώρα διερευνηθεί αν ενδογενή Bcl-XL είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με Praf2 στα κύτταρα U2OS. κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή με το φορέα έκφρασης Praf2

ΗΑ, και προϊόντα λύσης immunoprecipitaed χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ-συζευγμένο αγαρόζης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, αντι ΗΑ-συζευγμένο αγαρόζης μπορεί να καθιζάνει ειδικά ενδογενή Bcl-xL σε κύτταρα επιμολυσμένα με U2OS Praf2

ΗΑ, αλλά όχι με τον κενό φορέα.

Πολλαπλά μέλη της οικογένειας Bcl-2 μπορούν να αλληλεπιδρούν με πολλαπλά μέλη της οικογένειας PRA

το ιδρυτικό μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών PRA, PRA1 /Rabac1, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με το ιικό Bcl-2 ομόλογο ΒΗΚΡ1, αλλά όχι με Bcl-2 μόνη της [32] . Επομένως θέσαμε το ερώτημα αν η ικανότητα σύνδεσης του Praf2 περιορίστηκε σε Bcl-xL ή θα μπορούσε να επεκταθεί και σε Bcl-2, καθώς και. Ζητήσαμε επίσης εάν η στενή ομόλογο του Praf2, Arl6IP5, είναι επίσης σε θέση να αλληλεπιδράσουν με Bcl-xL ή /και Bcl-2. Σύκο. 4 δείχνει ότι Praf2

ΗΑ μπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει με τα

FLAGBcl-2 (λωρίδα 4), καθώς επίσης και ότι, Arl6IP5

ΗΑ μπορεί να αλληλεπιδράσει με τα δύο

FLAGBcl-Χι και

FLAGBcl-2 ( λωρίδα 5 και 6). Arl6IP5

Αποτελέσματα έκφραση ΗΑ σε ζώνες με διαφορετικές ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Δεδομένου ότι όλες ανοσοκαταβυθίστηκε από το αντίσωμα αντι-ΗΑ και δεδομένου ότι έχει περιγραφεί ότι τόσο Praf2 και Arl6IP5 μπορεί να οδηγήσει σε SDS-αδιάλυτα είδη [33], πιστεύουμε τις ζώνες που παρατηρήθηκαν αντιστοιχούν σε μονομερή, διμερή και πολυμερή Arl6IP5 .

κύτταρα ΗΕΚ 293 επιμολύνθηκαν με είτε FLAG-tagged BclxL ή Bcl-2 μόνο (λωρίδα 1 και 2), ή συν-επιμολύνθηκαν με HA-tagged Praf2 ή ΗΑ-tagged Arl6IP5 (λωρίδες 3 έως 6) . Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση, χρησιμοποιώντας ΗΑ-συζευγμένα αγαρόζης και τα δύο προϊόντα λύσης και σφαιρίδια αγαρόζης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ και αντι αντισωμάτων FLAG. Arl6IP5 μονομερές: *? Arl6IP5 διμερές: **? Arl6IP5 πολυμερές:. ***

Η

Η διαμεμβρανική περιοχή της Bcl-xL είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδρασή του με Praf2

Η ικανότητα των Bcl-xL να αλληλεπιδρούν με τα προ-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 είναι γνωστό ότι προκαλείται από ένα υδρόφοβο σχισμή που σχηματίζεται στην επιφάνεια της από τους ΒΗ1, ΒΗ2 και ΒΗ3 [34]. Αντιστρόφως, η δέσμευση του Bcl-2 /XL να Raf και Ras έχει δειχθεί ότι εξαρτώνται από την περιοχή ΒΗ4 [35], [36]. Προκειμένου να καθοριστούν οι περιοχές των Bcl-xL υπεύθυνες για την αλληλεπίδρασή του με Praf2, δημιουργήσαμε ένα μεταλλαγμένο Bcl-xL διαγράφεται από πρώτων 24 αμινοξέων του που αντιστοιχεί στην περιοχή ΒΗ4 (Bcl-xLΔBH4). Έχουμε δημιουργείται επίσης ένα μεταλλαγμένο Bcl-XL στην οποία η τυροσίνη 101 έχει αντικατασταθεί με μία λυσίνη (Bcl-xLY101K) (Σχ. 5Α), μια μετάλλαξη που έχει περιγραφεί για την κατάργηση ικανότητα Bcl-xL να αλληλεπιδρά με Βαχ [37]. Τέλος, επειδή Praf2 είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης [33], δημιουργήσαμε ένα μεταλλαγμένο Bcl-xL διαγράφεται των Ο-τερματικών 22 αμινοξέων του που αντιστοιχεί στο διαμεμβρανικό του τομέα (Bcl-xLΔTM). Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, ούτε η διαγραφή του τομέα ΒΗ4 ούτε η μετάλλαξη Y101K επηρέασε την ικανότητά Bcl-xL να αλληλεπιδρά με Praf2. Ωστόσο, η διαγραφή της Ο-τερματικό διαμεμβράνης πεδίο, καταργούνται πλήρως αλληλεπίδραση Praf2 /Bcl-xL, υποδεικνύοντας ότι η περιοχή ΤΜ είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση αυτή.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση των κατασκευασμάτων έκφρασης Bcl-xL χρησιμοποιήθηκε σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ. Bcl-XL: πλήρους μήκους Βοΐ-χ? Bcl-xLΔBH4: Bcl-xL χωρίς τα πρώτα 24 αμινοξέα? Bcl-xLΔTM: Bcl-xL λείπουν τα τελευταία 22 αμινοξέα? Bcl-xLY101K: Bcl-xL με υποκατάσταση της τυροσίνης 101 με λυσίνη. (Β) κύτταρα ΗΕΚ 293 συν-επιμολύνθηκαν με ΗΑ-tagged Praf2 και τα κατασκευάσματα BclxL που περιγράφονται στο (Α) που φέρει ένα FLAG-tag στο Ν-άκρο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση, χρησιμοποιώντας ΗΑ-συζευγμένα αγαρόζης και τα δύο προϊόντα λύσης και σφαιρίδια αγαρόζης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντι ΗΑ και αντι FLAG αντισώματα.

