Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ρύθμιση της απόπτωσης υπό βασικές (μη στρες) συνθήκες είναι ζωτικής σημασίας για τη φυσιολογική ανάπτυξη των θηλαστικών, αλλά και για τη φυσιολογική κυτταρική κύκλο εργασιών σε διαφορετικούς ιστούς σε όλη τη ζωή. Ελλιπής ρύθμιση της βασικής απόπτωσης, ή διατάραξη της, μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της ανάπτυξης ή /και καταστάσεις ασθένειας συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Σε αντίθεση με το στρες απόπτωση που επάγεται η ρύθμιση της απόπτωσης υπό βασικές συνθήκες είναι ελάχιστα κατανοητή. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος έχουμε σύγκριση basal- και άγχος που προκαλείται από απόπτωση σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των φυσιολογικών και καρκινικών προελεύσεων. Για το σκοπό αυτό εστιάσαμε τη μελέτη μας για τις /αντι-αποπτωτικών μονοπατιών NFκB αντίθετες προ-αποπτωτικών JNK.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Συνδυαστική RNAi συν γονιδίου νοκ-άουτ είχαν χρησιμοποιηθεί για να έχουν πρόσβαση και να χαρτογραφήσει τη βασική κανονιστική οδούς της απόπτωσης. Ακολουθήστε-on, σε βάθος αναλύσεις που περιλαμβάνονται εξωγενής έκφραση των μεταλλαγμένων φωσφορυλίωση και χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση. Έχουμε αποδείξει ότι η βασική απόπτωση συστατικώς καταστέλλεται από JNK2 σε μια σειρά ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε μη-καρκινικά κύτταρα. Σίγαση JNK2 με RNAi οδήγησε σε ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσω up-ρύθμιση του ΑΡ-1 παράγοντας c-Jun. Απροσδόκητα ανακαλύψαμε ότι ΙΝΚ1 και c-Jun προώθηση βασική απόπτωση απουσία της «ενεργοποίησης φωσφορυλιώσεις» τυπικά επάγεται από στρες. Hypo-φωσφορυλιωμένη c-Jun συσσωρευτεί σε υψηλά επίπεδα μετά JNK2 αποσιώπηση, αυτορυθμιζόμενης δική του έκφραση και κατέστειλε την έκφραση των Bcl-3, ένα ασυνήθιστο πρωτεΐνη ΙκΒ και ρυθμιστής του NFκB. Basal απόπτωση που διαμεσολαβείται από τα συστατικά της οδού απόκρισης ΤΝΡα αλλά ήταν μηχανιστικά διακριτή από ΤΝΡα-επαγόμενη απόπτωση.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μηχανιστικά διακριτών οδών λειτουργούν για να ρυθμίζουν την απόπτωση σε κύτταρα θηλαστικών υπό βασικές (φυσιολογικό) έναντι συνθήκες στρες που προκαλείται. Περιγράφουμε επίσης μία νέα δίκτυο αποπτωτικό που διέπει τη βασική επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Οι πληροφορίες αυτές είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση φυσιολογική κυτταρική κύκλου εργασιών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των θηλαστικών και στη συνέχεια σε όλη τη ζωή. Η πληροφορία αυτή ανοίγει επίσης νέες προοπτικές για θεραπευτική παρέμβαση σε νοσηρές καταστάσεις του ανθρώπου πολλαπλασιαστικής συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου

Παράθεση:. Ahmed SU, Milner J (2009) Cancer Βασικού Κυττάρου επιβίωσης Συνεπάγεται JNK2 καταστολή μιας Μυθιστόρημα JNK1 /c-Jun /Bcl -3 αποπτωτικά δικτύου. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10.1371 /journal.pone.0007305

Επιμέλεια: Ανδρέας Bergmann, Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10, Αυγούστου, 2009? Δεκτές: 7 Σεπ, 2009? Δημοσιεύθηκε: 6 Οκτώβρη 2009

Copyright: © 2009 Ahmed, Milner. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα βραβείο πυρήνα ερευνητικό πρόγραμμα Yorkshire Cancer Research για JM. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα c-Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNKs) είναι μέλη της οικογένειας της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από μιτογόνο (ΜΑΡ κινάσες, MAPKs) και ενεργοποιούνται σε απόκριση σε κυτταρικό στρες [1], [2]. Σε απάντηση τονίσει JNK1 και JNK2 ενεργοποιούνται μέσω διπλής φωσφορυλίωσης των T183 και Y185 από κινάσες ΜΑΡΚ (ΜΑΡΚΚ), ειδικά ΜΚΚ4 και ΜΚΚ7 [3], [4]. MAPKs και MAPKKs αποτελούν μέρος μιας μεταγωγής σήματος υπερ-οικογένειας που περιλαμβάνει τα εξωκυτταρικά κινάσες σήματος ρυθμίζεται (ΕΚΚ) και p38 ΜΑΡΚ. Οι λειτουργίες του JNK1 και JNK2 προσδιορίζεται από τον τύπο των κυττάρων και από τη φύση του στρες υπεύθυνος για την ενεργοποίηση τους. Οι αρχικές μελέτες που προσδιορίζονται JNKs από την ικανότητά τους να φωσφορυλιώνουν το Ν-τελικό άκρο της c-Jun, μέλος της πρωτεΐνης ενεργοποίησης 1 (ΑΡ-1) οικογένεια παράγοντα μεταγραφής [5]. Ακολούθως JNKs έδειξαν να φωσφορυλιώνει και ρυθμίζει τη δράση των άλλων πρωτεϊνών ΑΡ-1, καθώς και επιπλέον πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων ρ53, c-myc, Bcl-2 και Bim [2], [6].

