Αφηρημένο

Σκοπός

Μετασχηματισμός αυξητικός παράγοντας (TGF) -β1 σηματοδότηση εμπλέκεται στον καρκίνο-κυττάρων μετάσταση. Ερευνήσαμε κατά πόσο πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) σε

TGFβ1

συνδέθηκαν με τη συνολική επιβίωση (OS) και μακρινή μετάσταση επιβίωση χωρίς (ΒΔΜ) σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) που έλαβαν θεραπεία με οριστική ραδιοθεραπεία , με ή χωρίς χημειοθεραπεία.

Μέθοδοι

γονότυπου

TGFβ1

SNPs στο rs1800469 (C-509T), rs1800471 (G915C), και rs1982073 (Τ + 29C) από αλυσίδας πολυμεράσης μήκους θραύσματος αντίδραση περιορισμού πολυμορφισμού σε δείγματα αίματος από 205 ασθενείς με NSCLC που είχαν οριστικά ακτινοθεραπεία σε ένα ίδρυμα το Νοέμβριο του 1998-Ιανουαρίου 2005. Πρέπει επίσης να ελεγχθεί αν η

TGF-β1

rs1982073 (Τ + 29C) SNP επηρέασε την μετανάστευση και την εισβολή των Α549 και ο καρκίνος του πνεύμονα PC9 κύτταρα

Αποτελέσματα

ο διάμεσος χρόνος παρακολούθησης για όλους τους ασθενείς ήταν 17 μήνες (εύρος, 1-97 μήνες?. 39 μήνες για τους ασθενείς ζωντανός κατά τη στιγμή της ανάλυσης). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το

TGFβ1

rs1800469 CT /CC γονότυπο συσχετίστηκε με κακή OS (αναλογία κινδύνου [HR] = 1.463 [95% διάστημα εμπιστοσύνης CI {} = 1,012 – 2,114],

P

= 0.043) και μικρότερες ΒΔΜ (HR = 1.601 [95% CI = 1,042 – 2,459],

P =

0.032) και ότι το

TGFβ1

rs1982073 CT /CC γονότυπο προέβλεψε κακή ΒΔΜ ( HR = 1.589 [95% CI = 1,009 – 2,502],

P

= 0,046) και η κακή του εγκεφάλου MFS (HR = 2,567 [95% CI = 1,155 – 5,702],

P

= 0,021 ) μετά από προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, τη φυλή, την κατάσταση απόδοσης, το κάπνισμα, η ιστολογία του όγκου και του όγκου, το στάδιο, την παραλαβή των ταυτόχρονων ακτινοχημειοθεραπεία, τον αριθμό των κύκλων χημειοθεραπείας, και η δόση της ακτινοβολίας. Επιμόλυνση με

TGFβ1

+ 29C (έναντι + 29T) διέγειρε την μετανάστευση και την εισβολή των Α549 και PC9 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι TGFβ1 + 29C μπορεί να συνδέεται με αυξημένο μεταστατικό δυναμικό.

Συμπεράσματα

TGFβ1

γονότυπους στο rs1800469 και rs1982073 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη ΒΔΜ μεταξύ των ασθενών με NSCLC αγωγή με οριστική θεραπεία ακτινοβολίας. Τα ευρήματα αυτά απαιτούν επικύρωση σε μεγαλύτερες προοπτικές μελέτες και ενδελεχή μηχανιστικές μελέτες

Παράθεση:. Yuan Χ, Wei Q, Komaki R, Liu Ζ, Yang J, Tucker SL, et al. (2013)

TGFβ1

πολυμορφισμοί Προβλέψτε απομακρυσμένη μετάσταση-Δωρεάν επιβίωση των ασθενών με ανεγχείρητο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μετά την οριστική Ακτινοθεραπεία. PLoS ONE 8 (6): e65659. doi: 10.1371 /journal.pone.0065659

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 25 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται σε μέρει από το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης (Πυρήνας) Επιχορήγηση CA016672 στο MD Anderson Cancer Κέντρο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο. , με κατ ‘εκτίμηση 160.340 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2012 [1]. Το τρέχον πρότυπο περίθαλψης για τον καρκίνο του ανεγχείρητο μη μικροκυτταρικό πνεύμονα (NSCLC), μακράν η πιο κοινή παρουσίαση κατά τη διάγνωση, είναι η ακτινοθεραπεία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία. Ωστόσο, τα ποσοστά επιβίωσης μετά από μια τέτοια θεραπεία παραμένουν φτωχοί λόγω των υψηλών ποσοστών υποτροπής, τόσο σε τοπικό όσο και απομακρυσμένα. Συνήθως χρησιμοποιούνται ραδιόφωνο (χημειο) αγωγές θεραπείας συνδέονται επίσης με σημαντική φυσιολογική τοξικότητα των ιστών, περιλαμβανομένης πνευμονίτιδας ακτινοβολία, η οποία μπορεί να είναι θανατηφόρος. Καλύτερες στρατηγικές θεραπείας έχει σχεδιαστεί σύμφωνα με την εγγενή ευαισθησία και τον κίνδυνο της τοξικότητας του κάθε επιμέρους ασθενούς, μοναδική έκφραση του όγκου του μοριακού στόχου (s), και οι κίνδυνοι τοποπεριοχική ή απομακρυσμένη υποτροπή της νόσου απαιτούνται επειγόντως.

