Αφηρημένο

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-Ι ανάπτυξης (IGF-I) είναι κρίσιμη ρυθμιστές της διαφοροποίησης των κυττάρων, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε καρκίνους. Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι ARNO (cytohesin-2), ενεργοποιητής του EGF και οδούς IGF-I, ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό σε σύγκριση με καλοήθη γειτονικό ορθοκολικό ιστό. Όταν ARNO-siRNA ή το χημικό αναστολέα SecinH3 μπλοκάρει Άρνο, το κατάντη του ΕΤΠ και τα μονοπάτια του IGF-Ι μειώθηκε σε κυτταρικές σειρές παχέος ΗΤ29 και HCT116. Αυτό το κλείδωμα αποδυναμωθεί επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση in vitro. Επιπλέον, υποδοχέα EGF (EGFR) -εξαρτώμενη ορθοκολικού ξενομοσχεύματα όγκου σε γυμνό ποντίκι που ασκείται αντι-πολλαπλασιαστική και ανάπτυξης επιδράσεις καταστολής με έγχυση secineH3. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η αναστολή cytohesins ή ARNO ως κυτταροπλασματική ενεργοποιητές του EGFR και IGF-I σε καρκίνο του παχέος εντέρου οδήγησε σε αντι-πολλαπλασιασμό, μειωμένη εισβολή, μειωμένη μετανάστευση, και κατέστειλε την ανάπτυξη του in vivo και in vitro. Ως εκ τούτου, cytohesins ή ARNO μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος της θεραπείας για κάποιο καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Pan Τ, Sun J, Χου J, Χου Υ, Zhou J, Chen Ζ, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: Η λειτουργία σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10.1371 /journal.pone.0090997

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία Της Κορέας

Ελήφθη: 27 Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 6 Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου του 2014

Copyright: © 2014 Pan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και του Προγράμματος Ανάπτυξης της Κίνας (Αρ 2012AA02A506), Zhejiang Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (LD13H160015) και Zhejiang Provincial Βασικά Επιστημονικής και Τεχνολογικής Έρευνας Έργα του Διεθνούς συνεργασίας (Νο 2009C14010). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) εξακολουθεί να είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες παρά τις σημαντικές βελτιώσεις στην πρόγνωση της αποδίδεται στις προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία λεπτομέρειες. Περισσότεροι από 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καρκίνου και 608 700 θάνατοι καταγράφονται ετησίως [1]. Οι αποτελεσματικές θεραπείες του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, και στοχευμένη θεραπεία. Οι πρόοδοι στη συμβατική χημειοθεραπεία έχουν επεκταθεί το προσδόκιμο ζωής, αλλά η αποτελεσματικότητα για πολλούς ασθενείς παραμένει σε χαμηλά επίπεδα, ειδικά για εκείνους με μετάσταση. Η έρευνα για πιο αποτελεσματικές και λιγότερο τοξικές θεραπείες έχει δημιουργήσει μια νέα γενιά αντικαρκινικών παραγόντων. Η πιο διαδεδομένη είναι η στοχευμένη βιολογικός παράγοντας [2]. επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF) (EGFR) και συνδέονται οδούς μεταγωγής σήματος έχουν αναδειχθεί ως σημαντικό μοριακό θεραπευτικοί στόχοι για καρκίνο του παχέος εντέρου [3].

EGFR /ErbB1, μαζί με Her2 /ErbB2, Her3 /ErbB3, και ErbB4, είναι ένα μέλος της οικογένειας ErbB. EGFR /ErbB1 ρυθμίζει έμφυτη ανοσολογική απόκριση του οργανισμού [4], καθώς και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση. EGFR περιέχει ένα εξωκυτταρικό πεδίο σύνδεσης συνδετήρα, μία περιοχή ενιαίο μεμβρανοδιατρέχουσα, και μια κυτταροπλασματική περιοχή κινάσης τυροσίνης [5]? [6]. Συνδέτες δεσμεύονται με την εξωκυτταρική περιοχή προκαλώντας διμερισμό του υποδοχέα, επάγοντας έτσι διαμορφωτική αλλαγή των ενδοκυτταρικών συστατικών φωσφορυλίωση και επιτρέποντας κατάντη σηματοδότησης [7].