AP-1 παράγοντες είναι μία ομάδα δομικά και λειτουργικά συναφών μελών της πρωτεΐνης οικογένειας Jun (c-Jun, JunB και JunD) και η οικογένεια πρωτεϊνών Fos (c-Fos, Fos Β, Fra-1 και Fra-1) [7]. Διμερισμός εντός αυτών των μελών της οικογένειας σχηματίζει ένα παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-1 και η σχετική αφθονία των επιμέρους υπομονάδων ΑΡ-1 και τη σύνθεση του διμερούς είναι σημαντικοί παράγοντες που καθορίζουν κύτταρο μοίρα. Το ρεπερτόριο του ΑΡ-1 σύνθεση διμερούς επιτρέπει την προσαρμογή ενός ΑΡ-1 διαμεσολαβούμενη απόκριση από μεμονωμένους τύπους κυττάρων σε ένα δεδομένο ερέθισμα. Μετα-μεταφραστική τροποποίηση και του κύκλου εργασιών της πρωτεΐνης είναι δύο μηχανισμοί για τη ρύθμιση της δραστηριότητας του ΑΡ-1. Για παράδειγμα, σε απάντηση στο στρες του δυναμικού διενεργοποίησης του c-Jun ενεργοποιείται με Ν-τερματική φωσφορυλίωση JNK μεσολάβηση [8], [9], ενώ η σταθερότητα του c-Jun πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω της GSK-3 με τη μεσολάβηση C-τερματική φωσφορυλίωση η οποία στοχεύει c-Jun για ubiquitinylation και αποδόμησης μέσω των Ε3 λιγάση Fbw7 [10].

ένα σημαντικό ενεργοποιητής του αποπτωτικού μονοπατιού JNK είναι παράγοντας νέκρωσης όγκου α (TNFa), ένας προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη που διέπει την επιβίωση των κυττάρων μέσω προώθηση είτε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή απόπτωση [11]. TNFα εμπλέκεται με τριμερείς υποδοχέα του, TNFR1, στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης. ΤΝΡα /TNFR1 αλληλεπίδραση οδηγεί στο σχηματισμό ενός ενδοκυτταρικού ετερογενές σύμπλεγμα πρωτεΐνης (σύμπλοκο 1) στην κυτταροπλασματική ουρά του TNFR1. Με τη σειρά του αυτό το σύμπλεγμα οδηγεί στην ενεργοποίηση της JNK και επίσης του ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ). Κομψό μελέτες

in vitro

και

in vivo

έχουν αποδείξει ότι, σε ηπατοκύτταρα που εκτίθενται σε TNFα, ενεργοποιημένα JNK1 φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την Ε3 ουμπικουιτίνης ITCH λιγάση [1], [12]. Ενεργοποιείται ITCH προκαλεί ubiquitinylation και την υποβάθμιση των cFLIP (κυτταρική ΡΕΙΟΕ-ανασταλτική πρωτεΐνη) η οποία αναστέλλει διαφορετικά ειδικά την ενεργοποίηση της προ-κασπάσης 8 (ονομάζεται επίσης ΡΕΙΟΕ). Κασπάσης 8 αποτελέσματα ενεργοποίηση της απόπτωσης [1], [10]. Αυτό το προ-αποπτωτικό μονοπάτι είναι αντισταθμίζεται από NFκB που μέχρι-ρυθμίζει την έκφραση c-FLIP και ως εκ τούτου αναστέλλει την προ-κασπάσης 8 ενεργοποίηση και απόπτωση [13].

ΝΡκΒ είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που αποτελείται από ομο- ή ετερο των μελών της οικογένειας Rel πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των ρ65 (ΚεΙΑ), RelB, c-Rel, ρ50 και ρ52 (που επισκοπείται στο [14]. domains ενεργοποίησης μεταγραφής απουσιάζουν σε ρ50 και ρ52 η οποία έτσι χρειάζεται να σχηματίζουν ετεροδιμερή προκειμένου να διενεργοποιεί γονιδίων στόχων. Το κύριο συγκρότημα είναι ένα ετεροδιμερές της p65-p50, αλλά διαφορετικές συνθέσεις διμερές σχηματίζονται επίσης. NFκB υπόκειται σε ρύθμιση από αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με πρωτεΐνες ΙκΒ. ΙκΒα και IκBβ στοχεύουν κατά προτίμηση ετεροδιμερή p65-p50. Η φωσφορυλίωση της ΙκΒ από ΙκΒ κινάσες προκαλεί αποικοδόμηση της ΙκΒ με την απελευθέρωση του διμερούς ΝΡκΒ που μετατοπίζεται στον πυρήνα και ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων. Bcl-3 είναι ένα ασυνήθιστο ΙκΒ η οποία κατά προτίμηση δεσμεύει ρ50-ρ50 και ομοδιμερή ΝΡκΒ ρ52-P52 [15], [16]. Bcl-3 είναι περαιτέρω διακρίνονται από άλλες πρωτεΐνες ΙκΒ στο ότι μπορεί να εντοπίζεται στον πυρήνα, δεν αποικοδομείται κατά την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ και διαθέτει επτά, αντί έξι, επαναλαμβανόμενες επικράτειες ανκυρίνης. Πυρηνικός εντοπισμός των Bcl-3 είναι συμβατό με την ικανότητά του να σχηματίζει ένα τριμερές σύμπλοκο με DNA δεσμευμένο ρ50: ομοδιμερή ρ50 του ΝΡκΒ, και επίσης για να βοηθήσει την πρόσληψη του ρ50 εντός του πυρήνα (βλέπε [17] και παραπομπές εκεί). Bcl-3 περιγράφηκε για πρώτη φορά σε Β-κυττάρου χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [18] και θεωρείται ως ένα υποθετικό ογκοπρωτείνης.

Εκτός από τους ρόλους τους στην απόκριση στρες JNK1 και JNK2 επίσης λειτουργούν υπό βασικές, μη-στρες συνθήκες όπως αποδεικνύεται από ανωμαλίες ιστο-ειδικούς παρατηρείται σε JNK1 – /- και ΙΝΚ2 – /- ποντίκια. Για παράδειγμα, JNK1 – /- ποντίκια εμφανίζουν μειωμένη διαφοροποίηση των Τ-κυττάρων και ελαττωματικά ανοσίας [19]. Είναι σημαντικό JNK1 – /- ποντίκια αναπτύσσουν επίσης αυθόρμητη εντερική όγκους, υποδεικνύοντας ότι λειτουργεί ΙΝΚ1 ως καταστολέας όγκου για αυτόν τον τύπο του ιστού [20]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί των JNK1 και JNK2 λειτουργούν υπό βασικές, οι φυσιολογικές συνθήκες είναι ελάχιστα κατανοητές.