Μια πιθανή μοριακού βιοδείκτη για την πρόβλεψη της έκβασης της θεραπείας μετά ακτινοχημειοθεραπεία για NSCLC, όσον αφορά τόσο την απόκριση του όγκου και φυσιολογικό βλάβη ιστού, αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης β1 (TGFβ1). Μέλη της κυτοκίνης ΤΟΡβ εκμαιεύσει υπεροικογένεια ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών αποκρίσεων, που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, ίνωση, απόπτωση, φλεγμονή των ιστών, την επισκευή τραύματος, και την αγγειογένεση [2] – [4]. Οι αλλαγές σε ΤΟΡβ σηματοδότηση έχουν αναφερθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [5], [6]. Αν και ΤΟΡβ τυπικά δρα ως καταστολέας όγκου [7], [8], η ανάπτυξη του όγκου εξελίσσεται, τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν ανθεκτικότητα σε ΤGFβ-επαγόμενη διακοπή αύξησης. Από τις τρεις γνωστές ισομορφές του ΤΟΓβ, TGFβ1 φαίνεται να εμπλέκονται άμεσα στην πρόκληση της μεταστατικής δραστικότητα των καρκινικών κυττάρων [9]. Προκλινικές μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της σηματοδότησης TGFβ1 ρυθμίζει προς τα κάτω τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και καταστέλλει την ανάπτυξη μετάστασης [10], [11]. Έτσι, TGFβ1 μπορεί να έχει ένα διπλό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου, καταστολή της ανάπτυξης του όγκου κατά την διάρκεια των αρχικών φάσεων της καρκινογένεσης αλλά προωθώντας την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση σε πιο προχωρημένα στάδια [12], [13]. Πράγματι, η αύξηση της στοιχεία δείχνουν ότι TGFβ σηματοδότηση έχει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα [14], [15]. TGFβ1 έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει την επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικών μετάβασης, η οποία έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην εισβολή και μετάσταση ορισμένων τύπων κυττάρων του όγκου [16]. ΤΟΡβ έχει περαιτέρω εμπλακεί στην ευαισθησία των κυττάρων του όγκου στην ακτινοβολία και χημειοθεραπευτικά φάρμακα [17] – [19].

Εκτός από τα αποτελέσματά του επί κυττάρων όγκου, TGFβ1 εμπλέκεται επίσης στην απόκριση των φυσιολογικών ιστών σε ακτινοβολία ή ακτινοχημειοθεραπεία. Δύο ομάδες έχουν δείξει προκαταρκτική απόδειξη ότι οι αλλαγές στα επίπεδα των TGFβ1 πλάσμα κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας μπορεί να προβλέψει τον κίνδυνο ανάπτυξης που προκαλείται από ακτινοβολία του πνεύμονα τοξικότητα [20], [21]. Ισχυρές ενώσεις έχουν επίσης αναφερθεί μεταξύ πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) σε

TGFβ1

και προκαλούμενη από ακτινοβολία ίνωση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού ή γυναικολογικό καρκίνο [22], [23] και μεταξύ SNPs και πνευμονίτιδα ακτινοβολία σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που έλαβαν θεραπεία με ακτινοθεραπεία ή ακτινοχημειοθεραπεία [24]. Εξερευνήσεις της προγνωστικής αξίας των

TGFβ1

SNPs σε μια ποικιλία τύπων καρκίνου [25], [26] δείχνουν ότι ορισμένοι

TGFβ1

γονότυπους προβλέψει πιο επιθετικό φαινότυπο όγκου και κακή πρόγνωση.

Εμείς προηγουμένως αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ τριών διαφορετικών SNPs του

TGFβ1

[rs1800469 (C-509T), rs1800471 (G915C), και rs1982073 (Τ + 29C)] και η ανάπτυξη της πνευμονίτιδας από ακτινοβολία σε ασθενείς με NSCLC αγωγή με ακτινοχημειοθεραπεία και παρατήρησε ότι οι CT /CC γονότυπους του

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) συσχετίστηκαν με σημαντικά χαμηλότερο κίνδυνο πνευμονίτιδας από ακτινοβολία [24]. Επιπλέον, rs1982073 (Τ + 29C) και rs1800469 (C-509T) έχουν συνδεθεί με αυξημένα επίπεδα TGFβ1 [26] στον ορό και με τη συχνότητα του διηθητικού καρκίνου του μαστού [27]? rs1800469 (C-509T) έχει επίσης συνδεθεί με τον καρκίνο σε προχωρημένο στάδιο του προστάτη [26] και του παχέος εντέρου [28]. Με βάση αυτές τις δημοσιευμένες διαπιστώσεις, ερευνήσαμε αν αυτά τα λειτουργικά γενετικές παραλλαγές του

TGFβ1

επίσης να επηρεάσει την ανταπόκριση του όγκου και την έκβαση σε ασθενείς με ανεγχείρητο ΜΜΚΠ αντιμετωπίζεται με οριστική ακτινοβολία ή ακτινοχημειοθεραπεία, αξιολογείται από την άποψη της συνολικής επιβίωσης (OS) και μακρινή μετάσταση επιβίωση χωρίς (ΒΔΜ).

