Αφηρημένο

Η υπερθερμία (HT) βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας κατά του καρκίνου και χημειοθεραπεία. Ωστόσο, ΗΤ επίσης προκαλεί αναπόφευκτα λόγω άγχους και αυξάνει την έκφραση των πρωτεϊνών θερμικού σοκ (HSPs) σε καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ των HSPs, HSP70 είναι γνωστή ως πρωτεΐνη προ-επιβίωσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση ευαισθητοποίησης του pifithrin (PFT) -μ, ένα μικρό μόριο αναστολέα της HSP70, όταν τρία καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (LNCaP, PC-3, και DU-145) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες). Όλες οι κυτταρικές σειρές εκφράζουν συντακτικά HSP70, και HT περαιτέρω αύξηση της έκφρασης του σε LNCaP και DU-145. Knockdown της HSP70 με παρεμβολή RNA μείωσε την βιωσιμότητα και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων. PFT-μ μείωσε τις βιωσιμότητες όλων των κυτταρικών γραμμών στο ένα δέκατο της δόσης της κερκετίνης, ένα πολύ γνωστό αναστολέα HSP. Η συνδυαστική θεραπεία με υποβέλτιστες δόσεις PFT-μ και ΗΤ μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων πιο αποτελεσματικά όταν PFT-μ προστέθηκε αμέσως πριν ΗΤ, και αυτό το αποτέλεσμα συνδυασμού καταργήθηκε με προ-knockdown του HSP70, υποδηλώνοντας ότι η επίδραση διαμεσολαβείται μέσω αναστολή HSP70. Ο θάνατος που προκαλείται από κύτταρο συνδυαστική θεραπεία, μερικώς κασπάσης-εξαρτώμενη, και μειωμένη πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα, με μειωμένη έκφραση του c-myc και κυκλίνη D1 και αυξημένη έκφραση του p21

WAF1 /CIP, υποδεικνύοντας διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων. Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με είτε μόνο του. Επιπλέον, σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος, η θεραπεία συνδυασμού ανέστειλε σημαντικά PC-3 ανάπτυξη του όγκου. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι PFT-μ μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά ΗΤ επιδράσεις κατά του όγκου μέσω αναστολής της HSP70 επάγοντας κυτταρικό θάνατο και τη σύλληψη της κυτταρικής ανάπτυξης, και ότι PFT-μ είναι ένας υποσχόμενος παράγοντας για χρήση σε συνδυασμό με ΗΤ για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Sekihara K, Harashima Ν, Tongu Μ, Tamaki Υ, Uchida Ν, Inomata T, et al. (2013) Pifithrin-μ, ένας αναστολέας της Heat Shock Protein-70, μπορεί να αυξήσει τα Αποτελέσματα κατά του όγκου του Υπερθερμία ενάντια στα κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (11): e78772. doi: 10.1371 /journal.pone.0078772

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 10 Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 16, Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Νοεμ 2013

Copyright: © 2013 Sekihara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία (αρ. 18591449 έως Μ Harada και όχι. 23701074 έως Ν Harashima), και από Σιμάνε Πανεπιστήμιο Project «S-Takumi Ιατρική νανοτεχνολογία» (με τον Μ Harada). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Αν και ο καρκίνος του προστάτη πρώιμου σταδίου μπορεί να ελέγχεται καλά με χειρουργική επέμβαση ή ακτινοθεραπεία, οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη σε κατεργασία με ορμονοθεραπεία [2]. Ωστόσο, μετά από μια βραχυπρόθεσμη ύφεση, επιβιώνουν τα καρκινικά κύτταρα συχνά επιστρέφουν με αυξημένη κακοήθειας [3]. Ως εκ τούτου, να βελτιώσει την επιβίωση σε άνδρες με καρκίνο του προστάτη, πρέπει να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές στρατηγικές.

Υπερθερμία (ΗΤ) είναι μια αποτελεσματική θεραπεία που έχει χαμηλή τοξικότητα, ήπιες παρενέργειες, και έχει αποδειχθεί ότι είναι συνεργιστική με άλλοι τύποι αντικαρκινικών θεραπειών. Πολυάριθμες