Για να διερευνηθούν οι επιμέρους ρόλους των JNK1 και JNK2 σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα υπό βασικές συνθήκες χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό (i) RNAi που προκαλείται ελλείψει της εφαρμοσμένης στρες, (ii) το γονίδιο knock-out κυτταρικές σειρές, και (iii) εξωγενές γονιδιακής έκφρασης. Σε μια σειρά ανθρώπινων κυτταρικών σειρών που ανακαλύψαμε ότι JNK1 είναι ενεργά προ-αποπτωτικών αλλά ιδιοσυστατικά αναστέλλεται από την παρουσία του JNK2 σε καρκινικά κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε μη-καρκινικά κύτταρα. πειράματα συν-φίμωση αποκάλυψε ότι αυτά τα βασικά, αντίθετα προ- και αντι-αποπτωτικών λειτουργίες των JNK1 και JNK2 είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητες από ανάντη κινάσες ΜΚΚ4 και ΜΚΚ7. Αυτό ήταν σύμφωνο με την έλλειψη ορατή αλλαγή στην φωσφορυλίωση ΙΝΚ1 παρά ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση μετά την εξάντληση των JNK2. Περαιτέρω πειράματα αποκάλυψαν ότι η βασική ΙΝΚ1 προ-αποπτωτική οδός περιλαμβάνει c-Jun συν τις συνιστώσες του ΤΝΡα αποκρίνονται διαδρομή ΜΑΡ κινάσης σε συνδυασμό με την οδό ΝΡκΒ μέσω c-Jun μεσολάβηση κάτω ρύθμιση των Bcl-3. Έτσι, η βασική ρύθμιση της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων φαίνεται να εξαρτάται από τις αντιτιθέμενες λειτουργίες των JNK2 /Bcl-3 (προ-επιβίωσης) και JNK1 /c-Jun (προ-αποπτωτικών) και να είναι υπό έλεγχο από συστατική JNK2.

Αποτελέσματα

Επιλεκτική knock-down της JNK2 ενισχύει την έκφραση JNK1

για RNAi που χρησιμοποιούνται συνθετικά siRNA που υπό συνθήκες αποδειχθεί στο παρελθόν να δώσει αποτελεσματική knock-down των mRNA στόχο χωρίς την ενεργοποίηση του p53 κυτταρική αντίδραση στο στρες [21], [22]. έλεγχοι RNAi συμπεριλαμβάνονται BCR-ABL siRNA, η οποία δεν έχει στόχο mRNA σε επιθηλιακά κύτταρα και ως εκ τούτου χρησιμεύει ως μη λειτουργικό έλεγχο siRNA, και λαμίνη A /C siRNA που στοχεύει λαμίνη A C mRNA και /χρησιμεύει ως μάρτυρας λειτουργικό siRNA (Methods ). Επιλεκτική knock-down της JNK1 και JNK2 mRNA επανελήφθη με δύο διαφορετικά siRNAs για κάθε στόχο (Μέθοδοι και Εικ. S1). Η απόδοση του mRNA knock-down προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR και ήταν παρόμοια και για τις δύο JNK1 και JNK2 (~ 75% μείωση?. Βλέπε Σχήμα 1Α για τα επίπεδα JNK1 mRNA). RNAi που προκαλείται από σίγηση του λαμίνη A /C ή του JNK1 δεν προκάλεσε καμία αλλαγή στο ρ53 ή ρ21

WAF1, ένα γονίδιο στόχος ρ53-εξαρτώμενη (Σχ. 1Β για JNK1 siRNA και Εικ. S2 για λαμίνη A /C siRNA) , επιβεβαιώνοντας έτσι ότι οι συνθήκες της RNAi

per se

δεν ξεκινήσει μια απάντηση p53 στρες. Ωστόσο JNK2 σίγηση οδήγησε σε τριπλάσια αύξηση ~ 3 σε πρωτεΐνη ρ53 (Εικ. 1 Β) υποδεικνύοντας ότι JNK2 άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζει τον κύκλο εργασιών της ρ53 πρωτεΐνης. Αυτό είναι συνεπές με την έκθεση ότι JNKs μπορεί να ρυθμίσει το βασικό κύκλο εργασιών της p53 [23]. Είναι ενδιαφέρον, συν-αποσιώπηση των JNK1 με JNK2 κατήργησε την αύξηση της ρ53 (Εικ. 1Β) υπονοώντας ότι JNK1 και JNK2 ασκούν συντονισμένα αποτελέσματα μετά από τον κύκλο εργασιών της p53.

επίπεδα (Α) JNK1 mRNA, και ( Β) JNK1, JNK2, και επίσης ρ53 και ρ21 επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίζεται 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με JNK1- και JNK2-siRNAs όπως υποδεικνύεται (Μέθοδοι). εικόνων (C) αντίθεση φάσης των κυττάρων HCT116 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με JNK1- και JNK2-siRNAs. (Δ) Η απόπτωση προσδιορίζεται με επισήμανση V αννεξίνη κυττάρων siRNA επεξεργασμένου σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους σε μια σειρά ανθρώπινων κυτταρικών σειρών (Methods. Σημείωση: τα αποτελέσματα της απόπτωσης είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων επανάληψη εκτός εάν ράβδοι σφάλματος συμπεριλαμβάνονται για επαναλαμβανόμενες αναλύσεις ένα μόνο πείραμα). (Ε) Κασπάση 8 και τα προϊόντα διάσπασης του, ενεργοποιημένη κασπάση 7 και τελεστή κασπάσης 3 μετά μεσολάβηση RNAi σίγηση του JNK1 και JNK2 όπως υποδεικνύεται. ελέγχου ακτίνης = φόρτωσης. HCT116 p53 + /+ και HCT116 p53 – /- είναι ισογονιδιακές κλώνων του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα (Μέθοδοι)

Η

Απροσδόκητα, το HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα JNK2 knock-down οδήγησε σταθερά σε -50%. αύξηση στα επίπεδα mRNA JNK1 και ένα ~ 3 φορές αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης JNK1 (Εικ. 1Α και 1Β). Παρόμοια αποτελέσματα για JNK1 mRNA λήφθηκαν με ισογονικών HCT116 ρ53

+ /+ και HCT116 ρ53

– /- κύτταρα (Εικ. 1Α και 1Β), υποδεικνύοντας ότι η επίδραση είναι ανεξάρτητη της ρ53. Έτσι, σε κύτταρα HCT116, η παρουσία JNK2 άμεσα ή έμμεσα καταστέλλει τα βασικά επίπεδα έκφρασης ΙΝΚ1.

