Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα παράγουν μεταστάσεις, επειδή μπορεί να επιβιώσει το άγχος που επιβάλλονται από το νέο περιβάλλον του ιστού υποδοχής. Για να μιμούνται αυτήν την διαδικασία, τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που δεν τονίζεται σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας εγχύεται σε γυμνά ποντίκια. Επειδή αναπτύξουν ξενομοσχευμάτων, θα πρέπει να έχουν αναπτύξει κατάλληλη αντίδραση στο στρες. Χαρακτηρίζουν την απόκριση μπορεί να παρέχει νέες στρατηγικές για να παρεμβαίνει με παγκρεατική μετάσταση καρκίνου.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

στην ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές Panc-1, Mia-PaCa2, Capan-1, Capan -2 και BxPC3, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες DNA Affymetrix να συγκρίνουν τις εκφράσεις των 22.000 γονιδίων in vitro και στα αντίστοιχα ξενομοσχεύματα. Ταυτοποιήσαμε 228 γονίδια υπερεκφράζονται σε ξενομοσχεύματα και χαρακτηρίζεται από την εμπλοκή του ενός από αυτούς, WSB1, στον έλεγχο της απόπτωσης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. WSB1 παράγει 3 εναλλακτικό μάτισμα μεταγραφές κωδικοποιούν διακριτές ισομορφές της πρωτεΐνης. Σε ξενομοσχεύματα και σε ανθρώπινους όγκους του παγκρέατος, η παγκόσμια έκφραση του mRNA WSB1 είναι ελάχιστα αυξημένη ενώ ισομορφή 3 είναι έντονα υπερεκφράζεται και ισομορφές 1 και 2 ρυθμίζονται προς τα κάτω. Αγωγή κυττάρων Mia-PaCa2 με παράγοντες που προκαλούν στρες προκάλεσε παρόμοιες αλλαγές. Ενώ ρετροϊό-καταναγκαστική έκφραση των ισομορφών WSB1 1 και 2 προωθούνται ανάπτυξη των κυττάρων και τα κύτταρα ευαισθητοποιημένα προς gemcitabine- και δοξορουβικίνη επαγόμενη απόπτωση, WSB1 ισομορφή 3 έκφραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μειωμένη αυξημένη αντοχή σε απόπτωση, δείχνοντας ότι το άγχος που προκαλείται από διαμόρφωση του WSB1 εναλλακτικό μάτισμα αυξάνει την αντίσταση στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία σχετικά με τη ρύθμιση WSB1 υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η ενεργοποίηση των μηχανισμών του στρες-απόκρισης βοηθά τα καρκινικά κύτταρα για την ίδρυση μεταστάσεις και δείχνουν ενδιαφέρον για την ανάπτυξη του καρκίνου του άλλα γονίδια υπερεκφράζεται σε αλλομοσχεύματα

Παράθεση:. Archange C, Nowak J, Γκαρσία S, Moutardier V, Calvo EL, Dagorn JC, et al. (2008) Ο Gene WSB1 εμπλέκεται σε καρκίνο του παγκρέατος Εξέλιξη. PLoS ONE 3 (6): e2475. doi: 10.1371 /journal.pone.0002475

Επιμέλεια: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Ισπανία

Ελήφθη: 4 Μάρτη του 2008? Αποδεκτές: 18 Μάη, 2008? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2008

Copyright: © 2008 Archange et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. INSERM, La Ligue, Canceropole PACA, INCA

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρος νόσος με κακή καιρό. -Term ποσοστό επιβίωσης για ασθενείς με τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό στάδιο [1] – [3]. Μείζονες λόγοι για αυτήν την κακή έκβαση είναι η αδυναμία μας να διαγνώσει τον καρκίνο του παγκρέατος σε πρώιμο στάδιο, λόγω της έλλειψης συγκεκριμένων συμπτωμάτων, τη θέση του παγκρέατος βαθιά μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα και την έγκαιρη εμφάνιση μεταστάσεων. Ως εκ τούτου, στην πλειονότητα των ασθενών, από τη στιγμή της διάγνωσης, της περιφερειακής λεμφαδένες και ήπαρ μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος έχει συμβεί, περιορίζοντας την αποτελεσματικότητα των γνωστών μόνο θεραπευτικό επιλογές που πρέπει να περιλαμβάνουν χειρουργική εκτομή [4] – [6]. Μέχρι σήμερα, ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία δεν έχουν οδηγήσει σε σημαντική βελτίωση στη μακροπρόθεσμη επιβίωση [7]. Τα αίτια του καρκίνου του παγκρέατος δεν είναι ακόμη επακριβώς κατανοητός. Πολλά προϊόντα γονιδίων δείχνουν απελευθερωμένης λειτουργίες. Πολυάριθμες οι αυξητικοί παράγοντες και οι υποδοχείς τους υπερεκφράζεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παγκρέατος [7] -. [9], αλλά τα ευρήματα αυτά έχουν σχεδόν οδήγησαν σε οποιαδήποτε βελτίωση των παγκρέατος θεραπεία του καρκίνου