in vitro

και

in vivo

μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι HT βελτιώνει αποτελεσματικά την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας κατά διαφόρων τύπων καρκίνων [4] – [6]. Επιπλέον, πολλές κλινικές δοκιμές έχουν δείξει ότι η προσθήκη ΗΤ για ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία μπορεί να δώσει μια πιο ολοκληρωμένη απόκριση [7] – [11]. Ωστόσο, ΗΤ συνδέεται αναπόφευκτα με πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs) [12], [13]. HSPs είναι μοριακοί συνοδοί που ενεργεί ως βασικό κυτταρικό άμυνα εναντίον βλάβη στο πρωτέωμα, εκκινώντας αναδίπλωση μετουσιωμένες πρωτεΐνες και για τη ρύθμιση της υποβάθμισης μετά από σοβαρές βλάβες πρωτεΐνη [14]. HSPs προστατεύουν τα κύτταρα τόσο από τον περιορισμό των αποτελεσμάτων παραγόντων πρωτεϊνικής βλάπτουν μέσω συνοδό πρωτεΐνη και αναδίπλωση και με άμεση μπλοκάρισμα οδούς κυτταρικού θανάτου [15] – [18]. Μεταξύ των HSPs, HSP70 είναι ένα στρες-επαγώγιμους HSP που έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στη θεραπεία αντίστασης [19]. Σε αντίθεση με την πολύ χαμηλό επίπεδο σε μη τεταμένη φυσιολογικά κύτταρα, η έκφραση HSP70 αυξάνει γρήγορα σε απόκριση σε διάφορες τάσεις [20], [21]. Είναι σημαντικό ότι, η αυξημένη έκφραση της HSP70 σε καρκινικά κύτταρα έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με κακοήθη χαρακτηριστικά και χειρότερη πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο [22]. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι HSP70 είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο στη θεραπεία του καρκίνου. Η μείωση των επιπέδων της HSP70 σε ορισμένες καλλιεργημένα κύτταρα όγκου έχει αναφερθεί ότι προκαλεί κυτταρικό θάνατο, και /ή να τα ευαισθητοποιήσει σε κυτταροτοξικούς παράγοντες, ενώ δεν έχει προφανή δηλητηριώδη αποτελέσματα επί κυττάρων μη-όγκου [23] – [28].

Pifithrin (PFT) -μ (2-phenylethynesulfonamide) αρχικά αναγνωρίστηκε ως αναστολέας μικρού μορίου της δέσμευσης του ρ53 στα μιτοχόνδρια [29]. Στη συνέχεια, αυτό το μόριο βρέθηκε να αλληλεπιδρά επιλεκτικά με HSP70 και να αναστέλλουν τις λειτουργίες του [30]. Η πληροφορία αυτή μας οδήγησε να ελεγχθεί η υπόθεση ότι PFT-μ θα μπορούσαν να ενισχύσουν ΗΤ αντικαρκινική δράση κατά των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Στην παρούσα μελέτη, μετά την επιβεβαίωση ότι HSP70 εκφράζεται συστατικά και /ή ενισχύεται από ΗΤ και παίζει ένα ρόλο προ-επιβίωσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη, αποδείξαμε ότι ο συνδυασμός υποβέλτιστων δόσεων PFT-μ μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά ΗΤ αντικαρκινική αποτελέσματα εναντίον ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη

in vitro

, και ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

Τρεις καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (LNCaP, PC-3, και DU-145) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA), και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Sigma- Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) και 20 μg /ml γενταμυκίνη (Sigma-Aldrich) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. PFT-μ και Κερσετίνη αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (SCB: Santa Cruz, CA, USA). Και Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA), αντίστοιχα

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2, 4-δισουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζολίου μονονάτριο άλας (WST-8) δοκιμασία 2- (Nacalai Tesque, Κιότο, Ιαπωνία). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων. Δύο ημέρες αργότερα, WST-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες αναγνώστηκαν σε ένα μήκος κύματος 450 nm μετά από 3 ώρες.

Η θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ

Για να προκληθεί ΗΤ, τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία σπάρθηκαν 1 ημέρα πριν, επωάστηκαν στους 43 ° C για 2 ώρες. Τα καρκινικά κύτταρα ήταν πάντοτε καλλιεργήθηκαν παρουσία PFT-μ για 2 ημέρες. Σε μερικά πειράματα, ΗΤ εκτελέστηκε την ημέρα 1, 2, ή 3, μετά την έναρξη καλλιέργειας των καρκινικών κυττάρων.

Επιμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Η επιμόλυνση του siRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. HSP70 siRNA (SC-29352) αγοράστηκε από SCB. Ελέγχου siRNA (# 6568) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (ΚΣΑ), Danvers, ΜΑ, USA. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα.

που σχηματίζουν αποικίες

δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων επίπεδου πυθμένα. Μία ημέρα αργότερα, PFT-μ προστέθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ΗΤ. Δύο ημέρες μετά την προσθήκη της PFT-μ, το μέσο αντικαταστάθηκε με νέο μέσο που δεν περιέχει PFT-μ, και η καλλιέργεια συνεχίστηκε για επιπλέον 10-12 ημέρες. Στη συνέχεια, οι αποικίες σταθεροποιείται με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.05% κρυσταλλικό ιώδες, έπειτα μετρήθηκαν