Η

Praf2 υπερέκφραση επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

είναι ευρέως αποδεκτό ότι τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-xL μειώνουν επιδεκτικότητα σε απόπτωση με δέσμευση και αδρανοποιώντας προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών [8]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η υπερέκφραση του Yip3p (ζύμη PRA1 /Rabac1 ομόλογο) ανάπτυξη παρεμποδίζεται σοβαρά κυττάρου [38]. Ως εκ τούτου, εάν δοκιμαστεί Praf2 υπερέκφραση μπορεί να επάγει κυτταρικό θάνατο, και εάν αυτό θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από την ταυτόχρονη έκφραση των Bcl-xL ή του μεταλλαγμένου Bcl-xLΔTM που φάνηκε να είναι σε θέση να συνδεθεί με Praf2. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν μόνο με φορέα, με Praf2 ή συν-επιμολύνθηκαν με Praf2 και Bcl-xL ή Praf2 και Bcl-xLΔTM. Σύκο. 6Α δείχνει ότι Praf2 διαμόλυνση είχε ως αποτέλεσμα μια ισχυρή επαγωγή κυτταρικού θανάτου, με σχεδόν το 65% των κυττάρων να γίνει ΡΙ θετική. Είναι ενδιαφέρον Praf2 επαγόμενο κυτταρικό θάνατο ανεστάλη πλήρως από την ταυτόχρονη διαμόλυνση του πλήρους μήκους Bcl-xL, αλλά καμία αναστολή παρατηρήθηκε όταν Praf2 συνεπιμολύνθηκε με το μεταλλαγμένο Bcl-xLΔTM. Επιπλέον, ο κυτταρικός θάνατος που επάγεται από Praf2 συνοδεύεται από την ενεργοποίηση της κασπάσης, όπως εκτιμάται από την εμφάνιση του διασπασμένου μορφής PARP. Και πάλι, το φαινόμενο αυτό ήταν εντελώς αποκλεισμένη από Bcl-xL, αλλά όχι από το μεταλλαγμένο Bcl-xLΔTM (Εικ. 6Β). Αναστολή της Praf2-επαγόμενη διάσπαση PARP επίσης εμποδίζεται από την ταυτόχρονη έκφραση των Bcl-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) FACS ανάλυση των κυττάρων HeLa επιμολυσμένα με τις υποδεικνυόμενες φορείς έκφρασης και χρωματίστηκαν με προπίδιο ιωδίδιο ( ΠΙ). Τα ποσοστά των PI θετικών κυττάρων αναγράφεται στην πάνω αριστερή γωνία της κάθε γράφημα. (Β) Δείγματα των κυττάρων HeLa επιμολυσμένα όπως στο (Α) αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα για την εμφάνιση του διασπασμένου μορφής PARP. Τα επίπεδα έκφρασης του Praf2, Bcl-xL και Bcl-xLΔTM υποδεικνύεται επίσης. (C) Ανάλυση της GFP-Bax εντοπισμό σε κύτταρα U2OS επιμολυσμένα με άδειο φορέα (VEC) ή ΗΑ-tagged Praf2. Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές των δύο κύριων εντοπιότητας GFP-Bax που παρατηρείται στα δείγματα: διάχυτο του κυτταροπλάσματος και συγκεντρωτικά. Παραπάνω οι φωτογραφίες έδειξαν την% των GFP θετικών κυττάρων με συγκεντρωτική εντοπισμό μετά την επιμόλυνση των κυττάρων με άδειο φορέα ή ΗΑ-tagged Praf2 σε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, θέλαμε να εκτιμήσει αν Praf2 που προκαλείται απόπτωση περιελάμβανε την μετατόπιση του Bax στα μιτοχόνδρια, ένα πρώιμο συμβάν στην ενδογενή αποπτωτική παθολογική οδό. Ως εκ τούτου, συνεπιμολύνθηκαν μια GFP-Βαχ κατασκευή με Praf2 ή τον έλεγχο φορέα σε U2OS. Σύκο. 6C δείχνει ότι η έκφραση GFP-Bax στα κύτταρα U2OS μπορεί να έχει είτε μια διάχυτη κυτοσολική χρώση ή μπορούν να αθροιστούν σε συστάδες. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η συσσωμάτωση GFP-Bax, στην ίδια κυτταρική γραμμή, συνέπιπτε με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, όπως μετρήθηκε από την απώλεια ΔΨm [39]. Χρησιμοποιήσαμε μία περίσσεια Praf2 εκφράζουν ή κενό (Vec) πλασμίδια προκειμένου να ληφθεί ότι όλα τα κύτταρα που λαμβάνουν GFP-Βαχ έλαβε επίσης Praf2 και μετρήθηκαν το ποσοστό% των επιμολυσμένων κυττάρων με διάχυτη ή αθροιστικού σήματος GFP-Βαχ. Το αποτέλεσμα παρουσιάζεται στο Σχ. 6C δείχνει ότι Praf2 συν-επιμόλυνση συσχετίστηκε με περισσότερο από το 30% των κυττάρων που εμφανίζουν μια GFP-Βαχ συγκεντρωτικές χρώση, αναφορικά με μόνο το 2% παρατηρήθηκε στο κενό-φορέα συν-tansfected κύτταρα.