Η στρατηγική μας για τον εντοπισμό νέων πιθανών στόχων για παγκρέατος θεραπεία του καρκίνου βασίζεται στην ιδέα ότι καρκινική εξέλιξη συνοδεύεται πάντα από αλλαγές στο μικροπεριβάλλον και ότι η επιτυχία της εξαρτάται από την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να προσαρμοστούν σε αυτό το νέο μικροπεριβάλλον. Στην πραγματικότητα, είναι γνωστό ότι η εξέλιξη του καρκίνου περιλαμβάνει διάφορα διαδοχικά στάδια. Εντός του πρωτογενούς όγκου, κύτταρα πρώτα επιλέγονται με βάση την ταχεία ανάπτυξη, χαμηλή απόκριση σε αποπτωτικά σήματα και σε ικανότητα να ξεφύγουν από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Αυτά τα κύτταρα εγκαταλείψουν την πρωτογενή όγκο και μεταναστεύουν μέσω του οργανισμού. Ωστόσο, δεν είναι όλοι τους θα δημιουργήσει μεταστάσεις σε όλους τους ιστούς. Αυτή η διαδικασία είναι επιλεκτική και εξαρτάται τόσο από την ικανότητα των κυττάρων του όγκου στην καθιέρωση αλληλεπιδράσεις με τον ιστό του ξενιστή και την ικανότητά τους στη διαχείριση των περιβαλλοντικών παραγόντων στους οποίους εκτίθενται στη νέα τους θέση. Ο φαινότυπος του κυττάρου όγκου είναι προσαρμοσμένη να το αρχικό του περιβάλλον, το περιβάλλον του οργάνου στο οποίο αναπτύχθηκε ο πρωτογενής όγκος. Δεδομένου ότι το περιβάλλον που παρέχεται από το όργανο-στόχο είναι διαφορετικό από το αρχικό, θα βάλει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων υπό πίεση μικροπεριβάλλον του στρες. Κατά συνέπεια, η ικανότητα του κυττάρου του όγκου για να αντισταθεί ότι το άγχος μπορεί να είναι καθοριστικός παράγοντας για την επιτυχία της ανάπτυξης μεταστάσεων. Το κύτταρο θα ενεργοποιήσει την άμυνα του προγράμματος, προκειμένου να επιβιώσουν και, σε περίπτωση επιτυχίας, πολλαπλασιάζονται. Ο στόχος μας ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια που εμπλέκονται σε αυτό το πρόγραμμα, διότι η αναστολή της έκφρασής τους θα μπορούσε να είναι ένας νέος τρόπος στόχευσης καρκίνο του παγκρέατος. Σε αυτή την εργασία περιγράφουμε ένα πάνελ των πιθανών παγκρεατικών καρκινικών γονιδίων που επιλέγονται χρησιμοποιεί μια στρατηγική ξενομόσχευμα και να αναλύσει τη δομή και λειτουργία του ενός από αυτά, το γονίδιο WSB1, σε σχέση με την εξέλιξη του όγκου του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

Ο πίνακας των παγκρεατικών γονιδίων στρες καρκίνο

το μοντέλο που επιλέξαμε για να καθορίσει το πλαίσιο των δυνατοτήτων του παγκρέατος γονιδίων εξέλιξη που σχετίζονται είναι τα εξής: Χρησιμοποιήσαμε 5 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο, Panc-1 , Mia-PaCa2, Capan-1, Capan-2 και BxPC3. Κάναμε την υπόθεση ότι, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, αυτά τα κύτταρα δεν έχουν τονιστεί από το μικροπεριβάλλον τους. Κατά την έγχυση στο γυμνό ποντίκι, θα εκτεθούν στο στρες της ένα διαφορετικό περιβάλλον το ξενομόσχευμα μιμούνται μετάσταση. Αν και το μοντέλο ξενομοσχεύματος αντανακλά εν μέρει μόνο τι πραγματικά συμβαίνει με μετάσταση, είναι ένα καλό μέσο για να θέσει τα κύτταρα σε ένα περιβάλλον αρκετά διαφορετικό από το σύνηθες περιβάλλον τους. Κατά συνέπεια θα δημιουργηθεί ένα σημαντικό στρες, στο οποίο τα κύτταρα θα πρέπει να αντισταθεί. Σε κάθε κυτταρική γραμμή, συγκρίναμε τις εκφράσεις 22.000 γονιδίων in vitro και στα ξενομοσχεύματα, χρησιμοποιώντας την προσέγγιση των μικροσυστοιχιών Affymetrix. Για να εξασφαλιστεί ότι επιλεγμένα γονίδια είναι αντιπροσωπευτικά ενός μεγάλου ποσοστού των ανθρώπινων παγκρεατικών όγκων, μόνο τα γονίδια των οποίων η έκφραση τροποποιήθηκε τουλάχιστον διπλάσιο σε όλες τις 5 όγκους θεωρήθηκαν. Υπό αυτές τις συνθήκες, θα μπορούσαμε να επιλέξει 228 γονίδια που υπερεκφράζονται σε όγκους και 13 που είχαν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Τα πλήρη στοιχεία είναι προσβάσιμα online στο https://www.inserm-u624.univ-mrs.fr/affymetrix/. Αρκετές από τις πιο υπερεκφράζεται γονίδια είναι κακώς χαρακτηριζόμενη αν όχι εντελώς ανεξερεύνητη. Ως πρώτο βήμα, επιλέξαμε να εστιάσουμε σε WSB1 (WD-επανάληψης και SOCS Κουτί που περιέχει-1), διότι, όπως περιγράφεται κατωτέρω, έδειξε το πρωτότυπο χαρακτηριστικό της παραγωγής, από εναλλακτικό μάτισμα, 3 μεταγραφές παραλλαγή κωδικοποιεί διακριτές ισομορφές της πρωτεΐνης, του οποίου η ρύθμιση σε ξενομοσχεύματα και κατά την έκθεση σε διάφορες καταπονήσεις δεν είναι συντονισμένη.

