Οι

Abstract

υποδοχέα ανδρογόνου (AR) παραλλαγές που σχετίζονται με την αντίσταση σε αντι θεραπεία ανδρογόνων τόσο σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και κλινικά δείγματα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η συσσώρευση AR ισομορφή είναι συνέπεια της επιλεκτικής θεραπευτικής πίεση επί του πλήρους μήκους AR. Η ελλιπής μοντέλο καρκίνου του προστάτη PTEN προχωρά με σαφώς καθορισμένες κινητική συμπεριλαμβανομένων εξέλιξης σε καρκίνο ανθεκτικά ευνουχισμό του προστάτη (CRPC). Ενώ ο χειρουργικός ευνουχισμός και enzalutamide θεραπείες δώσει μια αρχική θεραπευτική ανταπόκριση,

PTEN

– /-

επιθήλια συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται αποδόσεων τοπικά επεμβατικές παθολογία πρωτοπαθούς όγκου. Αυτό πλέον επιθήλιο παραμένει AR θετική, αλλά συνδέτη ανεξάρτητη, υποδηλώνει την παρουσία των ογκογόνων AR παραλλαγές. Για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα πάνελ πρόσφατα περιγραφόμενων

ΡΤΕΝ

– /- κυτταρικές σειρές

όγκου που προέρχονται από τόσο από ορμόνη άθικτο (Ε4, Ε8) και ευνουχισμένων ΡΤΕΝ μεταλλάγματα (CE1, CE2) ακολουθούμενο με RACE PCR για τον εντοπισμό και το χαρακτηρισμό τριών νέων κολοβωμένη, αμινο άκρο που περιέχει παραλλαγές AR (mAR-Va, b, c). Παραλλαγές δεν εμφανίζονται μόνο συντηρούνται σε όλη εξέλιξη, αλλά συσχετίζονται με σχεδόν πλήρη απώλεια της πλήρους μήκους AR (AR-FL) σε επίπεδα ευνουχισμού ανδρογόνων. Η υπερέκφραση των παραλλαγών οδηγεί σε αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα του AR, ενώ γκρεμίζω μελέτες δείχνουν μειωμένη μεταγραφική εξόδου. Συλλογικά, η αναγνώριση των συντετμημένες παραλλαγές AR στο υπό όρους μοντέλο διαγραφή PTEN υποστηρίζει ένα ρόλο για τη διατήρηση του φαινοτύπου CRPC και παρέχει περαιτέρω θεραπευτικές εφαρμογές αυτής της προκλινικό μοντέλο

Παράθεση:. Liang Μ, Adisetiyo Η, Liu Χ, Liu Ε, Gill P, Roy-Burman P, et al. (2015) Προσδιορισμός των ανδρογόνων υποδοχέων Splice Παραλλαγές στην PTEN Ελλιπή ποντικού καρκίνου του προστάτη μοντέλο. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10.1371 /journal.pone.0131232

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 1, Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 29, Μάη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιούλη, 2015

Copyright: © 2015 Liang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και υποστήριξη αρχείο πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το RO1CA059705 επιχορήγηση NIH για PR, η PCF Νέων Ερευνητών Ανάθεση και Icahn της Ιατρικής Σχολής του Cancer Research ταμεία απονέμεται σε DJM

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έχουν καρκίνο του προστάτη κύτταρα διατυπωθεί η υπόθεση να προχωρήσει σε αντίσταση ευνουχισμό μέσα από ένα πλήθος των ανδρογόνων υποδοχέων (AR) τροποποιήσεις. συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης, αναδιατάξεις γονιδίων ή μεταλλάξεων, μεταβάλλεται η έκφραση του μεταγραφικού συν-ρυθμιστικών αρχών και

de novo

στεροειδογένεση [1-6]. Πιο πρόσφατα, μελέτες με κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και ιστών έχουν εντοπίσει την παρουσία των παραλλαγών ματίσματος AR (AR-Vs) το οποίο μπορεί να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε απόκριση προς ευνουχισμό και την προώθηση της αντίστασης σε ανδρογόνων θεραπεία υποδοχέα στοχευμένη [7-9] [10 ] [11]. Το υποδοχέα ανδρογόνου ανήκει στην οικογένεια παράγοντα μεταγραφής υποδοχέα στεροειδών και αποτελείται από μία περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης Ν-τερματικό (NTD, exon1), περιοχή δέσμευσης DNA (DBD, εξόνιο 2 και 3), μία περιοχή άρθρωσης (εξόνιο 4), και ο τομέας C-τερματικό δέσμευσης συνδέτη (LBD, εξόνιο 4-8) [12,13]. Μέχρι σήμερα πάνω από 15 διαφορετικές AR-Vs λείπει διαφορετικά τμήματα του LBD έχουν αναφερθεί σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη CWR-R1, 22rv1, VCAP και LuCaP ξενομοσχεύματα [14-21]. Παρά το γεγονός αυτό, AR ισομορφές παραμένουν πολύ μελετημένο σε προκλινικά μοντέλα ποντικών του προστάτη ιστών καρκίνου που περιορίζεται σε δύο AR-Vs όπως αναφέρθηκε με τη χρήση της κυτταρικής γραμμής Myc-Cap [15]. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν παραλλαγές AR έχει αναφερθεί από το κύριο όργανο ενός προκλινικό μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη.

Ο

ΡΤΕΝ

null μοντέλο ποντικού του καρκίνου του προστάτη είναι ελάχιστα αποκρίνεται σε θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων συμπεριλαμβανομένων στοχευμένη θεραπεία χειρουργικό ευνουχισμό και υποδοχέα ανδρογόνων [22] [23] [24]. Ενώ αυξημένη ΡΙ3Κ /Ακί σηματοδότησης έχει δειχθεί ότι παρέχει σημαντική συνθήματα επιβίωση κάτω από ευνουχισμένους συνθήκες, οι περισσότεροι επιθήλια παραμένουν υποδοχέα ανδρογόνου θετική. Αυτή η παρατήρηση εγείρει την πιθανότητα ότι ο συνδέτης ανεξάρτητες μορφές του υποδοχέα ανδρογόνων μπορεί να υπάρχουν διευκόλυνση επιβίωση και συνέχισε την εξέλιξη. Έχουμε λάβει μια πολύπλευρη προσέγγιση για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης, συμπεριλαμβανομένου του χαρακτηρισμού και την εφαρμογή πολλών νέων, PTEN ανεπάρκεια, ποντικού καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές [25] [26] και τα αντίστοιχα πρωτογενή μοντέλο όγκου.