JNK2 knock-down προκαλεί απόπτωση

knock-down του JNK2 οδήγησε σε απόπτωση σε μια σειρά από καρκίνο κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν HCT116 κύτταρα (Σχ. 1C και 1D). Η απόπτωση προσδιορίστηκε με κηλίδωση αννεξίνη V (Μέθοδοι) και εμπλεκόμενα ενεργοποίησης προ-κασπάσης 8 και τελεστή κασπασών 3 και 7 (Σχ. 1Ε). Αυτή η αποπτωτική δράση της εξάντλησης JNK2 ήταν ανεξάρτητη της ρ53 όπως αποδεικνύεται από HCT116 ρ53 – /- κύτταρα (Εικ. 1C και 1D). Σε μη-καρκινικά κύτταρα JNK2 σίγηση δεν επάγουν απόπτωση (επιθηλιακά κύτταρα ARPE19 και ΜΟΡ10Α, και WI-38 ινοβλάστες) παρά αποτελεσματική JNK2 mRNA knock-down (Εικ. 1 D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση με JNK2 αποσιώπηση, τη φίμωση του JNK1 δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα σε καμία από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχ. 1C και 1D). Συνολικά τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι JNK2, αλλά όχι JNK1, είναι απαραίτητο για τη βασική βιωσιμότητα σε έναν αριθμό ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών κυττάρων MCF7 καρκίνου του μαστού, αλλά δεν είναι απαραίτητη για τη βασική βιωσιμότητα των μη καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων των επιθηλιακών ΜΟΡ10Α μαστού.

η απόπτωση είναι ΙΝΚ1 εξαρτώμενη

επόμενο συν-σιγήσει JNK1 με JNK2 προκειμένου να διερευνηθεί λειτουργική σύνδεση τους στη ρύθμιση της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων. Σε όλες τις περιπτώσεις όπου JNK2 σίγηση απόπτωση που επάγεται βρήκαμε ότι η συν-αποσιώπησης JNK1 με JNK2 διασώθηκαν κύτταρα JNK2-εξαντλημένο από απόπτωση (Σχ. 1D). Έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι JNK1 και JNK2 αντισταθμίσει το ένα το άλλο για τη διατήρηση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων και ότι JNK2 καταστέλλει ιδιοσυστατικά ΙΝΚ1 απόπτωση που διαμεσολαβείται υπό βασικές συνθήκες.

ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση είναι ανεξάρτητη της ενισχυμένης JNK1 S63 /73 φωσφορυλίωση

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΙΝΚ1 είναι γεμάτοι για να επάγει απόπτωση σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα αλλά ιδιοσυστατικά καταστέλλεται από JNK2. Τόσο JNK1 και JNK2 είναι κατάντη μεσολαβητές της αποπτωτικής οδού της ΜΑΡ κινάσης και ενεργοποιούνται σε απάντηση στο στρες από ΜΚΚ4 και /ή φωσφορυλίωση ΜΚΚ7 στο T183 /Y185 (Εισαγωγή). Είμαστε δίπλα σε σύγκριση φωσφορυλίωση JNK1 και JNK2 υπό βασικές (RNAi) και το στρες που προκαλείται (UV ή TNFα) συνθήκες.

Όπως ήταν αναμενόμενο υπεριώδη ακτινοβολία που προκαλείται έντονη φωσφορυλίωση στα κατάλοιπα T183 /Y185 τόσο JNK1 και πρωτεϊνών JNK2 σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 2Α). Ομοίως, η επεξεργασία των HCT116 κυττάρων με ΤΝΡα επίσης επαγόμενη JNK1 και JNK2 φωσφορυλίωση στο T183 /Y185 (Εικ. 2Β, άνω πίνακας). Σε αυτή την τελευταία περίπτωση φωσφορυλίωση JNK1 κυριάρχησε πάνω φωσφορυλίωση JNK2. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν σαφώς φωσφορυλίωση του JNK1 και JNK2 σε απόκριση σε γενοτοξικό στρες (UV) και να τη μεσολάβηση υποδοχέων στρες (TNFa) σε κύτταρα HCT116. Τόσο UV-ακτινοβολία και TNFa που προκαλείται από απόπτωση (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

(Α) Σύγκριση του JNK1 /κατάσταση φωσφορυλίωσης JNK2 στον έλεγχο, JNK2-σιγήσει και ακόλουθη ακτινοβόληση με UV (HCT116 κύτταρα? Μέθοδοι).. p-JNK1 = φωσφορυλιωμένη JNK1, pJNK2 = φωσφορυλιωμένη JNK2 (βέλη). (Β) Επιπτώσεις του TNFα με την κατάσταση φωσφορυλίωσης των JNK1, JNK2 και c-Ιούνιος (C) Co-φίμωση c-Jun με JNK2 διασώζει κύτταρα HCT116 από απόπτωση (επισήμανση αννεξίνη V? Μέθοδοι). (D) JNK1, JNK2 και c-Jun επίπεδα πρωτεΐνης 48 ώρες μετά μεσολάβηση RNAi σίγηση του JNK2 και c-Jun. Τα επίπεδα Ρ53 και της πρωτεΐνης ρ21 φαίνεται επίσης. (Ε) επίπεδα c-Jun mRNA μετά JNK1 και JNK2 αποσιώπηση. (F) φορές αύξηση στα επίπεδα c-Jun mRNA σε HCT116 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ARPE19 48 ώρες μετά την JNK2 σίγηση. (G) εξόντωση c Jun-mRNA και πρωτεΐνη επίπεδα σε HCT116 p53 + /+ κυττάρων μετά από θεραπεία c-Jun siRNA.