Μέθοδοι

Θέματα για αυτό το αναδρομική ανάλυση επιλέχθηκαν από μια μεγάλη βάση δεδομένων των 740 ασθενών με ΜΜΚΠ οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε θεραπεία στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center από το Νοέμβριο του 1998 μέχρι το 2009. συνολικά 261 ασθενείς στους οποίους παρατηρήθηκε ότι είχαν δείγματα ολικού αίματος διαθέσιμα για ανάλυση? όλους αυτούς τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε θεραπεία το Νοέμβριο του 1998 έως τον Ιανουάριο του 2005. Από αυτά τα 261 ασθενείς, 56 είχαν αποκλειστεί: 25 που είχαν πεθάνει από άλλες ασθένειες ή των οποίων η κατάσταση υγείας του ήταν άγνωστη? 16 ο οποίος είχε πεθάνει από NSCLC χωρίς πληροφορίες σχετικά μακρινή μετάσταση ή τοποπεριοχική νόσου, 2 ο οποίος είχε υποβληθεί σε χειρουργική επέμβαση, 1 που είχαν καρκίνο των πνευμόνων μικρών κυττάρων, και 12 που είχαν νόσο σταδίου IV, αφήνοντας ένα σύνολο 205 ασθενών με πλήρεις πληροφορίες για η τρέχουσα ανάλυση.

γονοτυπικός

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από λευκοκύτταρα από δείγματα ολικού αίματος με ένα DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. καθαρότητα του DNA και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρική μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm. SNPs σε TGFβ1 είχαν επιλεγεί που πληρούν δύο τουλάχιστον από τα ακόλουθα τρία κριτήρια: (1) ανέφεραν συσχετίσεις με πνεύμονα ή άλλους τύπους καρκίνου? (2) ένα μικρό συχνότητα αλληλόμορφο & gt? 5% σε άτομα του Καυκάσου καταγωγή? και (3) θέση σε προαγωγού ή περιοχή κωδικοποίησης του γονιδίου. Εμείς γονότυπος τρία τέτοια SNP: rs1800469 (C-509T, στην περιοχή του προαγωγέα), rs1800471 (G915C, στο εξώνιο 1), και rs1982073 (Τ + 29C, επίσης στο εξώνιο 1) με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) μήκους θραύσματος -Περιορισμός πολυμορφισμός όπως περιγράφεται αλλού [24].

In vitro αξιολόγηση της rs1982073

TGFβ1 + 29C

ή

TGFβ1 + 29T

σταθερά επιμολυσμένα

επίσης εξετάσαμε εάν

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) C παραλλαγή γονότυπους επηρέασε την μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα in vitro ως εξής. Για αυτά τα πειράματα, Α549 και PC9 κύτταρα, τόσο που προέρχονται από αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα, καλλιεργήθηκαν σε Ham Ρ12 (Α549) ή RPMI 1640 (PC9) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και αντιβιοτικά (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μονάδες /mL στρεπτομυκίνη ) στους 37 ° C με 5% CO

2, andmedium αναζωογονήθηκε κάθε 2-3 ημέρες. Όταν οι καλλιέργειες των κυττάρων έφθασε περίπου το 50% συρροή σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό, αυτά επιμολύνθηκαν με έναν ιό ελέγχου ή με ένα TGFβ1 (+ 29C ή + 29T) υπερεκφράζουν φακοϊό (κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω) σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης 100 , επωάστηκαν για 48 ώρες, και καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε Ham Ρ12 (Α549) ή RPMI 1640 (PC9). Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μετράται σε όρους κυτταρικής έκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης με μικροσκοπία φθορισμού (Leica DMI4000B), βρέθηκε να είναι & gt? 99%. Τα επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια εξετάστηκαν για διεισδυτικότητα και κινητικότητα τους, όπως περιγράφεται παρακάτω.

TGFβ1 cDNA ενισχύθηκαν με PCR, με βιβλιοθήκη cDNA από κύτταρα βρογχικών λείων μυών χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα DNA. Οι εκκινητές ήταν 5′-CCAAGCTTATGCCGCCCTCCGGGCTG-3 ‘και 5′-CGGAATTCTCAGCTGCACTTGCAGGAG-3’ (υπογραμμισμένη αλληλουχίες υποδεικνύουν τις θέσεις περιορισμού HindIII και EcoRI). Η TGFβ1 cDNAs με + 29C και + 29T στάλθηκαν σε Genechem Company (Σαγκάη, Κίνα) για την κατασκευή των σχετικών συστημάτων φακοϊό.

Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα Α549 και PC9 εκχυλίζονται σε κρύο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM Tris -ΗΟΙ (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% Triton Χ-100, και μίγμα αναστολέα πρωτεάσης (1 mM PMSF, 2 μg /mL απροτινίνη, 1 μg /mL λευπεπτίνη, και 1 μg /mL πεπστατίνη Α)]. Τα προϊόντα λύσης κυττάρου στη συνέχεια διαυγάζονται με φυγοκέντρηση σε 10,000 χ

g

για 20 λεπτά, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε με μια BCA Protein Assay Kit. Ίση ποσότητα των πρωτεϊνών σε προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν σε 12% δωδεκυλοθειικό νάτριο για ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad). TGFβ1 ανιχνεύθηκε με ειδικό αντίσωμα # 3709 από τη Cell Signaling Technology.

Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία μηδέν και κυττάρου διεισδυτικότητα με μία δοκιμασία transwell ως ακολούθως. Για τη δοκιμασία μηδέν, Α549 και PC9 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 24-φρεατίων σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες, μετά την οποία η μονοστιβάδα γδαρμένο με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 200 μL, οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και τα κύτταρα επωάστηκαν με F12 Ham άνευ ορού του (Α549) ή RPMI χωρίς ορό (PC9) για 24 ώρες, μετά από το οποίο οι εικόνες συλλαμβάνονται από μικροσκοπία στα 100 × μεγέθυνση και την «επούλωση «περιοχές μετρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Leica DMI4000B). Για κάθε τύπο κυττάρου, τρία ανεξάρτητα πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν, και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Για τους προσδιορισμούς Transwell, Α549 και PC9 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ελεύθερο ορού του Ham F12 ή άνευ ορού RPMI 1640 σε πυκνότητα 3 × 10

5 ανά mL, και 100-μί υποπολλαπλάσια προστέθηκαν στα ανώτερα διαμερίσματα 24 φρεατίων transwell θάλαμο που περιέχει πολυανθρακικά φίλτρα με 8-μm πόρους και επικαλύπτεται με 60 μί Matrigel (1: 9 αραίωση? Sigma Aldrich). Πέντε υποπολλαπλάσια εκατό μικρολίτρων F12 ή RPMI 1640 με 10% FBS του Ham προστέθηκαν στους κάτω θαλάμους και οι θάλαμοι επωάζονται επί 24 ώρες. Εκείνη την εποχή, τα κύτταρα στο ανώτερο διαμέρισμα απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, ξεπλύθηκαν με PBS, και μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα από την Matrigel στην κάτω επιφάνεια χρώσθηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο και ποσοτικοποιείται με μέτρηση του αριθμού των φθοριζόντων κυττάρων σε 5 τυχαία μικροσκοπικά πεδία ανά ηθμό στα 400 × μεγέθυνση. Τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Στις κλινικές μελέτες συσχέτισης δείγματος, του χρόνου OS υπολογίσθηκε από την πρώτη ημέρα της θεραπείας ακτινοβολίας μέχρι το θάνατο ή την τελευταία γνωστή παρακολούθησης. ΒΔΜ φορές υπολογίστηκαν από την πρώτη ημέρα της θεραπείας ακτινοβολίας στην πρώτη παρατηρούμενη ημέρα των μακρινών μετάστασης ή στην τελευταία γνωστή παρακολούθησης. Σύλλογοι μεταξύ της κατανομής των

TGFβ1

γονότυπους και κλινικά χαρακτηριστικά αξιολογήθηκαν από την ακριβή τεστ του Fisher ή χ Pearson ‘s

2 δοκιμές. Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση των διαφόρων

TGFβ1

γονότυπους σε OS και ΒΔΜ, υπολογίζεται ως αναλογίες κινδύνου (HR) με τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (ΠΙ). Όλα τα HRs προσαρμόστηκαν ως προς την ηλικία, το φύλο, τη φυλή, την κατάσταση απόδοσης Karnofsky, το κάπνισμα, η ιστολογία του όγκου, συνολικού όγκου του όγκου, το στάδιο της νόσου, την παραλαβή της χημειοθεραπείας ή της ταυτόχρονης ακτινοχημειοθεραπεία, τον αριθμό των κύκλων χημειοθεραπείας, και δόση ακτινοβολίας που λαμβάνεται. Η ανάλυση Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση του

TGFβ1

γονότυπο για την αθροιστική πιθανότητα ΒΔΜ. Όλες οι αναφερόμενες

P

τιμές ήταν δύο όψεων, και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL).

Τα in vitro δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσοι ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (καθένα από τα οποία είχε διενεργηθεί εις τριπλούν) και σε σύγκριση με

t

τεστ του Student.