έκφραση WSB1 σε παγκρεατικά νεοπλασματικά ξενομοσχεύματα

Η πλήρης πρωτεΐνη που παράγεται από την παραλλαγή μεταγραφής 1, ισομορφή 1, αποτελείται από 3 περιοχές (ένα Ν τερματική περιοχή, μια περιοχή αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που περιλαμβάνει 8 WD-επαναλήψεις, και ένα κουτί SOCS) (Σχήμα 1). Το ισόμορφο 2 στερείται σχεδόν το σύνολο της Ν-τερματικό πεδίο και την πρώτη WD-επανάληψης. Τέλος, ένα πρόωρο κωδικόνιο λήξης σε ισομορφή 3 δημιουργεί μία κολοβωμένη πρωτεΐνη που στερείται του Ο-τερματικό τμήμα της πρωτεΐνης, που αντιστοιχεί σε 6 WD-επαναλήψεις και το κουτί SOCS.

A. Σχηματική αναπαράσταση των ισομορφών WSB1 1, 2 και 3. Β ισομορφές WSB1 εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης ετικέτα ΕΟΡΡ ή V5 και υποκυτταρικός εντοπισμός αναλύθηκε με άμεσο φθορισμό του μετά ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας ΕΟΡΡ ή V5 αντισώματα αντίστοιχα.

Η

Αν η παγκόσμια έκφραση του γονιδίου, που ανιχνεύεται από τον 213406_at Affymetrix ανιχνευτής που αντιστοιχεί στην μεταγραφή των τριών ισομορφών, αυξάνεται μόνο 1,17 έως 2,38 φορές σε ξενομοσχεύματα ποντικών ανάλογα με την κυτταρική σειρά, η έκφραση του ισόμορφου 3, ανιχνεύονται από τον 201295_s_at Affymetrix ανιχνευτή, αυξάνεται 4,63 να 20,32 φορές (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα αυτά ελέγχονται από ποσοτική ανάλυση RT-PCR. Αναπτύξαμε

Homo sapiens

-ειδικών εκκινητών για την ανάλυση ανεξάρτητα τις εκφράσεις του WSB1 ισομορφή 3, ισομορφές 1 + 2 και ισομορφές 1 + 2 + 3 (παγκόσμια έκφραση) (Σχήμα S1). Βρήκαμε ότι η παγκόσμια έκφραση WSB1 αυξήθηκε κατά 1,75 φορές να 3,93 σε όγκους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του ισόμορφου 3 αυξήθηκε κατά 3,7 φορές να 9, ενώ εκείνο των ισομορφών 2 + 3 μειώθηκε κατά 5 έως 20% (Σχήμα 2), σε συμφωνία με τα δεδομένα τσιπ DNA. Ως εκ τούτου, παρά την αύξηση της παγκόσμιας WSB1 έκφραση σε ξενομοσχεύματα όγκων, σε σύγκριση με τα κύτταρα διατηρούνται σε χημικό περιβάλλον, παρατηρήσαμε μια σημαντική μετατόπιση στην εναλλακτικό μάτισμα υπέρ της ισομορφής 3, η οποία γίνεται σε μεγάλο βαθμό κυρίαρχη σε όγκους.

Έκφραση WSB1 ισομορφές 1 + 2 και 3 mRNAs αξιολογήθηκε με qRT-PCR σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και σε ποντίκια ξενομόσχευμα όγκων (Α), σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παγκρέατος (Β), και σε κύτταρα Mia-PaCa2 μετά από θεραπεία με παράγοντες που προκαλούν στρες ( ΝΤΟ). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. του συνδυασμένα αποτελέσματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (*, P & lt? 0,05).

Η

Για να ελέγξετε την κλινική σημασία των ευρημάτων αυτών, μετρήθηκε η έκφραση των ισομορφών WSB1 από ποσοτική RT-PCR σε 8 ανθρώπινα δείγματα αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Παρατηρήσαμε σε αυτούς τους όγκους μια πολύ ισχυρή επικράτηση του ισόμορφου 3 έκφραση με ένα χαμηλό επίπεδο ισομορφών 1 + 2 (Σχήμα 2). Αυτό υποδηλώνει ότι το προφίλ έκφρασης WSB1 παρατηρήθηκε σε ποντικούς ξενομοσχευμάτων είναι αντιπροσωπευτική του τι συμβαίνει στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος.

κυτταρικό στρες διαμορφώνει WSB1 εναλλακτικό μάτισμα υπέρ της ισομορφής 3

Η υπόθεσή μας είναι ότι ορισμένοι των γονιδίων υπερεκφράζεται σε όγκους ενεργοποιούνται σε απόκριση στο στρες που προκαλείται από το νέο μικροπεριβάλλον του ιστού. Σε πειραματικό μοντέλο μας, το περιβάλλον του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι πράγματι αρκετά διαφορετική όταν καλλιεργούνται

in vitro

ή αυξάνεται στο

nude

ποντίκι, από την άποψη των θρεπτικών συστατικών, μήτρα ανάπτυξης, ορμόνες, κλπ Ωστόσο, ορισμένες από αυτές τις αλλαγές μπορεί να είναι αρκετό για να επηρεάσει την έκφραση του γονιδίου, αλλά δεν είναι σημαντικό στο σημείο της επαγωγής στρες. Για να ελέγξετε αν οι παρατηρούμενες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση WSB1 είναι πράγματι μια συνέπεια του άγχους, που παρακολούθησε την expressoin των ισομορφών WSB1 mRNA σε κύτταρα Mia-PaCa2, σε απάντηση στο στρες που δημιουργείται από διάφορες θεραπείες. Αυτές οι θεραπείες που επηρεάζουν διαφορετικά μονοπάτια θα πρέπει επίσης να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία του WSB1. Αυτοί περιλάμβαναν την επαγωγή απόπτωσης με σταυροσπορίνη, ή adriamycine και gemcitabine που μπλοκάρουν την σύνθεση του DNA, βλάβη του DNA με γ-ακτινοβολία, μεταβολικό στρες από ασιτία ορού και υποξία ή ανοξία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, όλες οι θεραπείες είχε ως αποτέλεσμα μια πολύ μέτρια αλλαγή στην έκφραση των ισομορφών WSB1 1 + 2 και σε μια ισχυρή αύξηση στην ισομορφή 3 έκφραση. Ως εκ τούτου, WSB1 ισομορφή 3 έκφραση φαίνεται να είναι αυξημένη σε απάντηση στο στρες, όποια και αν εμπλέκεται η οδός στρες. Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι αυτό είναι εν μέρει επηρεάζεται από την παρουσία του στρώματος σε όγκους, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι αλλαγές στην εναλλακτικό μάτισμα που παρατηρείται για WSB1 σε μοντέλο ξενομοσχεύματος μας πράγματι διαμορφώνονται από κύτταρο στρες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα PANC1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Υποκυτταρικός εντοπισμός των ισομορφών WSB1 1, 2 και 3