Η

Υπό βασικές συνθήκες, όταν JNK1 ήταν ενεργά προ-αποπτωτικών εξής JNK2 σίγηση, εκεί δεν ήταν διακριτή αύξηση στην φωσφορυλίωση JNK1 T183 /Y185 (Εικ. 2Α, συγκρίνετε λωρίδα ελέγχου με JNK2 siRNA λωρίδα). Αυτό είναι σε πλήρη αντίθεση με τις συνθήκες στρες που προκαλείται από (σχήμα 2Α?. Συγκρίνετε JNK2 siRNA λωρίδα με υν λωρίδα). Έτσι συμπεραίνουμε ότι JNK1 είναι σε θέση να προωθήσει την απόπτωση με την απουσία του «ενεργοποίησης» φωσφορυλιώσεις T183 /Y185 που χαρακτηριστικά επάγονται σε απόκριση στο στρες. Co-φίμωση ανάντη κινάσες ΜΚΚ4 ή ΜΚΚ 7 με JNK2 μόνο μερικώς διασωθεί ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση (Σχ. S3), περαιτέρω τεκμηριώνουν την ικανότητα του JNK1 να προωθήσει την απόπτωση με την απουσία της ενισχυμένης T183 /Y185 φωσφορυλιώσεις.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι, υπό βασικές συνθήκες, JNK1 μπορεί να προωθήσει ενεργά την απόπτωση χωρίς να υποβάλλονται σε ενισχυμένη T183 /Y185 φωσφορυλίωση χαρακτηριστικό της κυτταρικής απόκρισης στρες. Αυτή βασική προ-αποπτωτική λειτουργία του JNK1 είναι εμφανής σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα (αλλά όχι σε μη καρκινικά κύτταρα) και ιδιοσυστατικά αναστέλλεται από ενδογενή JNK2. Για τη διερεύνηση της βασικής οδού αποπτωτικό υπό έλεγχο JNK1 εμείς επόμενου πραγματοποίησε μια σειρά από συν-φίμωση πειράματα με στόχο τον προσδιορισμό απαραίτητη προ-αποπτωτικών μεσολαβητών που συνδέονται με την JNK1 εξαρτώμενη απόπτωση μετά JNK2 σιγαστήρα.

c-Jun είναι μια ουσιαστικό μεσολαβητή των βασικών απόπτωση και υπόκειται σε αντίθετα αποτελέσματα των JNK1 και JNK2

θα ήθελα να ρωτήσω αν το c-Jun απαιτείται για την απόπτωση υπό βασικές συνθήκες που συν-σιγήσει c-Jun με JNK2 (Σχήμα 2?. η αποδοτικότητα του c-Jun mRNA knockdown φαίνεται στο Σχ. 2G). Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι το c-Jun συν-σίγηση διασώζει JNK2-σιγήσει HCT116 κύτταρα από την απόπτωση με προσδιορισμό c-Jun ως ουσιαστικό μεσολαβητής της απόπτωσης που υπόκεινται σε καταστολή JNK2 υπό βασικές συνθήκες (Εικ. 2C).

Η c-Jun πρωτεΐνης συσσωρεύθηκαν σε υψηλά επίπεδα μετά JNK2 σίγηση σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 2D?. αυξημένη c-Jun παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα RKO και Lovo εξής JNK2 σίγησης, που δεν φαίνεται) παραλληλίζεται με μία αύξηση στο c-Jun mRNA (Σχ. 2Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε όταν ΙΝΚ1 συν-σιγήσει με JNK2 (Εικ. 3Α για την πρωτεΐνη c-Jun και Σχ. 2Ε για c Jun-mRNA) που δείχνει ότι πάνω ρύθμιση της c-Jun εξαρτάται από την συνεχή παρουσία του JNK1 . JNK1 φίμωση μόνη προκάλεσε μια μείωση στην c Jun-mRNA και πρωτεΐνης (Σχ. 2Ε και το Σχ. S4). Αυτές οι συνδυασμένες παρατηρήσεις δείχνουν ότι JNK1 και JNK2 ασκούν αντίθετα αποτελέσματα κατά την έκφραση του c-Jun και ότι JNK1 απαιτείται για τη συντήρηση των βασικών επιπέδων c-Jun mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης, ενώ JNK2 καταστέλλει ιδιοσυστατικά επίπεδα c-Jun mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε HCT116 p53

+ /+ και HCT116 p53

– /- κύτταρα (βλέπε για παράδειγμα Σχήμα 2Ε.). Είναι ενδιαφέρον ότι τα αυξημένα επίπεδα του c-Jun mRNA δεν παρατηρήθηκαν σε JNK2-σιγήσει κύτταρα ARPE19 (Σχ. 2F) σύμφωνο με την έλλειψη απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 1D).

(Α) Συνολική πρωτεΐνη c-Jun και φωσφορυλιώσεις σε S63, S73 και T91 παρακάτω είτε UV-ακτινοβολία (δεξιά λωρίδα) ή JNK1 και JNK2 RNAi που προκαλείται σίγαση. (Β) Σχηματική παρουσίαση

c-Jun

και το amplicon χρησιμοποιείται για την ανίχνευση c-Jun στον υποκινητή. φωσφο-ειδικά αντισώματα (γ) Συνολικός και φωσφορυλιωμένες μορφές του c-Jun δεσμεύεται στον υποκινητή c-Jun ανιχνεύεται με χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) με c-Jun και c-Jun. Ιστόγραμμα δείχνει φορές εμπλουτισμό σε σχέση με ελέγχους IgG (Μέθοδοι).

Η

Τα αποτελέσματά μας εντοπισμό αντίθετα αποτελέσματα των JNK1 και JNK2 σε c-Jun. Από την άποψη αυτή διαφέρει από τις παρατηρήσεις που λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση «χημικά γενετικής» στο οποίο η καταλυτική σύνδεσης ΑΤΡ τσέπη του JNK2 επεκτάθηκε με μετάλλαξη [2]. Το συμπέρασμα από αυτή τη δεύτερη προσέγγιση ήταν ότι JNK1 και JNK2 και θετικά ρυθμίζουν την έκφραση c-Ιούνιος Ωστόσο, είναι δυνατόν ότι η επέκταση της ΑΤΡ-δέσμευσης τσέπη του JNK2 μπορεί διαταράσσουν την χωρική μοριακή οργάνωση του παρακείμενου β-κλώνους σαν περιοχή της JNK2 πρωτεΐνης. Δεδομένου ότι αυτή η β-κλώνους, όπως τομέα είναι σημαντική για την JNK2 αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης προτείνουμε εντοπισμένη διατάραξη στην περιοχή αυτή μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τα χαρακτηριστικά πρόσδεσης των JNK2 πρωτεΐνης για υποστρώματα στόχους της. Αυτό μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία των μεταλλαγμένων JNK2 με τρόπους που προστίθενται στις προβλεπόμενες επιπτώσεις στη μοριακή πρόσβαση σε διευρυμένη θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ της JNK2