Σήμερα, πολλές στοχευμένες βιολογικούς παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στην οδό σηματοδότησης EGFR. Αντι-ΕΟΡΚ μονοκλωνικά αντισώματα και αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκίνων, ειδικά του παχέος εντέρου και ρινοφαρυγγικής καρκίνους [8]? [9]. Cetuximab και Panitumumab, αντισώματα έναντι EGFR, χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, οι ασθενείς τελικά αναπτύσσουν αντίσταση σε αυτούς τους παράγοντες [10]. Μία κοινή υπόθεση του cetuximab-αντίσταση είναι EGFR ή κατάντη μοριακό μετάλλαξη εντός των κυττάρων του όγκου, όπως αποκτήθηκε μετάλλαξη EGFR εξωτομέα S492R [10]. Επιπλέον, επίμονη μπλοκάρισμα EGFR ενισχύει μονοπάτια εκτός από το μονοπάτι EGFR, όπως το Her2, Her3, που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF) -Ι υποδοχέα (IGF-IR) οδούς σηματοδότησης [11] – [13].

IGF-I και IGF-II διαδραματίσουν κεντρικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την επιβίωση, τη μετατροπή, και μετάσταση. Οι βιολογικές επιδράσεις των IGFs μεσολάβηση του IGF-IR, έναν υποδοχέα κινάσης τυροσίνης με ομολογία προς τον υποδοχέα ινσουλίνης. Οι ερευνητές διαπίστωσαν πρόσφατα ότι η απορρύθμιση του συστήματος IGF είναι ένα βασικό παράγοντα που συμβάλλει στην εξέλιξη της πολλαπλής καρκίνων, με την ενεργοποίηση του IGF-IR αυξάνοντας το ογκογόνο δυναμικό του μαστού, του προστάτη, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, καθώς και το κεφάλι και το λαιμό καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [14 ]? [15].

Cytohesins καθώς οι ενεργοποιητές των υποδοχέων ErbB έχουν αναφερθεί από τον Bill et al. [16]. Έδειξαν ότι cytohesins ενισχύει την ενεργοποίηση του EGFR με την άμεση αλληλεπίδραση με τις κυτταροπλασματικές περιοχές των υποδοχέων διμεριστεί και διευκολύνοντας την διαμορφωτικές αναδιατάξεις αυτών των περιοχών. Cytohesins πάνω έκφρασης ενισχύει την σηματοδότηση EGFR σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, ενώ η χημική αναστολή ή την εξουδετέρωση των cytohesins μειώνει την ενεργοποίηση του EGFR. Παρομοίως, προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι η αναστολή cytohesins από SecinH3 ή να χτυπήσει κάτω ARNO από Arno-siRNA μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση του EGFR στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ΗΤ29 [17]. EGF και IGFs είναι κρίσιμη ρυθμιστές της διαφοροποίησης των κυττάρων, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε καρκίνους. Είναι επίσης εμπλέκονται στην απόπτωση, μετασχηματισμό, επεμβατική ανάπτυξη, και μακρινή μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [15]. Οι Cytohesins προταθεί ως μια νέα αποτελεσματική στόχος για τη μείωση εισβολή, μετάσταση, και Cetuximab ή Panitumumab-ανθεκτικά κύτταρα σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Η δυνατότητα που cytohesins μπορεί να είναι νέοι στόχοι για τους ασθενείς ανθεκτικά στα φάρμακα ή καρκίνο των προτέρων σταδίου έχουν εξερευνηθεί. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε cytohesins ή ARNO ως ένα νέο αντι-ορθοκολικού καρκίνου παράγοντα σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Το μέσο καλλιέργειας κυττάρων 1640 και McCoy S 5Α αγοράστηκαν από την Gibco (Gibco, USA). Τα αντι-ανθρώπινα αντισώματα κουνελιού ή ποντικού μονοκλωνικό χρησιμοποιήθηκαν ήταν ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pERK1 /2 (T202 /Y204, Bioworld, BS5016), EGFR (Cell Signaling, 3197), GAPDH (Bioworld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), ρρΙΟΡ-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), ρΑΚΤ (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), pShc (Abcam, ab155170), και Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Άλλα αντιδραστήρια και υλικά που χρησιμοποιούνται έχουν ως εξής: SecinH3 (Merck-565725 /sc-203260), siRNA ολιγο (Genephama), ΜΤΤ (sigma, m5655), DMSO (Sigma, D5879), ανθρώπινο EGF (Peprotech, AF-100-15 ), ανθρώπινο IGF-1 (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, USA), και 0.25% θρυψίνη (Sigma), ανοσοϊστοχημική κιτ (Zhongshan, Κίνα).

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και HCT116, τα οποία εντοπίστηκαν χωρίς καμία μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS και BRAF, ελήφθησαν από το Εργαστήριο Κλειδί της πρόληψης του καρκίνου και παρέμβασης, Ινστιτούτο καρκίνου, Δεύτερη Συνδεδεμένες Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Zhejiang University, Κίνα. Οι κυτταρικές καλλιέργειες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: κυτταρική γραμμή ΗΤ29 από 1640 (με 10% FBS + 1% στρεπτομυκίνη /πενικιλλίνη) και HCT116 κυτταρική γραμμή με McCoy 5Α ‘s (με 10% FBS + 1% στρεπτομυκίνη /πενικιλίνη). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 37 ° C 5%

2 θερμοκοιτίδα CO και περάστηκαν με 0.25% θρυψίνη (Sigma) σε 0,2 Μ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS).