Για να αναλυθεί η υποκυτταρική εντόπιση των ισομορφών WSB1 1, 2 και 3 που υποκλωνοποιήθηκε τα 3 cDNAs στον φορέα ρΕΟΡΡ-Ν1 για να ληφθεί ισομορφές WSB1 ως πρωτεΐνες σύντηξης ΕΟΡΡ- WSB1. Αυτά τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa και μετά από 24 ώρες, ισομορφές 1, 2 και 3 εμφανίστηκαν ως κυτταροπλασματική τελείες. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε τελεία μέγεθος ή τον αριθμό βρέθηκαν μεταξύ των τριών ισομορφών. πρωτεΐνες σύντηξης ΕΟΡΡ- WSB1 μπορούν να αποκτήσουν ανώμαλη χωρικών διαμορφώσεων εμποδίζοντάς τους να φθάσουν στην κανονική θέση της πρωτεΐνης και, ενδεχομένως, την πρόκληση σχηματισμό συσσωματωμάτων τα οποία θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις παρατηρήσεις μας. Ως μάρτυρας, εμείς υποκλωνοποιήθηκε τις ισομορφές WSB1 σε pcDNA4 για την παραγωγή τριών WSB1-V5 πρωτεΐνες με ετικέτα. Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa και τα αντισώματα αντι-V5 χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση 24 ώρες αργότερα τα ισόμορφα με ανοσοκυτταροχημεία. Είναι ενδιαφέρον ότι η υποκυτταρική κατανομή των V5-tagged ισόμορφα ήταν πολύ παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε για ισομορφές ΕΟΡΡ- WSB1 (Σχήμα 1).

WSB1 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία WSB1. WSB1, επίσης γνωστή ως SWIP1, εντοπίστηκε για πρώτη φορά από τον Vasiliauskas et al. [10] από την αναζήτηση ανθρώπινες αλληλουχίες παρόμοια με εκείνη του γονιδίου κοτόπουλο swip1. WSB1 μερίδια 88% ταυτότητα αμινοξέων με το swip1 κοτόπουλο. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι swip1 διέπονταν από την ηχητική σκαντζόχοιρος σε σωμιτών και τα μπουμπούκια των άκρων στον αναπτυσσόμενο κοτόπουλο. Πιο πρόσφατα, Dentice et al. [11] παρουσίασε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι WSB1 είναι μέρος μιας Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης για θυρεοειδικών ορμονών που ενεργοποιούν ιωδοθυρονίνης deiodinase-2. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι όλα τα προηγούμενα πειράματα διεξήχθησαν σε κοτόπουλο όπου έχουν εντοπιστεί μόνο δύο ισομορφές, που αντιστοιχούν σε ισομορφές του ανθρώπινου 1 και 2. Ως εκ τούτου, η λειτουργία αυτού του γονιδίου στον καρκίνο του ανθρώπου, ιδιαίτερα του ισόμορφου του 3, είναι τελείως άγνωστη. Ερευνήσαμε πρώτα το ρόλο της WSB1 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε αναστέλλεται έκφραση WSB1 με επιμόλυνση Mia-PaCa2 με ένα siRNA που στοχεύει τα 3 ισομορφές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αυτό siRNA μειωμένη αποδοτικά WSB1 παγκόσμια έκφραση κατά 85% (80% για τις ισομορφές 1 + 2 και 89% για την ισομορφή 3). Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε κάθε 24 ώρες, ξεκινώντας 48 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, με μέτρηση απευθείας των κυττάρων και με δοκιμασία ΜΤΤ. Και στις δύο περιπτώσεις, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με WSB1 siRNA αυξήθηκε πιο αργά από κύτταρα επιμολυσμένα με το siRNA ελέγχου (Σχήμα 3). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα PANC1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). πειράματα ενσωμάτωσης BrdU επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα. Ωστόσο, η διαφορά θα μπορούσε να οφείλεται σε μια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο και όχι σε μια μείωση του πολλαπλασιασμού του WSB1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, αξιολογήσαμε την απόπτωση με μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης-3 σε κύτταρα επιμολυσμένα με αυτά τα siRNA. δραστικότητα κασπάσης-3 ήταν το ίδιο σε κύτταρα επιμολυσμένα με WSB1 siRNA ή με siRNA ελέγχου. Επιπλέον, όταν η απόπτωση που επάγεται από κατεργασίες με σταυροσπορίνη ή δοξορουβικίνη, κύτταρα επιμολυσμένα με WSB1 siRNA έδειξε χαμηλότερο κασπάσης-3 δραστικότητα από τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η έκφραση WSB1 ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων, αυξάνοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και όχι με τη μείωση του κυτταρικού θανάτου.