Ανοσοστύπωμα

Τα κύτταρα λύθηκαν με ένα αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης θηλαστικού (Μ-PER?. Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Nacalai Tesque). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν επί 4-12% κλίση ή 12% πηκτές SDS-PAGE, και κατόπιν μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο μεμβράνες. Μετά τον αποκλεισμό των μεμβρανών, τα στυπώματα επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-HSP70 (HSP72? Ε & amp? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ, USA), αντι-HSP90 (CST), αντι-ο-Μγο (Epotomics, Burlingame, CA, USA), αντι-cyclinD1 (CST), αντι-β-ακτίνης (BioLegend, San Diego, CA, USA) και αντι-α-τουμπουλίνης (SCB). Κατσίκας αντι-κουνέλι ή φωσφατάση συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα αιγός αλκαλικής αντι-ποντικού (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των πρωτογενών αντισωμάτων. Για την αξιολόγηση του επιπέδου έκφρασης της HSP70 μετά ΗΤ, μία αναλογία της έκφρασης της HSP70 /έκφρασης της β-ακτίνης αξιολογήθηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το ImageJ (https://rsbwed.nih.gov/ij/).

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με τη χρήση της Annexin V-FITC απόπτωση Detection Kit (BioVision, Mountain View, CA, USA), APC-συζευγμένη αννεξίνη V (BD Biosciences, San Jose, CA, ΗΠΑ), και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Για την αναστολή των κασπασών, z-VAD-fmk (R &? D Systems, Mineapolis, ΜΝ, USA) προστέθηκε, και DMSO χρησιμοποιήθηκε ως ελέγχου του οχήματος. Για να εξεταστεί η κυτταρικό κύκλο και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, ένα κιτ BrdU /7ΑΑΌ Πολλαπλασιασμός (Becton Dickinson, Fullerton, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson).

In vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος

BALB

ηυ /ηυ αρσενικών ποντικών

, που αγοράστηκε από CLEA Japan (Tokyo, Japan), διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων οργανισμών. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Σιμάνε Πανεπιστήμιο Ιατρική Σχολή (Αριθμός Άδειας: IZ25-6). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Οι ποντικοί εμβολιάστηκαν στο δεξί πέλμα 1 × 10

6 PC 3-κυττάρων με Matrigel (BD Biosciences Ιαπωνία, Tokyo, Japan) σε αναλογία 1:01 όγκου σε έναν όγκο 50 μλ. Την ημέρα 15, οι ποντικοί ομαδοποιήθηκαν και χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες. Τις ημέρες 0 και 4 μετά ομαδοποίηση, αυτά τα PC-3 που φέρουν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με PFT-μ ή /και ΗΤ. PFT-μ (100 μg σε 50 μΐ) εγχύθηκε εντός του όγκου. Ως έλεγχος οχήματος, εγχύθηκαν 50 μΙ DMSO. Για την εκτέλεση της θεραπείας HT, αυτοί οι ποντικοί PC-3 που φέρουν είχαν μόνο πατούσες τους λούζονται σε 43 ° C νερό για 30 λεπτά μετά τον καθορισμό τους σε πλάκες με ταινία. Στη συνέχεια, το μέγεθος του όγκου, το γινόμενο δύο κάθετων διαμέτρων, και το πάχος πατούσας μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα.

Στατιστικές αναλύσεις

Δεδομένα αξιολογήθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο δύο ουρών του Student

t-test

ή ένα παραμετρικό τεστ Dunnett. Ένα

P

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε ότι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

Pro-επιβίωσης ρόλος της HSP70 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

αξιολογήσαμε πρώτα τα επίπεδα πρωτεΐνης HSP70 σε τρεις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη πριν και μετά τη θεραπεία με ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες) (Σχ. 1Α). Αυτές οι κυτταρικές σειρές εκφράζουν συντακτικά HSP70. Αν και καμία καθορισμένη μεταβολή παρατηρήθηκε σε PC-3, τα επίπεδα έκφρασης σε LNCaP και DU-145 αυξήθηκαν μετά ΗΤ. Είμαστε δίπλα καθοριστεί αν HSP70 παίζει ρόλο προ-επιβίωσης στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Η έκφραση της HSP70 επιλεκτικά μειώθηκε κατά επιμόλυνση HSP70 siRNA (Σχ. 1Β), η οποία μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα και των τριών κυτταρικών γραμμών (Εικ. 1 C). Βρήκαμε επίσης ότι knockdown του HSP70 μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των PC-3 και DU-145 (Σχ. 1D). Επιπλέον, λόγω της αδυναμίας των LNCaP να σχηματίσουν αποικίες σε αυτή τη δοκιμασία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), η βιωσιμότητά τους μετά από μία καλλιέργεια 12 ημερών αξιολογήθηκε. Ως αποτέλεσμα, knockdown του HSP70 μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP μετά την καλλιέργεια 12 ημερών (Εικ. 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HSP70 παίζει ένα ρόλο προ-επιβίωσης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