δείγματα όγκων

Πριν από την έρευνα σε ανθρώπινα δείγματα όγκων, πρέπει να είχε ληφθεί εν επιγνώσει συναίνεση των ασθενών. Είχαμε υποβάλει δήλωση από επιτροπή του νοσοκομείου ηθική μας και έλαβε την έγκριση της έρευνας. Όλα τα δείγματα όγκων πηγάζουν από την Βιοτράπεζα στο Key Εργαστήριο Πρόληψης Καρκίνου και Παρέμβασης, Ινστιτούτο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα. Όλες οι όγκοι κλινικά και παθολογικά χαρακτηρίζεται ως η κύρια και μοναδική νεοπλασματικής βλάβης και ταξινομούνται σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) ταξινόμηση των όγκων του πεπτικού συστήματος (2010).

Η ανοσοχρώση

Για ανοσοχρώση, χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού που εγείρεται έναντι ARNO (Abcam, ab56510), αντισώματα ποντικού έναντι pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι pIGF-IR (Abcam, ab39398) και μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι Ki-67 (Cell Signaling, 9027) ως πρωτεύοντα αντισώματα. Πριν από την εφαρμογή, όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν (Primary αντισώματα αραιωμένα 1:100, όλα τα άλλα δευτερεύοντα αντισώματα αραιωμένα 1:200) σε PBS (150 mM NaCl, 10 mM Να

2HPO

4, 10 mM Ν &

2 ΡΟ

4, ρΗ 7.4). Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. εντάσεις χρώσης μεμονωμένα αξιολογήθηκαν από τρεις ανεξάρτητους παρατηρητές χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης τεσσάρων βαθμίδων όπως περιγράφεται [18].

ΜΤΤ

ΗΤ29 ή HCT116 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 96 φρεατίων σε πυκνότητα 3000 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 1% FBS και αντιδραστήρια (50 ng /ml EGF ή 25 ng /ml IGF-1, SecinH3 με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 40 μΜ)) για 24, 48, και 72 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2. Στη συνέχεια, 5 mg /ml ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Στη συνέχεια, 200 μΐ DMSO προστέθηκαν σε αποφασιστική υπόστρωμα ΜΤΤ, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας Spectra MAX (Bio-Rad, USA)

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέγονται και εκχυλίζονται με ένα ευκαρυωτικό κύτταρο ρυθμιστικό λύσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με μια συσκευή μεταφοράς υγρού (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι κηλιδωμένες μεμβράνες αποκλείστηκαν με 10% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS Tween-20 για 1 ώρα. Μετά την πλύση των μεμβρανών τρεις φορές με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα Tween-20 (TBST), επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:1000 σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάζονται σε HRP-σημασμένο δευτερογενές αντίσωμα σε αραίωση 1:10 000 σε δωμάτιο θερμοκρασία για 1 ώρα. Μετά την έκπλυση των μεμβρανών, απεικόνιση διεξήχθη με ένα σύστημα ανάλυσης στυπώματος Western ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK), και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak). πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι βίδες ανιχνεύονται και ανάλυση με το λογισμικό της Alpha Imager EP (Έκδοση: 3.2.2.0).

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 24-καλά Tran διογκώνονται πλάκες (8 μm πόρων μέγεθος? Costar). Περίπου 1 χ 10

4 κύτταρα (ΗΤ29 ή HCT116) φορτώθηκαν στα άνω θαλάμους. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με μέσο (1640 συν 1% FBS) απουσία (DMSO 0,2%) ή παρουσία SecinH3 (10, 20, ή 40 μΜ). Οι πλάκες φούσκωμα Tran κατόπιν επωάστηκαν σε 37 ° C, 5% CO2 επί 48 ώρες. Μετά τον καθαρισμό των κυττάρων από την άνω πλευρά του πολυανθρακικής μεμβράνης και χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη, η μεμβράνη πολυανθρακικού κόπηκε και τοποθετήθηκε σε πλάκα μικροσκοπίου, κάλυψη γλίστρησε, και εξετάζεται στο μικροσκόπιο. Ο συνολικός μετανάστευσαν αριθμός των κυττάρων και το ποσοστό μετρήθηκαν στη συνέχεια.