A. κύτταρα Mia-PaCa2 επιμολύνθηκαν με ένα siRNA που κατευθύνεται έναντι WSB1 mRNA και η έκφραση των ισομορφών WSB1 1 + 2 + 3, 1 + 2 και 3 mRNAs αναλύθηκαν με qRT-PCR. κύτταρα Β Mia-PaCa2 διαμολύνθηκαν με το WSB1 siRNA και ανάπτυξη αναλύθηκε με άμεση μέτρηση κυττάρων (Β), ανάλυση ΜΤΤ (C) ή με ενσωμάτωση BrdU (D) όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Κύτταρα Ε Mia-PaCa2 διαμολύνθηκαν με το WSB1 siRNA και δραστικότητα κασπάσης 3 μετρήθηκε σε μη επεξεργασμένα και μετά τη θεραπεία με σταυροσπορίνη ή δοξορουβικίνη. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. του συνδυασμένα αποτελέσματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (*, Ρ & lt? 0,05).

Η

ένας ειδικός ρόλος για ισομορφή 3

Η έκφραση της ισομορφής WSB1 3 διεγείρεται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος τόσο in vitro μετά από έκθεση σε ένα στρες και in vivo όταν αυτά τα κύτταρα αναπτύσσονται ως ξενομοσχεύματα σε ποντικούς. Είναι, επίσης, σε μεγάλο βαθμό κυρίαρχη σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινώματα, που υποδηλώνει ότι οι 3 ισομορφές έχουν διαφορετικές λειτουργίες. Για να χαρακτηρίσουμε αυτές τις λειτουργίες που δημιουργούνται σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν κάθε ισομορφή WSB1 χωριστά ως πρωτεΐνες σύντηξης WSB1-EGFP, με μεταγωγή κυττάρων Mia-PaCa2 με ισομορφές ρετροϊό που κωδικοποιεί WSB1 1, 2 ή 3. Η έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης αποδεικνύεται από western blot (Σχήμα S2). Μετρήσαμε την ανάπτυξη των κυττάρων με άμεση μέτρηση κάθε 24 ώρες κατά τη διάρκεια 4 ημέρες και βρήκαν ότι κύτταρα που εκφράζουν ισομορφή 1 ή 2 αυξήθηκε ταχύτερα από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν EGFP και μόνο. Ωστόσο, προς έκπληξή μας, τα κύτταρα που εκφράζουν ισομορφή 3 αυξήθηκε πιο αργά από ό, τι τα κύτταρα που εκφράζουν τις ισομορφές 1 ή 2, ή κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3). Όπως και προηγουμένως, έχουμε αποκλειστεί ότι αυτό οφειλόταν σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο επειδή δραστικότητα κασπάσης-3 ήταν το ίδιο στις κυτταρικές γραμμές 3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εκτός από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου επιβεβαίωσε αυτές τις παρατηρήσεις. Στην πραγματικότητα, βρήκαμε ότι η αναλογία S /G1 φάση υψηλότερα σε κύτταρα που εκφράζουν τις ισομορφές 1 ή 2 σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, και πιο αργή σε κύτταρα που εκφράζουν ισομορφή 3 (σχήμα 4). Ως εκ τούτου, οι ισομορφές WSB1 1 ή 2 και ισομορφή 3 έχουν αντίθετα αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ισομορφή 3 αναστολή της παγκρεατικής κυτταρικής ανάπτυξης ενώ ισομορφές 1 και 2 διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό τους.

A. κύτταρα Mia-PaCa2 μετήχθησαν με ρετροϊό που εκφράζει ισομορφές WSB1 1, 2 ή 3 ως πρωτεΐνη σύντηξης ΕΟΡΡ ή EGFP μόνη σαν ένας έλεγχος και επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με άμεση μέτρηση μετά την επίστρωση 10

5 κύτταρα σε δίσκους 48-φρεατίων καθημερινά κατά τη διάρκεια 4 ημερών. B. Μετά το συγχρονισμό με 24 h ορό ασιτίας, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιέχει ορό επί 24 ώρες, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής. Γ S /αναλογία G1. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. του συνδυασμένα αποτελέσματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (Α) ή trice εις τριπλούν (Β και Γ) (*, ρ & lt? 0,05).

Η

WSB1 ισομορφή 3 μειώνει την ευαισθησία στο στρες που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο

Δεδομένου ότι η έκφραση του ισόμορφου 3 επάγεται από στρες, διερευνήσαμε κατά πόσον θα μπορούσε να επηρεάσει την ευαισθησία των κυττάρων σε επαγόμενη από στρες κυτταρικού θανάτου. Υποβάλαμε κύτταρα Mia-PaCa2 εκφράζουν ισομορφές 1, 2 ή 3 σε θεραπεία με δοξορουβικίνη 100 ή 150 μΜ γνωστό ότι επάγει απόπτωση, και μετρήθηκαν κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από 6 ώρες. Παρατηρήσαμε με τα δύο συγκεντρώσεις φαρμάκου αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα που εκφράζουν τις ισομορφές 1 ή 2, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αντιθέτως, τα κύτταρα που εκφράζουν ισομορφή 3 ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικές από τους ελέγχους (Σχήμα 5). Για να ελέγξετε αυτά τα ευρήματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με 150 και 350 μΜ γεμσιταμπίνη και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε. Ένα προφίλ παρόμοιο με εκείνο των κυττάρων που doxorubicin επεξεργασμένου ελήφθη, τα κύτταρα που εκφράζουν τις ισομορφές 1 και 2 είναι πιο ευαίσθητοι στο φάρμακο από τα κύτταρα ελέγχου, σε αντίθεση με κύτταρα που εκφράζουν ισομορφή 3 (Σχήμα 5). Αυτά τα φάρμακα σκοτώνουν διαίρεση αλλά δεν συλλαμβάνεται κύτταρα, αλλά οι διαφορές μετά από 6 ώρα της αγωγής είναι πολύ σημαντική για να εξηγηθεί πλήρως από το γεγονός ότι βραδύτερα αναπτυσσόμενα κύτταρα πεθαίνουν πιο αργά. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερ-έκφραση της ισομορφής WSB1 3 και προς τα κάτω ρύθμιση των ισομορφών 1 και 2 σε απόκριση σε κυτταρικό αποτέλεσμα στρες σε αυξημένη αντίσταση στην απόπτωση.