Νοκ-κάτω της Praf2 αυξάνει την κυτταρική επιβίωση

Είμαστε δίπλα ήθελε να καθορίσουν εάν η μείωση της έκφρασης Praf2 από την RNA παρεμβολής θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει την κυτταρική βιωσιμότητα. Η κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U2OS εκφράζει σχετικά υψηλά επίπεδα Praf2. Εμείς νοκ-κάτω την έκφραση Praf2 στα κύτταρα U2OS χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν διάφορες περιοχές του ανθρώπινου mRNA Praf2. Η ανάλυση στυπώματος Western των Praf2 δείχνει μια ισχυρή μείωση της έκφρασης Praf2 σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες επιμολυσμένα (Σχ. 7Α). Αριθ προφανές μορφολογική διαφορά ήταν διακριτό μεταξύ του ελέγχου και των κυττάρων knock-down Praf2 72 ώρες μετά την επιμόλυνση σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. Ως εκ τούτου, ρώτησε αν Praf2 αποσιώπηση θα μπορούσαν να επηρεάσουν την κυτταρική ευαισθησία στην τοξική επίδραση ενός χημειοθεραπευτικού παράγοντα όπως η ετοποσίδη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Β σίγηση του Praf2 τόσο με τις siRNAs επιλεγεί ως αποτέλεσμα τη μείωση μεγαλύτερη του 50% σε ενεργοποίηση της κασπάσης σε σχέση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα. Κατά συνέπεια, κλωνογενοποιήσεως των κυττάρων U2OS αγωγή με ετοποσίδη αυξήθηκε από κάτω του 20% του Ctrl επιμολυσμένων κυττάρων σε σχεδόν 60% σε Praf2 σιγήσει κύτταρα (Εικ. 7C). Η μείωση στην ενεργοποίηση της κασπάσης που παρατηρήθηκε μετά Praf2 RNAi δεν ήταν αποπτωτικά ερεθίσματα-ειδική ούτε τύπου κυττάρου-ειδικά, καθώς ήταν προφανές επίσης σε κύτταρα U2OS αγωγή με πακλιταξέλη ή δοξορουβικίνη (Σχ. S2A) και στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MDA-ΜΒ 231 αγωγή με ετοποσίδη (Εικ. S2B).