μοντέλα όγκων ξενομοσχεύματος

Όλες οι διαδικασίες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις Zhejiang University νόμοι για την προστασία των ζώων και εγκρίθηκε από την επιτροπή προστασίας των ζώων του Πανεπιστημίου Zhejiang . Οι όγκοι που δημιουργούνται από υποδόριες ενέσεις 5 × 10

6 ΗΤ29 κυττάρων σε ηυ /ηυ αθυμικοί αρσενικά ποντίκια σύμφωνα με Ullrich et al. [19]. Μετά την ίδρυση όγκοι (περίπου 6 mm σε διάμετρο), δεκατέσσερα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. Οι ποντικοί στην ομάδα SecinH3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ημερήσιες ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις SecinH3 (100 μΙ, 2,5 mM? Σε διάλυμα 75% γλυκόζης (5%) /25% DMSO). Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον ίδιο όγκο διαλύματος γλυκόζης 75% και 25% DMSO μέχρι την 14η ημέρα. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, μετρήθηκε η μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου κάθε 2 ημέρες με υπερήχους και στη συνέχεια θυσιάστηκαν τα ποντίκια για τη συλλογή των όγκων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki-67 για την ανίχνευση της αναστολής του πολλαπλασιασμού των SecinH3 στα μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου. Η συνολική Ki-67 τον αριθμό θετικών κυττάρων και ποσοστό κατόπιν μετρήθηκαν.

Στατιστικά

Τα αποτελέσματα δίδονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική SPSS16.0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Αξιόπιστες συγκρίσεις έγιναν με Μαθητή

t-test

. ανάλυση συσχέτισης Pearson έγινε, με το

σ

& lt? 0,05 (με την ένδειξη «*») και

σ

& lt?. 0.01 (με την ένδειξη «**») θεωρούνται σημαντικά διαφορετικές ή συσχετίστηκε σημαντικά

Αποτελέσματα

ARNO πάνω έκφραση συσχετίστηκε με τα επίπεδα EGFR και IGF-IR σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκινικό ιστό

EGFR και IGF-IR σηματοδότηση παίζουν κρίσιμους ρόλους σε πολλούς τύπους καρκίνου [16 ] και η ομάδα μας διαπίστωσε ότι Άρνο και άλλα cytohesins ενισχύσει την ενεργοποίηση του EGFR στα καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [17]. Έτσι, αναρωτηθήκαμε αν ARNO ήταν πάνω εκφράζεται σε καρκινικούς ιστούς των ασθενών και η υπερβολική έκφραση συσχετίστηκε με EGFR και IGF-IR σηματοδότηση. Ως εκ τούτου, θα χρησιμοποιηθούν για ανοσοϊστοχημεία για τη διερεύνηση πρωτογενούς ανθρώπινου παχέος αδενοκαρκινώματα με ένα αντίσωμα ανίχνευσης Άρνο, pEGFR (pY1068), και ρρΙΟΡ-IR (pY1185). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κανονική ορθοκολικό ιστό ή καλοήθη παρακείμενο ιστό ορθοκολικού είχε μόνο φόντο (30/36) ή ασθενής χρώση (6/36). Επιπλέον, όλα τα καρκινώματα έδειξε ARNO θετική χρώση, εκ των οποίων 93,1% ήταν μέτρια ή ισχυρή. Βρήκαμε μια ιδιαίτερα σημαντική (

r

= 0,712,

σ

= 0.012 για pEGFR?

r

= 0.684,

σ

= 0,031 για pIGF- IR,

n

= 36) συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του Άρνο και pEGFR ή ρρΙΟΡ-IR (Σχήμα 1). προηγούμενες μελέτες μας σχετικά με το ρόλο του ARNO σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς αποκάλυψαν υψηλή συσχέτιση με pEGFR και pIGF-IR, γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανώς ARNO ενισχύει την ενεργοποίηση και σηματοδότηση του EGFR και IGF-IR.

παχέος εντέρου ασθενών ή καλοήθη γειτονικό ιστό διαδοχικές τομές βάφτηκαν για ARNO (α), pEGFR (β), και pIGF-IR (γ). Αντιπροσωπευτικά εικόνες της κανονικής ορθοκολικό ιστό (αριστερή στήλη) και μέτρια (δεξιά στήλη) έκφραση ARNO εμφανίζονται (αρχική μεγέθυνση χ 100). Το διάγραμμα στο (α) δείχνει το κλάσμα και τις συχνότητες των όγκων με φόντο (-), ασθενές (+), μέτρια (++), ή ισχυρά (+++) χρώση για ARNO. Τα διαγράμματα στο (β) και (γ) απεικονίζουν τη συσχέτιση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των αντίστοιχων πρωτεϊνών με το σκορ ARNO (

σ

= 0.012 για pEGFR,

σ

= 0,031 για ρρΙΟΡ-IR ,

n

= 36). Αποκαλύπτει ότι ARNO πάνω έκφραση συσχετίστηκε με αυξημένη EGFR και IGF-IR.