κύτταρα Mia-PaCa2 μετήχθησαν με ρετροϊό που εκφράζει ισομορφές WSB1 1 , 2 ή 3 ως πρωτεΐνη σύντηξης ΕΟΡΡ ή EGFP ως έλεγχος και επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (100 και 150 μΜ) για 48 ώρες ή με δοξορουβικίνη (150 και 350 μΜ) για 6 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. του συνδυασμένα αποτελέσματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (*, P & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Η υπόθεση που υποστηρίζουν αυτό το έργο είναι ότι η παγκρεατική την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση συμβαίνει μόνο όταν κυκλοφορούν τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αντισταθεί με επιτυχία τις τάσεις που δημιουργούνται από το νέες μικροπεριβάλλον που παρέχονται από τον ιστό του ξενιστή. Αν διαφύγει καρκινικά κύτταρα δεν υποβλήθηκαν σε στρες σε νέα περιβάλλοντα, μετάσταση θα αναπτυχθεί σε όλους τους ιστούς. Στην πραγματικότητα, η κλινική παρατήρηση είναι ότι πρωτογενείς καρκίνους ανάπτυξη σε ένα δεδομένο όργανο αναπτύσσουν πάντοτε μεταστάσεις στα ίδια άλλα όργανα, πιθανώς αυτές στις οποίες αυτές οι καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να αντισταθεί στην πίεση που προκαλείται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Συνεπώς, θεραπευτικές στρατηγικές που παρεμβαίνουν στους μηχανισμούς προστασίας των καρκινικών κυττάρων από το στρες ενδέχεται να επιβραδύνει ή να αποτρέψει την μεταστατική διαδικασία. Το πρώτο βήμα προς τη δημιουργία αυτών των στρατηγικών είναι να εντοπίσει τα γονίδια που προσδίδουν ανθεκτικότητα στο νέο μικροπεριβάλλον κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τη σύγκριση με την έκφραση του γονιδίου συστοιχίας DNA σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε διαφορετικές συνθήκες μικροπεριβάλλοντος, στη συνέχεια, επιλέξτε τα γονίδια υπερεκφράζεται σε συνθήκες της ανάπτυξης του όγκου. Για να μιμηθεί το άγχος που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια σχηματισμού μετάστασης σε ασθενείς, χρησιμοποιήσαμε ένα πειραματικό στήσιμο βασίζεται σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος παγκρεατικού όγκου. Συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης της ανθρώπινης παγκρεατικής καρκινικές κυτταρικές γραμμές που αναπτύσσονται σε vitro υπό τυποποιημένες συνθήκες καλλιέργειας (μικροπεριβάλλον Α) και κατά την διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου μετά την ένεση σε γυμνά ποντίκια (μικροπεριβάλλον Β). Πράγματι, πολλά γονίδια έδειξε υπερέκφραση στο νέο μικροπεριβάλλον και αν κάποια από αυτά μπορεί να υπερεκφράζεται σε απόκριση προς τα σήματα σαν κύτταρο-προς-κύτταρο κύτταρο-προς-εξωκυττάριας μήτρας ή επαφή, άλλοι μπορεί να εμπλέκεται στην αντίσταση στο στρες. Έχουμε επιλεγεί ως καλύτεροι υποψήφιοι τα γονίδια έντονα υπερεκφράζεται στα ξενομοσχεύματα που παράγονται από όλες τις 5 κυτταρικές σειρές. Μεταξύ υποψήφια γονίδια, επιλέξαμε να χαρακτηρίσει λεπτομερώς WSB1 επειδή παρουσίασε την περαιτέρω ενδιαφέρον της παραγωγής από εναλλακτικό μάτισμα τρεις διαφορετικές ισομορφές του οποίου η ρύθμιση κατά την έκθεση στο στρες δεν είναι συντονισμένες. Παρά το γεγονός ότι η υπερ-έκφραση των ισομορφών 1 + 2 + 3 είναι μέτρια, 1,75 να 3,93 φορές ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, ισομορφή 3 είναι έντονα υπερεκφράζεται (3.7 9 να φορές). Αντίθετα, η έκφραση των ισομορφών 1 + 2 μειώνεται σε 5 έως 20% σε ξενομοσχεύματα. Είναι ενδιαφέρον, ισομορφή 3 είναι επίσης σε μεγάλο βαθμό κυριαρχεί στην ανθρώπινη όγκους του παγκρέατος, η οποία υποστηρίζει την υπόθεση εργασίας μας.

Αν και η GeneChip U133A έχει σχεδιαστεί για να καλύψουν το ανθρώπινο ακολουθίες, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε μια πιθανή διασταυρούμενη υβριδοποίηση ορισμένων ανιχνευτών με αλληλουχίες ποντικού. Αυτός είναι ο λόγος που έχουν σχεδιαστεί

Homo sapiens

-ειδικών εκκινητών για qPCR. qPCR διεξήχθησαν σε ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών cDNA υπό τις ίδιες συνθήκες όπως για την ανθρώπινη παγκρεατική cDNA και δεν υπήρχε ενίσχυση του DNA μετά από 45 κύκλους, αν και ήμασταν σε θέση να ενισχύσουν το σύνολο της ισομορφής 3 από τους εμβρυϊκούς ινοβλάστες ίδιο cDNA ποντικού με PCR με εκκινητές που ταιριάζουν τέλεια αλληλουχίες κοινές σε δύο είδη (Forward 5′-CCATGAGCCAGCTTTCCC-3 ‘? αντίστροφη 5′-TCACACCAATATTGCTGCCAC-3’). Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι εκκινητές qPCR μας είναι τα ανθρώπινα-ειδικά και ότι η αυξημένη έκφραση του ισόμορφου 3 εμφανίζεται σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα και όχι σε στρώμα ποντίκι.