(Α) κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη Τρεις υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες). Πριν και μετά από 4, 8, 12, και 24 ώρες, παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης και η έκφραση της HSP70 αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωμα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ο αριθμός αντιπροσωπεύει την αναλογία της έκφρασης της HSP70 με εκείνη της β-ακτίνης, η οποία αξιολογήθηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ. (Β) Τρεις ημέρες μετά την διαμόλυνση των HSP70 siRNA ή siRNA ελέγχου, η έκφραση της HSP70 αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωμα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Γ) Τρεις κυτταρικές γραμμές, οι οποίες είχαν προ-επιμολυσμένα με HSP70 siRNA ή ελέγχουν siRNA τρεις ημέρες πριν, καλλιεργήθηκαν. Μετά από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (Μαθητή

t-test

) (D) PC-3 και DU-145, το οποίο είχε προ-επιμολυσμένα με HSP70 siRNA ή τον έλεγχο siRNA 2 ημέρες πριν, καλλιεργήθηκαν για την δοκιμασία αποικίας-σχηματισμού για 12 ημέρες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (του Student

t-τεστ

) (Ε) LNCaP, η οποία είχε προ-επιμολυσμένα με HSP70 siRNA ή ελέγχουν siRNA 2 ημέρες πριν, καλλιεργήθηκαν για 12 ημέρες, και η κυτταρική βιωσιμότητα (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (Μαθητή

t-test

)

Η

επιδράσεις κατά του όγκου σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία με HT και PFT-. μ

Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της HSP70 θα μπορούσε να διευκολύνει τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη με τη χρήση ΗΤ. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η επίδραση του νέου αναστολέα HSP70 PFT-μ για ΗΤ αντικαρκινική δράση. Πριν την αξιολόγηση της επίδρασης κατά του όγκου που προκαλείται από το συνδυασμό του ΗΤ και PFT-μ, συγκρίναμε την αντικαρκινική δράση της PFT-μ με εκείνη της Quercetin, ένας παράγοντας θερμικού σοκ (HSF) -1 αναστολέα, η οποία αναστέλλει την προς τα πάνω ρύθμιση όλων θερμικού σοκ που προκαλείται από γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

HSP70

γονίδιο [31] (Εικ. 2Α). Τόσο κερσετίνη και PFT-μ μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών τρία προστάτη σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά PFT-μ που ασκείται κατά του όγκου του αποτελέσματος κατά σχεδόν το ένα δέκατο της δόσης της Quercetin. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι knockdown του HSP70 απέτυχε να επηρεάσει την έκφραση του HSP90, ένα άλλο κλειδί HSP της οδού απόκρισης στρες (Εικ. 2Β). PFT-μ δεν είχε καμία επίδραση επί της έκφρασης πρωτεΐνης HSP70, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30].

(Α) Τρεις κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις Quercetin ή PFT-μ. Μετά από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. (Β) Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση της HSP70 siRNA ή ελέγχου siRNA, η έκφραση του HSP90 και HSP70 αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωμα. Η έκφραση αυτών των HSPs εξετάστηκε επίσης μετά την αγωγή με PFT-μ (5 μΜ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα κατά του όγκου που προκαλείται από το συνδυασμό του ΗΤ και PFT-μ. Ερευνήσαμε πρώτα για τη βέλτιστη πρωτόκολλα να μεγιστοποιηθούν τα αποτελέσματα κατά των όγκων που προκαλούνται από το συνδυασμό αυτό. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τρία διαφορετικά πρωτόκολλα? σε πρωτόκολλο-1 (Ρ-1), ΗΤ εκτελέστηκε 24 ώρες πριν από την προσθήκη του PFT-μ? σε πρωτόκολλο-2 (Ρ-2), PFT-μ προστέθηκε αμέσως πριν ΗΤ? και στο πρωτόκολλο-3 (Ρ-3), ΗΤ εκτελέστηκε 24 ώρες μετά την προσθήκη του PFT-μ. Το πιο σημαντικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε κατά την εφαρμογή του πρωτοκόλλου P-2 (Σχ. 3Β). Τα επιλεγμένα αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται στο Σχ. 3C. Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά όταν ΗΤ συνδυάστηκε με μία υποβέλτιστη δόση (5 μΜ) PFT-μ. Έχουμε περαιτέρω αποφασιστική εάν η επίδραση συνδυασμός θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε καρκινικά κύτταρα τα οποία είχαν προ-επιμολύνθηκαν με HSP70 siRNA (Σχ 3D.)? η προ-νοκ ντάουν της HSP70 κατήργησε το συνδυασμό αποτελέσματος έναντι PC-3 και DU-145. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υποβέλτιστες δόσεις PFT-μ μπορεί να ενισχύσει ΗΤ επιδράσεις κατά του όγκου επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω αναστολής της HSP70, και ότι το πιο σημαντικό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται όταν PFT-μ προστίθεται αμέσως πριν από ΗΤ.