Μια άλλη μελέτη που συνέκρινε ινοβλάστες ποντικού που προέρχεται από JNK1 -. /- Και JNK2 – /- ποντίκια έδειξαν ότι JNK1 και JNK2 μπορούν να λειτουργήσουν ως αντίθετες ρυθμιστές του c-Jun [3]. Η δική μας αποτελέσματα, κάτω από βασικές συνθήκες, είναι συνεπείς με την έκθεση αυτή και δείχνουν ότι σε HCT116 κύτταρα αποτελέσματα (i) JNK2 σίγηση σε πάνω ρύθμιση της c Jun-mRNA συνοδεύεται αξιοσημείωτη συσσώρευση της c-Jun πρωτεΐνης, και (ii) τα πάνω ρύθμιση του c-Jun υπό αυτές τις συνθήκες εξαρτάται από ΙΝΚ1.

up-ρύθμιση των JNK1 σε κύτταρα JNK2-εξαντλημένο είναι ανεξάρτητη του c-Jun

Δεδομένου ότι η βασική πάνω ρύθμιση της c-Jun (σε κύτταρα JNK2-απεμπλουτισμένου) απαιτεί JNK1 (βλέπε παραπάνω) αναρωτηθήκαμε εάν c-Jun, με τη σειρά του, είναι απαραίτητη για την αυξητική ρύθμιση της JNK1 πρωτεΐνης μετά JNK2 σίγηση (Εικ. 1Β). Ωστόσο, η αύξηση των JNK1 που παρατηρήθηκε με συνέπεια σε κύτταρα JNK2-σιγήσει ήταν ανεπηρέαστη με συν-φίμωση c-Jun με JNK2 (Εικ 2Δ?. Ανώτερο πλαίσιο). Αυτό δείχνει ότι η ενισχυμένη mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης JNK1 εξής εξάντληση JNK2 είναι ανεξάρτητη του c-Jun.

Hypo-φωσφορυλιωμένη c-Jun δεσμεύεται με το υποκινητή c-Jun

στρες που προκαλείται από S63 /S73 φωσφορυλίωση του c-Jun από κινάσες JNK κυκλοφορίες c-Jun από μία ανασταλτική συγκρότημα επιτρέποντας έτσι c-Jun να δεσμεύει και υποκινητές στόχος μετενεργοποιούν [24]. φωσφορυλίωση που προκαλείται από στρες του c-Jun σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με UV-ακτινοβολία φαίνεται στο Σχ. 3Α. Ωστόσο, αν και παρατηρείται υψηλή συγκέντρωση c-Jun πρωτεΐνης μετά JNK2 σίγηση (Σχήμα 3Α?. JNK2 siRNA λωρίδα) αυτή ήταν ανεξάρτητη της αυξημένης φωσφορυλίωσης Ν-τερματικό στο S63, S73 ή S91 (Σχήμα 3Α).

JNK2 σίγηση επάγει μια αξιοσημείωτη αύξηση στα επίπεδα c-Jun mRNA (βλέπε παραπάνω, Σχ. 2Ε). Θα ήθελα να ρωτήσω εάν η αυξημένη μεταγραφές c-Jun οφείλονταν, τουλάχιστον εν μέρει, σε μια θετική αυτο-ρυθμιστικών feed-back loop θα εκτελείται χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) για συγκροτήματα c-Jun /c-Jun προαγωγός (Εικ. 3Β και 3C) . Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 c-Jun ήταν ανιχνεύσιμη στον υποκινητή c-Jun (Σχ. 3C, έλεγχοι). Μετά UV-ακτινοβολία c-Jun φωσφορυλιώθηκε σε S63 και S73 (Εικ. 3Α) και η φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη δεσμεύεται στον υποκινητή c-Jun όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση ChIP χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-T63 /73 c-Jun αντισώματα (Σχ. 3C). Σε κύτταρα JNK2 εξαντλημένο, υπό βασικές συνθήκες, καμία αλλαγή στην c-Jun T63 /73 φωσφορυλίωσης ήταν εμφανής σε σχέση με τους ελέγχους (Σχ. 3Α). Παρ ‘όλα αυτά c-Jun σε αυτά τα κύτταρα συνδέθηκε στον υποκινητή c-Jun (Σχ. 3C). Η έλλειψη φωσφορυλίωσης της χρωματίνης δεσμευμένου c-Jun επιβεβαιώθηκε από την έλλειψη αντιδραστικότητας με αντι-φωσφο-T63 /73 c-Jun αντισώματα (Σχ 3C?. Συγκρίνουν τα δείγματα από κύτταρα UV-ακτινοβολημένα κύτταρα με JNK2-σιγήσει). Έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι S63 /73 υπο-φωσφορυλιωμένη c-Jun συνδέεται με τη δική υποστηρικτής ακόλουθη εξάντληση JNK2 και είναι πιθανό να συμβάλλουν στα υψηλά επίπεδα έκφρασης του c-Jun mRNA (~ 9-πλάσια αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο, βλέπε εικ. 2Ε) προκάλεσε κάτω από αυτές τις βασικές συνθήκες.