Για την επικύρωση ότι WSB1 είναι πράγματι ένα γονίδιο στρες που προκαλείται από, εμείς υποβάλλονται παγκρεατικά κύτταρα σε διάφορες πιέσεις και παρατήρησε ότι η έκφραση της ισομορφής WSB1 3 ήταν πάντα έντονα ενεργοποιημένο ενώ η έκφραση των ισομορφών 1 + 2 ήταν αμετάβλητη ή μειώθηκε. Αυτό κυτταρικό στρες ρυθμίζει WSB1 έκφρασης διαμορφώνοντας μάτισμα του είναι πράγματι ενδιαφέρουσα, αλλά δεν αρχική δεδομένου ότι μια τέτοια ρύθμιση είχε ήδη περιγραφεί για άλλα γονίδια. Για παράδειγμα, διαμορφώσεις του εναλλακτικού ματίσματος συμβεί για Arabidopsis ομόλογα SR πρωτεΐνη, atSR30 και atSR45a, σε απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες [12]. Επίσης, UV και ακτινοβολία γ, καθώς και θεραπεία σισπλατίνη επάγουν εναλλακτικό μάτισμα του hdm2 [13] και την έκθεση των πρωτογενών λεμφοκυττάρων σε ένα στρες επάγει την εμφάνιση των παραλλαγών ματίσματος TSG101 [14]. Τέλος, σε νευρώνες, ακετυλοχολινεστεράση μετατοπίσεις από ισομορφή AChE-S στην κανονικά σπάνια ισομορφή AChE-R σε απόκριση σε διάφορες καταπονήσεις [15]. Το σημαντικό σημείο είναι ότι το άγχος που προκαλείται από τη διαφοροποίηση από εναλλακτικό μάτισμα της έκφρασης των ισομορφών WSB1 είναι πολύ παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της εξέλιξης ξενομοσχεύματος όγκου.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η ανθρώπινη WSB1 ισομορφή 3 ακολουθία έχει οριστικά καταργηθεί από το βάσεις δεδομένων για να είναι μια ανοησία μεσολάβηση mRNA αποσύνθεσης (NMD) υποψήφιο. NMD είναι ένα μονοπάτι επιτήρηση mRNA που εξασφαλίζει την ταχεία αποικοδόμηση των mRNA που περιέχουν πρόωρου κωδικόνια λήξης της μετάφρασης, εμποδίζοντας έτσι τη συσσώρευση της αποκομμένης και δυνητικά επιβλαβείς πρωτεΐνες [16]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε μια συσσώρευση ισομορφής 3 mRNA μετά την επαγωγή του στρες, κατά ξενομοσχεύματος και σε ανθρώπινους όγκους του παγκρέατος σε αντίθεση με ό, τι θα αναμενόταν σε NMD πλαίσιο. Επομένως, αν και η αλληλουχία του μπορεί να σχετίζεται με NMD, είναι προφανές ότι WSB1 ισομορφή 3 mRNA δεν αποικοδομείται ταχέως και δεν φαίνεται να είναι ένας πραγματικός στόχος για NMD. Επίσης αποκλείεται με ενίσχυση RT-PCR και αλληλούχιση ολόκληρου του ισόμορφου 3 mRNA το γεγονός ότι ένα προ-mRNA ανιχνεύεται αντί ισομορφής 3 mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι φυσιολογικές συνέπειες για παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα του στρες που προκαλείται από μεταβολές στις αναλογίες των ισομορφών WSB1, από την άποψη του ρυθμού ανάπτυξης και την αντοχή σε απόπτωση, είναι σημαντικές. Έκφραση των ισομορφών WSB1 1 ή 2 δείχθηκε να επιταχύνει τον κυτταρικό κύκλο ενώ η έκφραση του ισόμορφου 3, αντιθέτως, θα επιβραδυνθεί. Όταν όλες οι ισομορφές ταυτόχρονα στοχευμένη από siRNA σε Mia-PaCa2 ή PANC1 ανάπτυξη κυττάρων μειώθηκε σημαντικά, η οποία αναμενόταν επειδή ισομορφές 1 και 2 είναι άφθονα σε μη τόνισε κύτταρα που παρουσιάζουν φυσιολογική ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, σε συνθήκες στρες ανάπτυξης περιορίζεται τόσο από την μειωμένη έκφραση των ισομορφών 1 και 2 και από την υπερέκφραση του ισόμορφου 3. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του ισόμορφου 1 ή 2 αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων σε προ-apototic ερεθίσματα ενώ η έκφραση του ισομορφή 3 αυξάνει την αντοχή τους. Και πάλι, το στρες που προκαλείται από την αναστολή των ισομορφών 1 και 2 έκφρασης και υπερέκφραση ισομορφής 3 τόσο βοηθούν τα κύτταρα να αντιμετωπίσουν ένα διαφορετικό περιβάλλον. Οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των κυττάρων και την αντίσταση στην απόπτωση σε αντίθετες κατευθύνσεις παραμένουν να καθοριστεί, αν και η απώλεια σε ισομορφή 3 του Ο-τερματικό τμήμα της ισομορφής 1 θα πρέπει πιθανώς αντιπροσωπεύουν μέρος της. Ωστόσο, παρά τις σημαντικές δομικές διαφορές, τα 3 ισομορφές WSB1 ομοίως κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε ότι η μετατόπιση στην έκφραση ισομορφή WSB1 παρατηρείται σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε μια πίεση είναι παρόμοια με τη μετατόπιση που παρατηρείται όταν τα κύτταρα αυτά είναι ξενομόσχευμα σε γυμνούς ποντικούς ή σε ανθρώπινους όγκους του παγκρέατος. Εάν ότι τα αποτελέσματα μετατόπιση μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων, αλλά αυξάνει επίσης σημαντικά την αντοχή τους σε απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η ενεργοποίηση των μηχανισμών του στρες-απόκρισης βοηθά τα καρκινικά κύτταρα για την ίδρυση μεταστάσεις, καθόσον παρατηρείται η ίδια αναλογία WSB1 ισομορφή σε παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα. Είτε τα στρες που προκαλείται από τις αλλαγές στην έκφραση WSB1 ισομορφή είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των όγκων, η οποία θα είναι ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο να κάνει, παραμένει ωστόσο να διερευνηθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυττάρων συνθήκες καλλιέργειας