P

τιμές των & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές

Αποτελέσματα

Κλινικές Συσχέτιση Δείγμα Μελέτες

Τα κλινικά χαρακτηριστικά του 205 που αναλύθηκαν οι ασθενείς συνοψίζονται στον πίνακα 1. τον ασθενή, ασθένειες, και τα χαρακτηριστικά σχετίζονται με τη θεραπεία σύμφωνα με τις

TGFβ1

πολυμορφισμοί ήταν καλά ισορροπημένο όσον αφορά την ηλικία, τη φυλή, το φύλο, την κατάσταση απόδοσης Karnofsky, η χρήση καπνού, ιστολογία του όγκου, συνολικού όγκου του όγκου, το στάδιο της νόσου, τον αριθμό των κύκλων της χημειοθεραπείας, την παραλαβή της χημειοθεραπείας έναντι μόνο ακτινοβολίας, και η δόση ακτινοβολίας που λαμβάνει (δεν φαίνεται).

η

Οι μέσοι χρόνοι παρακολούθησης ήταν 17 μήνες για το ολόκληρη την ομάδα και 39 μήνες για τους ασθενείς που ήταν ζωντανοί κατά τη στιγμή της ανάλυσης (εύρος 1-97 μήνες). Ο μέσος χρόνος OS ήταν 21 μήνες. Ένα σύνολο 103 ασθενών (50%) ανέπτυξαν DM σε 134 sites? 27 ασθενείς είχαν DM σε περισσότερες από 1 χώρο (23 σε 2 χώρους και 4 σε 3 περιοχές). Οι θέσεις των μεταστάσεων περιλαμβάνονται εγκεφάλου (n = 39), των οστών (n = 26), του πνεύμονα (n = 26), τα επινεφρίδια (n = 13), το ήπαρ (η = 14), και άλλα μη καθορισμένων εντοπίσεων (n = 16).

Σχήμα 1 απεικονίζει την ανάλυση Kaplan-Meier της επίδρασης του

TGFβ1

γονότυπο και αθροιστική πιθανότητα ΒΔΜ. Οι

TGFβ1

rs1800469 (C-509T) γονότυπους CT + ΤΤ συσχετίστηκαν με σημαντικά μικρότερη διάμεση ΒΔΜ (11 μήνες έναντι 31 μηνών για τον CC γονότυπο,

P

= 0,010? Εικ. 1Α ). Η

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) CT + CC γονότυπους επίσης συσχετίστηκε με σημαντικά μικρότερη διάμεση ΒΔΜ (σε σύγκριση με το γονότυπο ΤΤ) (

P

= 0,013? Εικ. 1Γ). Ωστόσο, υπάρχουν συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ οποιουδήποτε γονότυπου (ΓΚ, ΚΔ, CC, ή CG + CC) του

TGFβ1

rs1800471 (G915C) SNP και ΒΔΜ (Εικ. 1Β).

P τιμές

υπολογίστηκαν με τεστ log-rank.

η

τα ευρήματα από τις πολυπαραγοντικές αναλύσεις του

TGFβ1

πολυμορφισμών και κλινικές εκβάσεις προσαρμοστεί για τον ασθενή, ασθένειες και θεραπεία οι-σχετικών παραγόντων παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Η

TGFβ1

rs1800469 (C-509T) γονότυπους CT + ΤΤ συσχετίστηκαν με αυξημένη HR για OS και ΒΔΜ σε σύγκριση με το γονότυπο CC (HR για το OS = 1.463, 95% CI = 1,012 – 2,114,

P

= 0,043? HR για ΒΔΜ = 1.601, 95% CI = 1,042 – 2,459,

P

= 0,032). Οι

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) CT + CC γονότυπους επίσης σχετίζεται με αυξημένο Ανθρώπινου Δυναμικού για ΒΔΜ σε σύγκριση με το γονότυπο CC (HR = 1,589, 95% CI = 1,009 – 2,502,

P

= 0,046). Δεν συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ οποιωνδήποτε γονότυπους (ΓΚ, ΚΔ, CC, ή CG + CC) του

TGFβ1

rs1800471 (G915C) SNP και OS ή ΒΔΜ.

Η

αναλυθεί περαιτέρω η ένωση των

TGFβ1

rs1800469 (C-509T), rs1800471 (G915C), και rs1982073 (Τ + 29C) γονότυπους με τις θέσεις του οργάνου στο οποίο μεταστάσεις αναπτυχθεί με τη χρήση Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων. Οι CT ή τους γονότυπους ΤΤ του rs1800469 (έναντι CC) και το CT ή CC γονότυπους PF rs1982073 (έναντι ΤΤ), και οι δύο συνδέονται με μια διπλή αύξηση του HR για τον εγκέφαλο, οστά, και πνευμονικές μεταστάσεις σε μονοπαραγοντική ανάλυση. Ωστόσο, σε αναλύσεις πολλαπλών μεταβλητών, η μόνη σημαντική συσχέτιση ήταν μεταξύ rs1982073 CT ή CC (έναντι ΤΤ) και μεταστάσεις στον εγκέφαλο (HR = 2,567 [CI = 1,155 – 5,702],

P

= 0,021) (Πίνακας 3) .