(Α) Ανάλυση με ανοσοστύπωμα της αποτελεσματικότητας της Praf2 γκρεμίζω μετά από επιμόλυνση των κυττάρων U2OS με δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν το mRNA Praf2. κύτταρα (Β) U2OS επιμολυσμένα με ελέγχου (Ctrl) ή Praf2 στόχευση siRNAs (siRNA5 και siRNA6) μετά από 48 ώρες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ ετοποσίδη επί 24 ώρες. Cellular κασπάσης 3 και 7 δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό λουμινομετρικές κασπάση-Glo 3/7. Το γράφημα δείχνουν το ποσοστό της κασπάσης 3 και 7 της ενεργοποίησης σε δείγματα που κατεργάζονται με τις Praf2 στόχευσης siRNAs σε σύγκριση με την δραστικότητα που υπάρχει στα κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA σε 3 ανεξάρτητα πειράματα. (C) κλωνογενοποιήσεως των κυττάρων U2OS επιμολυσμένα με έλεγχο ή Praf2 siRNAs που στοχεύουν και να αντιμετωπίζονται ή όχι με ετοποσίδη. 48 ώρες μετά την διαμόλυνση των κυττάρων U2OS με έλεγχο siRNA ή Praf2 siRNA6, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ ετοποσίδη για 3 ώρες και από μετατοπίζεται πάλι προς κανονικό μέσο για 2 εβδομάδες. Αποικίες χρωματιστό χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει το ποσοστό των αποικιών που καλλιεργούνται μετά σε σχέση θεραπεία ετοποσίδη προς το μη επεξεργασμένο μάρτυρα.

Η

Συζήτηση

Bcl-XL είναι ένα C-ουρά αγκυροβολημένα πρωτεΐνη με την ικανότητα να εντοπίζονται σε αρκετές ενδοκυττάριες μεμβράνες. Για να έχουν μια ευρεία εικόνα του συνόλου των πρωτεϊνών μεμβράνης που αλληλεπιδρούν με Bcl-xL, εκτελέσαμε Tandem Καθαρισμός συγγένειας από συνολικό κυτταρικό μεμβράνες των κυττάρων HeLa που εκφράζουν σταθερά ΤΑΡ tagged Bcl-XL. Δεδομένου ότι τα μη ιονικά απορρυπαντικά, όπως Τπίοη-100 ή ΝΡ-40 είναι γνωστό ότι μεταβάλλουν την διαμόρφωση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 [23], όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε παρουσία CHAPS, ένα απορρυπαντικό που αφήνει την διαμόρφωση της Bcl-xL αμετάβλητος. Όπως παρατίθεται στον Πίνακα 1, βρήκαμε πολλές πρωτεΐνες συν-καθαρισμό με ΤΑΡ-Bcl-XL. Ωστόσο, αυτά είναι πιθανό να αντικατοπτρίζει την πραγματική αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για τουλάχιστον δύο λόγους. Πρώτα απ ‘όλα, όπως φαίνεται στη λωρίδα 1 του Σχ. 2C, καθαρισμοί από την ίδια κυτταρική γραμμή που φέρει ένα ΤΑΡ-tag-μόνο κατασκεύασμα ανακτήσει σχεδόν μη ανιχνεύσιμα πρωτεΐνες, υποδεικνύοντας ότι όλα τα ανακτήθηκαν πρωτεΐνες πράγματι συνδέονται με Bcl-xL. Δεύτερον, όπως συζητείται παρακάτω, χρησιμοποιώντας αυτή τη διαδικασία βρήκαμε συν-έκλουση με πολλές πρωτεΐνες Bcl-xL είναι γνωστό ότι είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν ειδικά με Bcl-xL. Έχουμε υποδιαιρούνται τη λίστα των πρωτεϊνών που βρίσκονται να αλληλεπιδρούν με Bcl-xL στις λειτουργικές κατηγορίες που συζητούνται παρακάτω. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλες οι πρωτεΐνες που υπάρχουν είναι είτε πρωτεΐνες trans-μεμβράνη ή διαλυτές πρωτεΐνες εντοπισμένες σε ενδοκυτταρικά οργανίδια. Οι περισσότεροι από αυτούς εντοπίζονται στις υπο-κυτταρικά διαμερίσματα είναι γνωστό ότι στοχεύονται από Bcl-XL. Πολλά από αυτά είναι πολλαπλών συστατικών συμπλοκών πρωτείνης. Οι παρατηρήσεις αυτές αποτελούν μια καλή ένδειξη για την ισχύ της προσέγγισης που χρησιμοποιείται και της ιδιαιτερότητας και της ευαισθησίας της τεχνικής που χρησιμοποιείται. Ως εκ τούτου, μπορούμε να εξάγουμε το συμπέρασμα ότι η Bcl-xL μπορούν να ασχολούνται με πολλά διαφορετικά συμπλέγματα πρωτεϊνών σε διάφορες υπο-κυτταρικές θέσεις. Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται περαιτέρω από τα σακχαρόζη δεδομένα κλίση κλασματοποίηση παρουσιάζονται στο Σχ.