Το ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο προέρχεται Mia-PaCa2, BxPC3, Panc-1, Capan-1 και Capan-2, και οι κυτταρικές γραμμές συσκευασίας ιικού Phoenix Αμφοτροπικά καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται από την American Type Culture Collection.

υποδόρια επαγωγή όγκου σε γυμνούς ποντικούς

Εναιωρήματα παγκρεατικών κυτταρικών σειρών, (10

7/200 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό αρσενικών αθυμικών 7-8 εβδομάδων γυμνούς ποντικούς και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 30 ημέρες. Όλες οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους κανονισμούς της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα πειράματα σε ζώα.

δείγματα Ανθρωπίνων παγκρεατικού όγκου

παγκρέατος ιστού που ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε παγκρεατικά εκτομή στο Τμήμα Χειρουργικής, Hopital Nord, Μασσαλία, Γαλλία. έγκριση Institutional Review Board λήφθηκε από την Comité d’Ethique de l’Institut Paoli Calmettes (Μασσαλία, Γαλλία). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς, σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι.

RNA απομόνωση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με τη διαδικασία ΤπζοΙ (Gibco-BRL).

μικροσυστοιχιών

το πείραμα διεξήχθη σε U133 2.0 Plus GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], και αναλύθηκαν με το λογισμικό Microarray Suite 5.0 (Affymetrix).

Θεραπείες

σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα Mia-PaCa2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία κατά την διάρκεια 24 h με 10 μΜ δοξορουβικίνη (Sigma), 0.5 μΜ σταυροσπορίνη (Sigma) ή 350 μΜ γεμσιταβίνη (Eli Lilly), ή υποβληθεί σε 24 ώρες στέρηση ορού, ή σε γ-ακτινοβολία (5Grays)

η υποξία /ανοξία

οι συγκεντρώσεις οξυγόνου τροποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο υποξίας θερμοκοιτίδα (κατάλογος # 27310? Stem τεχνολογίες κυψελών). και κατάλληλα μείγματα αερίου (φυσικού αερίου Linde, Γαλλία ), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε 5 ώρες ανοξία (5% CO

2, 95% Ν

2) ή σε 6-18 h υποξία (5% CO

2, 94,8% Ν

2 και 0,2% O

2).

η ποσοτική ανάλυση RT-PCR

Ο πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας Expand ανάστροφης μεταγραφάσης (Roche, Meylan, Γαλλία). Ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Roche σύστημα Light Cycler και αντιδραστήρια, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται και τις συνθήκες της ανόπτησης ήταν 5′-AGTGTCAGACTGATCTGG-3 ‘και 5′-ACAGTAGACGGATTCTTCAA-3′, 58 ° C για 7 δευτερόλεπτα? 5’-GATCATACTGAAGTGGTCAG-3 ‘και 5′-GCCCAAATTCCATCAGAATG-3′, 56 ° C για 14 sec? και 5’-GATCGTGGTTAGTTTGGG-3 ‘και 5′-TGGGTCACCAACTTGAG-3’, 57 ° C για 6 δευτερόλεπτα? για την παγκόσμια έκφραση του wsb1, ισομορφών 1 + 2 και 3 αντιστοίχως ισομορφή. (Βλέπε συμπληρωματικό σχήμα S1) Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση RelQuant (Roche) και εκφράζεται ως λόγος της ΤΑΤΑ Binding Protein (ΤΒΡ) ή του τιμές ελέγχου (ακατέργαστα κύτταρα).

Οι επιμολύνσεις

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας FuGENE HD ( Roche Diagnostics) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με το πλασμίδιο pEGFP-N1 (Clontech) που περιέχει πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης WSB1, ισομορφή 1, 2 ή 3 (αντίστοιχα NM_015626, NM_134265, NM_134264), ή καθόλου ένθετο. Τα 3 ισομορφές επίσης υποκλωνοποιήθηκαν στο pcDNA4-V5-ένα πλασμίδιο (Invitrogen).

WSB1 φθορισμός

Το αντι-V5 αντισώματος ποντικού (InVitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει V5-tagged πρωτεΐνες WSB1 , και αποκαλύπτεται από την κατσίκα Chromeo 488 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο αντι-ποντικού (ActiveMotif). Τα κύτταρα που εκφράζουν τις πρωτεΐνες σύντηξης ΕΟΡΡ- WSB1 ήταν μόνο σταθερό. Τα κύτταρα τοποθετούνται σε παρατείνει Gold (Invitrogen) και αναλύθηκαν με μικροσκόπιο Nikon I90 (40 × /APO σχέδιο /NA1.40).

ρετρο-ιικού φορέα και μεσολάβηση ρετροϊών γονιδιακή μεταφορά

Το 3