Η

in vitro ευρήματα

Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και για τις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου Α549 και PC9 πνεύμονα ήταν περίπου 99% (Σχ. 2Α, Β). Η επιμόλυνση των Α549 και PC9 κυττάρων με

ΤΟΡ-β1

+ 29C ή + 29T επαγόμενη τις αναμενόμενες αυξήσεις στην έκφραση τόσο προδρόμου και δραστικές μορφές του TGFβ1 (Σχ. 2C, D). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές, μετά από επιμόλυνση με το + 29C κατασκεύασμα TGFβ1, διαπιστώθηκε αυξημένη κινητικότητα (Εικ. 3Α, Β, C, Ε) και αυξημένη εισβολή (Σχ. 3D, F) σε σχέση με τα + 29T μορφομετατροπείς. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο γονότυπος TGFβ1 + 29C και στις δύο από αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από ένα φαινότυπο με αυξημένο δυναμικό για μετάσταση

(Α, Β) την επισήμανση φθορισμού έδειξε ότι η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν & gt?. 99% και για τα δύο κυτταρικές γραμμές. (C, D) ανάλυση κηλίδος Western επιβεβαίωσε ότι επιμόλυνση με είτε + 27C ή + 29T οδήγησε στην υπερέκφραση της TGFβ1 τόσο πρόδρομο και ενεργές μορφές. Con, τον έλεγχο lentivirus κατασκεύασμα? αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GADPH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α, Β) φθορισμού αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές εικόνες δείχνουν ότι στις 24 ώρες, περισσότερες από τις + 29C μορφομετατροπείς μετανάστευσαν σε μια «θεραπευτική» περιοχή σε δοκιμασία το μηδέν ό, τι έκανα + 29T επιμολύνσεων. Τα ευρήματα αυτά απεικονίζονται ποσοτικά ως η απόσταση μετανάστευσαν κατά την διάρκεια της δοκιμασίας το μηδέν σε πάνελ C και Ε (D, F) Οι + 29C μορφομετατροπείς έδειξαν μεγαλύτερη διεισδυτικότητα, όπως υποδεικνύεται από τους αριθμούς των κυττάρων που διαπερνούν μεμβράνη σε μια δοκιμασία transwell. Τα αποτελέσματα δίδονται ως μέσο από 3 ανεξάρτητα πειράματα? μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

Μετάσταση παραμένει μια σημαντική αιτία της αποτυχίας της θεραπείας για ασθενείς με ΜΜΚΠ αντιμετωπίζεται με ακτινοθεραπεία, με ή χωρίς χημειοθεραπεία [29], [30]. Οι παράγοντες που προβλέπουν τη βιολογική συμπεριφορά και μεταστατικό δυναμικό των NSCLC ζητήθηκε ενεργά για τις τελευταίες 3 δεκαετίες. Το πιο σημαντικό εύρημα από την παρούσα μελέτη είναι η σχέση μεταξύ παραλλαγή

TGFβ1

γονότυπους στο rs1800469 και rs1982073 και χειρότερα ΒΔΜ μεταξύ των ασθενών με NSCLC δοθεί ακτινοθεραπεία? Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι SNPs σε

TGFβ1

γονίδια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για να συνταγογραφήσει εξατομικευμένες ακτινοχημειοθεραπεία ανάλογα με το αναμενόμενο ρυθμό της υποτροπής πριν την έναρξη της θεραπείας. Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω τη σύνδεση των

TGF-β1

SNP rs1982073 Τ + 29C με αυξημένη μετανάστευση και τη διεισδυτικότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών δύο πνεύμονα, Α549 και PC9, in vitro.

Περαιτέρω αναλύσεις μας τα αποτελέσματα έδειξαν στατιστικά υψηλότερο κίνδυνο εγκεφαλικών μεταστάσεων σε ασθενείς με τις