Έχουμε εντοπίσει τρία νέες παραλλαγές του υποδοχέα ανδρογόνων (που ονομάζεται Μαρ-Va, b, c). Αυτά AR παραλλαγές περιέχουν όλα το AR-NTD με ένα μόνο που περιέχει μια μερική επικάλυψη ακολουθίας με το AR-LBD. Η σχετική έκφραση αυτών των παραλλαγών αυξάνει όχι μόνο ως απάντηση σε ευνουχισμό, αλλά σε απάντηση AR στοχευμένη θεραπεία που περιλαμβάνει Casodex και enzalutamide. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μετά την εξέλιξη στη μακροχρόνια του ευνουχισμού ανδρογόνων επίπεδα, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της πλήρους μήκους AR αλλά διατήρηση των προσδιοριζόμενων ισομορφών. Λειτουργικές μελέτες αποκάλυψαν ότι η υπερέκφραση ή γκρεμίσουμε του AR-Va και AR-Vc θα μπορούσε να ρυθμίσει AR μεταγραφική εξόδου.

Συλλογικά, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την παρουσία νέων AR παραλλαγές που μπορούν να χρησιμεύσουν ως σημαντικοί παράγοντες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CRPC. Παραλλαγή ταυτοποίηση ενισχύει επίσης σημαντικά την χρησιμότητα του null μοντέλο καρκίνου του προστάτη ΡΤΕΝ τόσο όσον αφορά την κατανόηση της λειτουργίας του AR και ως σύστημα για την αξιολόγηση των θεραπειών που στοχεύουν ανθεκτικές μορφές του υποδοχέα ανδρογόνων.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση νέων παραλλαγών AR σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το μοντέλο καρκίνου του προστάτη null ΡΤΕΝ

Ως μέρος των μελετών μας υποδοχέα ανδρογόνων (AR) συνάρτηση και οι μηχανισμοί του CRPC εξέλιξης, χαρακτηρίσαμε πρόσφατα τέσσερα νέα καρκίνου του προστάτη ποντικού κυτταρικές σειρές που προέρχονται είτε από ορμόνη άθικτο (Ε4, Ε8) ή ευνουχισμένα (CE1, CE2)

PTEN

null μεταλλαγμένα ποντίκια. Οι κυτταρικές σειρές χαρακτηρίστηκαν ως

PTEN

– /-

, αφού ενεργοποιηθεί PI3K /Akt σηματοδότησης και τα χαρακτηριστικά του πρωτογενούς μοντέλο όγκου [25] [26]. Για να προσδιοριστεί για την παρουσία του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) παραλλαγές, εφαρμόσαμε 3 ‘RACE για cDNAs που δημιουργούνται από τις γραμμές Ε8 και CE1 χρησιμοποιώντας εμπρόσθια εναύσματα αγκυρώνεται εντός του exon1 του AR ποντικού (S1 πίνακα). Χρησιμοποιώντας αυτήν την αμερόληπτη προσέγγιση, ενισχυμένο AR mRNAs με πολυ (Α) ουρές, συμπεριλαμβανομένων εκείνων AR-Vs με δυναμικό νέες αλληλουχίες 3 ‘. Μετά με ένθετη PCR, παρατηρήσαμε πολλά μοναδικά προϊόντα ακολουθία (Σχήμα 1α, S1 σχήμα). Όπως αναμενόταν, το μακρύτερο (~ 2 kb) μπάντα ήταν το μήκος AR πλήρως (AR-FL), που περιέχουν αλληλουχίες ανάντη της περιοχής πολυ (Α) που συνδυάζεται με την 3’UTR του AR ποντικού (MAR) mRNA. Κλωνοποίηση και αναλύσεις αλληλουχίας των ~ 850 bp προϊόντων PCR έδειξαν την ύπαρξη αρκετών μοναδικό ποντίκι AR-Vs (Μαρ-Vs) σε κύτταρα E8 και CE1. Εστιάσαμε σε τρεις μοναδικές μεταγραφές. Πρώτον, μια σύντομη AR ισομορφή βρέθηκε στη γραμμή Ε8, διατηρώντας εξόνια 1-4 από mAR mRNA, ακολουθούμενη από μια μοναδική 175-bp αλληλουχία που βρέθηκε να ευθυγραμμιστεί με την περιοχή εσωνίου AR παρακείμενη στο εξώνιο 4 οποίου ονομάζονται εξωνίου 4α (m4a) ή παραλλαγή AR-Va (Σχήμα 1α και 1β). Η μοριακή δομή AR-Va είναι ανάλογη με τα 5′-συγκράτησης εξώνια 1-4 αλλά διαφέρουν στις συνθέσεις της 3’-αλληλουχίες που περιγράφηκε προηγουμένως ποντικού Μαρ-V4 [15] και την ανθρώπινη ARV

567es [27]. Στη συνέχεια, δύο νέα AR-Vs με δυνητικά μοναδικές εναλλακτικές θέσεις ματίσματος ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα CE1. Κατά τη χαρτογράφηση τους αλληλουχίες στο γονιδίωμα του ποντικού, βρήκαμε ότι 442-bp και 495 bp-αλληλουχίες ταιριάζουν με ενδονίου 1 και συγκολλημένα εξώνιο 1, το οποίο αναφέρεται M1B και M1C παραλλαγές. Για να αποφευχθεί πιθανή σύγχυση με την ονοματολογία των αντιρετροϊκών φαρμάκων που αναφέρθηκαν σε μοντέλα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, ονομάσαμε αυτές τις παραλλαγές των τριών νέων AR ως ποντίκι AR-Va, b, c (Μαρ-Va, b, c), του οποίου εντοπίστηκε για πρώτη φορά Μαρ-Va στην Ε8, με Μαρ-Vb και Vc Μαρ-σε CE1 (S1 Σχήμα). Χρησιμοποιώντας τις παραπάνω κυτταρικές γραμμές προσδιορίσαμε τα σχετικά επίπεδα έκφρασης της κάθε παραλλαγής. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση Μαρ-Va ήταν υψηλότερη στις γραμμές Ε4 και Ε8, ενώ Μαρ-Vb και MAR-Vc έδειξε υψηλότερη έκφραση στις γραμμές CE1 και CE2. Όλες οι εκδόσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερες στην έκφραση από το AR-FL (S2 σχήμα).