Η

Χημική αναστολή της cytohesins και νοκ ντάουν του ARNO μειωμένη κυτταρική σηματοδότηση

Για την ανίχνευση της λειτουργίας των cytohesins ή ARNO στην οδό EGF των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, SecinH3 και ARNO-siRNA (που επιλέγονται από τις πρωτογενείς πειράματα) αναστέλλουν cytohesins /ARNO σε κύτταρα ΗΤ29 [17]. Στον προσδιορισμό, ΗΤ29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινο πυθμένα δίσκους 35 χλστ σημειώνονται ως ομάδα Α, Β ή C. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με μέσο 1% FBS καλλιέργεια. SecinH3 (20 μΜ ή ένα μίγμα από 100 pmol του ARNO-siRNA σε 5 μΙ Lipofectamine 2000) προστέθηκε σε πιάτα από την ομάδα Β, όταν τα κύτταρα είχαν εξαπλωθεί για να καλύψει το 70% των πιάτων για 10 ώρες. Ταυτόχρονα, 0.2% DMSO (ή 5 μΙ Lipofectamine 2000) προστέθηκε σε πιάτα από τις ομάδες Α και Γ ως έλεγχος, και στη συνέχεια, 50 ng /ml EGF προστέθηκε σε πιάτα από τις ομάδες Α και Β για 5 λεπτά. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η έκφραση του EGF συνδέονται με την πορεία μόρια, περιλαμβανομένων ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, pShc, και pERK1 /2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όταν SecinH3 μπλοκάρει cytohesins ή ARNO αναστέλλεται από Arno-siRNA, η έκφραση ARNO μειώθηκε στα κύτταρα ΗΤ29. Επιπροσθέτως, τα φωσφορυλιωμένα μόρια της οδού EGF συμπεριλαμβανομένων pEGFR, pShc, και pERK1 /2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε κύτταρα ΗΤ29 (Εικ. 2).

(α και β) SecinH3 και ARNO-siRNA ελαττωμένη σηματοδότηση του υποδοχέα EGFR. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων ΗΤ29 σε επεξεργασία με SecinH3 (α) ή ARNO-siRNA (β) και διεγέρθηκαν με EGF δείχνεται. Η φωσφορυλίωση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας phosphospecific αντισώματα. Γλυκεραλδεΰδες φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα διαγράμματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης μετά από κανονικοποίηση για GAPDH. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα συνδέτη διεγερμένα ορίστηκαν ως 3 (

n

= 3). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Για την ανίχνευση της λειτουργίας των cytohesins ή ARNO στο μονοπάτι του IGF, SecinH3 και ARNO -siRNA [17] σε κύτταρα HCT116 ανέστειλε cytohesins /Άρνο. Στη δοκιμασία, τα κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε γυάλινο πυθμένα δίσκους 35 χλστ σημειώνονται ως ομάδα Α, Β ή C. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με μέσο 1% FBS καλλιέργεια. SecinH3 (20 μΜ ή ένα μίγμα από 100 pmol του ARNO-siRNA σε 5 μΙ Lipofectamine 2000) προστέθηκε σε πιάτα από την ομάδα Β, όταν τα κύτταρα είχαν εξαπλωθεί για να καλύψει το 70% των πιάτων για 10 ώρες. Ταυτόχρονα, 0.2% DMSO (ή 5 μl Lipofectamine 2000) προστέθηκε σε πιάτα από τις ομάδες Α και Γ ως έλεγχος, και στη συνέχεια, 25 ng /ml IGF-1 προστέθηκε σε πιάτα από τις ομάδες Α και Β για 5 λεπτά. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η έκφραση του IGF συνδέονται με την πορεία μόρια που περιλαμβάνουν ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, και ρΑΚΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όταν cytohesins είχαν μπλοκαριστεί από SecinH3 ή αναστέλλονται από Arno-siRNA, η έκφραση ARNO μειώθηκε στα κύτταρα HCT116. Επιπλέον, φωσφορυλιωμένα μόρια της οδού IGF συμπεριλαμβανομένων pIGF-IR και ρΑΚΤ ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 3).