( Α) Τρεις διαφορετικές πρωτόκολλα απεικονίζεται. (Β) Τρεις κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις PFT-μ που βασίζεται σε τρεις διαφορετικά πρωτόκολλα με ΗΤ (ριγέ bar) ή χωρίς ΗΤ (μαύρη γραμμή). ΗΤ διεξήχθη στους 43 ° C για 2 ώρες. Μετά από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. (γ) Επιλεγμένα αποτελέσματα φαίνονται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (Μαθητή

t-test

) (D) PC-3 και DU-145, το οποίο είχε προ-επιμολυσμένα με HSP70 siRNA ή τον έλεγχο siRNA δύο ημέρες νωρίτερα, ήταν culured με PFT-μ (5 μΜ) με /χωρίς ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες). Μετά από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (Μαθητή

t-test

) NS, μη σημαντικό

Η

κυττάρων του καρκίνου του θανάτου μετά τη θεραπεία συνδυασμού του ΗΤ και PFT-μ.

στις μελέτες που περιγράφονται παραπάνω, αξιολογήσαμε κυρίως τις επιδράσεις κατά του όγκου επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη με τη μέτρηση της βιωσιμότητας 2 ημέρες μετά τη θεραπεία με ΗΤ και PFT-μ. Ωστόσο, τέτοιες επιδράσεις στην βιωσιμότητα μπορεί να αντικατοπτρίζει μεταβολές στον κυτταρικό θάνατο και /ή την ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη αξιολόγησε το υποκείμενο μηχανισμό δράσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, ΗΤ μόνη της απέτυχε να αυξήσει το ποσοστό των Annexin-V

+ κύτταρα, ενώ κατεργασία με PFT-μ αυξήθηκε ελαφρά. Ωστόσο, η θεραπεία συνδυασμού αυξηθεί δραματικά το ποσοστό των Annexin V

+ κύτταρα, τόσο πρώιμων αποπτωτικών Annexin-V

+ /ΡΙ

– και αργά αποπτωτικών ή /και νεκρωτικές Annexin-V

+ /ΡΙ

+, ειδικά σε κύτταρα LNCaP. Η αύξηση του ποσοστού των αννεξίνης V

+ κύτταρα φαίνεται να είναι μόνο πρόσθετο σε PC-3 και DU-145. Επιπλέον, η προσθήκη 20 μΜ Ζ-VAD, ένας αναστολέας παν-κασπάσης, μείωσε μερικώς το ποσοστό των αννεξίνης V

+ κύτταρα σε LNCaP μετά από συνδυασμό θεραπεία της ΗΤ και PFT-μ (Σχ. 4Β). Η ζ-VAD-προκαλούμενη ανάκτηση από αννεξίνης V

+ κυττάρων ανιχνεύθηκε στο αννεξίνης V

+ /ΡΙ

– (πρώιμη αποπτωτική) υποσύνολο. Αυτή η δόση του z-VAD ήταν επαρκής για να αναστείλει TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων θανάτου που εκφράζουν υποδοχέα [32]. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι, αν και η αποτελεσματικότητα ποικίλει μεταξύ καρκινικές κυτταρικές σειρές, η συνδυαστική θεραπεία με ΗΤ και PFT-μ μπορεί να ενισχύσει θάνατο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και ότι η θεραπεία συνδυασμού κυτταρικό θάνατο που επάγεται από LNCaP είναι μερικώς κασπάσης-εξαρτώμενη.

(Α) Τρεις κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες) και /ή PFT-μ. Μετά από 48 ώρες, κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε μετά από χρώση με ΡΙΤΟ-συζευγμένο Annexin V και ΡΙ. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα εμφανίζεται. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά του κάθε υποσύνολο. (Β) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο με ΗΤ και PFT-μ (5 μΜ) παρουσία του z-VAD (20 μΜ) ή DMSO ελέγχου. Μετά από 48 ώρες, κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε μετά από χρώση με ΑΡΟ-συζευγμένο αννεξίνης V και ΡΙ. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά του κάθε υποσύνολο.

Η

Η θεραπεία συνδυασμού με HT και PFT-μ μπορεί να σταματήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων που εμπλέκονται στην τα αποτελέσματα κατά των όγκων που προκαλούνται από τη θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, αξιολογήσαμε τον κύκλο πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής των καρκινικών κυττάρων με την αξιολόγηση της πρόσληψης BrdU και χρώση 7AAD. Βρήκαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με ΗΤ και PFT-μ μείωσε το ποσοστό των BrdU καρκίνο

+ S-φάσης κύτταρα και αυξημένη εκείνη των G2 /M φάση του καρκίνου κύτταρα στις τρεις κυτταρικές σειρές. Εκτιμήσαμε επίσης την έκφραση των μορίων συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων και διαπίστωσε ότι η θεραπεία συνδυασμού οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του c-myc σε LNCaP και μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 σε PC-3 και DU-145. Επιπλέον, η έκφραση της ρ21

WAF1 /CIP αυξήθηκε στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων συμβάλλει στις επιδράσεις κατά του όγκου που προκαλείται από θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ.