α) Προσδιορισμός των παραλλαγών Mar (α, β, γ) σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται οπτικοποιούνται με τη χρήση συμβατικών PCR. β) Real Time PCR αξιολόγηση της AR παραλλαγών που ενισχύθηκε από cDNA Ε8 κύτταρο ορατά με ηλεκτροφόρηση πηκτής. c, αριστερά) Ανίχνευση AR ισομορφών σε ανθρώπινα και του προστάτη ποντικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές και c, δεξιά) ανάλυση πυκνομετρίας της παραλλαγής και η έκφραση πρωτεΐνης AR-FL ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη (*, ρ & lt? 0,05). δ) Σχηματική δομή της Μαρ παραλλαγές (α, β, γ) και AR πλήρους μήκους (AR-FL). Στερεά χρώματος κουτιά αντιπροσωπεύουν τις κοινές εξώνια του AR-FL και εκκολάπτονται κασέτες δείχνουν τις αινιγματικές εξώνια. Bold ευθείες γραμμές αναφέρονται στις μεταγραφόμενες αλληλουχίες σε mRNAs τους. Η προβλεπόμενη αλληλουχία αμινοξέων που μεταφράζεται από m4a και M1C είναι εισηγμένη (κάτω διαγράμματα).

Η

Χρησιμοποιώντας ApE λογισμικού πλασμίδιο editor ήμασταν σε θέση να συναγάγει τα μοριακά βάρη των Μαρ-Va ως ~ 80 KDa και αγο- Vb, Vc να είναι ~ 54 και 56 kDa που αντιστοιχούν σε διαπιστωμένες μεταγραφές μας (Σχήμα 1δ, S2 πίνακα, S3 Πίνακας). Για να εξακριβωθεί αν AR-Vs μπορούσαν να ανιχνευθούν στο επίπεδο της πρωτεΐνης χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα που στοχεύει την Animo άκρο του AR (Santa Cruz, Ν-20) και εξετάστηκαν λύματα από το Ε8, CE1 και ευνουχισμένα παράγωγα ανδρογόνων (Ε8-CSS, CE1 -CSS). Αξιολογούνται μαζί με τις ανθρώπινες γραμμές, LNCaP και PC3, ανιχνεύσαμε το AR-FL (~ 110 kDa) και τρεις κύριες ζώνες που κατοικούν σε ~ 75 kD, 85kD και κάτω των ειδών σε ~ 50kD και ~ 56 kD (Σχήμα 1γ, S2 πίνακα).

ανδρογόνων κατάλυσης αυξάνει η σχετική έκφραση του AR παραλλαγές

για να υποστηρίξει περαιτέρω ένα ρόλο για τις παραλλαγές AR κατά τη διάρκεια CRPC, θεωρήσαμε την επίδραση των αντι-ανδρογόνων θεραπεία. Για να το κάνετε αυτό, αμφισβήτησε τα κύτταρα γραμμές E8 και CE2 είτε με ευνουχίσει ανδρογόνων συνθήκες καλλιέργειας (ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο ορό, CSS) ή Casodex (10 μΜ) για 3 ημέρες. Εντυπωσιακά, σε συνθήκες CSS πολιτισμό παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση μεταγραφή σε όλες τις τρεις παραλλαγές με τη μεγαλύτερη αύξηση φορές παρατηρούνται σε Μαρ-Va στα κύτταρα E8 (Μαρ-Va, 3,5 φορές, Μαρ-Vb, 2,5 φορές, Μαρ-Vc 2,2 φορές, σ & lt? 0,05) όταν εξομαλύνεται σε όλο το μήκος AR (Σχήμα 2α). Χρησιμοποιώντας Casodex, παρατηρήσαμε επίσης μια στατιστικά σημαντική βελτίωση όλων των AR παραλλαγές χρησιμοποιώντας τις γραμμές Ε8 και CE2 (Σχήμα 2β).

α) Πολιτισμού του καρκίνου του προστάτη ποντικού (Ε8) κυτταρικές σειρές με αντι θεραπεία των ανδρογόνων, συμπεριλαμβανομένων απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα καταλήγει σε σημαντικά αυξημένη έκφραση του AR ορού (CSS) (3 ημέρες) ή β) Casodex (10 μΜ, 3 ημέρες) ισομορφών κανονικοποιημένη προς AR πλήρους μήκους. γ) του χειρουργικού ευνουχισμού των μεταλλάξεων PTEN (

C

+

? PTEN

L /L

, n = 7) οδηγεί σε σημαντική αύξηση στην σχετική έκφραση των ισομορφών AR όπως ανιχνεύεται με κηλίδωση Western. δ) η έκφραση παραλλαγή AR μεταγραφή από

Wt

, ορμόνη άθικτο και ευνουχισμένοι μεταλλαγμένα ποντίκια ομαλοποιηθούν τα επίπεδα AR-FL (*, p & lt? 0,05? **, p & lt?. 0.01)

Η

στη συνέχεια εξέτασε κατά πόσον υπήρχαν ισομορφές AR

in vivo

χρήση ορμονών άθικτο PTEN-null όγκους (

C

+

? PTEN

L /L

? n = 6) και αν εξέλιξη σε επίπεδα ανδρογόνων ευνουχισμού θα μπορούσαν να αλλοιώσουν την έκφραση τους. Χρησιμοποιώντας εκτομή λοβών του προστάτη (κοιλιακό, ραχιαίο πλευρική, πρόσθια) αξιολογήσαμε την έκφραση του ΑΕ σε ορμόνη ανέπαφα μεταλλάγματα σε 2, 13 και 23 μήνες και ανιχνεύεται η παρουσία του AR-FL (~ 110 kD) και τρεις μεγάλες παραλλαγές του μειωμένου μεγέθους περίπου 45-50, 64 και 75 kD (Εικόνα 2c). Από τις 6 μεταλλάξεις που αναλύθηκαν, παρατηρήσαμε μία μόνο στον 13 μηνών ομάδα με μειωμένη έκφραση AR-FL (*, αστέρι). Εντυπωσιακά, σε μεταλλάξεις ΡΤΕΝ που είχαν χειρουργικά ευνουχισμένα (