(α και β) SecinH3 και ARNO-siRNA ελαττωμένη σηματοδότηση του υποδοχέα IGF-IR. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων HCT116 σε επεξεργασία με SecinH3 (α) ή ARNO-siRNA (β) και διεγέρθηκαν με IGF-1 εμφανίζεται. Η φωσφορυλίωση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας phosphospecific αντισώματα. Γλυκεραλδεΰδες φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα διαγράμματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης μετά από κανονικοποίηση για GAPDH. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα συνδέτη διεγερμένα ορίστηκαν ως 3 (

n

= 3). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Αποκλεισμός cytohesins μείωσε τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του παχέος

Ανοσοϊστοχημεία των καρκινικών ιστών ασθενών έδειξε ότι ARNO πάνω έκφραση συσχετίστηκε με αυξημένη EGFR και IGF-IR. Η διαπίστωση αυτή μας ώθησε να σκεφτούμε το ενδεχόμενο της μειωμένης πολλαπλασιασμό ή μετανάστευση του EGFR κύτταρα /IGF-ευαίσθητες όταν ARNO είναι αποκλεισμένη. Για να επιλέξετε EGFR /IGF-ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές, εκτελέσαμε ανάλυση ΜΤΤ με καλλιέργεια των ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ΗΤ29, SW620, SW480, HCT116, και LOVO σε 1% FBS με EGF ή IGF. Βρήκαμε ότι ΗΤ29 ήταν ο EGFR-εξαρτώμενη κυτταρική γραμμή και HCT116 ήταν IGF ευαίσθητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές πιστοποιήθηκαν ως άγριου τύπου για KRAS και BRAF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την ανίχνευση της σχέσης του ARNO με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε καρκίνο του παχέος εντέρου, προσθέσαμε sesinH3 στο μέσο καλλιέργειας και διαπίστωσε ότι μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό (δοκιμασία ΜΤΤ με SecinH3 σε 0 (DMSO), 10, 20, και 40 μΜ για 24, 48, και 72 ώρες) (Σχ. 4b), και τη μετανάστευση (Tran διογκώνονται με SecinH3 σε 0 (DMSO), 10, 20 και 40 μΜ για 48 ώρες) του ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 (Εικ. 4α). Δείχνει ότι SecinH3 μπορούν να αναστείλουν τη διείσδυση και τη μετανάστευση των ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα. Και τα αποτελέσματα είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της SecinH3 και την ώρα της λειτουργίας.

αριστερή στήλη του διαγράμματος (α) είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες των Tran προσδιορισμού των ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 αντιμετωπίζονται με SecinH3 στο 0, 10, 20 διογκώνονται και 40 μΜ αντίστοιχα. Τα αριστερά εικόνες είναι το αποτέλεσμα των κυττάρων ΗΤ29 χωρίς SecinH3 (DMSO 0,2% για 48 ώρες) και με SecinH3 (20 μΜ για 48 ώρες) (αρχική μεγέθυνση χ 100). Φαίνεται ότι SecinH3 μπορούν να αναστείλουν τη μετανάστευση των ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι συσχέτιση με τη συγκέντρωση του SecinH3 και του χρόνου. Τα διαγράμματα (β) παρουσιάζουν σχετικό αριθμό κυττάρων ΗΤ29 και HCT116 προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ παρουσία SecinH3 σε 0, 10, 20, και 40 μΜ για 24, 48, και 72 ώρες. Φαίνεται ότι SecinH3 μπορεί να αναστείλει την διείσδυση του ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι επίσης συσχέτιση με τη συγκέντρωση του SecinH3 και του χρόνου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01 (

n

= 5)

Η

SecinH3 μείωσε την ανάπτυξη του παχέος ξενομοσχευμάτων όγκου ΗΤ29

Η ισχυρή έκφραση της ARNO σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό και σημαντική συσχέτιση της με pEGFR και ρρΙΟΡ-IR μας ώθησε να αναρωτιούνται αν το κλείδωμα cytohesins in vivo μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα ΗΤ29 που έχουν την υψηλότερη έκφραση του EGFR σε σχέση με άλλα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [17], επιλέχθηκε για να κάνει το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έτσι υποδορίως ΗΤ29 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια για να δημιουργήσει ξενομοσχεύματα όγκου. Όταν το μέγεθος ξενομοσχεύματος όγκου έφθασε 6-7 χιλιοστών σε ποντίκια που είχαν ενεθεί τα κύτταρα ΗΤ29 για σχεδόν μία εβδομάδα, οι ποντικοί άρχισαν να αντιμετωπίζουν με ή χωρίς SecinH3. Οι όγκοι της ομάδας SecinH3 ανεστάλησαν ανάπτυξη προφανώς μετά τη θεραπεία με SecinH3 για περισσότερο από μία εβδομάδα. Οι δύο ομάδες είχαν προφανείς διαφορές μέχρι τον 11ο ημέρες μετά την κατεργασία (Σχ. 5α). Η ανοσοϊστοχημική χρώση του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ki-67 σε εκτομή όγκων επιβεβαίωσε την μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η συνολική Ki-67 τον αριθμό θετικών κυττάρων και ποσοστό κατόπιν μετρήθηκαν. Βρήκαμε το πολύ σημαντική διαφορετικό επίπεδο έκφρασης μεταξύ των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς SecinH3 μετά την επεξεργασία του 14 ημέρες (ρ = 0,0083, η = 7) (ΕΙΚΟΝΑ 5Β, c, d). Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η έκφραση του EGF συνδέονται με την πορεία μορίων σε όγκους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή για 2 εβδομάδες, συμπεριλαμβανομένων ARNO, pEGFR. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι όταν SecinH3 μπλοκάρει cytohesins, Άρνο και την έκφραση pEGFR μειώθηκαν σε ξενομοσχεύματα ΗΤ29. (Fig.5e).