(Α) Τρεις κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς ΗΤ (43 ° C για 2 ώρες) και PFT-μ (5 μΜ) για 2 ημέρες. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας 5 ώρες για LNCaP, 90 λεπτά για PC-3, και 3 ώρες για DU-145, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με BrdU (10 μΜ). Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-BrdU αντίσωμα και 7AAD, και διεξήχθη κυτομετρία ροής. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά του κάθε υποσύνολο. (Β) Τρεις κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μία ή δύο από ΗΤ και PFT-μ (5 μΜ) για 2 ημέρες, και τα επίπεδα έκφρασης του c-myc, κυκλίνη D1, και ρ21

WAF1 /CIP πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανοσοστυπώματος. β-ακτίνη και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Η

Η θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ μπορεί να μειώσει την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με ΗΤ και PFT-μ στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Η θεραπεία συνδυασμού μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των PC-3 και DU-145 κύτταρα (Σχ. 6Α) και μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP στην καλλιέργεια μακροχρόνια (12 ημερών) (Σχ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνδυαστική θεραπεία με ΗΤ και PFT-μ μπορεί να μειώσει την ικανότητα σχηματισμού αποικιών και βιωσιμότητα, σε μακροχρόνια καλλιέργεια, των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

(Α) PC-3 και DU-145 τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες και προσδιορίστηκαν ικανότητες αποικίας σχηματισμό τους. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (Μαθητή

t-test

) (Β) LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 12 ημέρες, και η βιωσιμότητα (%) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WST-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05 (

t-test

Student)

Η

In vivo

αντικαρκινική επίδραση του ΗΤ και PFT-μ συνδυασμού. θεραπεία σε ένα μοντέλο

ξενομοσχεύματος ποντικού

Τέλος, αξιολογήσαμε κατά πόσο η θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ που ασκείται μια αντικαρκινική επίδραση σε καθιερωμένες ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού (Εικ. 7). Τα πέλματα γυμνών ποντικών εμβολιάσθηκαν με κύτταρα PC-3 και οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με PFT-μ ή /και ΗΤ. Δεδομένης της ανατομία του πέλματος, η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε μετρώντας όχι μόνο το γινόμενο δύο κάθετων διαμέτρων αλλά επίσης το πάχος πατούσας. Ως αποτέλεσμα, αν και η τοπική χορήγηση PFT-μ δεν είχε καμία αντικαρκινική δράση, αλλά, μάλλον, προώθησε την ανάπτυξη του όγκου, και ΗΤ μείωσε την ανάπτυξη του όγκου ελαφρά αλλά όχι σημαντικά, η θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

BALB

ηυ /ηυ

αρσενικά ποντίκια εμβολιάστηκαν στο δεξί πέλμα 1 × 10

6 PC 3-κυττάρων με Matrigel. Την ημέρα 15, οι ποντικοί ομαδοποιήθηκαν και χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες. Κάθε ομάδα περιείχε έξι ποντικούς. Τις ημέρες 0 και 4 μετά ομαδοποίηση, τα PC-3 Τα ποντίκια που έφεραν τοπικά ένεση με PFT-μ (100 μg εντός 50 μΙ) και /ή σε επεξεργασία με ΗΤ (43 ° C για 30 λεπτά). Τα βέλη αντιπροσωπεύουν την ημέρα της θεραπείας. Ως έλεγχος οχήματος, εγχύθηκαν 50 μΙ DMSO. ΗΤ διεξήχθη 1 ώρα μετά την τοπική έγχυση του PFT-μ. Στη συνέχεια, το μέγεθος του όγκου, το γινόμενο δύο κάθετων διαμέτρων (Α, Β), και το πάχος του πέλματος (C, D) μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD των έξι ποντικών. *