C

+

? PTEN

L /L

? N = 7) παρατηρήσαμε 6/7 να έχουν σημαντική απώλεια AR-FL, αλλά διατήρησε την έκφραση των ισομορφών AR (Σχήμα 2γ, δεξιά). Ποσοτική RNA (q-PCR) μέτρηση της Μαρ-Va, b, και c επιβεβαίωσε την ανύψωση των ισομορφών σε ορμόνη άθικτη και CRPC ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκίνους σε σχέση με το

Wt

προστάτες και ομαλοποιήθηκε ως προς AR-FL (Σχ 2d ) (**, p & lt? 0,01). Να συνδέσει ακόμη περισσότερο την παρουσία του κόλουρου AR-Vs με ανθεκτικά ευνουχισμό εξέλιξη, είμαστε αντιμετωπίζονται PTEN ορμόνη άθικτο μεταλλάξεις (

C

+

? PTEN

L /L

, n = 6) με enzalutamide (10 mg /kg,

μέσω

τροφή ποντικών

ad libitum

) για 10 εβδομάδες, ακολουθούμενη από ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον είτε το AR αμινο άκρο (AR, Ν-20) ή AR ο-άκρο (AR, C-19). Συνεπής με την βιοχημική ανάλυση, παρατηρήθηκε πολύ χαμηλή ανίχνευση της πλήρους μήκους AR αλλά ισχυρή χρώση για αμινοξέα, που περιέχουν παραλλαγές (S3 Εικ). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η πρόοδος στα επίπεδα των ανδρογόνων ευνουχισμού μπορεί να επιλέξει κατά της πλήρους μήκους AR αλλά όχι AR παραλλαγές.

Η μεταγραφική δραστηριότητα του πλήρους υποδοχέα ανδρογόνων μήκους ενισχύεται από AR παραλλαγές

μας

in vivo

ανάλυση δείχνει ότι η σχετική έκφραση των ισομορφών AR μπορεί να επιμείνει κατά τη διάρκεια CRPC και μας ώθησε να εξετάσει τις επιπτώσεις της σχετικής αύξησης στην έκφραση της Μαρ-Vs στην PTEN καρκίνο του προστάτη ανεπάρκεια. Για να γίνει αυτό, πραγματοποιήσαμε μια σειρά μεταγραφικό δοκιμασίες χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο αναφοράς PSA-λουσιφεράσης [28]. Πρώτον, κάθε παραλλαγή και το AR-FL υπεκμισθώθηκαν κλωνοποιήθηκε σε κατασκευάσματα έκφρασης ακολουθούμενη από την επικύρωση έκφρασης χρησιμοποιώντας στύπωση western και το AR (Ν-20) αντίσωμα (Σχήμα 3α).

α) κηλίδωση Western με τη χρήση του AR ( Ν-20) αντίσωμα επιβεβαιώνει έκφραση κλωνοποιημένων παραλλαγών AR σε κύτταρα COS-1. β) Η υπερέκφραση του AR παραλλαγές στα κύτταρα E8 αγωγή με έλεγχο, DHT (0,03, 0,3 nM) ή DHT + Casodex (BIC, 1 μΜ). (Control

vs

Μαρ-Va = συγκρίσεις 1-4?.. Ελέγχου

vs

Μαρ-Vc = συγκρίσεις 5-6) (*, p & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01 ). γ) Co-ανοσοκαθιζήσεις από COS-1 κύτταρα επιμολυσμένα με AR-FL και είτε AR-Va-myc (μεσαία) ή AR-Vc-myc (δεξιά).

Η

Βρήκαμε κύτταρα E8 ελέγχου να ανταποκρίνεται σε DHT με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (0,03 – 0,3 ηΜ) (Σχήμα 3β), ενώ τα κύτταρα CE1 δεν ήταν αποκριτικά σε DHT εκτός εξωγενή αρουραίου AR-FL εισήχθη μέσω διαμόλυνσης (S4 Εικ). Εμείς επόμενη υπερεκφράζονται Marva, b, ή c σε κύτταρα E8 και CE1 και παρατήρησε ότι η ισομορφή Μαρ-Va σημαντικά αυξημένη δραστικότητα μεταγραφικής ρεπόρτερ σε σύγκριση με τον έλεγχο του πλασμιδίου επιμολύνσεις (συγκρίσεις ραβδόγραμμα 1-4, *, ρ & lt? 0,05, ** , p & lt? 0,01). Είναι ενδιαφέρον, Μαρ-Vc επιμόλυνση επαυξημένης επίπεδα δημοσιογράφος μόνο με την παρουσία των ανδρογόνων (συγκρίσεις 5-6? *, P & lt? 0,05), ενώ Μαρ-Vb είχε στατιστικά σημαντική επίδραση (p & gt? 0,05). (Σχήμα 3β)