Η διάμετρος του ξενομοσχεύματος όγκου εγκατεστημένοι σε ποντικούς μετρήθηκε με υπερηχογράφημα κάθε 2 ημέρες κατά τη διάρκεια της θεραπείας (σχήμα α). Τ

1 ήταν η ομάδα ελέγχου. Τ

2 ήταν η ομάδα SecinH3. Οι όγκοι της ομάδας SecinH3 ανεστάλησαν ανάπτυξη προφανώς, μετά καθημερινά ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις SecinH3 για περισσότερο από μία εβδομάδα. Υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στο 11

ου, 14

ου ημέρες μετά τη θεραπεία. Διάγραμμα (β) και (γ) αντιπροσωπεύουν ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα καταπονήσεως για Ki-67 του όγκου από ποντικούς μετά κατεργάστηκε με (β) ή χωρίς SecinH3 (γ) για 14 ημέρες, (αρχική μεγέθυνση χ 200). Είναι ραφές που SecinH3 μειώνει την έκφραση του Ki-67 σε ξενομοσχεύματα ΗΤ29. Διάγραμμα (d) απεικονίζει τη θετική ρυθμό έκφρασης του Ki-67 στους όγκους των ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα ΗΤ29 στα 14

ης ημέρας μετά την αγωγή με ή χωρίς SecinH3. Διάγραμμα (ε) απεικονίζει τη θετική έκφραση του ARNO, pEGFR στους όγκους των ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα ΗΤ29 μετά την αγωγή με ή χωρίς SecinH3 για 2 εβδομάδες. Η έκφραση Άρνο και pEGFR των δύο ομάδων έχουν σημαντική διαφορά. Τα διαγράμματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης μετά από κανονικοποίηση για GAPDH. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. *

σ

& lt? 0,05, * *

σ

& lt? 0.01, n = 7.

Η

Συζήτηση

EGF και IGF είναι ζωτικής σημασίας ρυθμιστές των βιολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων, ειδικά σε καρκίνους [20]. προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι ARNO είναι το πιο σημαντικό cytohesin και πάνω εκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ως ενεργοποιητή που παίζει καθοριστικό ρόλο στην οδό σηματοδότησης EGFR [17].

Για να επαληθευτεί η υπόθεση ότι ARNO είναι που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου με την ενεργοποίηση EGF και IGF, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία των εκτομή του ανθρώπου αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου χρωματίζονται από Arno, pEGFR και ρρΙΟΡ-IR. Σε σύγκριση με το φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό ή καλοήθη παρακείμενο ορθοκολικό ιστό, ARNO, pEGFR και ρρΙΟΡ-IR ήταν πάνω εκφράζεται σε αδενοκαρκινώματα. Βρήκαμε επίσης μια πολύ σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του Άρνο και pEGFR ή ρρΙΟΡ-IR.

Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε siRNA και SecinH3-ανέστειλε ARNO /cytohesins στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές για να εξερευνήσετε τη δραστηριότητα του Άρνο και σύνδεσή του με το σύστημα σηματοδότησης EGFR και IGF-IR. Στη συνέχεια ανιχνεύεται το κατάντη του EGFR και IGF-IR σε συνδυασμό με ορθοκολικό ποσοστά επίπτωσης του καρκίνου. Όταν αναστέλλεται cytohesins ή Άρνο, οι μεταγενέστεροι μόρια της οδού ΕΤΠ δεν αντανακλάται στη μειωμένη ενεργοποίηση των pEGFR, pIRS1, pShc, και pERK1 /2. Στοιχεία έδειχναν ότι μπλοκάροντας cytohesins ή ARNO θα μπορούσε να μειώσει το σύστημα μονοπάτι ΕΤΠ. Ανά πάσα στιγμή, ανιχνεύσαμε μονοπάτι του IGF κατάντη συμπεριλαμβανομένων IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, και ρΑΚΤ. Αυτά τα μόρια κάτω ρυθμίζονται όταν ARNO ανεστάλη χημικά ή με siRNA. Αυτά τα κάτω κανονισμοί έδειξαν ότι η ενίσχυση των σημάτων και μονοπάτια μεταγωγής ήταν αναστέλλεται αποτελεσματικά [21]? [22]. Έτσι cytohesins ή ARNO ήταν συσχετίζεται έντονα με την ΕΤΠ και την ενεργοποίηση του IGF οδού σε καρκίνο του παχέος εντέρου [23].