συσσώρευση πρωτεΐνης c-Jun συσχετίζεται με απώλεια της φωσφορυλίωσης στο S243

είναι πιθανό ότι το c-Jun διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα σε κύτταρα HCT116, χαμηλότερες από αυτή που παρατηρείται για τις μη κύτταρα -cancer ARPE19 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), μέσω συνεχούς αποδόμησης πρωτεΐνης c-Jun. Υποβάθμιση του c-Jun περιλαμβάνει φωσφορυλίωση C-τερματικού σταθμού στο S243 που πριμοδοτεί c-Jun για φωσφορυλίωση μεσολαβεί η GSK3 σε T239. Αυτό δημιουργεί μια θέση πρόσδεσης για την ubiquitin λιγάση Fbw7 Ε3, με αποτέλεσμα polyubiquitinylation και την υποβάθμιση του c-Jun [10]. Στην παρούσα μελέτη μας διαπιστώσαμε ότι JNK1 σίγηση προκάλεσε μια μικρή αλλά αναπαραγώγιμη αύξηση του c-Jun S243P (βλέπε σχήμα 4Β-4D?. Έλεγχος λωρίδα cp JNK1 siRNA λωρίδα S243P ανοσοστυπώματα). Αντίθετα JNK2 φίμωση επαναλήψιμα προκάλεσε μειωμένα επίπεδα της c-Jun 243P, μερικές φορές μη ανιχνεύσιμα παρά την μαζική συσσώρευση της συνολικής πρωτεΐνης (Εικόνα 4Β-4D?. Έλεγχος λωρίδα cp JNK2 siRNA για S243P ανοσοστυπώματα). Έτσι JNK1 και JNK2 ασκούν αντίθετες επιδράσεις επί της φωσφορυλίωσης c-Jun σε S243, μία τροποποίηση που συνδέεται με de-σταθεροποίηση του c-Jun πρωτεΐνης.

(Α) Σχηματική παρουσίαση θέσεις φωσφορυλίωσης της c-Jun από JNK, GSK -3 και ERK, και τις αντίστοιχες λειτουργικές συνέπειες τους. Σημειώστε ότι S243P είναι προαπαιτούμενο της φωσφορυλίωσης T239 (υποδεικνύεται με καμπύλο βέλος). (Β) ανοσοστυπώματα που δείχνουν επιδράσεις των JNK1, JNK2 και GSK3 σίγηση, μόνα τους και σε συνδυασμούς, σε ένα πάνελ κυτταρικών πρωτεϊνών HCT116. (Γ) και (Δ) ανοσοστυπώματα εξής συνδυαστικής σίγηση του JNK1 και JNK2 με Fbw7 και ERK. (Ε) Essential προ-αποπτωτικών ενδιάμεσα προσδιορίστηκε με συν-σίγησης με JNK2. (F) απόπτωση μετά JNK2 αποσιώπηση υπό βασικές συνθήκες είναι ανεξάρτητο από Bax, όπως αποδεικνύεται από Bax +/- και Bax – /-. HCT116 ισογονιδιακές κλώνους

Η

GSK3, ERK, Fbw7 και ITCH είναι απαραίτητα μεσολαβητές της βασικής ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση

σε μία περαιτέρω σειρά συν-φίμωση πειράματα αποδεικνύουν ότι οι κινάσες GSK3, ERK, και ο ουβικιτίνης 3 λιγάση Fbw7 είναι επίσης απαραίτητα μεσολαβητές της ΙΝΚ1 εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα JNK2-εξαντλημένο (Σχ. 4Ε). Ωστόσο κανένα από αυτά τα συστατικά φαίνεται να προσκρούσουν πάνω φωσφορυλίωση ή συσσώρευση της πρωτεΐνης c-Jun S243 (Σχήμα 4Β, 4C και 4D?. Λωρίδες GSK3, Fbw7 και ERK αντίστοιχα). Αυτό ήταν απρόσμενη, δεδομένου ότι, σε απάντηση στην πίεση, και οι τρεις έχουν συνδεθεί με την υποβάθμιση του c-Jun μέσω S239 και φωσφορυλίωση S243 (ERK και GSK3 αντίστοιχα) και η υποβάθμιση ουβικιτίνης μεσολάβηση (Fbw7) [10], [25], [26] . Φαίνεται ότι, υπό βασικές συνθήκες, GSK3, ERK και Fbw7 λειτουργούν ως ουσιαστικό μεσολαβητές απόπτωσης μέσω υποστρώματα, εκτός από c-Ιούνιος

Bax και CKII είναι περιττό για το αποπτωτικό μονοπάτι βασική JNK1 /JNK2

Μετά στρες Bax είναι ένα προ-αποπτωτικό μεσολαβητής της JNK που επάγεται απόπτωση [27], [28]. Θα ήθελα να ρωτήσω αν Bax είναι επίσης απαραίτητη για τη βασική JNK1 /JNK2 ρυθμιζόμενων αποπτωτικό μονοπάτι που χρησιμοποιείται ισογονιδιακές Bax +/- και Bax – /- HCT116 κύτταρα [2]. JNK2 σίγηση επαγόμενη απόπτωση τόσο σε HCT116 Βαχ

+/- και HCT116 Bax

– /- κύτταρα (Σχ 4F.) Υποδεικνύοντας ότι Bax δεν απαιτείται για απόπτωση υπό αυτές τις βασικές συνθήκες. Co-φίμωση CKII, ένα υποθετικό κινάσης για c-Jun [3], επίσης απέτυχε να διασώσει JNK2 εξαντλημένο κύτταρα HCT116 από απόπτωση (Σχ. 4Ε). Έτσι, τόσο Βαχ και CKII εμφανίζονται επουσιώδεις για τη βασική JNK1 /JNK2 αποπτωτική παθολογική οδό.

Αλληλεπίδραση μεταξύ c-Jun και ITCH

Η προ-αποπτωτική παθολογική οδό που προκαλείται από ΤΝΡα κορυφώνεται με φωσφορυλιωμένο JNK1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση φαγούρας, η υποβάθμιση του c-FLIP και κασπάσης 8 ενεργοποίηση (βλέπε Εισαγωγή). Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ITCH είναι επίσης ένα σημαντικό προ-αποπτωτικών μεσολαβητής διέπεται από JNK1 /JNK2 υπό βασικές συνθήκες και ότι συν-φίμωση ITCH με JNK2 διασώζει κύτταρα από την απόπτωση (Σχ. 5Α και 5Β).

(Α) και (Β) πρωτεϊνών και αποπτωτικών επίπεδα παρατηρήθηκαν μετά ITCH και JNK2 σίγηση σε κύτταρα HCT116. (C) Συγκροτήματα των ενδογενών πρωτεϊνών ITCH-c-Jun ανιχνεύονται πριν JNK2 αποσιώπηση χάνονται μετά από εξάντληση JNK2.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το προ-αποπτωτικό ρόλο των ITCH υπό βασικές συνθήκες πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεως /ανοσοκηλίδος ανάλυση για την ενδογενή σύμπλοκα ITCH-c-Jun πριν και μετά από μεσολάβηση RNAi σίγηση του JNK2 (Εικ. 5C). Σημαντικά, ITCH-c-Jun συγκροτήματα ήταν ανιχνεύσιμα υπό συνθήκες ελέγχου, αλλά αυτά τα συγκροτήματα χάθηκαν μετά από JNK2 σίγηση (Εικ. 5C).