για να κατανοήσουμε έναν πιθανό μηχανισμό με τον οποίο Μαρ-Vs ενεργοποιήσετε τη λειτουργία του AR-FL, πραγματοποιήσαμε συν-ανοσοκαθιζήσεις δοκιμασία για την παραλλαγή στην αλληλεπίδραση AR-FL. Τα πλασμίδια που κωδικοποιούν myc-tagged Μαρ-Va και MAR-Vc δημιουργήθηκαν για αυτή τη δοκιμασία βασίζεται στο εύρημα ότι αυτές οι δύο αντιρετροϊκά μπορούσε συν-activate AR-FL σε μία ή περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. AR αρνητική, COS-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν μόνο με AR αρουραίου (+ κενό φορέα) ή σε συνδυασμό με Μαρ-Va-myc (Va-myc) ή Μαρ-Vc-myc (Vc-myc) κατασκευάσματα έκφρασης που ακολουθείται από ανοσοκαταβυθίσεις για mAR πρωτεΐνες -Va /Vc χρησιμοποιώντας το myc επίτοπο. αναλύσεις κηλίδος Western στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για το Ο-άκρο του AR η οποία αναγνωρίζει μόνο AR-FL. Βρήκαμε το kDa ζώνη AR-FL 110 να είναι παρούσα στις Va-myc ανοσοκαθιζήματα υποδεικνύοντας ότι Μαρ-Va θα μπορούσε να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με AR-FL. Ωστόσο, δεδομένου ότι μια σημαντική ζώνη AR-FL δεν ανιχνεύθηκε στα Vc-myc ανοσοκαθιζήματα, έχουμε υποθέσει ότι σταθερά συμπλοκοποίησης ήταν λιγότερο αποτελεσματική ή όχι σχηματίζονται μεταξύ AR-FL και AR-VC-μια παρατήρηση που είναι συνεπής με σημαντικά μειωμένη AR-Vb και AR-Vc μεσολάβηση συν-ενεργοποίηση του PSA ανταποκριτή (Σχήμα 3c). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενισχυμένη έκφραση της Μαρ-Vs μπορεί να ενισχύσει τη σταθερότητα του AR-FL ενισχύοντας έτσι εξαρτώνται από ανδρογόνα εξόδου δοκιμασίας ανταποκριτή. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι επίσης παρόμοια με εκείνα που λαμβάνονται με ανθρώπινο AR-V5, 6, 7es [27].

Στη συνέχεια, εξέτασε τις επιπτώσεις της αναστολής παραλλαγή PSA μεταγραφική εξόδου δημοσιογράφος. Για να το κάνετε αυτό σχεδιάσαμε τα siRNA υπόστρωμα Dicer (DsiRNAs) που θα στοχεύουν ειδικά Μαρ-Va ή γ, αλλά όχι όλο το μήκος AR. Μέσω επιμόλυνση αυτών των siRNAs σε Ε8 ή CE1 κύτταρα μαζί με τα πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης, παρατηρήθηκε ότι knockdown του είτε Μαρ-Va και Vc μειωμένη AR μεταγραφική δραστικότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4α). Παραλλαγή siRNAs ήταν εξίσου ισχυρά σε κύτταρα E8 ενώ σε κύτταρα CE1, knockdown της Μαρ-Vc έδωσε την πιο ισχυρή επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αποτελεσματικότητα της παραλλαγής γκρεμίζω επεξηγείται με μέτρηση Q-PCR των επιπέδων Μαρ-Vc στον έλεγχο και MAR-VC-siRNA κατεργασμένων κυττάρων E8 (Σχήμα 4β).

α) κύτταρα E8 επιμολύνονται με siRNAs που στοχεύουν είτε Μαρ-Va ή c και αξιολογήθηκαν για δραστηριότητα ρεπόρτερ PSA-Luc 48 ώρες αργότερα (έλεγχος siRNA

vs

Μαρ-Va siRNA = συγκρίσεις 1-3?.. τον έλεγχο siRNA

vs

Μαρ-Vc siRNA = συγκρίσεις 4-7). β) Επικύρωση των siRNA νοκ ντάουν της Μαρ-Vc όπως μετράται από την Q-PCR (*, p & lt? 0,05, **, p & lt?. 0.01)

Η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Μαρ-Vs συμβάλλουν στην AR μεταγραφική δραστηριότητα και στις δύο κύτταρα E8 και CE1 και ότι η αναστολή τους αντιτίθεται δραστηριότητα AR. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το πώς η δραστηριότητα της σηματοδότησης AR μπορούν να τροποποιηθούν κατά τη διάρκεια CRPC, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου-στόχου AR,

Fkbp5

[29], με τη χρήση δύο διαφορετικών

in vivo

χειρισμούς. Πρώτον, ευνουχισμένα

C

+

? PTEN

L /L

μεταλλάξεις σε 6 Εβδομάδων και αναλύονται τα ποντίκια στα 30 wks και το δεύτερο θα διαγράφονται επιθηλιακά AR στην ανεπάρκεια προστάτες PTEN (

C

+

? PTEN

L /L

? Ar

L

/Υ

) -ένα μοντέλο που έχουμε χαρακτηρίζεται προηγουμένως (S5 σχήμα) [30]. Παρόμοια με κατεργασία enzalutamide μεταλλάκτες μας (S3 Εικ), παρατηρήσαμε μειωμένη /απώλεια της έκφρασης του περιφερικού AR στόχευσης αντισώματος (AR-C19) και διατηρήθηκαν έκφραση του αντισώματος αμινοτελική στόχευσης (AR-N20). Σε σύγκριση με την ορμόνη άθικτο (AR +) περιοχές (S5B σχήμα, επάνω αριστερό πάνελ, AR + βέλη), FKBP5 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε δείγματα ευνουχισμού. Η γενετική επικύρωση και τον έλεγχο των εξαρτώμενων FKBP5 ανδρογόνων διαμόρφωσης, αξιολογήσαμε AR και FKBP5 έκφρασης ΡΤΕΝ-null? AR-null περιοχές του

C

+

? PTEN

L /L

? AR

L

/Υ

μεταλλάξεις παρατηρώντας πλήρη απώλεια των επιθηλιακών AR (AR- περιοχή) και κοντά σε απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης FKBP5 (S5B σχήμα, πάνω αριστερά, Ar-βέλη). Περαιτέρω, με τη χρήση CRPC σειρές που προέρχονται από τη μηδενική μοντέλο ποντικού ΡΤΕΝ [30], μπορούμε επικυρωθεί η ενεργοποίηση των ανδρογόνων του

Fkbp5

κατά την προσθήκη εξωγενούς ανδρογόνου (S5c Εικ). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια χειρουργικών ή γενετική επαγωγή CRPC στην PTEN-null ογκογένεση, ο άξονας AR-FKBP5 σηματοδότησης έχει απομειωθεί.