Σε ένα κυψελοειδές πλαίσιο, χρησιμοποιήσαμε τα ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και HCT116 προσδιορίζονται χωρίς καμία μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS και BRAF . Όταν ARNO-siRNA ή SecinH3 μπλοκάρει ARNO ή cytohesins, ο πολλαπλασιασμός των ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα μειώθηκαν σε ΜΤΤ. Επιπλέον, η μείωση πολλαπλασιασμός συσχετίζεται θετικά με την συγκέντρωση SecinH3. Για τον προσδιορισμό εισβολής και της μετανάστευσης, δοκιμασία πρήζεται Tran εκτελέστηκε. Οι πόροι στις μεμβράνες φούσκωμα Tran αποκλείστηκαν με ένα πήγμα (matrigel) που αποτελείται από εξωκυτταρική μήτρα να μιμούνται τις τυπικές μήτρες που τα καρκινικά κύτταρα συναντήσουν κατά την διάρκεια της διαδικασίας εισβολής in vitro. Με την τοποθέτηση του ορθοκολικού κύτταρα στην άνω πλευρά του πήγματος να προσελκύονται από μια υψηλότερη συγκέντρωση του ορού στην άλλη πλευρά του φρεατίου, εισβολή προσδιορίστηκε με μέτρηση αυτών των κυττάρων που είχαν διασχίσει την κυτταρική μεμβράνη που έχει εισβάλλει και μετανάστευσαν προς το υψηλότερο ορό συγκέντρωση. Σε αυτή τη δοκιμασία, βρήκαμε ότι αναστέλλοντας cytohesins με SecinH3 μείωσε την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Οι ερευνητές έχουν αναφέρει πρόσφατα παρόμοιες μειώσεις σε πνεύμονα και του προστάτη [6]? [19]? [24]. Αυτή η μείωση μπορεί να συμβάλει στην προς τα κάτω ρύθμιση του EGF και ενίσχυσης σήματος μονοπάτι του IGF-I και την μεταγωγή. Στη μελέτη in vivo, εμείς εγχύεται SecinH3 καθημερινά μετά τις ξενομοσχεύματα όγκου ΗΤ29 δημιουργήθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται προφανώς μετά από 9 ημέρες από την ένεση SecinH3. Μετά από 14 ημέρες θεραπείας, ο πολλαπλασιασμός του όγκου σε ποντικούς αναστέλλεται επίσης.

Σε μια πρόσφατη έρευνα, είναι οτι ARNO εκφράζεται έντονα σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και η έκφραση συσχετίζεται με τις οδούς EGFR και IGF-IR . αναστολή ARNO μπορεί να μειώσει την σηματοδότηση και αγωγιμότητα αυτών των οδών, καθώς και μείωση του πολλαπλασιασμού, εισβολή, και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε βιολογικό περιβάλλον και vitro. Ludovini [25] ανέφεραν ότι αν και οι δύο IGF-IR και EGFR είναι ιδιαίτερα συν εκφράζονται σε καρκίνο του πνεύμονα εκτομή μη-μικρού κυττάρου, οι ασθενείς μπορεί να επιτύχει βραχύτερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Choi et al. [26] έδειξε ότι η συνδυασμένη αναστολή της σηματοδότησης IGF-IR ενισχύει την ανασταλτική της ανάπτυξης και επαγωγής απόπτωσης επιδράσεις του αναστολέα οδού EGFR. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα έχουν πάντα πολλούς τρόπους κανάλι σήμα για την αναπαραγωγή, και EGFR και IGFR είναι μόνο δύο από αυτούς τους τρόπους. Αν και ARNO μπορεί να είναι ένας νέος στόχος θεραπεία κάποιων ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα η υψηλότερη συγκέντρωση ARNO σε καρκινικά κύτταρα από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να οφείλεται σε άλλους λόγους, όπως πολλαπλασιασμό και την ανοσία. Ο μηχανισμός της μετανάστευσης μπορεί επίσης να σχετίζονται με ιντεγκρίνης β [27]. Όλες αυτές οι υποθέσεις θα πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Ζου Jiaojiao και ο Δρ Ταν Chunwen για κυτταρικές γραμμές τους (ΗΤ29, HCT116), και εμείς επίσης να ευχαριστήσω για την υποστήριξή τους και τον ενθουσιασμό. Θα ήθελα να ζητήσω συγγνώμη σε εκείνους τους συγγραφείς των οποίων το ανεκτίμητο έργο δεν αναφέρεται και αναφέρονται στην παραπάνω.