P

& lt? 0,05 **

P

& lt?. 0.01 (Dunnett δοκιμή) NS, μη σημαντικό

Η

Συζήτηση

Ανάμεσα σε ποικιλία τύπων καρκίνου, ΗΤ είναι εφαρμόσιμη ειδικά για τον καρκίνο του προστάτη [33]. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, ΗΤ προκαλεί αναπόφευκτα αντιδράσεις στρες στα καρκινικά κύτταρα. HSP70 είναι ένας ισχυρός πρωτεΐνη θερμο-επαγώγιμο προ-επιβίωσης που προσδίδει κυτταροπροστασία εναντίον διαφόρων ερεθισμάτων που επάγει θάνατο και αυξάνει ογκογονικότητα [25], [27], [34]. Ως εκ τούτου, HSP70 έχει προταθεί ως ένα υποσχόμενο στόχο για την θεραπεία του καρκίνου [19]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του προστάτη είναι ιδιοσυστατικά θετικό για HSP70, και ότι ΗΤ μπορεί να αυξήσει την έκφραση της σε LNCaP και κυτταρικές γραμμές DU-145. Απροσδόκητα, η έκφραση της HSP70 σε PC-3 ήταν μειώθηκε ελαφρά 8 ώρες μετά ΗΤ? δεν είμαστε σε θέση να εξηγήσουμε αυτή την παρατήρηση επί του παρόντος. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλεκτική knockdown του HSP70 σε καρκινικά κύτταρα μειώθηκαν σημαντικά τη βιωσιμότητά τους και την ικανότητα σχηματισμού αποικίας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HSP70 είναι μία πρωτεΐνη προ-επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [23] – [28]. Αυτά τα ευρήματα μας οδήγησαν να ελεγχθεί η επίδραση του συνδυασμού της HT με PFT-μ, ένα πρόσφατα αναγνωρισμένο αναστολέας της HSP70 [30], σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη.

Η θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ μειώθηκε σημαντικά ο βιωσιμότητα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών τρία προστάτη σε σύγκριση με τη θεραπεία με είτε θεραπεία μόνο. Όσον αφορά την υποκείμενος μηχανισμός, ελέγξαμε δύο δυνατότητες?

δηλ.

, Κυτταρικό θάνατο και τη σύλληψη την ανάπτυξη των κυττάρων. χρώση /ΡΙ αννεξίνης V αποκάλυψε ότι η θεραπεία συνδυασμού αύξησε το ποσοστό της αννεξίνης V

+ κύτταρα (Σχ. 4Α). Αν και η επίδραση του συνδυασμού ήταν ελαφρά σε PC-3 και DU-145 κύτταρα, μια δραστική και συνεργιστική αύξηση στο ποσοστό των αννεξίνης V

+ κυττάρων παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP. ΗΤ μόνη της δεν επηρέασε το ποσοστό αννεξίνης V

+ κύτταρα, και την επίδραση της PFT-μ μόνη της ήταν επίσης περιθωριακό. Αννεξίνη V

+ /ΡΙ

+ θετικότητα δεν σημαίνει αποπτωτικών κυττάρων, διότι αργά νεκρωτικό κύτταρα είναι επίσης θετικά τόσο για αννεξίνη V και PI. Όσον αφορά την διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, η θεραπεία συνδυασμού μείωσε το κλάσμα S-φάσης και αύξησε το κλάσμα G2 /M φάση σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχ. 5Α). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με εκείνα από μια πρόσφατη έκθεση που δείχνει ότι PFT-μ μπορεί να προκαλέσει G2 /M σύλληψης σε καρκινικά κύτταρα [35]. Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού μείωσε την έκφραση του c-myc σε LNCaP και κυκλίνης D1 σε PC-3 και DU-145, και αύξησε την έκφραση του p21

WAF1 /CIP σε τρεις κυτταρικές γραμμές. Αυτές οι αλλαγές στα μόρια που σχετίζονται με τον κύκλο κυττάρου μπορεί εν μέρει ευθύνονται για τη σύλληψη της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε απόκριση προς τη θεραπεία συνδυασμού.

HSP90 και HSP70 αλληλοεπηρεάζονται [36]. Επειδή η αναστολή της HSP90 συνδέεται με την ανοδική ρύθμιση της HSP70 [37], πολλές ομάδες έχουν αναφέρει ότι η συν-αναστολή της HSP70 ενισχύει σημαντικά την κυτταροτοξικότητα των αναστολέων της HSP90 για αρκετούς διαφορετικούς τύπους όγκων [38]. Αντιστρόφως, HSP70 είναι ένα κρίσιμο συν-συνοδών για HSP90 και εμπλέκεται στην παροχή πρωτεϊνών πελάτη να HSP90 [39], και η αναστολή της HSP70 μπορεί να επάγει όγκο-ειδική απόπτωση μέσω της HSP90 λειτουργία [28]. Αυτές οι γραμμές πληροφοριών υποδεικνύουν ότι knockdown του HSP70 και PFT-μ ενίσχυσε την επίδραση του ΗΤ μέσω της αναστολής της HSP90. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της knockdown της HSP70 ή PFT-μ για την έκφραση της HSP90 σε καρκινικά κύτταρα, ενώ καμία αλλαγή στην έκφραση HSP90 παρατηρήθηκε (Εικ. 2Β). Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό δεν μπορεί να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι η αναστολή της HSP70 ή PFT-μ επηρέασε την κατάσχεση των πρωτεϊνών πελατών της HSP90, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, HER2 /ErbB2 και AKT, σε ένα αδιάλυτο κλάσμα και προώθησε τη συσσώρευση και αδρανοποίησή τους, όπως αναφέρθηκε [ ,,,0],40].