Η απόπτωση προχωρά μέσω του γ-FLIP και κασπάσης 8

Συνεργασίας φίμωση της κασπάσης 8 με JNK2 διασωθεί κύτταρα από την απόπτωση (Σχ. 4Ε). Αυτή η επίδραση περιορίζεται σε βασικές συνθήκες αφού κασπάσης 8 RNAi απέτυχε να διασώσει την απόπτωση μετά από ακτινοβόληση UV (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). c-FLIP σίγασης που μόνος επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HCT116 [29]. Co-φίμωση c-Jun, GSK3, ή Fbw7 με c-FLIP απέτυχε να διασώσει τα κύτταρα από την απόπτωση (Σχ. 6Α), υποδεικνύοντας ότι κάθε μία από αυτές προ-αποπτωτικών ενδιάμεσα λειτουργούν ανάντη του c-FLIP (Εικ. 7Α-σχηματικό ). Έτσι βασικά και το άγχος που προκαλείται από μονοπάτια κινάσης ΜΑΡ αποπτωτικά συγκλίνουν στο επίπεδο των c-FLIP. Όπως αναμενόταν, η συν-φίμωση κασπάσης 8 με c-FLIP διασωθεί κύτταρα από την απόπτωση (Σχ. 6Α και 6Β).

(Α) Επίπεδα της απόπτωσης που παρατηρείται μετά από συν-αποσιώπηση του c-FLIP με προ-αποπτωτικών μεσολαβητών . (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης που δείχνει προ-κασπάσης 8 διάσπαση και τη συσσώρευση c-Jun μετά από εξάντληση c-FLIP από RNAi.

Η

(Α) Σχηματική παρουσίαση άγριου τύπου c-Jun (wt-c-Jun) και μη-φωσφορυλιώσιμη μεταλλαγμένο c-Jun κατασκευάσματα. μέτρηση V (Β) Annexin απόπτωσης μετά υπερέκφραση του wt-c-Jun ή mut-c-Jun όπως υποδεικνύεται. (C) ανοσοστυπώματα δείχνει συνολική και φωσφορυλιωμένη c-Jun μετά από υπερέκφραση, τον έλεγχο SIRT1 φόρτωσης εμφανίζεται. (D) Τα επίπεδα απόπτωσης μετά συνδυασμένης θεραπείας siRNA με την παρουσία ή απουσία του μη στοχευόμενων mut-c-Jun, (βλέπε υλικά και μέθοδοι).

Η

Η υπερέκφραση εξωγενούς επάγει c-Jun απόπτωση

επόμενο ρώτησε αν η έκφραση υψηλού επιπέδου και μόνο c-Jun είναι επαρκής για να επάγει απόπτωση. Υπερ-έκφραση του εξωγενούς άγριου τύπου c-Jun επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα HCT116 (Εικ. 7Α και 7Β). Σημαντικά, η υπερέκφραση μιας φωσφορυλίωσης μεταλλαγμένου c-Jun, όπου S63, S73, Τ91 και Τ93 είναι όλα μεταλλαχθεί σε αλανίνη, επίσης επήγαγε απόπτωση έτσι την ενισχύει απόδειξη για προ-αποπτωτική λειτουργίες του υπο-φωσφορυλιωμένη c-Jun (Σχ . 7Α και 7Β). Σημειώστε ότι η εξωγενής έκφραση μιας άλλης πρωτεΐνης, SIRT1, δεν επάγει απόπτωση σε κύτταρα HCT116 [22] δείχνει ότι τα παρόντα αποτελέσματα είναι ειδικά για c-Jun. έκφραση της πρωτεΐνης από τα κατασκευάσματα και φωσφορυλίωση κατάσταση c-Jun δείχνει φωσφορυλίωση σε όλους τους χώρους που εξετάστηκαν σε άγριου τύπου c-Jun (Εικ. 7C). Αυτό είναι ενδεικτικό της κυτταρικής στρες σε απόκριση εξωγενούς γονιδίου υπερέκφραση. Σημειώστε ότι αυτό είναι σε αντίθεση με την παρατεταμένη c-Jun υπο-φωσφορυλιωμένη κατάσταση εξής μεσολάβηση RNAi γονιδιακή σίγηση υπό τις βασικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή την εργασία (βλέπε για παράδειγμα Εικ. 3Α). Η φωσφορυλίωση μεταλλαγμένο c-Jun δεν είχε αντιδραστικότητα με αντι-φωσφο-S63, S73 και αντισώματα T91 όπως αναμενόταν (αντίσωμα προς φωσφοσερίνη 93 δεν ήταν διαθέσιμη). Αν και οι δύο μεταλλάξεως και αγρίου τύπου εξωγενείς πρωτεΐνες c-Jun φωσφορυλιώθηκαν στο T239 και S243 (Εικ. 7C) πιστεύουμε ότι αυτή ήταν μη αναγκαία για την επαγωγή της απόπτωσης από το ενδογενές c-Jun απαιτείται για την απόπτωση, παρά την έλλειψη φωσφορυλίωσης C-τερματικό (βλέπε για παράδειγμα Εικ. 4Β-4D εξής JNK2 αποσιώπηση). Σημαντικά, υπερ-έκφραση του εξωγενούς c-Jun δεν διεγείρει απόπτωση σε μη καρκινικά κύτταρα ARPE19 (Εικ. 7Β). Αυτές οι συνολικές παρατηρήσεις περαιτέρω να ενισχύσουν τα συμπεράσματά μας (i) ότι τα αυξημένα επίπεδα της υπο-φωσφορυλιωμένη c-Jun είναι προ-αποπτωτικά στα καρκινικά HCT116 κύτταρα, και (ii) ότι η επίδραση είναι ειδική για τα καρκινικά κύτταρα (HCT116) και δεν παρατηρείται