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) γονότυπους παραλλαγή C. εγκεφαλικές μεταστάσεις είναι μια κοινή επιπλοκή του τοπικά προχωρημένου NSCLC, με 21% έως 54% των ασθενών που αναπτύσσουν μετάσταση εγκεφάλου κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου [31], [32]. Ο χρόνος OS ασθενών με μετάσταση στον εγκέφαλο γενικά κυμαίνεται από περίπου 3 έως 6 μήνες [33] – [35], και το 30% -50% των ασθενών με εγκεφαλικές μεταστάσεις πεθαίνουν από νευρολογικά αίτια [36], [37]. Η προφυλακτική κρανιακή ακτινοβολία (PCI) έχει δειχθεί σε δύο τυχαιοποιημένες μελέτες για να μειώσει τη συχνότητα εμφάνισης ή να καθυστερήσει την έναρξη της εγκεφαλικής μετάστασης σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο NSCLC μετά την πρωτογενή θεραπεία, και τη χρήση των PCI μπορεί να παρατείνει OS σε αυτούς τους ασθενείς [38], [39 ]. Η Ακτινοθεραπεία Oncology Group (RTOG), σε μια προσπάθεια να επεκτείνει τα αποτελέσματα αυτά, άνοιξε μια μεγάλη μελέτη (RTOG 0214) του PCI έναντι παρατήρησης για ασθενείς με τοπικά προχωρημένο NSCLC. Σε ασθενείς με III στάδιο της νόσου χωρίς εξέλιξη της νόσου μετά την θεραπεία, PCI μείωσε το ποσοστό της εγκεφαλικής μετάστασης, αλλά δεν βελτίωσε την OS ή ελεύθερη νόσου επιβίωση [40]. Στην ιδανική περίπτωση, κάποιος θα συνταγογραφήσει PCI μόνο για τους ασθενείς που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο ανάπτυξης εγκεφαλικών μεταστάσεων. Ωστόσο, μέχρι στιγμής, δεν υπάρχει αξιόπιστος τρόπος έχει βρεθεί να προσδιορίσει ποιοι ασθενείς θα αναπτύξουν εγκεφαλικές μεταστάσεις και η οποία δεν θα-εξ ου και η έντονη αναζήτηση για βιοδείκτες. Ως εκ τούτου, το εύρημα μας ότι

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) C παραλλαγή γενότυποι που σχετίζεται με μετάσταση στον εγκέφαλο έχει ιδιαίτερη σημασία στη διαχείριση των NSCLC, διότι αυτό SNP μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτη για την αναγνώριση των ασθενών οι οποίοι θα ωφελούνταν από PCI.

Η δυνατότητα χρησιμοποίησης

TGFβ1

SNPs ως προγνωστική βιολογικών δεικτών σε άλλα είδη καρκίνου έχει μελετηθεί από τους άλλους. Σε μια τέτοια μελέτη, η

TGFβ1

rs1800469 C-509T ομόζυγη ΤΤ γονότυπο βρέθηκε να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο να έχουν μια επιθετική μορφή του καρκίνου του προστάτη, αλλά η rs1982073 Τ + 29C (+ 29C T) C παραλλαγή γονότυπους δεν ήταν [26]. Σε αντίθεση, μια άλλη ομάδα έδειξε ότι οι ασθενείς με καρκίνο του μαστού που έφερε το αλληλόμορφο Τ + 29C C είχαν χαμηλότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση 5 ετών από ό, τι εκείνοι με το γονότυπο ΤΤ [25]. Άλλα στοιχεία που αναδύεται ότι SNPs σε ορισμένα άλλα γονίδια μπορεί να προβλέψει το αποτέλεσμα σε NSCLC. Για παράδειγμα, έχουν γενετικών ανωμαλιών σε γονίδια για μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -3 και ΜΜΡ-9 ή την ΧΚΧΧ1 πρωτεΐνη επισκευή ακτίνων Χ έχουν αναφερθεί ότι επηρεάζουν την κλινική συμπεριφορά και τον κίνδυνο μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα [41] – [43]. Αυτές οι βιοδείκτες έχουν ακόμη να μεταφραστεί ευρέως στην κλινική πρακτική. Τα ευρήματά μας συνάδουν με αυτές τις εκθέσεις: DM ήταν ένα σημαντικό μοτίβο της αποτυχίας στη μελέτη μας (ποσοστό ΒΔΜ, 50,2%), και η παραλλαγή γονότυπους σε

TGFβ1

rs1800469 (C-509T) και

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) φάνηκε να σχετίζεται με μικρότερους χρόνους ΒΔΜ. Αν επικυρωθεί σε μεγαλύτερες μελέτες, τα ευρήματά μας θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βάση για τη χρήση αυτών των γονότυπων ως προγνωστικός δείκτης της κλινικής έκβασης, ιδιαίτερα προδιάθεση για μετάσταση στον εγκέφαλο, σε ασθενείς με NSCLC.

Η μηχανιστική βάση τα ευρήματα από το τρέχουσα μελέτη χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Ορισμένοι ερευνητές έχουν προτείνει ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης TGβ1 μπορούσαμε να προβλέψουμε ανεξάρτητα επιβίωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [18], [44] – [46]. Σε αυτές τις μελέτες, η έκφραση TGFβ1 σε πρωτογενείς ιστούς καρκίνου του πνεύμονα ήταν υψηλότερη μεταξύ των ασθενών με πνευμονικές μεταστάσεις από ότι μεταξύ των ασθενών χωρίς τέτοιες μεταστάσεις. Προηγούμενες εκθέσεις πρότειναν ότι οι πολυμορφισμοί στην αλληλουχία σήματος σε 915 [47], C-509T [48], και Τ + 29C (που κωδικοποιεί Leu10Pro) στο

TGFβ1

γονίδιο που σχετίζεται με την αυξημένη παραγωγή TGFβ1. Οι μελέτες αυτές μπορεί να ρίξει φως σε μας διαπίστωση ότι γονότυπους παραλλαγή σε

TGFβ1

rs1800469 (C-509T) και

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) συνδέθηκαν με μικρότερους χρόνους ΒΔΜ σε ασθενείς με ΜΜΚΠ αντιμετωπίζεται με οριστική θεραπεία ακτινοβολίας.