καθοριστεί εάν η θεραπεία συνδυασμού-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων LNCaP εξαρτιόταν από κασπάσης (Εικ. 4Β). Η προσθήκη του αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD μείωσε το ποσοστό της αννεξίνης V

+ /ΡΙ

– αρχές αποπτωτικά κύτταρα LNCaP, υπονοώντας ότι κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση ήταν εν μέρει υπεύθυνη για την θεραπεία συνδυασμού-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των LNCaP. Δεδομένου ότι και μόνο HT απέτυχε να επάγει κυτταρικό θάνατο, η επίδραση αυτή φαίνεται να αντανακλά κυρίως την επίδραση της PFT-μ. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα ότι PFT-μ προκαλεί κασπάσης-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τον κυτταρικό θάνατο των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων [32]. Όσον αφορά κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου, HSP70 έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με τον παράγοντα που επάγει την απόπτωση (ΟΕΕ), η οποία επάγει κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση με μετατόπιση εντός του πυρήνα [41]. Ωστόσο, παρεμβολή RNA του ΟΕΕ δεν είχε επίδραση στην PFT-μ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, ΟΕΕ πιθανόν δεν συμμετέχει στη θεραπεία συνδυασμού που επάγεται θάνατος των κυττάρων LNCaP. Εναλλακτικά, HSP70 έχει αναφερθεί ότι εντοπίζονται στις μεμβράνες του λυσοσώματα, την προώθηση βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, και αναστέλλουν την επαγόμενη από τον TNF κυτταρικό θάνατο με αναστολή διαπερατότητα λυσοσωμικής μεμβράνης [42]. Έτσι, HSP70 ενισχύει την επιβίωση με τη σταθεροποίηση των λυσοσώματα σε καρκινικά κύτταρα. Από PFT-μ δεσμεύει HSP70, είναι πιθανό ότι PFT-μ αναστέλλει HSP70 προκαλούμενη σταθεροποίηση της διαπερατότητας της μεμβράνης λυσοσωματικής, με αποτέλεσμα αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να αποσαφηνιστεί η ακριβής μηχανισμός κυτταρικού θανάτου μετά τη θεραπεία συνδυασμού με ΗΤ και PFT-μ.

Όταν HT συνενώνεται με αντικαρκινικά φάρμακα, ο χρόνος χορήγησης του φαρμάκου είναι κρίσιμος [ ,,,0],13]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τα αποτελέσματα κατά των όγκων που προκαλούνται από τρία διαφορετικά πρωτόκολλα, και διαπίστωσε ότι ΗΤ αμέσως μετά την προσθήκη του PFT-μ απέδωσε τα μέγιστα αποτελέσματα κατά του όγκου (Εικ. 3). Αυτό υποδηλώνει εμμέσως ότι HSP70 παίζει ένα προστατευτικό ρόλο αμέσως μετά από θερμική καταπόνηση.

Εκτιμήσαμε τα αποτελέσματα κατά του όγκου της θεραπείας συνδυασμού με δοκιμασία αποικίας σχηματισμού. Αυτή η δοκιμασία εκτελέστηκε για 12 ημέρες, και το αποτέλεσμα μπορεί να αντανακλά την επίδραση και των δύο κυτταρικού θανάτου και διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων. Ο συνδυασμός με ΗΤ και PFT-μ μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των PC-3 και DU-145 κύτταρα. Στην περίπτωση των LNCaP, η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε μία αντικαρκινική επίδραση επί LNCaP σε μια δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας μακροχρόνια (12 ημερών). Σε αυτές τις δοκιμασίες, PFT-μ απομακρύνθηκε μετά την αρχική καλλιέργεια 2 ημερών, επειδή η συνεχής παρουσία του PFT-μ, ακόμη και σε σχετικά χαμηλή δόση που χρησιμοποιείται για τη δοκιμασία βραχυπρόθεσμης βιωσιμότητας κυττάρων, ήταν πάρα πολύ υψηλή για να επιτρέψει αποικίες να σχηματίσουν. Υποθέτουμε ότι η δοκιμασία αποικίας-διαμόρφωση και η μακροπρόθεσμη (12 ημέρες) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας είναι χρήσιμα για τον έλεγχο των μακροχρόνιες επιδράσεις επί καρκινικών κυττάρων μετά από παροδική αντικαρκινική θεραπεία.

Παρά το γεγονός ότι Quercetin είναι ένα γνωστό αναστολέα HSP [31], αυτό το φάρμακο δεν έχει χρησιμοποιηθεί κλινικά επειδή οι σχετικά υψηλές δόσεις που απαιτούνται για την πρόκληση επιδράσεων κατά του όγκου

in vivo

. Συγκρίναμε τα αποτελέσματα κατά του όγκου των κερσετίνη και PFT-μ και διαπίστωσε ότι PFT-μ μπορεί να επάγει την επίδραση κατά των όγκων, ακόμη και σε ένα δέκατο της δόσης της Quercetin (Εικ. 2Α).