Συζήτηση

Η υπερέκφραση των υποδοχέων των ανδρογόνων (ΑΕ) εμφανίζεται σε μια σημαντική αριθμός των καρκίνων του προστάτη όψιμου σταδίου συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προχωρούν σε αντίσταση ευνουχισμό. Ο προσδιορισμός των AR παραλλαγών σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRPC και κλινικά δείγματα υποδεικνύει ότι AR παραλλαγές μπορεί να διευκολύνει την συνεχιζόμενη AR ογκογόνο λειτουργία παρά την παρουσία του AR στοχευμένη θεραπεία [31]. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι η πλειοψηφία των AR-Vs ταυτοποιηθεί μέχρι τώρα προβλέπεται να κωδικοποιούν πρωτεΐνες που στερείται της LBD αλλά διατηρώντας την Ν-τελική περιοχή διενεργοποίησης έτσι ενεργούν ως συστατικά ενεργός παράγοντες μεταγραφής. Αυτό δείχνει ότι ο AR LBD δεν είναι απαραίτητη για δραστηριότητα AR μεταγραφική και η συνεχής συνεισφορά προς την πρόοδο του καρκίνου [27] [32] [33]. Κατά συνέπεια, η κατανόηση της διαδικασίας με την οποία προκύπτουν παραλλαγές AR και η συμβολή τους προς την εμφάνιση CRPC έχει γίνει μια περιοχή έντονης έρευνας.

Ο ομόλογος συστήματα του καρκίνου του προστάτη (εξάρτηση των ορμονών, αντίσταση ευνουχισμό και κυτταρικές σειρές που προέρχονται) όπως ελήφθη χρησιμοποιώντας τη μηδενική μοντέλο ΡΤΕΝ, παρέχουν μια εξαιρετική πλατφόρμα για να εκτιμήσει την έναρξη της νόσου και την εξέλιξη [22]. Η μελέτη μας, για πρώτη φορά, περιγράφει την φυσική εμφάνιση αυτών των παραλλαγών AR NTD σε ΡΤΕΝ κυττάρων καρκίνου του προστάτη ανεπαρκή ποντικού και της θέσεως κύριο όργανο. Είναι σημαντικό ότι, δείχνουμε ότι η ταυτοποιημένη AR-Vs δεν είναι στατική, αλλά μεταβάλλεται σε έκφραση κατά την διάρκεια CRPC εξέλιξης. Οι τρεις παραλλαγές AR ποντίκι που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη αποτελείται νέων μοριακών δομών. Μαρ-Va, η οποία διατηρεί τα γειτονικά εξώνια 1-4 ακολουθούμενη από ανάγνωση μέσω εντός ιντρόνιο 4 και είναι χονδρικά ανάλογη με την αναφερόμενη Μαρ-V4 [15] και AR

V567es [27] με την εξαίρεση της μοναδικής αμινοξέος αλληλουχία που κωδικοποιείται από το 3′-άκρο. Μαρ-Vb και Vc Μαρ-αποτελούνται από δύο διαφορετικές περιοχές που βρίσκονται εντός ιντρονίου 1 ματιστεί μετά εξόνιο 1, που οδηγεί στην συναγόμενη αλληλουχία πρωτεΐνης AR-Vs που περιέχει μόνο το NTD. Η λεγόμενη AR-V8 που προσδιορίζονται στο 22rv1 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη εμφανίζεται ως η πλησιέστερη ανθρώπινο ομόλογό περιέχουν το AR-NTD ακολουθούμενη από μία μακρύτερη ουρά 33-aa που κωδικοποιείται από ένα εξόνιο 3 ‘βρίσκονται εντός ιντρόνης 3 [19]. Η ομοιότητα μεταξύ προσδιορίζονται οι παραλλαγές του ποντικιού και εκείνων που είχαν διαπιστωθεί σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, υποδηλώνει ότι το κυτταρικό στρες της θεραπείας ορμονοθεραπεία μπορεί να δράσει από κοινού τρόπο κατά τη διάρκεια της επιλογής για τις παραλλαγές παραλλαγή πληθυσμούς AR

Πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει Har-V7 να είναι αυξημένα σε CRPC, μετάσταση, τη σύνδεση με βιοχημικής υποτροπής και η κακή κλινική έκβαση [11] [17] [18] [34]. Ένα από τα πιο σημαντικά ευρήματα από τη μελέτη μας είναι η ικανότητα του ευνουχισμού ή AR στοχευμένη θεραπεία για την επιλογή ισομορφές AR ποντίκι. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν όχι μόνο ένα πρόσθετο μηχανισμό δια του οποίου

ανεπαρκή προστάτη ΡΤΕΝ

καρκινικά κύτταρα μπορεί να εξελιχθεί σε CRPC αλλά έχει επίσης ισχυρές επιπτώσεις για θεραπείες που προορίζονται να στοχεύουν άμεσα την περιοχή σύνδεσης προσδέματος του υποδοχέα ανδρογόνων. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ παρατηρείται αυξημένη σε σχέση με την έκφραση της mARVs σε κυτταρικές γραμμές που παράγονται στον πολιτισμό, την έκφραση του AR-FL διατηρήθηκε το οποίο είναι διαφορετικό από αυτό που παρατηρήθηκε στις πρωτογενείς ποντίκι όγκους. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο μονοκλωνικό φύση των κυττάρων προέλευση

έναντι

της μεγάλης ανομοιογένειας των πρωτογενών δειγμάτων. Μπορεί επίσης να σχετίζεται με τη γενική συντήρηση των κυτταρικών σειρών σε ορμόνη άθικτη συνθήκες

έναντι

μακρών συνθήκες ευνουχισμού χρησιμοποιείται για τη διατήρηση πρωτογενών όγκων. Η εντυπωσιακή παρατήρηση ότι AR-FL μειώθηκε κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε επίπεδα ανδρογόνων ευνουχισμού ή παρουσία της χρόνιας έκθεσης enzalutamide, παρέχει συναρπαστικό υποστήριξης που έχει επιλεγεί AR-FL κατά και ότι τα αντιρετροϊκά φάρμακα μπορούν να διευκολύνουν τη συνεχή λειτουργία AR. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι

PTEN

null μεταλλάξεις είναι ελάχιστα ανταποκρίνονται τόσο ο ευνουχισμός και enzalutamide θεραπεία [23] [35] [24]. Τα στοιχεία μας έδειξαν την σχετική αύξηση του AR-NTD παραλλαγές, τόσο

in vitro

και

in vivo

, η οποία είναι συνεπής με την απουσία απάντησης στην AR στοχευμένη θεραπεία σε αυτό το μοντέλο.