στη μελέτη μας, που έχουν τις

TGFβ1

rs1800469 (C-509T) CT ή τους γονότυπους ΤΤ φάνηκε στην μονοπαραγοντική ανάλυση να σχετίζεται με μικρότερο λειτουργικό σύστημα, και δεν ενώσεις βρέθηκαν μεταξύ OS και

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) γονότυπους. Το εύρημα αυτό έρχεται σε αντίθεση με μια έκθεση από Mu et al. [49] δείχνουν ότι οι ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε πρώιμο στάδιο και το γονότυπο T /T ή υψηλά επίπεδα εντός του όγκου TGFβ1 είχαν μικρότερους χρόνους OS από ό, τι τα άτομα χωρίς Μ /Τ ή με χαμηλά επίπεδα intratumorial TGFβ1. Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή ήταν διαφορετική για τους ασθενείς με τελικού σταδίου νόσο: για τους ασθενείς, που έχουν την T /T γονότυπο σχετίστηκε με χαμηλότερο κίνδυνο υποτροπής της νόσου. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι

TGFB1

έχει πολύπλοκο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού, η οποία υποστηρίζει τα ευρήματα άλλων μελετών που

TGFβ1

έχει αντικρουόμενα αποτελέσματα στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου.

μας μελέτη είχε αρκετούς περιορισμούς? single-φορέα του και αναδρομικού χαρακτήρα απαιτούν ότι τα πορίσματά της να επικυρωθεί το μεγαλύτερο, κατά προτίμηση πολυ-θεσμική προοπτικές μελέτες. Ένας άλλος περιορισμός ήταν ότι δεν είχαμε τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης TGFβ1 στο πλάσμα πριν, κατά τη διάρκεια ή μετά τη θεραπεία ακτινοβολίας, και έτσι δεν μπόρεσε να προσδιορίσει αν έχει το

TGFβ1

rs1982073 (Τ + 29C) CT γονότυπο επηρέασε την έκφραση της TGFβ1 επίπεδα πρωτεΐνης in vivo, ούτε θα μπορούσαμε να καθορίσει αν ο κίνδυνος DM συσχετίζεται με αλλαγές στη μεταβλητή αυτή πριν ή μετά τη θεραπεία. Έτσι διευκρινίσεις εξακολουθεί να είναι αναγκαία όσον αφορά τις σχέσεις μεταξύ των πολυμορφισμών στο

TGFβ1

και τα επίπεδα της πρωτεΐνης TGFβ1 στο πλάσμα και την πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC. Τέλος, η έρευνά μας περιορίστηκε σε ασθενείς που έλαβαν οριστική θεραπεία ακτινοβολίας. Αν η

TGFβ1

rs1982073 παραλλαγή γονότυπους επίσης προβλέπουν έκβαση στους ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση ή άλλες θεραπείες μη-ακτινοβολία με βάση παραμένει ασαφής.

προηγούμενες εργασίες μας [24] έδειξε ότι έχει την CT ή CC παραλλαγές στο

TGFβ1

rs1982073 συσχετίστηκε με χαμηλότερο κίνδυνο σοβαρής (βαθμού ≥3) πνευμονίτιδα από ακτινοβολία, μια παρατήρηση που υποδηλώνει ότι η εντατικοποίηση της δόσης ακτινοβολίας για την αύξηση τοποπεριοχική έλεγχο του όγκου σε ασθενείς με γονότυπο αυτό θα ήταν εφικτό. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αναφέρουμε εδώ έδειξαν ότι οι ασθενείς με αυτές τις γονότυπους είχαν αυξημένο κίνδυνο DM, ειδικά του εγκεφάλου μεταστάσεις, μια παρατήρηση που υποδηλώνει ότι η συστημική θεραπεία και PCI υποδεικνύονται. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη μας δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι το

TGFβ1

rs1982073 παραλλαγή γονότυπους μπορεί να είναι χρήσιμη ως μια γενετική βιοδείκτη για να βοηθήσει τους γιατρούς προσαρμόσουμε τη θεραπεία ανάλογα με τον κίνδυνο του ασθενούς πνευμονίτιδας από ακτινοβολία και DM. Ως τέτοιες, συμπληρωματικές μελέτες που απαιτούνται για την επικύρωση αυτό το εύρημα και να διερευνήσει τους μηχανισμούς με τους οποίους

TGFβ1

πολυμορφισμοί επηρεάζουν την πορεία της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα. Αυτά τα είδη των μελετών θα βοηθήσει να παρέχει μια καλύτερη κατανόηση της μικροπεριβάλλον του καρκίνου και μετάσταση και μπορεί να συμβάλει στην προσαρμογή της θεραπείας για NSCLC.