Παρατηρήσαμε την ικανότητα Μαρ-Va, αλλά μειώνεται για Μαρ-Vb και mAR-Vc, για την ενίσχυση της δραστηριότητας των AR δοκιμασίες μεταγραφικής δημοσιογράφος. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι Μαρ-Vb και Vc δεν έχουν μοτίβο δέσμευσης DNA. Τα δεδομένα μας, όμως, δεν μπορεί να αποκλείσει το ενδεχόμενο παραλλαγές όπως Μαρ-Vb και Vc να έχουν ογκογόνο λειτουργία μέσω εναλλακτικών μηχανισμών. Ενδιαφέρον, μια παραλλαγή νέα AR παρόμοιας δομής ταυτοποιήθηκε σε διάφορες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου [19]. Η λεγόμενη AR8 στερείται επίσης έναν τομέα δέσμευσης DNA και, ως εκ τούτου, όπως και η Μαρ-Vb και Vc Μαρ-προσδιορίζονται εδώ, είναι απίθανο να λειτουργήσει ως μεταγραφικός παράγοντας από μόνος του. Μάλλον, AR8 δείχθηκε να συνδέσουν με Src και τον υποδοχέα EGF προωθώντας έτσι την αυξημένη φωσφορυλίωση του AR [19]. Θα είναι ενδιαφέρον για τις μελλοντικές μελέτες για να διερευνηθεί κατά πόσο Μαρ-Vb και Vc είναι ικανά παρόμοιες ενώσεις πλασματική μεμβράνη και μια πιθανή συμβολή στην CRPC.

μας AR-V γκρεμίζω μελέτες, η οποία οδήγησε σε μειωμένη AR μεταγραφική δραστηριότητα , αποκαλύπτουν πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές της παραλλαγής στόχευσης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CRPC. Η παρουσία του κόλουρου παραλλαγές σε ανεπάρκεια PTEN ποντίκι είναι επίσης σύμφωνη με την κλινική παρατήρηση διατηρείται έκφραση AR παρά την παρουσία ισχυρών AR στοχευμένες θεραπείες, όπως enzalutamide. Ωστόσο, δεδομένου ότι Μαρ-Va, b, και c έδειξαν διαφορική απόκριση σε αλλαγές έκφραση σε ευνουχισμό ή Casodex σε μελέτες μας, την ακριβή συμβολή (ες) των επιμέρους παραλλαγές, και το δυναμικό συνεργασιμότητα τους προς CRPC μένει να διευκρινιστεί και πιθανόν να εξαρτάται από την κυτταρική πλαίσιο [8]. Μελλοντικές μελέτες της εξέλιξης μπορεί να εξετάσει Μαρ-V κυτταρική εντοπισμούς, αλληλεπιδράσεις με άλλα ογκογόνο μονοπάτια και τις επιπτώσεις στο

in vivo

εξέλιξη.

Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ παρέχουν ενδείξεις για την παρουσία των νέων παραλλαγών ανιχνεύσιμη στον πρωτογενή σύστημα οργάνων των γενετικά τροποποιημένων null ποντίκια PTEN τονίζεται από την αυξημένη έκφραση παραλλαγή κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε επίπεδα ευνουχισμού ανδρογόνων. Μελλοντικές θεραπευτικές μελέτες μπορεί να εξετάσει κατά πόσο νωρίς στόχευση αυτών που προσδιορίζονται ισομορφών AR μπορεί να αποτρέψει ή να καθυστερήσει την εξέλιξη σε CRPC. Αυτό Μαρ-Va και αναστολή Vc οδήγησε σε μειωμένη λειτουργία AR μεταγραφική παρέχει τη λογική για τη δοκιμή των φαρμακολογικών παραλλαγές AR στόχευση. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα μας, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η εισαγωγή του AR-FL πίσω σε ορισμένα ανεπάρκεια CRPC κύτταρα PTEN που περιέχουν AR Vs μπορεί να αποκαταστήσει τέτοια κύτταρα σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων.

Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και δείγματα προστάτη του ποντικιού

Ε4, Ε8, CE1 CE2 [25] [26] και CaP8, P8 [36] κυτταρική σειρά καθιερώθηκαν από το υπό όρους

PTEN

-null μοντέλο ποντικού. LNCaP και PC-3 κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC. C4-2B και COS-1 κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον Δρ Baruch Frenkel (Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας, Λος Άντζελες, CA) και ο Δρ Allen Epstein (Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας, Λος Άντζελες, CA), αντίστοιχα. Τα παράγωγα του γονικές κυτταρικές σειρές παρήχθησαν μέσω του πολιτισμού 10% CSS (απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό, Cellgro) για έως 18 ημέρες. E8 και CE2 κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή σε φυσιολογικά μέσα διατήρησης με την προσθήκη 10 μΜ των αντι-ανδρογόνων, βικαλουταμίδη (Sigma-Aldrich) για 6 ημέρες. Προστάτη ιστοί συλλέχθηκαν από ποντίκια που φέρουν ADCA ή CRPC όγκων καθώς και αυτές που άγριου τύπου σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες. Ανατμηθέντες προστάτες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ταχεία κατάψυξη σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται σε -80 ° C για περαιτέρω ανάλυση.

Κλωνοποίηση και κατασκευάσματα

Το συνολικό κυτταρικό RNA που απομονώθηκαν από Ε8 και CE1 με RNAqueous-4PCR Kit (τεχνολογίες ζωής) που χρησιμοποιείται ως πηγή. Η ανίχνευση του AR ποντικιού ματίσματος παραλλαγές από τους επιτεύχθηκε με GeneRacer Kit με SuperScript III RT και ΤΟΡΟ ΤΑ κιτ κλωνοποίησης για αλληλούχιση (τεχνολογίες ζωής), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα κατασκευαστή. Εν συντομία, εκχυλίζεται RNA που ήταν πρώτα μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το GeneRacer ολίγο (dT) εκκινητή και μονάδα SuperScript RT III από το κιτ. RACE-ready cDNAs υποβλήθηκαν σε 3 ‘ταχεία ενίσχυση cDNA άκρου PCR (3’ RACE-PCR) χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός έναυσμα ειδικού γονιδίου (GSP) και αντίστροφος εκκινητής GeneRacer 3 ‘από την ηλεκτρονική μονάδα GeneRacer. Άλλος ένας γύρος ένθετη PCR διεξήχθη για περαιτέρω ενίσχυση χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός ΣΓΠ ένθετη αστάρι και να αντιστρέψει GeneRacer 3 ‘Φωλιά αστάρι που παρέχονται στο κιτ. SuperTaq Plus πολυμεράσης (τεχνολογίες ζωής) χρησιμοποιήθηκε τόσο για 3 ‘RACE και ένθετη PCR. Προς τα εμπρός ΣΓΠ και φωλιασμένα εναύσματα αγκυροβολημένο στο exon1 (S1 πίνακα) για την προβλεπόμενη παραλλαγές (S2 Πίνακας) χρησιμοποιώντας την παραλλαγή ειδικούς εκκινητές RACE (S3 Πίνακας). 3 ‘RACE και ένθετη PCR προϊόντα στη συνέχεια εξετάστηκαν με τυπική ΤΑ υπο κλωνοποίηση και αλληλούχιση χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική μονάδα Cloning ΤΟΡΟ ΤΑ. ApE πλασμίδιο Επεξεργαστή χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη για να αναλύσει τα αποτελέσματα αλληλούχισης, την πρόβλεψη πρωτεϊνικών αλληλουχιών και παράγει χάρτες κείμενο για mARVs (S3 πίνακας)

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται:. Rat AR πλήρους μήκους (Dr. Robert Matusik, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, TN), ανθρώπινο AR πλήρους μήκους (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, CA), και PSA-λουσιφεράσης και pcDNA3.1-myc (Δρ Parkash Gill, University of Southern Καλιφόρνια, Λος Άντζελες, CA). pCR4-TOPO αγοράστηκε στο ΤΟΡΟ ΤΑ κιτ κλωνοποίησης για αλληλούχιση (τεχνολογίες ζωής).

CDS (αλληλουχίες κωδικοποίησης) για Marva, Vb και Vc ενισχύθηκαν με PCR από τα cDNA της Ε8 και CE1 χρησιμοποιώντας τα σύνολα εκκινητών που περικλείει ολόκληρο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), και υπο κλωνοποιήθηκαν σε pcDNA3.1-myc-HisC. Για να δημιουργήσετε τις Arva-myc και ARVC-myc κατασκευάσματα, αντίστροφοι εκκινητές εκ νέου σχεδιασμένο να αγκιστρωθεί ανάντη της δικής τους κωδικόνια τερματισμού και-πλαισιωμένο με το ORF του φορέα έκφρασης. Hifi AccuStart Taq DNA πολυμεράσης (Quanta Biosciences) και HotStar Taq DNA πολυμεράση (Qiagen) εφαρμόστηκαν στην κλωνοποίηση PCR. Οι αλληλουχίες των εναυσμάτων που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση Va, Vb, Vc, Va-myc και Vc-myc δόθηκαν στον Πίνακα S4.

PCR και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Το ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίσθηκε από όλες οι γονικές και άλλα παράγωγα κυτταρικές γραμμές και στη συνέχεια μεταγράφηκε ανάστροφα με χρήση ολίγο (dT) εκκινητή και SuperScript III Πρώτη Strand Synthesis (τεχνολογίες Life). Δείγματα RNA χρησιμοποιήθηκαν για διάφορες δοκιμασίες απομονώθηκαν από κύτταρα με διαφορετικές παρτίδες. Συμβατική PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA που χρησιμοποιούν την ίδια προς τα εμπρός εκκινητή αγκυρώνεται εντός exon1 αντιστοιχιστεί με αντίστροφο εκκινητή ειδικό για Μαρ-Va, b, c και AR-FL, αντίστοιχα (S5 πίνακα). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και την ανάλυση των δεδομένων έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Τα σύνολα εκκινητών σε πραγματικό χρόνο έχει σχεδιαστεί ειδικά και αποκλειστικά για την ενίσχυση κάθε ARV και AR-FL είχαν παρατίθενται στον Πίνακα S6.

Η επιμόλυνση και λουσιφεράσης δοκιμασία

1-2 ημέρες πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσα που περιέχουν ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο ορό (CSS). Για όλες τις επιμολύνσεις, δεξαμενές κύτταρα μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine Plus (Invitrogen) με κενό πλασμίδιο φορέα ελέγχου, πλήρους μήκους πλασμίδιο AR, ή παραλλαγή ματίσματος AR πλασμιδίων μαζί με τα κατασκευάσματα που αποκρίνονται στο ανδρογόνο MMTV-λουσιφεράση πυγολαμπίδας ή PSA-λουσιφεράση πυγολαμπίδας [28 ] και το ανδρογόνο-insensitive ελέγχου λουσιφεράσης Renilla pRL-SV40 (Promega). Αδειάστε πλασμίδιο ελέγχου φορέας χρησιμοποιήθηκε να ισορροπήσει συνόλου του DNA σε όλες τις επιμολύνσεις. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τετραπλούν με φάρμακα σε πλάκες 96 φρεατίων. 24hrs αργότερα λουσιφεράσης δραστηριότητες προσδιορίστηκαν ποσοτικά (Dual κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης, Promega) σε μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας (Tecan) και πυγολαμπίδας σήμα κανονικοποιημένης ως προς το σήμα για τον έλεγχο της Renilla για τον αριθμό των κυττάρων.

Δοκιμασία

συνανοσοκαθίζησης

COS κύτταρα επιμολύνθηκαν με Marva-myc ή mARVc-myc μαζί με Rat AR-FL χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (τεχνολογίες Life) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Περίπου 48 ώρες.